專利名稱：一種糖尿病腎病微炎癥小鼠模型的建立方法
技術領域：
本發明屬生命科學技術領域，具體涉及一種糖尿病腎病微炎癥小鼠模型的建立方法。
背景技術：
糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是一種損毀性腎病,是引起終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)發生的主要原因，近10年來患病率逐漸上升，已經超過了 50%。糖尿病腎病的特點為腎小球肥大、基底膜增厚、腎小球濾過屏障受損、腎小球基質增生，晚期發生腎小球硬化、腎小管間質纖維化、進展性蛋白尿及腎功能衰竭。然而，糖尿病腎病的具體發生機制尚不完全清楚，近年來研究表明許多因素涉及DN的發生機制，包括蛋白尿、遺傳、種族、缺氧、缺血以及炎癥。其中，炎癥被認為是在DN發生發展中的一個關鍵路徑，DN中存在的代謝、生化及血液動力學紊亂都可以激活炎癥的產生。研究表明，各種炎癥細胞，包括白細胞、單核細胞和巨噬細胞，以及其它一些分子，如細胞因子[單核細胞趨化蛋白 _1 (monocyte chemoattractant protein-l, MCP-1)]、黏附分子[細胞間黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)]、各種酶(環氧化酶-2、氮氧化物)、生長因子(血管內皮生長因子、生長激素、IGF、TGF-β )及核因子(NF-K B)都參與了糖尿病腎病的發展過程。炎癥通路中的這些信號分子活化并募集成纖維細胞，參與腎臟纖維化過程。因此，除了常規的控制血糖和血壓外，進一步研究炎癥通路活化及其引起腎損傷的機制，找出阻斷這些信號的方法，將是一種新的能有效控制糖尿病腎病的治療手段。目前尚未發現有關糖尿病腎病的微炎癥研究模型。
發明內容
本發明的目的在于提供一種糖尿病腎病微炎癥小鼠模型的建立方法，有助于深入了解糖尿病腎病損傷機制，更好地防治糖尿病腎病的發生發展。本發明采用以下技術方案:一種糖尿病腎病微炎癥小鼠模型的建立方法，包括以下步驟:步驟1、挑選6-8周齡雄性db/db小鼠,飼養備用；步驟2、將步驟I選擇的每只小鼠每日或隔日背部皮下注射質量濃度為5 10%的酪蛋白(casein)溶液0.3 0.8ml，持續8_12周，以刺激產生慢性持續微炎癥反應；步驟3、將步驟2得到的小鼠進行臨床生化指標和組織病理學分析，即可獲得糖尿病腎病微炎癥小鼠模型。進一步地,步驟I所述小鼠為8周齡雄性db/db小鼠。進一步地,所述步驟2中casein溶液注射持續時間為8周。進一步地，步驟3中所述臨床生化指標和組織病理學分析包括采取ELISA法檢測炎癥指標，Lowery法測24小時尿蛋白，免疫組化檢查腎臟組織炎癥因子的表達，光鏡檢查小鼠腎臟病理 變化。
本發明的有益效果:本發明首次應用db/db小鼠并結合小劑量casein皮下注射成功誘導具有典型微炎癥特征的糖尿病腎病模型，具有操作簡單、經濟實用、造模成功率高等特點，而且能模仿人類糖尿病疾病特征，具備微炎癥、高血糖、腎小球系膜基質增生、腎小球硬化等特點，病理學檢查符合糖尿病腎病病理變化，該模型為研究糖尿病腎病的發生及發展機制打下基礎。
圖1為本發明模型建立方法流程圖；圖2為實施例1模型組和對照組造模8周后小鼠血清中SAA濃度，其中*表示P〈0.0lVS對照組；圖3為實施例1模型組和對照組造模8周后小鼠血清中TNF- α濃度，其中*表示P〈0.0lVS對照組；圖4為實施例1模型組和對照組造模8周小鼠24小時尿蛋白變化情況圖；圖5為實施例1對照組造模8周后HE染色小鼠腎臟組織光鏡病理變化圖(X 400);圖6為實施例1模型組造模8周后HE染色小鼠腎臟組織光鏡病理變化圖(X 400);·
圖7為實施例1對照組造模8周后PAS染色小鼠腎臟組織光鏡病理變化圖(Χ400)；圖8為實施例1模型組造模8周后PAS染色小鼠腎臟組織光鏡病理變化圖(Χ400)；圖9為實施例1對照組造模8周后小鼠腎臟組織MCP-1表達圖(X400);圖10為實施例1模型組造模8周后小鼠腎臟組織MCP-1表達圖(X400);圖11為實施例1對照組造模8周后小鼠腎臟組織TNF- α表達圖(Χ400)；圖12為實施例1模型組造模8周后小鼠腎臟組織TNF- α表達圖(X 400)。
具體實施方式
:下面結合實施例和附圖對本發明做更進一步的解釋。應該理解以下實施例僅旨在說明，不應被視為對本發明范圍的限制。—種糖尿病腎病微炎癥小鼠模型的建立方法，如圖1所示，包括以下步驟:步驟1、挑選6-8周齡優選8周齡的雄性db/db小鼠,飼養備用；步驟2、將步驟I選擇的每只小鼠每日或隔日背部皮下注射質量濃度為5 10%的casein溶液0.3 0.8ml，持續8_12周，優選8周，以刺激產生慢性持續微炎癥反應；步驟3、將步驟2得到的小鼠進行臨床生化指標和組織病理學分析，即可獲得糖尿病腎病微炎癥小鼠模型，其中臨床生化指標和組織病理學分析包括采取ELISA法檢測炎癥指標，Lowery法測24小時尿蛋白，免疫組化檢查腎臟組織炎癥因子的表達，光鏡檢查小鼠腎臟組織病理變化。 Db/db小鼠是1966年Jackson實驗室發現的由C57BL/KsJ品系小鼠自發出現瘦素受體基因(db)突變產生的一種DM鼠種。瘦素基因定位于4號染色體上，呈常染色體隱性遺傳。Db/db小鼠的缺陷主要為瘦素受體的轉錄異常，導致瘦素作用不足。Db/db小鼠大概5-7周出現明顯肥胖，血糖逐漸升高，并出現糖尿，8-9周出現微量白蛋白尿，發生DN。12-14周齡出現腎小球肥大、系膜增寬、腎小球基底膜增厚，20周齡時出現細胞外基質明顯積聚，7月齡出現明顯的腎小球硬化，是研究DN較好的動物模型。本發明建立的模型能模仿人類糖尿病疾病特征，具備微炎癥、高血糖、腎小球系膜基質增生、腎小球硬化等特點，病理學檢查符合糖尿病腎病病理變化。產生此優點的原因與以下因素有關:1.研究對象的選擇:選擇6-8周齡雄性db/db小鼠作為研究對象，該種瘦素受體基因敲除小鼠是研究II型糖尿病、糖尿病腎病等諸多疾病發病機制的重要模型。2.小劑量casein皮下注射:每日或隔日背部皮下注射5 10%casein溶液0.3 0.8ml,以刺激產生慢性持續微炎癥反應。實施例1模型組步驟1、挑選8周齡雄性db/db小鼠20只，體重為30 40g。飼養環境溫度為20 ± 2°C，分籠飼養，普通顆粒飼料喂養，自由攝水，12小時交替照明，適應性喂養一周。動物實驗符合國家《實驗動物管理條例》和《江蘇省實驗動物管理實施辦法》要求。步驟2、步驟I選擇的每只小鼠隔日背部皮下注射質量濃度為10%的casein溶液
0.5ml，持續8周，以刺激產生慢性持續微炎癥反應。步驟3、將步驟2得到的小鼠進行臨床生化指標和組織病理學分析，即可獲得糖尿病腎病微炎癥小鼠模型，其中臨床生化指標和組織病理學分析包括采取ELISA法檢測炎癥指標，Lowery法測24小時尿蛋白，免疫組化檢查腎臟組織炎癥因子的表達，光鏡檢查腎臟組織病理變化。對照組隔日注射的是蒸餾水0.5ml,其他試驗步驟和條件與模型組一致。模型組和對照組臨床生化指標·和組織病理學分析方法和結果如下:一、實驗方法1、血尿標本的檢測小鼠處死前，剪尾取血，自動血糖儀(德國Bayer)檢測隨機血糖。經10%水合氯醛麻醉后，予心臟采血，血標本置于含有抗凝劑EDTA的離心管中，1000rpm/min離心5min,取上清液放置于-2(TC冰箱待用。血甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(totalcholesterol, TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein, LDL) 7jC平，及血肌酐(serum creatinine, Scr)、血尿素氮(bloodurea nitrogen, BUN)由日立自動生化儀檢測。ELSIA法檢測血清淀粉樣蛋白A (SerumamyloidA, SAA, Invitrogen,美國)、腫瘤壞死因子(tumor necrotic factor, TNF-α )濃度(R&D,美國)。每周尿標本采用小鼠代謝籠收集，小鼠在代謝籠中自由飲食飲水，收集24h尿量，離心、計總量，置于_20°C冰箱保存待測。Lowry法測定24h尿蛋白含量。2、腎臟組織病理學檢查抽血后PBS灌注沖洗，取腎去除包膜，沿縱軸方向切開，用10%中性福爾馬林固定24h后，逐級脫水，常規石蠟包埋，2 μ m連續切片行HE、PAS染色。光鏡下觀察腎小球及腎小管的形態，分析腎小球系膜基質及腎小球硬化等腎組織病理改變情況，Image J軟件分析測定胞外基質沉積占腎臟結構比，每只小鼠共取5張切片計算均值。部分組織經4%戊二醛固定，再以2%鋨酸后固定，Epon812包埋，JEM-1010透射電鏡觀察腎小球足細胞、基底膜及系膜的超微結構。
3、免疫組織化學將3 μ m厚的石蠟切片脫蠟、水化，經微波抗原修復后，采用EliVision法免疫組化試劑盒(福州邁新公司)，檢測腎組織內炎癥因子單核細胞趨化蛋白-1 (monocytechemoattractant protein-1, MCP-1) (1:100, Santa Cruz,美 H)> TNF- α (1:50, SantaCruz,美國)的表達情況。4、統計方法采用SPSS13.0統計軟件處理數據。計量資料用均數士標準差(表示，組間計
量資料的分析采用t檢驗，用Spearman進行相關性分析。P〈0.05認為差異有統計學意義。二、實驗結果1、炎癥刺激后兩組小鼠血清炎癥因子水平的變化模型組小鼠血清炎癥因子SAA (圖2)、TNF-α (圖3)水平明顯高于對照組，差異具有統計學意義(p〈0.05)。2、腎臟組織炎癥因子表達情況小鼠腎組織免 疫組化結果顯示，炎癥因子MCP-1、TNF-α在對照組小鼠腎臟組織中有少量表達，模型組小鼠腎臟組織中炎癥因子的表達明顯增加，顯著高于對照組(圖9至圖 12)。3、各組小鼠蛋白尿的變化如圖4所示，小鼠尿液檢測表明，對照組及模型組小鼠在建模后，24h尿蛋白含量都逐漸增加，對照組尿蛋白增加緩慢，而模型組小鼠從第四周開始24h尿蛋白含量迅速增力口，明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P〈0.05)。4、腎臟病理學改變光鏡下觀察腎組織，HE染色及PAS染色可見對照組小鼠腎小球系膜基質輕度增力口，模型組系膜區增寬明顯增大，基質增加更為嚴重，明顯多于對照組(圖5-8)。
權利要求
1.一種糖尿病腎病微炎癥小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1、挑選6-8周齡雄性db/db小鼠，飼養備用； 步驟2、將步驟I選擇的每只小鼠每日或隔日背部皮下注射質量濃度為5 10%的casein溶液0.3 0.8ml，持續8_12周，以刺激產生慢性持續微炎癥反應； 步驟3、將步驟2得到的小鼠進行臨床生化指標和組織病理學分析，即獲得糖尿病腎病微炎癥小鼠模型。
2.根據權利要求1所述的糖尿病腎病微炎癥小鼠模型的建立方法，其特征在于，步驟I所述小鼠為8周齡雄性db/db小鼠。
3.根據權利要求1所述的糖尿病腎病微炎癥小鼠模型的建立方法，其特征在于，所述步驟2中casein溶液注射持續時間為8周。
4.根據權利要求1所述的糖尿病腎病微炎癥小鼠模型的建立方法，其特征在于，步驟3中所述臨床生化指標和組織病理學分析包括采取ELISA法檢測炎癥指標，Lowery法測24小時尿蛋白，免疫組化檢查腎 臟組織炎癥因子的表達，光鏡檢查小鼠腎臟病理變化。
全文摘要
本發明公開了一種糖尿病腎病微炎癥小鼠模型的建立方法，包括挑選db/db小鼠、casein皮下注射誘導微炎癥狀態、臨床生化指標和組織病理學分析步驟。本發明具有操作簡單、經濟實用、造模成功率高等特點，而且能模仿人類糖尿病腎病疾病特征，具備微炎癥、腎小球系膜基質增生、腎小球硬化等特點，該方法的建立將有助于深入了解糖尿病腎病損傷機制，更好地防治糖尿病腎病的發生發展。
文檔編號A61K38/17GK103239713SQ20131020811
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月28日 優先權日2013年5月28日
發明者馬坤嶺, 張洋 申請人:東南大學