專利名稱：一種siRNA分子及其抗腫瘤應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種SiRNA分子，尤其是指靶向NET-1和VEGF基因的siRNA分子及其抗腫瘤應用。
背景技術：
RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA(double-strand RNA,dsRNA)引發其同源信使RNA(messenger RNA, mRNA)酶解的一種轉錄后基因沉默形式(Nature.1998，391:806-811)。長雙鏈RNA進入細胞后，被Dicer酶結合并切割。Dicer酶的切割產物長度通常為20 25bp，且在每條鏈的3’末端有2個核苷酸懸垂的小干擾RNA (small interference RNA, siRNA)。siRNA的一條鏈慘入到RNA-誘導的沉默復合物中(RNA-1nduced silencing complex, RISC),與互補 RNA 的序列配對。RISC 首先介導 siRNA雙鏈解旋，與RISC耦合的單鏈的siRNA以序列特異的方式與靶mRNA結合，之后由RISC的催化組分切割靶mRNA。切割靶mRNA可以抑制其翻譯，最終抑制該基因的表達。現已被證實在多種病毒感染性疾病和腫瘤的治療中具有極大的潛力，是理想的阻斷基因表達的治療手段。RNAi在醫藥領域有廣闊的應用前景，如抗病毒、抗腫瘤和抗炎癥等。雙鏈干擾核酸可設計成能被Dicer酶剪切的稱做Dicer底物的長雙鏈形式,或者是短的、不需Dicer酶剪切直接作為RISC底物的形式。合成的雙鏈RNA與目的基因序列互補，導入細胞或生物體后，被內源的遺傳物質識別，激活RNAi途徑。利用這種機制，RNAi使靶基因的表達水平急劇下降。血管內皮生長因子(VascularEndothelial Growth Factor,VEGF)是誘導血管生成的促進因子，可促進內皮細胞分裂與增殖、促進血管生成以及增加微、小靜脈的通透性，誘導絲氨酸蛋白酶與間質膠原酶的表達，使細胞質鈣聚集，誘導血管生成，在創傷愈合、胚胎發育、腫瘤生長和轉移過程中起著重要的作用。VEGF在成熟器官中表達較低，在一些代謝旺盛、血供豐富的組織細胞中表達較`高，尤其是在腫瘤組織中。隨著研究的深入，VEGF促進腫瘤血管生成的作用和與人類癌癥的發病機制的關系是確定的，因此，抑制VEGF途徑被確認為是一種重要的有效的抗癌治療方法。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種siRNA分子及其抗腫瘤應用。為了解決上述技術問題，本發明的技術方案是提供了一種靶向VEGF和NET-1基因的雙靶向siRNA雙鏈分子，其特征在于，其序列由如下正義鏈和反義鏈1、2組成:正義鏈:5，-GCUUCCUACAGCACAACAAACCACAAUGGCUGAGCACUUNn-3’ (SEQ ID NO:1),反義鏈1:5’ -UUGUUGUGCUGUAGGAAGCNn-3’ (SEQ ID NO:2),反義鏈2:5’ -AAGUGCUCAGCCAUUGUGGNn-3’ (SEQ ID NO:3)；
上述SiRNA分子中，N是4種DNA堿基及其脫氧形式中的任何一種，即胞嘧啶C、鳥嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脫氧胞嘧啶dC、脫氧鳥嘌呤dG、脫氧腺嘌呤dA或脫氧胸腺嘧啶dT ；n代表N的個數，η是O 2的整數。換言之，上述雙鏈siRNA分子的主干序列為:正義鏈:5，-GCUUCCUACAGCACAACAAACCACAAUGGCUGAGCACUU-3’ (SEQ ID NO:4),反義鏈1:5’ -UUGUUGUGCUGUAGGAAGC-3’ (SEQ ID NO:5),反義鏈2:5’ -AAGUGCUCAGCCAUUGUGG-3，(SEQ ID NO:6)。優選地，所述的N為dT，且η為2。優選地，所述的η為O。本發明還提供了上述靶向VEGF和NET-1基因的雙靶向siRNA雙鏈分子在在制備抑制細胞中NET-1基因和VEGF基因功能的藥物中的應用。本發明還提供了上述靶向VEGF和NET-1基因的雙靶向siRNA雙鏈分子在制備治療抗腫瘤藥物中的應用。優選地，所述的腫瘤為肝癌或肺癌。體外實驗證明，本發明的siRNA分子的反義鏈可特異性地與NET-1和VEGF基因的mRNA結合，降解mRNA，從而干擾轉錄后翻譯過程，誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞轉移和侵襲，達到治療腫瘤的目的·。本發明的有益效果是:本發明的雙靶向SiRNA分子可以應用于制備調節細胞中NET-1基因和VEGF基因功能的藥物中發揮RNA干擾的作用，誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞轉移和侵襲，達到抗腫瘤的目的。
圖1-1是RT-QPCR檢測肝癌細胞株H印G2各實驗組NET-1和VEGF基因的mRNA表達水平結果圖。圖1-2是RT-QPCR檢測肺癌細胞株A549各實驗組NET-1和VEGF基因的mRNA表達水平結果圖。圖2是Western Blot檢測各實驗組NET-1蛋白表達水平結果圖。其中，A為不同實驗組NET-1和內參β-actin蛋白印跡結果圖；B為不同實驗組NET-1蛋白相對表達水平柱形圖。圖3是ELISA檢測各實驗組細胞中VEGF的含量結果柱形統計圖。圖4是CCK8法檢測各實驗組的細胞生長曲線圖。圖5是流式細胞術檢測各實驗組細胞凋亡結果圖。其中，A為不同實驗組的FCM分析結果圖；B SAnnexin V和PI雙染陽性細胞的定量柱形圖。
具體實施例方式為方便起見，在下文中，術語“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”可以互換，它們表不的意思和范圍相同。其中，siRNA是正義鏈和反義鏈退火形成的雙鏈結構。
本發明的siRNA分子來源于針對NET-1和VEGF基因開放閱讀框的功能保守區而設計。siRNA的制備可采用多種方法，比如:化學合成法、體外轉錄、酶切長鏈dsRNA、載體表達siRNA、PCR合成siRNA表達元件等，這些方法的出現為研究者提供了可選擇的空間，可以更好地獲得基因沉默效率。本發明的siRNA分子可以作為制備調節細胞中NET-1基因和VEGF基因功能藥物的有效成分，尤其是抗腫瘤藥物的有效成分。出于應用目的，可將SiRNA分子作為藥物直接給藥于受藥者身上特定部位，比如腫瘤組織。本發明的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合于相應疾病的給藥、并且恰當地保持siRNA分子的活性。比如，對于注射用給藥系統，劑型可以是凍干粉。任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學上可接受的載體及佐劑，只要其適合于相應的給藥體系、并且恰當地保持siRNA分子的活性。為使本發明更明顯易懂，茲以優選實施例，并配合附圖作詳細說明如下。下述實施例僅用于闡明本發明，并非是對本發明進行限制。實施例11、細胞培養肝癌細胞株H印G2和肺癌細胞株A549購于上海中科院細胞研究所，用含10% FBS的DMEM培養基(Gibco公司)培養，所述的培養基中加入青霉素和鏈霉素(Invitrogen公司)，其終濃度分別為100U/mL和100 μ g/mL,培養于37 °C 二氧化碳培養箱。2、siRNA 體外轉染用在線設計軟件(ThermosiDESIGN Center 和 Invitrogen BLOCK-1TRNAiDesigner)設計靶向NET-1 (基因庫登錄號:AF065388)和VEGF (基因庫登錄號:ΝΜ_001025366.2)基因的 siRNA 序列 NET-1siRNA 和 VEGF siRNA。并設計同時靶向 NET-1和VEGF基因的雙靶向siRNA序列:VEGF_NET siRNA，設計方案參照公開號為CN102191246、名稱為《多靶標干擾核酸分子及其應用》的中國發明專利進行，序列見表I。取步驟I中培養得到的處于對數生長期的細胞，按96孔板接種密度為5X IO4/孔、6孔板接種密度為IX IO6/孔接種 細胞，將其分為實驗組和不轉染siRNA的未處理組，所述的實驗組包括NET-1siRNA轉染組、VEGF siRNA轉染組、VEGF-NET siRNA轉染組.各實驗組采用相應的siRNA按操作說明用Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)轉染到細胞內，使siRNA終濃度為50nM，37°C培養4h后，培養液換成含10% FBS (Gibco公司)的DMEM培養基(Gibco公司)ο所有的實驗均重復3次，結果均用平均值土SD表示，用SPSS17.0進行統計學分析。統計學差異用單因素方差分析和雙側t檢驗。P <0.05表明差異顯著。在所有的圖表中，*、#表明與未處理組和雙靶向siRNA組相比差異顯著。表1:siRNA序列及對照序列 I VEGF ——IEXIj I GCUUCCUAC^CACAACAAttCSEQIDNO: 7)
權利要求
1.一種靶向VEGF和NET-1基因的雙靶向siRNA雙鏈分子，其特征在于，其序列由如下正義鏈和反義鏈1、2組成: 正義鏈:5，-GCUUCCUACAGCACAACAAACCACAAUGGCUGAGCACUUNn-3，，反義鏈 1:5’ -UUGUUGUGCUGUAGGAAGCNn-3’，反義鏈 2:5’ -AAGUGCUCAGCCAUUGUGGNn-3’ ； 上述siRNA分子中，N是4種DNA堿基及其脫氧形式中的任何一種，即胞嘧啶C、鳥嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脫氧胞嘧啶dC、脫氧鳥嘌呤dG、脫氧腺嘌呤dA或脫氧胸腺嘧啶dT ；η代表N的個數，η是O 2的整數。
2.如權利要求1所述的靶向VEGF和NET-1基因的雙靶向siRNA雙鏈分子，其特征在于，所述的N為dT,且η為2。
3.如權利要求1所述的靶向VEGF和NET-1基因的雙靶向siRNA雙鏈分子，其特征在于，所述的η為O。
4.權利要求1-3中任一項所述的靶向VEGF和NET-1基因的雙靶向siRNA雙鏈分子在在制備調節細胞中NET-1基因和VEGF基因功能的藥物中的應用。
5.權利要求1-3中任一項所述的靶向VEGF和NET-1基因的雙靶向siRNA雙鏈分子在制備治療抗腫瘤藥物中的應用 。
全文摘要
本發明提供了一種靶向VEGF和NET-1基因的雙靶向siRNA雙鏈分子，其特征在于，其序列由如下正義鏈和反義鏈1、2組成，其中正義鏈為5’-GCUUCCUACAGCACAACAAACCACAAUGGCUGAGCACUUNn-3’，反義鏈1為5’-UUGUUGUGCUGUAGGAAGCNn-3’，反義鏈2為5’-AAGUGCUCAGCCAUUGUGGNn-3’；上述siRNA分子中，N是4種DNA堿基及其脫氧形式中的任何一種，即胞嘧啶C、鳥嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脫氧胞嘧啶dC、脫氧鳥嘌呤dG、脫氧腺嘌呤dA或脫氧胸腺嘧啶dT；n代表N的個數，n是0～2的整數。本發明的siRNA分子可以應用于制備調節細胞中NET-1基因和VEGF基因功能的藥物中發揮RNA干擾的作用，誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞轉移和侵襲，達到抗腫瘤的目的。
文檔編號A61K48/00GK103243100SQ201310206799
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月29日 優先權日2013年5月29日
發明者陳莉, 仲崇俊, 王建力, 張一心, 吳圓圓, 王桂蘭, 周家名, 喬宇, 李鐵軍 申請人:南通大學, 南通市第一人民醫院, 百奧邁科生物技術有限公司