可治療癌癥的藥學組合物的制作方法

可治療癌癥的藥學組合物的制作方法
【專利摘要】本文揭示一種用以治療癌癥的組合物，其包含三萜化合物的新穎組合。此新穎的三萜化合物組合至少包含靈芝酸S(ganoderic?acid?S，GAS)、靈芝酸T(ganoderic?acid?T，GAT)、靈芝酸Me(ganoderic?acid?Me，GAMe)、靈芝酸R(ganoderic?acid?R，GAR)、赤靈酸S(ganodermic?acid?S，GMAS)。所揭示組合物可用來治療或預防直腸癌、肝癌、乳癌、肺癌或血癌。
【專利說明】可治療癌癥的藥學組合物

【技術領域】
[0001]本揭示內容是有關于一種藥學性組合物，其包含一新穎的三萜化合物的組合，可用來治療癌癥，包括具有抗藥性的癌癥。

【背景技術】
[0002]長久以來，在東南亞地區，食用性真菌都被當作營養補充品或健康食品來使用，其中又以靈芝(Ganoderma Iucidum)為大宗，且因其具有醫療效果也被當作藥材使用超過千年之久。自靈芝中分離出來的活性成分大致包括靈芝三職類(triterpenoids)、多糖體(polysaccharides)、核苷(nucleic acids)、多肽類(polypeptides)、和植物固醇類(phytosterols)等等。在這些活性成分中，又以靈芝三萜類最重要，因其具有藥學活性，包括抑制膽固醇合成、抗癌、抗高血壓等等。靈芝三萜類包含各式靈芝酸(ganoderic acids, GAs)、赤靈酸(ganodermic acids, GMAs)、靈芝酉享(ganodericalcohol)、靈芝酮(ganoderic ketone)、靈芝醒(ganoderic aldehyde)等化合物。在靈芝酸的相關研究中發現，靈芝酸具有可殺死癌細胞的細胞毒性和抑制其擴增的效果。舉例來說，已知靈芝酸D(ganoderic acid D, GAD)可防止人類子宮頸癌細胞(即，Hela 細胞)增生(Yue et al.,Mol Cell Proteomics (2008) 7:949-961);靈芝酸 A 和H (ganoderic acids A and H;簡稱GAA及GAH)可抑制乳癌細胞生長或防止其侵犯其它組織(Jiang et al., Int J Mol Med(2008) 21:577-584);靈芝酸 X(ganoderic acidX，GAX)可抑制拓樸酶活性并能誘使肝癌細胞進入細胞凋亡程序(Li et al.,Life Sc1.(2005) 77，252-265);靈芝酸M除了可有效地抑制癌細胞生長外，還可抑制肺癌細胞的遷移(Wang et al., Int ImmunopharmacoI (2007) 7:864-870)，GMAS 則已知可誘發血小板聚集(Wang et al., B1chim.B1phys.Acta.(1989)986，151-160)、抑制血小板功能(Wang et al.，B1chem.J.(1991) 277 (Ptl)，189-197)和抑制由血栓素 A2 (Suet al., B1chem.Pharmacol.(1999)58, 587-595;Su et al., B1chim.B1phys.Acta.(1999b) 1437，223-234)或前列腺素 El (Su et al., Thromb.Res.(1999c) 99，135-145)在血小板中所誘發的細胞反應。
[0003]本案發明人意外地發現，一種新穎的三萜化合物的組合，具有可抑制特定種類的癌細胞的功效，包括具抗藥性和的癌細胞，使其不致增生，因此，可作為治療或預防癌癥的藥物或其佐劑。


【發明內容】

[0004]本揭示內容至少部分是基于發現一種新穎的三萜化合物的組合，其具有可延緩或抑制癌細胞生長的特性而來，該些三職化合物系分別自靈芝(Ganoderma Iucidum)的子實體或菌絲體中單離或純化而來。上述發現暗示本揭示內容中的新穎的三萜化合物組合可作為能治療或預防癌癥，包括對藥物具有抗性的癌癥，的藥物或佐劑。
[0005]因此，本揭示內容的第一目的是關于一種可治療或預防癌癥的藥學組合物。此藥學組合物包含一藥學有效量的三職化合物，其至少包含靈芝酸S(ganoderic acidS，GAS)、靈芝酸 T (ganoderic acid T, GAT)、靈芝酸 Me (ganoderic acid Me, GAMe)、靈芝酸R (ganoderic acid R, GAR)和赤靈酸 S (ganodermic acid S, GMAS);及其藥學上可接受的載體。
[0006]依據一較佳實施方式，所述GMAS、GAMe和GAR、GAT、與GAS的量分別約為總三萜化合物含量的0.5-20%、0.5-20%、20-75%及10-30% (重量比)。適合以所述藥學組合物進行治療或預防的癌癥可以是直腸癌、肝癌、乳癌、肺癌或血癌。在一實例中，該癌癥為肺癌。在另一實例中，該癌癥為對吉非替尼(gefitinib)發展出抗藥性的肺癌。
[0007]若以醫藥品或藥學組合物總重量為基準，本發明的新穎三萜化合物組合約占該藥學組合物總重量的0.1%至99%(重量％)。在某些實施方式中，本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的1%。在特定實施方式中，本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的5%。在其它實施方式中，本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的10%。在另外實施方式中，本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的25%。
[0008]在某些實施方式中，本發明所述醫藥品或藥學組合物更可作為諸如外科手術、放射線治療或化學治療之類的其它主要癌癥治療方式外的另一種輔助性治療，以改善該癌癥治療效果。
[0009]本揭示內容的第二目的是提供一種治療癌癥的方法。所揭示方法包括對需要治療的個體施用一治療有效量的三萜化合物，其包含GMAS、GAMe和GAR、GAT、與GAS。適合以本發明方法進行治療的癌癥可以是直腸癌、肝癌、乳癌、肺癌或血癌。在一實例中，上述的癌癥為肺癌。在一較佳實施方式中，該癌癥是對吉非替尼具有抗藥性的肺癌。該個體可以是哺乳動物，較佳是人類。
[0010]在某些實施方式中，本發明所述方法更包括在對該個體施用本發明藥學組合物之前、同時或之后，額外對該個體施加外科手術、放射線治療或化學治療之類的其它主要癌癥治療手段，以改善對該個體的癌癥治療效果。
[0011]透過以下的詳細說明與附隨之權利要求書將可更了解本揭示內容的這些及其它特征。需知以上的概述及以下的詳細說明僅為例示，用來闡述本揭示內容，而非用以限制本揭示內容的范圍。

【具體實施方式】
[0012]為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施方式與具體實施例提出了說明性的描述；但這并非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特征以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其它具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
[0013]以下為本說明書中所用特定名詞的說明:
[0014]在本文中，“治療(treatment or treating)”一詞包括可導致欲求的藥學和/或生理效果的防止性(即，預防性)、治愈性或緩和性處置。該效果較佳是指醫療上可部分或完全治愈或防止癌細胞的生長。此外，“治療”一詞在此是指基于可部分或完全減輕、延遲發生、抑制進程、減輕嚴重性、和/或減少一種特定疾病、異常和/或醫療狀況之一或多個病征出現機率的目的，而對受測個體(或患者)，尤指具有一種醫療狀況、一種該醫療狀況的癥狀、一種因該醫療狀況而引起的疾病或病癥、或是一種會使朝向該醫療狀況發展的先期狀況的個體，施用或施加本揭示內容的化合物。可對尚未出現特定疾病、異常和/或醫療狀況的明顯病征的個體，和/或僅對該特定疾病、異常和/或醫療狀況產生早期病征的個體進行治療，以期降低產生該特定疾病、異常和/或醫療狀況相關的病理的風險。在本文中，所述病征、疾病、異常和/或醫療狀況可以是原位癌或轉移性癌。若能減少一或多個病征或臨床指標即代表該治療是“有效”的。
[0015]“預防(prophylaxis) ”在此是指對一種未來事件的防制手段。基于本文中預防癌細胞或因手術或診斷程序進而潛藏地增加了該些癌細胞轉移的文意，因此，可在實施該手術或診斷程序之前、同時或之后，實施本文所述的預防性處置手段。
[0016]“一有效量(an effective amount) ” 一詞意將對于治療癌癥的目的,此一用量在經過適當的給藥期間后，能夠達到減少癌細胞數目的欲求效果。
[0017]“化合物(compound) ”、“組合物(composit1n) ”、“藥劑(agent) ” 或“醫藥品(medicine or medicament) ”等詞在此可交替使用，且都是指當施用于一個體(人類或動物)時，能夠透過局部和/或全身性作用而誘發所亟求的藥學和/或生理反應的一種化合物或組合物。
[0018]“施用(administerecUadministering或、administrat1n) ”一詞在此是指直接施用所述的化合物或組合物，或施用活性化合物的前驅藥(prodrug)、衍生物(derivative)、或類似物(analog)等，而可在施用個體體內形成該活性化合物的一相當用量者。
[0019]本文中交替使用“個體(subject) ”或“患者(patient) ”等詞,其是指可接受所述化合物和/或方法治療的動物(包括人類)。“個體”或“患者”在此涵蓋了雄性與雌性兩種性別，除非另有具體說明。因此“個體”或“患者”包含任何哺乳類動物，包括，但不限于，人類、非人類的靈長類，如哺乳動物、狗、貓、馬、羊、豬、牛等，其可因利用所述化合物進行治療而獲益。適合接受本發明化合物和/或方法治療的動物較佳為人類。一般來說，“患者”一詞及“個體” 一詞在本文中可彼此交替使用。
[0020]雖然用以界定本發明較廣范圍的數值范圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，“約”通常是指實際數值在一特定數值或范圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，“約”一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本領域技術人員的考慮而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有范圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其它相似者)均經過“約”的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨權利要求書所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。
[0021]除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞匯的含義與本領域技術人員所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文沖突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的復數型；而所用的復數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
[0022]本揭示內容至少有一部分是基于單離自靈芝子實體或菌絲體之三職化合物的新穎組合，具有可對抗癌細胞(包括具抗藥性的癌細胞)增生的特性，而發展出來的。因此，此三萜化合物的新穎組合是潛在可用來治療或預防癌癥的藥劑或可作為癌癥藥物的佐劑。
[0023]因此，本揭示內容的第一方面提供一種可治療或預防癌癥的藥學組合物。此藥學組合物包含一藥學有效量的三職化合物，其至少包含靈芝酸S (ganoderic acidS，GAS)、靈芝酸 T (ganoderic acid T, GAT)、靈芝酸 Me (ganoderic acid Me, GAMe)、靈芝酸R(ganoderic acid R, GAR)和赤靈酸S (ganodermic acid S, GMAS);及其藥學上可接受的載體。
[0024]本揭示內容之三萜化合物是由靈芝屬菌類中分離而來，并可透過熟知的純化方法由赤芝(Ganoderma Iucidum)的子實體或菌絲體中分離而得,例如GAS、GAT和GAMe和GAR 可利用 Xu 等人(App.Microb1l B1technol (2010) DOI10.1007/s00253-010-2576-5)所揭示的方法進行分離或純化；GMAS則可依據Hirotani等人(Phytochemistry (1987)，26(10),2797-2803)所揭示的方法進行分離純化，或是依據2013年I月11日授予給陳等人的臺灣專利號1381844中所述方法，利用取自培養靈芝用的廢棄太空包中的靈芝菌絲體作為原料來進行分離。無論原料來自靈芝子實體或是菌絲體，所用的分離純化方法一般都包括以溶劑(較佳是醇類溶液)，在高于室溫的溫度下進行萃取，接著將萃取物進行管柱層析，其包括但不限于高效液相層析(HPLC)和反相液相層析(Reverse Phase LiquidChromatograpy)等，以及濃縮、干燥等步驟,直到獲得該靈芝活性化合物的干燥粉末為止。
[0025]在某些較佳實施方式中，所述GMAS的量約為總三萜化合物含量的0.5-20%(重量 ％)，例如約 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5或20%(重量％)，這是以組合物中所含三萜化合物的總量當作100%計算而得。在一實例中，該GMAS的量約為組合物中三萜化合物總量的1.5%。在另一實例中，該GMAS的量約為組合物中三萜化合物總量的2%。在又一實例中，該GMAS的量約為組合物中三萜化合物總量的
8% ο
[0026]所述GAMe與GAR的量約為總三萜化合物含量的0.5-20%(重量％)，例如約0.5、1、
1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、
13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5 或 20% (重量 ％)，這是以組合物中所含三萜化合物的總量當作100%計算而得。在一實例中，該GAMe與GAR的量約為組合物中三萜化合物總量的4.5%。在另一實例中，該GAMe與GAR的量約為組合物中三萜化合物總量的6.5%。在又一實例中，該GAMe與GAR的量約為組合物中三萜化合物總量的15%。
[0027]所述GAT的量約為總三萜化合物含量的20_75%(重量％)，例如約20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、50、52、55、57、60、62、65、67、70、72 或 75% (重量 ％)，這是以組合物中所含三萜化合物的總量當作100%計算而得。在一實例中，該GAT的量約為組合物中三萜化合物總量的65%。在另一實例中，該GAT的量約為組合物中三萜化合物總量的70%。在又一實例中，該GAT的量約為組合物中三萜化合物總量的73%。
[0028]所述GAS的量約為總三萜化合物含量的10-30%(重量％)，例如約10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30%(重量％)，這是以組合物中所含三萜化合物的總量當作100%計算而得。在一實例中，該GAS的量約為組合物中三萜化合物總量的17%。在另一實例中，該GAS的量約為組合物中三萜化合物總量的18%。在又一實例中，該GAS的量約為組合物中三萜化合物總量的20%。
[0029]若以醫藥品或藥學組合物總重量為基準，本發明的新穎三萜化合物組合(即，GMAS、GAMe和GAR、GAT、與GAS之組合)約占該藥學組合物總重量的0.1%至99% (重量％)。在某些實施方式中，本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的1%。在特定實施方式中，本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的5%。在其它實施方式中，本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的10%。在另外實施方式中，本發明三萜化合物的總量至少約為該藥學組合物總重量的25%。
[0030]適合以本發明所揭示的藥學組合物進行治療的癌癥包括，但不限于，直腸癌、肝癌、乳癌、肺癌或血癌。較佳是，以本發明所揭示的藥學組合物來治療具有抗藥性的癌癥，例如對吉非替尼具有抗藥性的肺癌。
[0031]在本文中，抗藥性(drug-resistance)是指癌的一種特定狀態，尤指已對單一藥物發展出抗性的癌的狀態。舉例來說，已發展出抗藥性的癌包括對長春花生物堿(vinca alkaloids)(如，長春堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)及長春瑞賓(vinorelvine))具有抗性；對蒽環霉素(anthracyclines)(如，阿霉素(doxorubicin)、唐霉素(daunorubicin)、埃達霉素(idarubicin))具有抗性；對微管穩定藥物-泰素(paclitaxel)具有抗性；和對以酪胺酸激酶(tyrosine kinase, TK)活性作為標的的藥物(如，達沙替尼(dasatinib)、尼羅替尼(nilotinib)、伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib))具有抗性。在一較佳實施方式中，適合以本發明藥學組合物進行治療的癌是肺癌，其是已對一種FDA核可藥物-吉非替尼，發展出抗藥性的肺癌。
[0032]在某些實施方式中，可將本發明所揭示的藥物或藥學組合物作為諸如外科手術、放射線治療或化學治療之類的其它主要癌癥治療方式外的另一種輔助性治療藥物，以改善該癌癥的治療效果。
[0033]可根據眾所接受的藥學制程來制備上述藥物或藥學組合物，如Remington’ sPharmaceutical Sciences (17th edit1n,ed.Alfonoso R.Gennaroj Mack PublishingCompany, Easton, Pa(1985))一書中所揭示的制程。藥學上可接受的賦型劑是指可和藥學制劑中其它成分兼容且與生物體兼容者。
[0034]依據本發明所揭示的實施方式，可經由任何適當的給藥途徑來施用本發明所揭示的藥物或藥學組合物，例如經過口腔服用的膠囊、懸浮液或藥錠，或是以不經過腸胃道方式來施用。不經過腸胃道的施用方式包括諸如肌肉注射、靜脈血管注射、皮下注射或腹腔內注射等系統性施用方式。或是，也可透過穿皮膜方式施用，如局部皮膚涂抹或是吸入性(如，支氣管內、鼻腔內、口腔內或鼻滴劑等)；或是直腸內方式施用。施用時可單獨給藥或并同熟知的藥學可接受輔劑一起給藥。在較佳實施方式中，可經由口服方式(如，透過食物)將本發明化合物投予個體。
[0035]若以口服方式施用，可將本發明三萜化合物的新穎組合配方成為內含各種輔劑(如，微晶纖維素、碳酸鈣、磷酸二鈣及甘胺酸)；各種崩解劑(如淀粉、藻酸及特定硅酸鹽)；以及顆粒黏合劑(如，聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明膠及相思樹膠(acacia))的藥錠。除此外，還可包含諸如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉及滑石等的潤滑劑。與此相關的較佳材料包括乳糖或牛奶中的糖以及高分子量聚乙二醇。上述的固態劑型也可非必要地包括涂層或殼，例如腸衣涂層，以及用來改善任一藥物活性成分釋放速率的涂層。這類涂層的實例已為本領域技術人員所熟知。在一實例中，所述藥學組合物是被配方成為藥錠。在另一實例中，所述藥學組合物是被配方成為充填在軟或硬明膠膠囊內或是封裝在生物可分解之藥包內的顆粒。當使用方式是口服用懸浮液和/或特效藥液(elixirs)時，可組合活性成分與各種甜味劑或風味劑、著色劑或染料一起配方，需要時還可加入乳化劑和/或懸浮劑，以及諸如水、酒精、丙二醇、甘油等稀釋劑。在某些實施方式中，本發明藥學組合物是被配方成為適合口服的液體劑型。此類液體配方可更包括用來維持PH值的緩沖液。也可將此液體配方充填在軟膠囊內。此液體劑型可為一種溶液，懸浮液，乳化液，微乳化液，沉淀或是可攜帶本發明化合物、其藥學上可接受的衍生物、異構物、代謝物、鹽類或溶合物的任何液體介質。此液體可被設計成能改善本發明化合物其的藥學上可接受鹽類的溶解度，以便形成一種含有藥物的乳化液或分散液。當使用這種劑型時，是將活性化合物與至少一種藥學上可接受的輔藥(包括，但不限于，上述輔藥)一起混合后形成。
[0036]若以腸胃外(parenteral Iy )方式施用，可將本發明三職化合物的新穎組合配方成為液態的藥學組合物，其可為能以靜脈內注射、肌肉內注射、皮下注射或腹膜內注射等方式施用的無菌溶液或懸浮液。可用來制造上述無菌注射溶液或懸浮液的稀釋劑包括，但不限于，1，3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液、等滲氯化鈉溶液。也可使用脂肪酸(如，油酸)及其的甘油酯衍生物，或是天然藥學可接受的油(如，橄欖油或菜籽油)來制造可供注射用的溶液或懸浮液。這類油性溶液或懸浮液中也可包含用來稀釋的醇類或羧甲基纖維素或類似的分散劑。也可使用其它常用的界面活性劑(如，Tweens或Spans系列)或乳化劑，或藥學領域制造配方時常用來增強生物可利用性的藥劑。
[0037]亦可將本發明之上述醫藥品或藥學組合物制成多種適用于局部皮膚表面施用的劑型。在此種實施方式中，可采用多種已知、適于皮膚表面使用的惰性載體來制造適合的劑型。這類劑型包括溶液、乳液、乳霜、凝膠、軟膏、噴劑、皮膚貼布等。典型的惰性載體可以是，例如水、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙二醇、礦物油、硬脂酸醇、和可產生凝膠的物質。以上所揭示的載體或劑型都是本領域技術人員所熟知的，適合劑型的選擇與本發明藥學組合物的功效兩者間并不具有必然的相關性。
[0038]亦可將本發明上述醫藥品或藥學組合物制成多種適用于黏膜給藥(mucosalapplicat1n)的劑型，如經頰(buccal)和/或舌下(sublingual)藥物劑型單元，以遞送藥物穿過口腔黏膜。可使用多種生物可降解且藥學可接受的高分子輔劑，此種輔劑可使得藥學組合物具有可接受的吸附效果以及所欲的藥物釋放模式，且可和經頰和/或舌下藥物劑型單元中所含的欲施用活性成分或其它成分兼容。一般來說，上述的高分子輔劑包含親水性聚合物，其可黏附至口腔黏膜的濕潤表面。高分子輔劑的實施例包括但不限于丙烯酸聚合物與共聚物(acrylic acid polymers and copolymers);水解聚乙烯醇(hydrolyzed polyvinylalcohol);聚乙烯氧化物(polyethylene oxides);聚丙烯酸酯(polyacrylates);乙烯聚合物與共聚物(vinyl polymers and copolymers);聚乙烯批咯唳；葡萄糖(dextran);瓜膠(guar gum);果膠(pectins);淀粉；及纖維素聚合物(cellulosic polymers)。
[0039]當可理解，本發明三萜化合物組合的劑量會因個體而異，這不僅是因為所用的特定化合物或組合物、給藥途徑、化合物(單獨或連同一或多種藥物)于患者體內所引發之所欲反應等因素之不同，還可能受到其它因素影響，例如:欲治療癥狀的疾病狀態或嚴重程度；患者的年齡、性別或體重、患者的健康狀況；以及欲治療的病理狀態的嚴重程度、患者于同時進行的其它醫療或特殊飲食內容；以及本領域通常知識者可想到的其它因素；而負責照料的醫療人員最終可基于這些因素而判斷出適當的劑量。可調整給藥劑量與形式以提供較佳的治療反應。治療有效量同時也是指化合物或組合物所致的毒性或有害的效果不及于其所帶來的治療利益。在較佳的情形中，本發明三萜化合物的組合在投藥時，應采用適當的劑量并持續一段時間，以減少出現癥狀的次數和/或嚴重程度。
[0040]依此,本揭示內容還提供一種可治療一患者的癌癥的方法。所揭示方法包括對該患者施用一有效量的上述本發明藥學組合物，且該藥學組合物可經由抑制癌細胞生長和/或復制而能有效地治療該患者的癌癥。可以任何能夠有效傳送此藥學組合物至適合的生體作用位置的途徑(如，口服、鼻用、肺、穿皮膜等方式，或是諸如直腸栓劑、皮下、靜脈注射、肌肉注射、眼科溶液或軟膏的類的方式)來將該藥學組合物施用至一哺乳動物個體上，較佳是人類身上。此外，本發明藥學組合物也可與其它活性成分同時一起施用。
[0041 ] 適合以本發明方法進行治療的癌癥包括直腸癌、肝癌、乳癌或肺癌。較佳是以本發明化合物來治療具有抗藥性的癌，包括對吉非替尼具有抗藥性的癌癥。
[0042]當本發明藥學組合物被施用至一個體身上時，所施用的有效用量約為1-100毫克/公斤個體體重間。每天可施用至該個體身上的藥學組合物的用量約為10、20、30、40、50、60、70、80、90或100毫克/公斤體重；較佳是約30-70毫克/公斤體重，例如約30、40、50、60,70毫克/公斤體重；更佳是約50毫克/公斤體重。這些劑量可以單次施用或是分成多次在一天內施用。
[0043]在某些實施方式中，本發明所述方法更包括在對該個體施用本發明藥學組合物之前、同時或之后，額外對該個體施加外科手術、放射線治療或化學治療之類的其它主要癌癥治療手段，以改善對該個體的癌癥治療效果。
[0044]以下實施例是用來闡明本揭示內容特定方式，并幫助本領域技術人員了解并實施本揭示內容。但本揭示內容范疇并不限于這些實施例中。
[0045]實施例
[0046]材料與方法
[0047]細胞培育
[0048]本研究是使用人類乳癌細胞株MDA-MB-231、人類肝臟細胞癌株IfepG2 (humanhepatocarcinoma cell line HepG2)、人類肺腺癌(lung adenocarcinoma)細胞株A549,人類直腸癌細胞株HCT116、人類非小型肺癌細胞株PC-9、對吉非替尼具有抗性的人類非小型肺癌細胞株PC-9 (PC9-1R)、人類非小型肺癌細胞株H1650、人類骨髓性白血球細胞株K652、人類前骨髓性白血球細胞株HL-60,以及小鼠肺癌細胞株(Lewis lung carcinoma LLC)。
[0049]將MDA-MB_231、!fepG2、HCT116，以及LLC細胞分別培育在經Dulbecco氏改良過的Eagle 氏培養基(Dulbecco’ s modified Eagle，s medium, DMEM)中，PC9, PC9-1R、H1650、K562，以及HL-60培育在RPMI培養基中，并在培養基中都添加10%胎牛血清(fetal calfserum, FCS)、100 單位 /ml 的盤尼西林、100ng/ml 的鏈霉素(Invitrogen, Carlsbad, CA)、2mML-谷氨酸和非必要氨基酸及丙酮酸鈉，并維持在37°C的潮濕環境下(5%C02及95%空氣)。平時將細胞培養于10公分培養盤內，當細胞長到八分滿時進行繼代培養。繼代培養方式是先吸去舊的培養液后，以3毫升的磷酸緩沖液(PBS)清洗培養細胞一次，接著，在37°C下以I毫升之胰蛋白酶/EDTA (0.05%/0.025%)溶液處理細胞5分鐘，使細胞脫離培養盤成懸浮狀態；接著，在懸浮細胞中加入2毫升新鮮的培養液，以中和胰蛋白酶的活性。然后，將細胞打散使平均分布于細胞懸浮液中，留下適當比例的細胞數后，加入新培養液補至適當體積并混勻后，放入37°C培養箱內培養。
[0050]細胞活性分析
[0051]取約3，000個細胞，將之接種在平底96孔盤中，以培養液補充每一培養孔內的培養液，使體積達180 μ L，接著將培養盤放入37°C之培養箱培養過夜。次日加入含不同濃度的三萜化合物組合、吉非替尼或是伊馬替尼，于上述培養液。各培養孔內最終體積為20 μ L，每個濃度進行三重復，放入37°C培養箱培養，于48小時后測定細胞活性。
[0052]酸性憐酸酶活性(Acid phosphatase, ACP)分析
[0053]活細胞中有大量ACP可將其受質磷酸對硝基苯酯(p-nitrophenylphosphate, p-NPP)轉換成對-硝基苯酌.(p-nitrophenol, p-NP), p-NP 在 405nm 波長下有最大吸光值，故可藉測定吸光值可定量出細胞中ACP活性，進而推算出細胞的活性。測定細胞活性時，先吸去培養液，以200 μ L PBS清洗一次，加入100 μ I的分析用緩沖液(內含1mM p-NPP,0.1M 醋酸鈉、0.l%Triton X-100，且 pH 約為 5.5)，于 37°C反應 30-40 分鐘后加A 10 μ I 的氫氧化鈉(0.1N)終止反應，以 SpectraMax Μ5 Microplate Reader (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA)于波長405nm測定吸光值為細胞活性，以未處理藥物組的細胞活性為1，計算出不同條件處理下的細胞活性比。
[0054]誘發原位癌及活體內治療
[0055]本試驗使用6周齡的C57BL/6及N0D/SCID雄鼠，飼養在無病原菌的環境下，室溫維持于22±3°C，相對濕度保持于50±20%，日夜周期維持12/12小時，并可自由取用飲水及食物。動物飼料使用實驗鼠飼料5001 (Laboratory Rodent Diet5001)(購自PM I ?Nutrit1n Internat1nal, Inc., MO, USA) 0動物飲水則使用煮沸過的自來水。所有動物實驗操作，皆遵循中華實驗動物學會出版的“實驗動物管理與使用指南”的規范。
[0056]試驗前一天，將動物依體重分組，分組后確認各組間體重無統計上顯著差異，然后，將動物右后大腿外側剃毛。試驗開始當天，注射腫瘤細胞于剃毛處皮下，將A549人類肺癌細胞或HCTl 16人類直腸癌細胞(0.1mL生理食鹽水內含IXlO7個細胞)注射至N0D/SCID小鼠，或將LLC小鼠肺癌細胞(0.1mL生理食鹽水內含IXlO6個細胞)注射至C57BL/6小鼠。注射3天后，再開始投予本發明藥學組合物，投藥當日定為投藥試驗第I天。所有投藥溶液均當日配制。投藥時，以喂食針對試驗動物灌食投藥用懸浮液；每日灌食兩次，兩次間隔至少三小時。C57BL/6小鼠第22天完成試驗，N0D/SCID小鼠第35天完成實驗，實驗完成后將腫瘤取下，秤量腫瘤重量并且計算本發明藥學組合物抑制腫瘤生長的比例。
[0057]實施例1抑制活體外的癌細胞活性
[0058]1.1藥學組合物
[0059]本揭示內容中特定可預防及/或治療癌癥的藥學組合物是透過將各活性成分依據下表所示配方混合成一均勻混合物后而制得，該些活性成分是可依據本發明揭示內容中所載明的方法，自靈芝子實體或菌絲體中分離或純化而得。
[0060]表I本揭示內容之藥學組合物配方
[0061]

【權利要求】
1.一種用于治療癌癥的藥學組合物，包含一藥學有效量的三萜化合物，其至少包含靈芝酸 S (ganoderic acid S，GAS)、靈芝酸 T (ganoderic acid T, GAT)、靈芝酸 Me (ganodericacid Me, GAMe)、靈芝酸R(ganoderic acid R, GAR)和赤靈酸S(ganodermic acid S, GMAS)；及其藥學上可接受的載體。
2.如權利要求1所述的藥學組合物，其中GMAS的量約為該組合物中三萜化合物總量的0.5-20% (重量 ％)。
3.如權利要求1所述的藥學組合物,其中GAMe與GAR的量約為該組合物中三萜化合物總量的0.5-20% (重量％)。
4.如權利要求1所述的藥學組合物，其中GAT的量約為該組合物中三萜化合物總量的20-70% (重量 ％)。
5.如權利要求1所述的藥學組合物，其中GAS的量約為該組合物中三萜化合物總量的10-30% (重量 %)。
6.如權利要求1所述的藥學組合物，其中該癌癥可以是肝癌、直腸癌、肺癌、乳癌或血癌。
7.如權利要求6所述的藥學組合物,其中該肺癌對吉非替尼(gefitinib)具有抗藥性。
【文檔編號】A61P35/02GK104173354SQ201310205265
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月28日 優先權日:2013年5月28日
【發明者】林淑萍, 黃政博, 陳登海, 陳光地 申請人:雙鶴生物科技股份有限公司