一種抗感染細胞及其制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種抗感染細胞，為表達I58基因的腸上皮細胞。將含有I58基因的重組載體轉化正常腸上皮細胞中，得到表達I58基因的腸上皮細胞。本發明提供的抗感染細胞能夠表達I58基因，有效降低致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）和侵襲性大腸桿菌（EIEC）等對其的黏附活性，降低對人體腸道屏障功能的損害；且在受到EPEC、EHEC或EIEC等損傷后，所述抗感染細胞的緊密連接相關蛋白表達高于正常腸上皮細胞，本發明提供的抗感染細胞能夠腸粘膜上皮機械屏障功能更強，本發明提供的抗感染細胞及其制備方法將為腸損傷的預防和修復提供適宜的微環境，應用前景廣闊。
【專利說明】一種抗感染細胞及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抗感染細胞，尤其涉及一種表達158基因的腸上皮細胞及其制備方法。
【背景技術】
[0002]乳酸桿菌是益生菌中及其重要的一種，可以與靶細胞黏附，競爭抑制致病性大腸桿菌(EPEC)、出血性大腸桿菌(EHEC)和侵襲性大腸桿菌(EIEC)等致病菌對人體腸道屏障功能的損害；激發繼發于黏附的細胞內信號轉導途徑，降低腸上皮細胞(IEC)的通透性；調節人體腸道黏膜免疫功能，促進樹突狀細胞(DC)分化成熟，以及誘導腸道T細胞分化成熟等。益生菌在腸道內的黏附和定植能抑制致病菌的損傷，對于保護腸道黏膜的完整性具有重要意義。
[0003]近幾年來研究表明，乳酸桿菌表面蛋白(Surface layer protein, SLP)在其發揮益生作用時起著核心作用。SLP由蛋白或糖蛋白亞單位晶體狀排列而成，具有疏水性，氨基酸序列分析發現其主要包括谷氨酸和天門冬氨酸(約15%)，較多的賴氨酸(約10%)，以及大量的疏水性氨基酸(40-60%)。其外表面由一定大小和不同形態的孔隙組成多孔狀結構，包括眾多的特征性亞單位，通過非共價鍵結合在細胞表面的基底層，形成一定的固定結構，構成70%的網格狀表面，分子質量從25-71kDa，最大可達200kDa，SLP占細菌總蛋白的10%-15%，其中疏水氨基酸約占31.9%-38.7%。SLP酸性氨基酸數量較堿性氨基酸高12.5%，等電點(Predicted isoelectric, PI)約為9.35~10.4,并成為乳酸桿菌SLP特征性的標志。通過蛋白質序列分析以及循環二色性測量的方法，提示其二級結構組成包括約為20%的α -螺旋和40%的β -折疊，而不規則折疊及β -轉角約5%~45%。目前國內外的研究均表明， SLP是乳酸桿菌發揮其生理功能的重要結構基礎，使其不僅能夠適應外界環境的變化，而且能夠增強人類腸上皮細胞(Intestinal epithelial cell, IEC)的抗損傷作用，SLP在乳酸桿菌益生方面的作用已得到充分肯定。然而，益生菌在使用過程中也存低效性問題，即在病理狀態下，益生菌劑量較難在腸道長期維持一個較高的劑量。
[0004]綜上所述，本領域有必要進一步開發一種方法，能夠在微環境中通過細胞等方式預防和/或修復腸損傷。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是克服上述不足，提供抗感染細胞，可用于預防和/或修復腸損傷。
[0006]本發明提供的抗感染細胞為表達158基因的腸上皮細胞。
[0007]優選地，將含有158基因的重組載體轉化正常腸上皮細胞中，得到表達158基因的腸上皮細胞。
[0008]本發明還提供了一種制備上述抗感染細胞的方法，包括以下步驟:
[0009]步驟1，依據158基因序列設計擴增引物，經PCR克隆158基因片段；
[0010]步驟2，將所得158基因片段克隆至表達載體中，獲得重組載體；[0011 ] 步驟3，轉化所述重組載體至正常腸上皮細胞中，得到抗感染細胞。
[0012]優選地，在擴增引物設計過程中，使所設計的上游引物在158基因上游引入Bgl II酶切位點；使所設計的下游引物在158基因下游引入Xho I酶切位點。
[0013]優選地，步驟I中所述擴增引物如下:
[0014]上游引物:5’-atcAAGCTTTTTTCAGTTCAAAATGGTTA-3’ ；
[0015]下游引物:5，-atcctcgagAGTTTTCATCTTAACAACCT-3，；
[0016]其中所述上游引物中ate為Bgl II酶切位點，所述下游引物中atcctcgag為Xho I酶切位點。
[0017]優選地，所述表達載體為含有Bgl II酶切位點和Xho I酶切位點的表達載體。
[0018]優選地，所述表達載體為pET32載體。
[0019]本發明還提供了上述抗感染細胞在制備預防和修復腸損傷藥物或材料中的應用。
[0020]益生菌在腸道內的黏附和定植對抑制病菌的定植、移位和感染，維護腸道黏膜的完整性具有特別重要的意義。乳酸桿菌是益生菌中重要的一類，其在發揮益生作用時，表面蛋白(surface layer protein, SLP)的黏附結構起著核心作用。其中，乳酸桿菌表面蛋白的活性片段158 (IMP501-580)為具有黏附活性的片段。
[0021] 本發明提供的抗感染細胞能夠表達158基因，有效降低致病性大腸桿菌(EPEC)、出血性大腸桿菌(EHEC)和侵襲性大腸桿菌(EIEC)等對其的黏附活性，降低對人體腸道屏障功能的損害；且在受到EPEC、EHEC或EIEC等損傷后，所述抗感染細胞的緊密連接相關蛋白表達高于正常腸上皮細胞，本發明提供的抗感染細胞能夠腸粘膜上皮機械屏障功能更強，本發明提供的抗感染細胞及其制備方法將為腸損傷的預防和修復提供適宜的微環境，應用前景廣闊。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為EPEC的黏附率檢測結果；
[0023]圖2為緊密連接相關蛋白mRNA表達檢測結果。
【具體實施方式】
[0024]下面參照附圖，結合具體的實施例對本發明作進一步地說明，以更好地理解本發明。
[0025]本實施例提供了一種高表達158基因的腸上皮細胞，將將含有158基因的重組載體轉化正常腸上皮細胞中，得到高表達158基因的腸上皮細胞。
[0026]制備方法具體為:
[0027]1、克隆1158基因
[0028]1.1基因組NDA的提取
[0029]I)抽提緩沖液65°C預熱；
[0030]2)加菌體(植物乳酸桿菌CGMCC1258)到已經預熱的緩沖液(700 μ I)中混勻，65°C, 1min ；
[0031]3)加酹 / 氯仿 / 異戍醇(25:24:1)，振蕩，離心 12, OOOrpm, 1min ；
[0032]4)取上清，加氯仿/異戊醇(24:1)振蕩，離心12，OOOrpm，1min ;
[0033]5)取上清，重復4步驟；
[0034]6)加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇(或加入等體積的異丙醇)，_20°C沉淀；
[0035]7)離心 12, OOOrpm, 1min ；
[0036]8)棄上清，70%乙醇洗，也可以再用100%乙醇洗，然后溶解于10mL水中。
[0037]1.2目的基因的克隆
[0038]I)克隆
[0039]以基因組DNA為模板，根據GenBank中目的基因的DNA序列設計引物(表1)對目的基因進行擴增(表2)。程序:94°C 3min ；94°C 30秒，55°C 30秒；72°C lmin,30個循環；72 °C 15min。
[0040]表1擴增引物
[0041]
【權利要求】
1.一種抗感染細胞，其特征在于，所述抗感染細胞為表達158基因的腸上皮細胞。
2.根據權利要求1所述抗感染細胞，其特征在于，將含有158基因的重組載體轉化正常腸上皮細胞中，得到表達158基因的腸上皮細胞。
3.一種制備權利要求1所述抗感染細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1，依據158基因序列設計擴增引物，經PCR克隆158基因片段； 步驟2，將所得158基因片段克隆至表達載體中，獲得重組載體； 步驟3，轉化所述重組載體至正常腸上皮細胞中，得到抗感染細胞。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，在擴增引物設計過程中，使所設計的上游引物在158基因上游引入Bgl II酶切位點；使所設計的下游引物在158基因下游引入Xho I酶切位點。
5.根據權利要求4所 述的方法，其特征在于，步驟I中所述擴增引物如下: 上游引物:5’ -atcAAGCTITITTCAGTTCAAAATGGTTA-3’ ； 下游引物:5’ -atcctcgagAGTTTTCATCTTAACAACCT-3’ ； 其中所述上游引物中ate為Bgl II酶切位點，所述下游引物中atcctcgag為Xho I酶切位點。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達載體為含有BglII酶切位點和Xho I酶切位點的表達載體。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述表達載體為PET32載體。
8.—種如權利要求1所述抗感染細胞在制備預防和修復腸損傷藥物或材料中的應用。
【文檔編號】A61K48/00GK104178455SQ201310189037
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月20日 優先權日:2013年5月20日
【發明者】劉志華, 秦環龍, 汪建平 申請人:劉志華