專利名稱：一種攜帶Neuritin基因的Ⅱ型腺相關病毒及其在修復視神經損傷中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程和神經損傷技術領域，具體涉及一種攜帶Neuritin基因的
II型腺相關病毒及其在修復視神經損傷中的應用。
背景技術：
視神經損傷是許多眼部疾病和外傷，如青光眼、視神經缺血、鈍挫傷、視神經管骨折等，導致視功能損害共同的作用環節，嚴重時會造成患者視神經的萎縮和失明。盡管對視神經損傷的治療開展了大量研究工作，但其臨床實際療效不盡人意，按照目前的醫療技術水平難以讓患者恢復視力。視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells, RGCs)的內在再生能力低下，是視神經損傷后再生失敗導致視神經萎縮和失明的關鍵因素，如何進行有效的逆轉治療一直是眼科界面臨的難題之一。近期的研究表明，找準靶點增強受損RGC內在再生能力，能促進視神經長期、活躍的再生并到達上丘和外側膝狀體(參見文獻[l]Sun F, Park KK, BelinS，et al.Sustained axon regeneration induced by co-deletion of PTENand S0CS3.Nature.2011;480 (7377):372-5.； [2]Kurimoto T，Yin Yj Omura K，etal.Long-distance axon regeneration in the mature optic nerve:contributions ofoncomodulin，cAMP，and pten gene deletion.J Neurosc1.2010;30(46):15654-63.)，并有一定程度的功能恢復(參見文獻[3]de Lima S，Koriyama Y，KurimotoT，et al.Ful1-length axon regeneration in the adult mouse optic nerveand partial recovery of simple visual behaviors.Proc Natl Acad SciUSA.2012;109(23):9149-54.)，但應用于臨床尚遠，仍需尋找可應用于臨床的關鍵性因子。Neuritin 又名可塑性相關候選基因 15 (candidate plasticity-related gene15，CPG15)，是神經營養因子家族中的新成員。Neuritin主要表達于神經系統中，Neuritin具有獨特的神經營養作用，能維持神經元細胞的存活(參見文獻[4]Putz U, Harwell C andNedivi E.Soluble CPG15 expressed during early development rescues corticalprogenitors from apoptosis.Nat Neurosc1.2005; 8 (3): 322-31.)、促進神經突起的生長(參見文獻[5]Cappelletti G，Galbiati M，Ronchi C，et al.Neuritin (cpgl5)enhances the differentiating effect of NGF on neuronal PC12 cells.JNeurosci Res.2007;85(12):2702-13.；[6]Nedivi Ej Wu GY and Cline HT.Promotionof dendritic growth by CPG15，an activity-1nduced signaling molecule.Science.1998; 281 (5384): 1863-6.)和突觸成熟(參見文獻[7]Cantallops IjHaas Kand Cline HT.Postsynaptic CPGI5 promotes synaptic maturation and presynapticaxon arbor elaboration in viv0.Nat Neurosc1.2000; 3 (10): 1004-11.)，調節突觸可塑性(參見文獻[8]Wibrand K, Messaoudi Ej Havik B，et al.1dentification of genesco-upregulated w ith Arc during BDNF—induced long-term potentiation in adultrat dentate gyrus in viv0.Eur J Neurosc1.2006; 23 (6): 1501-11.)，并且是神經營養因子(參見文獻[9]Naeve GSj Ramakrishnan Mj Kramer Rj et al.Neuritin: a geneinduced by neural activity and neurotrophins that promotes neuritogenesis.ProcNatl Acad Sci USA.1997; 94 (6):2648-53.; [10] Lee KHj Ryu CJ，Hong HJj et al.CDNAmicroarray analysis of nerve growth factor-regulated gene expression profilein rat PC12 cells.Neurochem Res.2005; 30 (4): 533-40.)和神經活動(參見文獻[11]Nedivi E，Fieldust S，Theill LEj et al.A set of genes expressed in response tolight in the adult cerebral cortex and regulated during development.Proc NatlAcad Sci USA.1996;93 (5):2048-53.； [12]Lee WC and Nedivi E.Extended plasticityof visual cortex in dark-reared animals may result from prolonged expressionof cpgl5_like genes.J Neurosc1.2002;22(5):1807-15.； [13]Harwell Cj BurbachBj Svoboda K，et al.Regulation of cpgl5 expression during single whiskerexperience in the barrel cortex of adult mice.J Neurobiol.2005;65(I):85-96.)發揮作用的共同下游因子，介導雄激素和電剌激促進神經再生的必須和關鍵分子(參見文獻[14]Sharma N, Marzo SJj Jones KJj et al.Electrical stimulation andtestosterone differentially enhance expression of regeneration-associatedgenes.Exp Neurol.2010 ; 223 (I): 183-91.； [15]Marron TUj Guerini V，Rusmini P，etal.Androgen-1nduced neurite outgrowth is mediated by neuritin in motorneurones.J Neurochem.2005; 92 (I): 10-20.)。大鼠缺血性腦損傷(參見文獻[16]HanY，Chen X，Shi F，et al.CPG15，anew factor upregulated after ischemic brain injury,contributes toneuronal network re-establishment after glutamate-1nduced injury.JNeurotrauma.2007;24(4):722-31.; [17]Rickhag M，Teilum M and Wieloch T.Rapid andlong-term induction of effector immediate early genes (BDNF，Neuritin and Arc)in peri—infarct cortex and dentate gyrus after ischemic injury in rat brain.Brain Res.2007; 1151:203-10.)，大鼠腦彌漫性軸索損傷(參見文獻[18]賀亞龍，賀曉生，章翔，等.候選可塑性相關基因15在大鼠腦彌漫性軸索損傷中的表達.中華神經外科雜志.2010; 26 (2): 186- 188.)等腦內Neuritin的表達上調，提示Neuritin在神經元網絡修復重建過程中起著重要作用。席紹松等在急性脊髓損傷的模型中，經蛛網膜下腔注入重組人Neuritin，能促進大鼠急性脊髓損傷(改良Alien打擊法)后傷區軸突再生相關蛋白神經絲蛋白200及生長相關蛋白43 (GAP-43)的表達，并能促進大鼠后肢運動功能的恢復(參見文獻[19]席紹松，劉維鋼，張紅，et al.Neuritin蛋白對大鼠急性脊髓損傷后神經元軸突再生的作用.中國修復重建外科雜志.2009:23(10):1219-1223.)。這些都提示Neuritin在神經系統的發育成熟、創傷修復、病變發生和治療中起著重要作用，應用前景廣泛。2001年，Krishnamoorthy等釆用剛出生I天的大鼠視網膜節細胞轉染Ψ2 ElA病毒建立的大鼠視網膜細胞系(RGC5)(參見文獻[20] Krishnamoorthy RRj AgarwalP，Prasanna Gj et al.Characterization of a transformed rat retinal ganglion cellline.Brain Res Mol Brain Res.2001; 86 (1-2): 1-12.)，自建立細胞系以來，由于其生長活力旺盛，易于培養，被人們廣泛應用于體外實驗研究，同時也是研究視神經損傷及修復的最佳工具。目前尚無文獻報道Neuritin基因與修復視神經損傷相關，也未見有文獻報道構建一種攜帶Neuritin基因的II型腺相關病毒載體來治療視神經損傷。
發明內容
本發明的目的在于提供一種攜帶Neuritin基因的II型腺相關病毒載體。本發明的另一目的在于提供該攜帶Neuritin基因的II型腺相關病毒載體在制備治療修復視神經損傷藥物中的應用。本發明在Krishnamoorthy等采用剛出生I天的大鼠視網膜節細胞轉染Ψ2Ε1Α病毒建立的大鼠視網膜細胞系(RGC5)基礎上，首次采用丙烯酰胺損傷RGC5，以模擬體內的視神經損傷模型。本發明人在大鼠視神經的基因芯片中發現視神經損傷后7天，視神經內的Neuritin表達下調5倍；對視神經夾傷9秒后分別取不同的時間點觀察視網膜neuritin的表達變化，初步觀察到 損傷后短時間內3天和7天表達下調明顯，13天表達上調，到28天逐漸接近正常水平但仍較正常水平低。視神經損傷早期Neuritin的表達下調，提示在視神經損傷早期給予Neuritin重組蛋白或Neuritin重組病毒治療可能會對視網膜節細胞的存活產生保護作用并有利于視神經的再生。本發明的技術方案，主要是構建Neuritin的II型腺相關病毒載體，并在視網膜神經節細胞系RGC5的丙烯酰胺損傷模型中，利用Neuritin的II型腺相關病毒載體感染節細胞，體外觀察并探討Neuritin基因治療修復RGC5的作用及機制。建立大鼠視神經損傷模型，行眶內玻璃體注射攜帶Neuritin基因的II型腺相關病毒，在體觀察并探討Neuritin基因修復視神經損傷的作用及機制。Neuritin基因，以下也稱NRNl基因或Nrnl基因。本發明的第一方面，是提供一種攜帶Neuritin基因的II型腺相關病毒載體，該腺相關病毒載體是攜帶如SEQ ID NO:1所示的Neuritin基因的DNA序列。所述的II型腺相關病毒載體選用AAV三質粒系統，由AAV載體pAOV-CAG-eGFP、包裝質粒pAAV-RC和輔助質粒pHelper組成。目的基因NRNl由CAG啟動子啟動，具有神經特異性的表達性質。NRNl基因插入時可選擇在eGFP N端或C端或3XFlag C端插入，也可選擇將eGFP替換，或eGFP-3XFlag同時替換。當蛋白插入在eGFP N端時，eGFP和NRNl基因之間有GTGGGGSG的柔性短肽相互連接。本發明的第二方面，提供了一種攜帶Neuritin基因的II型腺相關病毒載體的構建方法，具體步驟如下:1.Neuritin基因II型腺相關病毒表達載體的構建根據Neuritin (NRNl)基因(GenBank:BC002683.2)設計并合成如下 PCR 引物:NRNl-正向引物:5’ -CGACGCGTATGGGACTTAAGTTGAAC-3’(SEQ ID NO:2);NRNl-反向引物:5’ -TTTGCGGCCGCTCAGAAGGAAAGCCA-3’(SEQ ID NO:3);使用PCR方法從含有NRNl基因cDNA (1551 bp,如SEQ ID NO:1所示)克隆模板中擴增NRNl基因CDS區；將II型腺相關病毒載體和目的基因分別雙酶切，純化酶切產物后與NRNl基因PCR產物進行定向連接或重組，通過連接反應將上述酶切片段準確連接到pAOV表達載體的Kpn I / Sal I位點上，獲得pAOV-Neuritin表達載體，其產物轉化感受態細菌，對生長出的克隆進行Nrnl基因PCR鑒定，PCR鑒定為陽性的克隆，證明目的基因已經定向連入目的載體。再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和分析比對，比對正確的即為構建成功的融合蛋白表達質粒載體。將構建好的融合蛋白表達載體進行超純去內毒素抽提，鈣轉法將質粒轉入293T細胞，36-48小時后通過熒光顯微鏡觀察融合蛋白eGFP。2.Neuritin基因腺相關病毒包裝制備包裝質粒pAAV-RC和輔助質粒pHelper，與Neuritin基因II型腺相關病毒表達載體pAOV-Neuritin-eGFP共轉染293T細胞，轉染后8小時更換為完全培養基，培養48小時后，收集富含II型腺相關病毒顆粒的細胞上清液，對其濃縮后得到高滴度的II型腺相關病毒濃縮液，感染Hela細胞后米用倍比稀釋法檢測病毒滴度。體內和體外實驗對II型腺相關病毒滴度的要求不同，生產過程中可過濃縮得到不同滴度的II型腺相關病毒顆粒。本發明的第三方面，是提供上述的攜帶Neuritin基因的II型腺相關病毒載體在制備治療修復視神經損傷藥物中的應用。用本發明構建的攜帶Neuritin基因II型腺相關病毒治療損傷的RGC5:首先采用Neuritin基因II型腺相關病毒感染RGC5細胞系，再應用丙烯酰胺致RGC5損傷，觀察Neuritin基因過表達后對損傷后RGC5的作用及機制。采用Neuritin蛋白對損傷后RGC5的存活具有保護作用，通過抑制Caspase 3的活性減少細胞的早期及晚期凋亡。
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攜帶Neuritin基因的II型腺相關病毒載體在制備治療修復視神經損傷藥物中的應用，Neuritin II型腺相關病毒可轉染視網膜節細胞，臨床上，具體可采用玻璃體注射該藥物轉染視網膜神經節細胞以進行視神經損傷的基因治療。腺相關病毒載體AAV是一種無包膜的單鏈線狀缺損型DNA病毒，AAV被公認為是最安全的病毒載體，AAV的DNA能以dsDNA的形式整合入宿主的染色體中，保持一種穩定的潛伏狀態、宿主范圍廣，穩定性好。本發明人前期以慢病毒為載體，構建了 Neuritin慢病毒，發現其對節細胞的感染率較低，主要是感染視網膜色素上皮細胞，可能主要是通過Neuritin的旁分泌實現其對節細胞的保護作用。而II型腺相關病毒在視網膜節細胞中的感染率可高達90%，通過構建攜帶Neuritin基因的II型腺相關病毒載體，可以更好地發揮Neuritin對視網膜節細胞的保護作用。本發明基于Neuritin獨特的神經營養作用及其在神經創傷、疾病中的表達變化和作用，以Neuritin為靶標對RGC5損傷進行基因治療，以增強RGC的內在再生能力，改善其存活及再生情況。并推測其對RGC5的存活和再生這一視神經損傷和疾病的關鍵環節具有明顯的作用，從而達到甚至超過給予多種NTF、或多種治療方法保護視網膜RGC和促進視神經再生的療效，為臨床治療視神經損傷提供有力的手段和理論依據。視神經由于其特殊的結構和生理特性，實際上是中樞神經系統(CNS)的一部分。故研究視神經損傷后的修復再生，也對CNS疾病和損傷的治療有著重要意義。
圖1是星狀孢子堿(Staurosporine)誘導分化視網膜神經節細胞系，其中A為未誘導的RGC5 ；B為星狀孢子堿(Staurosporine)誘導分化后的RGC5(采用星狀孢子堿(StauiOsporine)對視網膜神經節細胞進行誘導分化，使其為成熟的神經元樣細胞。)標尺=50 μ m。圖2是不同濃度的丙烯酰胺損傷視網膜神經節細胞系其中A為相差顯微鏡下的照片，顯示不同濃度丙烯酰胺對視網膜節細胞系(RGC5)損傷24h的作用；B為不同濃度丙烯酰胺對RGC5損傷后最長突起的的變化，0.2mM對RGC5最長突起已有明顯損傷作用；(:為不同濃度丙烯酰胺對RGC5的存活的影響，0.2mM損傷后RGC5存活影響不顯著。因此，本發明擬選用0.2mM的丙烯酰胺以模擬體內的視神經損傷模型，該濃度對突起有明顯的損傷作用，而對節細胞存活影響較小。標尺=20 μ m。圖3是CCK8法測重組人Neuritin對損傷后RGC5的存活的保護作用。圖4是流式細胞術測凋亡其中A為正常組；B為單純損傷組；C為Neuritin治療組；D為CNTF陽性對照組。早期凋亡和晚期凋亡均顯示Neuritin治療組可減少損傷后RGC5的凋亡，保護作用最明顯，優于CNTF陽性對照組。圖5是II型腺相關病毒AAV2_eGFP轉染大鼠視網膜神經節細胞其中A顯示AAV2_eGFP成功轉染大鼠視網膜神經節細胞；B顯示AAV2_eGFP標記的視網膜神經節細胞軸突；標尺=50 μ m。圖6是Neuritin II型腺相關病毒表達質粒載體構建圖。圖7是II型腺相關病毒eGFP質粒和Neuritin II型腺相關病毒表達質粒載體的線圖。
具體實施例方式下面結合實施例和附圖對本發明進行詳細描述。但下列實施例不應看作對本發明范圍的限制。實施例1:1.Neuritin基因II型腺相關病毒表達載體構建(I) II型腺相關病毒表達載體及目的基因的酶切采用pAOV-CAG-eGFP載體(購自Addgene公司)，使用Not 1、Mlu I進行酶切，酶切后的載體準備載體構建時使用。以NRNl基因CDS區的cDNA克隆為模板采用PCR擴增NRNl基因片段，產物使用Not 1、Mlu I進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收載體及目的基因DNA。(2)連接反應將酶切后的II型腺相關病毒載體和NRNl基因的PCR產物按照表I中的反應體系進行連接反應。 表1:連接反應體系
權利要求
1.一種攜帶Neuritin基因的II型腺相關病毒載體，其特征在于，該II型腺相關病毒載體是攜帶如SEQ ID NO:1所示的Neuritin基因的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的一種攜帶Neuritin基因的II型腺相關病毒載體，其特征在于，所述的II型腺相關病毒載體選用AAV三質粒系統，由AAV載體pAOV-CAG-eGFP、包裝質粒PAAV-RC和輔助質粒pHelper組成；目的基因NRNl由CAG啟動子啟動；NRN1基因插入時選擇在eGFP N端或C端或3XFlag C端插入，或者選擇將eGFP替換，或者eGFP_3XFlag同時替換；當蛋白插入在eGFP N端時，eGFP和NRNl基因之間有GTGGGGSG的柔性短肽相互連接。
3.—種如權利要求2所述的攜帶Neuritin基因的II型腺相關病毒載體的構建方法，其特征在于，具體步驟如下: A)Neuritin基因的II型腺相關病毒表達載體的構建 設計并合成PCR引物如下: NRNl-正向引物如SEQ ID N0:2所示; NRNl-反向引物中SEQ ID NO:3所示; 使用PCR方法從含有如SEQ ID NO:1所示的NRNl基因cDNA克隆模板中擴增NRNl基因CDS區；將II型腺相關病毒載體和目的基因分別雙酶切，純化酶切產物后與NRNl基因PCR產物進行定向連接或重組，通過連接反應將上述酶切片段準確連接到PAOV表達載體的KpnI/ Sal I位點上，獲得pAOV-Neuritin表達載體，其產物轉化感受態細菌，對生長出的克隆進行Nrnl基因PCR鑒定，PCR鑒定為陽性的克隆，證明目的基因已經定向連入目的載體；再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和分析比對，比對正確的即為構建成功的融合蛋白表達質粒載體；將構建好的融合蛋白表達載體進行超純去內毒素抽提，鈣轉法將質粒轉入293T細胞，36-48小時后通過熒光顯微鏡觀察融合蛋白eGFP ； B)Neuritin基因的II型腺相關病毒包裝 制備包裝質粒pAAV-RC和輔助質粒pHelper，與Neuritin基因II型腺相關病毒表達載體pAOV-Neuritin-eGFP共轉染293T細胞，轉染后8小時更換為完全培養基，培養48小時后，收集富含II型腺相關病毒顆粒的細胞上清液，對其濃縮后得到高滴度的II型腺相關病毒濃縮液，感染Hela細胞后采用倍比稀釋法檢測病毒滴度。
4.一種如權利要求1或2所述的 攜帶Neuritin基因的II型腺相關病毒載體在制備治療修復視神經損傷藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬于基因工程和神經損傷技術領域，視神經損傷是許多眼部疾病和外傷，嚴重時會造成患者視神經的萎縮和失明，目前臨床實際療效不盡人意。本發明提供了一種攜帶Neuritin基因的Ⅱ型腺相關病毒及其構建方法，本發明還進一步地提供了攜帶Neuritin基因的Ⅱ型腺相關病毒在制備治療修復視神經損傷藥物中的應用。
文檔編號A61K48/00GK103224956SQ201310182950
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月17日 優先權日2013年5月17日
發明者許家軍, 曹文珞, 劉芳, 藺海燕 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學