專利名稱：在c端水解p物質的膽堿酯酶在制備速激肽拮抗劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及治療或預防體內過量速激肽介導的病癥的藥物，特別地涉及在P物質等速激肽C-端水解氨基酸殘基的膽堿酯酶在制備速激肽拮抗劑或反向激動劑中的應用。
背景技術：
速激肽(Tachykinins, TKs)是具有下述共同酰胺化羧基末端系列的一簇肽。速激肽C末端有-Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2共同結構，是一種在哺乳動物包括人體內產生的具相似藥理活性神經肽，有著多種生理功能，速激肽的名字源于它們對平滑肌組織的刺激作用。哺乳類動物的速激肽主要包括P物質(Substance P, SP),神經激肽A (Neurokinin A, NKA)和神經激肽B (Neurokinin B, NKB)三種。速激肽廣泛分布在中樞神經系統和周圍神經系統，由神經釋放,也可由非神經組織產生。速激肽受體包括NK-1，NK-2和NK-3三種類型，廣泛分布于神經系統和外周組織中，屬G蛋白共役型受體，速激肽受體cDN已被克隆。受體激活后能夠引起多種生理效應，并且在某些疾病狀態下，連激肽受體的表達和分布具有可塑性，速激肽受體拮抗劑的研制將進一步推動速激肽受體的研究并有廣泛的應用前景。速激肽受體是有7個跨膜結構的G蛋白共役型受體。速激肽與相應受體結合，激活G蛋白，G蛋白激活磷脂酶C，使二磷酸肌醇酯降解成三磷酸肌醇(Inositoltrisphosphate, IP3)和二酰甘油(DG), IP3作用于肌楽;網膜上的特異性受體,釋放細胞內貯存的Ca2 +，DG通過蛋白激酶C打開肌漿膜的L-型鈣通道，細胞內Ca2+的升高引起相應組織的生理效應[Khawaja AW, Rogers DF.Tachykinins:receptor to effector.1nt JBiochem Cell Biol,1996，28:721-738.]。以P物質(SP)為例，研究表`明，SP能以神經內分泌的方式作用于各種免疫細胞，參與免疫調節；SP還影響活化的淋巴細胞合成細胞因子，進而介導和調節免疫炎癥反應；SP對T淋巴細胞的趨化作用具有劑量依賴性和受體依賴性，在炎癥時的免疫細胞募集過程中發揮重要作用；SP影響輔助性T細胞合成細胞因子；SP及其C-端片段對中性粒細胞有啟動效應，還可延緩中性粒細胞的凋亡，表明SP在炎癥的遷延過程中起作用。另外，SP還是中性粒細胞的趨化因子，10_9mOl/L的SP可直接影響其向炎癥部位的遷移。SP可以激活肥大細胞，引起胞內Ca2+動員和細胞脫顆粒，釋放組胺。人皮膚郎格罕斯細胞表面存在豐富的SP結合位點，它們被激活后可以抑制抗原提呈過程。SP也可誘導骨髓細胞產生IL-1和IL-6。SP對其他系統的作用有:(I)神經系統，SP作為一種對靶組織起興奮作用的介質，從初級傳入終末釋放，涉及痛覺傳遞；(2)消化系統，SP具有收縮消化道平滑肌的作用，可刺激唾液分泌增加，還可促進大腸和小腸內水和電解質的分泌；(3)循環系統，SP可使血管擴張，血管通透性增加和血漿蛋白滲出，腦室內注射SP可引起大鼠平均血壓升高；(4)呼吸系統，SP神經元參與氧不足的換氣發動，使呼吸道平滑肌緊張性加強，致支氣管痙攣、肺內水腫；(5)泌尿系統，SP能使輸尿管、膀胱平滑肌收縮，使ADH釋放量增加，引起腎血流量增加、尿量增加；(6)被皮系統，人皮膚注射SP引起局部紅腫、瘙癢反應；在皮膚損傷時期，SP參與局部炎癥反應及免疫反應。綜上所述，SP不僅是一種重要的神經遞質，而且還是神經系統、內分泌系統和免疫系統共同的化學語言，是傳遞信息、調節機體反應的重要信使(參見方秀斌《神經肽與神經營養因子》42-55人民衛生出版社)。SP在各種組織中呈現出紛繁多樣的生理效應，使其受體激動劑和拮抗劑具有了廣闊的應用前景。SP的結構和活性關系密切，羧基端(C-端)的氨基酸斷裂，活性則明顯降低或消失。根據對SP不同長短的片段及各種D型氨基酸取代衍生物的活性研究，認為C端6個氨基酸為其生物活性所必需的。Duplaa等用相應的D型氨基酸分別取代SP的各個氨基酸殘基后進行的生物活性及受體結合分析發現，第6，7，8，9，11位的氨基酸殘基被D型氨基酸取代后，受體結合能力幾乎完全喪失(參見路長林等《神經肽基礎與臨床》134第二軍醫大學出版社)本領域已充分證明P物質和其它速激肽類與許多疾病的病理生理學上的廣泛聯系，例如，已證實P物質參與了疼痛或偏頭痛的傳導作用(參見《神經肽基礎與臨床》第二軍醫大學出版社(2000年 )第十七章,神經肽與痛覺調制,461頁；B.E..B.Sandberg等，Journal of Medicinal Chemistry, 25, 1009 (1982);L.Urban 等，TINS，1994，17，432-438 ;Seguin等，Pain,1995，61，326-343 ;S.H.Buck,1994,“The Tachykinin Receptors”，HumanaPress, Totowa,N.J.)，也與中樞神經系統疾病(如焦慮和精神分裂癥)有關(見C.A.Maggi等Autonomic Pharmacol.，1993,13, 23-93 ;Μ.0tsuka 和 K.Yoshioka Physiol.Rev.1993,73,229-308)，與呼吸系統疾病(如氣喘)有關(見 J.Mizrahi 等 Pharmacology，1982，25，39-50 ；C.Advenier 等，Eur.Reespir.J., 1997, 10,1892-1906 ；C.Advenier 和 X.Emonds-Alt,Pulmonary Pharmacol.，1996，9，329-333)，還與過敏及炎癥有關(見 S.H.Buck, 1994，“TheTachykinin Receptors”),還與風濕病(如肌風濕病)、以及胃腸紊亂和胃腸道疾病(如潰瘍性結腸炎和節段性回腸炎)等有關(見P.Holzer和U.Holzer-Petsche, Pharmacol.Ther.,1997，73，173-217 和 219-263 及參見 D.Regoli 的文章，載于 F.Sicuteri 等人編的“Trendsin Cluster Headache” 一書第 85—95 頁，此書由阿姆斯特丹市 Elsevier ScientificPublishers 出版,1987 年)。由于P物質等速激肽與許多疾病的病理生理學上的廣泛聯系和作用，這使速激肽受體拮抗劑具有了廣闊的應用前景。提供拮抗P物質等速激肽的藥物組合物，文獻作了許多報告，例如:中國專利 CN02131556.6，CN94194790.4，CN94195008.5，CN95194416.9，CN96123888.7，CN95195280.8，CN94192362.2，CN93114371.3，CN93100018.1，CN99810915.0,CN99810017.X 及美國專利 US6521621, US6329394, US6197772, US5939433 等。它們的共同特點是提供了速激肽受體亞型的特異性受體拮抗劑，均為化學合成物質。美國專利6，709，651提供了一種有選擇地在Xaa-Pro位點裂解多肽的肽酶用作P物質的拮抗劑，作用機理為裂解P物質專一性受體結合位點而拮抗P物質作用。膽堿酯酶(Cholinesterase)是一類糖蛋白，以多種同工酶形式存在于體內。一般可分為乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase)和丁酰膽堿酯酶(Butylcholinesterase)。乙酰膽堿酯酶(EC3.1.1.7) (AChE)也稱真性膽堿酯酶，主要存在于膽堿能神經末梢突觸間隙，特別是運動神經終板突觸后膜的皺摺中聚集較多；也存在于膽堿能神經元內和紅細胞中。此酶對于生理濃度的Ach作用最強，特異性也較高。丁酰膽堿酯酶(EC3.1.1.8)(BChE)也稱血清膽堿酯酶、擬膽堿酯酶或非特異膽堿酯酶，廣泛存在于神經膠質細胞、血漿、肝、腎、腸中，對Ach的特異性較低，丁酰膽堿酯酶可水解其他膽堿酯類，如琥珀膽堿。文獻中未見將膽堿酯酶用于制備速激肽受體拮抗劑的報道。
發明內容
本發明的目的是提供膽堿酯酶的一個新用途，特別是能夠在C端水解P物質的膽堿酯酶在制備速激肽拮抗劑中的應用。本發明的一個方面，提供在C端水解P物質的膽堿酯酶在制備速激肽拮抗劑或反向激動劑中的應用。本發明的一個方面，提供在C端水解P物質的膽堿酯酶在制備治療或預防哺乳動物包括人的由速激肽介導的病癥的藥物中的應用，所述的病癥包括:疼痛、炎癥、中樞神經系統疾病、呼吸系統疾病、胃腸紊亂和胃腸道疾病、過敏、神經病理學疾病、與免疫增進或抑制有關的疾病以及風濕病、皮膚病和慢性疲勞綜合癥。所述的膽堿酯酶為單體或混合物。在一個優選方案中，所述的膽堿酯酶選自:乙酰膽堿酯酶；丁酰膽堿酯酶；乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶的同工酶及衍生物；乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶的基因重組物。
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在一個優選方案中，其中所述膽堿酯酶是從動植物組織或血液提取純化或通過基因重組從表達載體分離純化得到的、在以乙酰膽堿或丁酰膽堿為底物檢測出具有膽堿酯酶活性的非均一狀態的粗提物。在一個優選方案中，其中所述膽堿酯酶劑量范圍為0.01微克至I毫克。本發明的另一個方面，提供一種拮抗哺乳動物體內速激肽作用的藥物組合物，它包括速激肽拮抗有效量的上述膽堿酯酶，膽堿酯酶可以是單體也可以是混合物。本發明的另一個方面，提供一種拮抗哺乳動物體內速激肽作用的藥物制劑，它包括上述的藥物組合物和藥學上可接受的賦形劑。本發明的另一個方面，包括將藥學上可接受的賦形劑與上述的藥物組合物混合均勻。本發明的另一個方面，提供一種化妝品或改善皮膚癥狀的皮膚護理用品組合物，它包括上述膽堿酯酶及皮膚學上可接受的皮膚護理用載體或賦形劑。本發明基于這樣一個理念，利用膽堿酯酶或其同工酶首先在C-端Leu - Met位點水解氨基酸殘基，繼而多位點水解C-端肽鏈，可以給予體內存在非正常高水平P物質等速激肽的病人，用于治療或預防他們的疾病及失調癥狀。膽堿酯酶首先將P物質C-端的Met11殘基解離，繼而多位點水解C-端肽鏈，由此產生的P物質的I一 10肽段、或I一9、I一7、I一5肽段，不再具有受體激活或受體結合的效能。在這里，膽堿酯酶通過降低原肽的效能水平，扮演了 “反向激活或拮抗劑”的角色。它們可以全身或局部地用于治療或預防依照文獻報道的用P物質拮抗劑、速激肽拮抗劑或速激肽受體拮抗劑治療的任何病癥。更進一步地說，本發明提供包含膽堿酯酶或其同工酶在內的藥物組合物，其首先在C-端多位點水解包括P物質在內的速激肽C-端肽鏈，使P物質等速激肽失去藥理生物活性或受體結合能力，起到反向激活或速激肽拮抗劑的作用。通過降低P物質等速激肽介導的免疫調節作用或降低P物質等速激肽介導的神經傳導作用，可用于治療或預防包括P物質在內的速激肽或速激肽受體介導的疾病。治療是給予病人治療有效量的上述藥物組合物。由于根據本發明的藥物組合物通過降解速激肽而具有反向激活或拮抗速激肽作用，尤其是通過降解P物質而拮抗P物質的作用，它們適用于醫用，尤其是由速激肽介導的哺乳動物包括人的病癥的預防和治療，例如，用作但不限于:止痛劑，尤其是治療如手術后或運動創傷引起的疼痛；臂神經叢痛；骨關節炎或風濕性關節炎引起的慢性疼痛；偏頭痛；皰疹后神經痛，脈間、外周神經痛，糖尿病神經痛，化療及AIDS導致的神經痛；幻痛；牙痛；癌痛；痛經，月經痛；坐骨神經或椎間盤下墜引起的疼痛；痛風；與瘢痕或癢疹有關的皮膚疼痛；神經或血管受壓以及肌肉受損引起的周邊疼痛如頸椎疼痛、肩肘疼痛。抗炎劑，尤其是治療哮喘、流感、支氣管炎(特別是C0PD)、咳嗽、變態反應、支氣管痙攣；風濕性關節炎、類風濕性關節炎、骨關節炎；胃腸系統炎癥如:克隆病、節段性回腸炎、潰瘍性結腸炎、感染引起的胃腸失調；膀胱炎。治療過敏癥，尤其是風疹等皮膚過敏、接觸性皮炎和鼻炎。治療中樞神經系統疾病，尤其是焦慮、抑郁癥、精神分裂癥、躁狂抑郁性精神病、性功能障礙、癡呆、與壓力相關的障礙、睡眠障礙、認知障礙、情感障礙、分裂情感性障礙、飲食障礙、神經病變性障礙、嗜癮性障礙、人格障礙、消沉、藥物依賴、恐慌以及其他與CNS相關的病癥。治療急性或延遲預期的惡心和嘔吐，如化療、透析、毒素、眩暈、高海拔、消化不良、胃弱等引起的惡心和嘔吐。 治療胃腸系統疾病，如腸應激綜合癥(IBS)、腹瀉、分泌過多、胃炎、大便失禁、食物過敏。治療皮膚病變，如牛皮癬、異位性皮炎、蕁麻疹、瘙癢癥和斑尤其是曬斑。治療血管痙攣疾病，纖維組織與膠原疾病，與免疫加強或抑制相關的病變，以及風濕病與體重控制。治療高血壓，中風，癲癇，頭部創傷，脊髓創傷，缺血性神經損傷如由中風或血管閉塞(如在開心手術中)引起的中樞缺血性損傷，興奮毒性神經損傷(如中風癲癇中)和肌萎縮性側索硬化。治療慢性疲勞綜合癥。由于在C端水解P物質的膽堿酯酶在體內能迅速滅活組織及體液中的前炎癥因子一速激肽，不僅可以限制在高水平免疫過程中的炎癥過度，也可以限制在免疫低下時出現的過劇炎癥反應，還可以限制在免疫恢復過程中出現的局部與全身性炎癥反應綜合癥，而所有的癌癥、AIDS及器官移植者都有免疫低下。另外癌癥病人身體除受癌癥本身的損害夕卜，更多的受到的是癌癥引發的身體其它部位的炎性病變、化療放療造成的副作用以及治療用藥造成的免疫低下所引發的炎癥反應，它們對癌癥病人的生命期及生存質量，起著舉足輕重的作用。使用本發明的藥物組合物對這類病癥患者是有益的。
由于在C端水解P物質的膽堿酯酶在體內能迅速滅活組織及體液中的傳遞信息、調節機體反應的重要信使一速激肽，當機體因感染受到外來全新抗原如SARS病毒、禽流感病毒及暴發型流感的侵襲時，某些情況下有可能產生過激反應，導致病情急劇變化甚至死亡，以及諸如此類因感染引發的過劇免疫反應的預防和治療，使用本發明的藥物組合物，相信對這類病癥患者是有益的。本發明的組合物可以用作化妝品或皮膚護理用品，尤其是作為用于抑制由P物質誘導的來自肥大細胞的組胺釋放的試劑的用途。膽堿酯酶由于來源不同及純化手段不同，其比活力差異巨大，每毫克蛋白從幾十單位到幾萬單位不等，它們均可為本發明所利用。如折算酶比活力為1000單位(U)/毫克蛋白的干物質，本發明的治療有效量的劑量范圍為0.001微克至I毫克，優選的劑量范圍為0.01微克至I毫克。本發明的制劑，通常以藥物組合物配制成水溶液劑、凍干粉或凍干粉復溶劑的形式使用。本發明提供在C端水解P物質的膽堿酯酶治療包括P物質在內的速激肽介導的病癥的用途及其藥物組合物和制劑，可以治療或預防多種疾病。為由于體內過量P物質等速激肽引發病理生理變化的人群，提供一種有效的、副作用小的治療手段。由于本發明的膽堿酯酶可以是乙酰膽堿酯酶、或丁酰膽堿酯酶及它們的同工酶、或它們的衍生物，它們可以來源于動物的細胞、組織或血液，也可以來源于植物及通過基因重組的方法得到，來源廣泛，而且不需要高度提純，適宜產業化。
圖1-圖5分別為含鐵離子丁酰膽堿酯酶水溶液水解SP反應0、25、60、120、180分鐘時取樣質譜分析的質譜圖。圖6-圖9分別為丁酰膽堿酯酶雙蒸水溶液水解SP反應0、25、60、180分鐘時取樣質譜分析的質譜圖。圖10-圖15分別為乙酰膽堿酯酶水解SP反應0、2、4、6、8和30分鐘時取樣分析的質譜圖。
具體實施例方式本發明的制藥應用中，使用的膽堿酯酶優選自:乙酰膽堿酯酶，丁酰膽堿酯酶，乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶的同工酶及衍生物，乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶的基因重組物。使用的膽堿酯酶可以是單體，也可以是混合物。它們的來源及提取純化的技術，是本領域人員公知的，不同來源的膽堿酯酶，原料中的含量各不相同，收率差異巨大，因而出現不同來源的產品，如從蒼蠅頭部、電鰻、牛血清及動物血液等提取的膽堿酯酶，利用果蠅基因重組的膽堿酯酶(參考專利公開CN1472316，CN1727487)等。如專利公開CN1472316中提到一種用于果蔬中農藥殘留量測定的乙酰膽堿酯酶的制備方法，以動物血液為酶源，其工藝步驟包括從酶源中提取乙 酰膽堿酯酶粗提液，以及用硫酸銨沉淀法純化乙酰膽堿酯酶和用透析法脫硫酸銨，再將酶液濃縮，干燥，即得已純化的乙酰膽堿酯酶制品。這里所稱‘已純化’，是一種習慣的說法，即已把酶提純到一恒定的比活，大多數的酶都需要進一步的純化。本發明使用的膽堿酯酶或其同工酶，只需要純化到一恒定的比活，在以乙酰膽堿或丁酰膽堿為底物檢測出具有膽堿酯酶活性的情況下，就滿足本發明的制藥應用。本發明使用的膽堿酯酶也可以從市場購得。本發明的藥物組合物，雖然不想受任何特定理論的限制，由于它們的藥理活性可用作速激肽拮抗劑，尤其是用作P物質和神經激肽A神經激肽B以及類似物質的拮抗劑，本發明的目標之一是提供新的有用的速激肽拮抗劑，尤其是提供P物質和神經激肽A神經激肽B的拮抗劑。相信本發明的藥物組合物通過首先在C端Leu-Met位點繼而在C-端多位點水解P物質等速激肽使P物質等速激肽失去藥理生物活性或受體結合能力，降低P物質等速激肽介導的免疫調節或神經傳導發揮作用，使與疼痛、炎癥、中樞神經系統疾病(如抑郁、焦慮和精神分裂癥)、呼吸系統疾病(如氣喘)、胃腸紊亂和胃腸道疾病(如腸易激綜合癥和潰瘍性結腸炎)、過敏、神經病理學疾病、與免疫增進或抑制有關的疾病以及風濕病、皮膚病和慢性疲勞綜合癥得到緩解。本發明的進一步的目標是提供一種藥物制劑，該藥物制劑含有膽堿酯酶或它們的同工酶，或它們的衍生物，用于預防和治療病人需要用它們來治療的各種疾病。本發明也涉及治療或預防哺乳動物包括人體內下列病癥的方法，該方法包含對所說哺乳動物包括人治療或預防這類疾病給予治療有效量的本發明的藥物組合物。其治療或預防是通過在C端多位點水解P物質等速激肽使P物質等速激肽失去藥理生物活性或受體結合能力，降低P物質等速激肽介導的免疫調節作用或神經傳導作用而實現或促進實現的。不過，應理解到本發明不受任何用來解釋最后應用的效力的理論或假定的機理的限制。由于本發明的藥物組合物是速激肽拮抗劑，所以它們在治療與速激肽有關的病癥中有潛在的用途，包括但不限于:疼痛、炎癥、中樞神經系統疾病(如抑郁、焦慮和精神分裂癥)、呼吸系統疾病(如氣喘)、胃腸紊亂和胃腸道疾病(如腸易激綜合癥和潰瘍性結腸炎)、過敏、神經病理學疾病、與免疫增進或抑制有關的疾病以及風濕病、皮膚病、慢性疲勞綜合癥。具體地說 ，本發明藥物組合物可用于疼痛的治療或預防，包括但不限于創傷疼痛如手術后疼痛；創傷撕裂疼痛如臂神經叢；慢性疼痛例如發生在關節炎、風濕性關節炎、骨關節炎、類風濕性或銀屑病性關節炎的關節痛；神經性疼痛如帶狀疤疹后神經痛、三叉神經痛、節段性或脈間神經痛、纖維肌痛、灼痛、末梢神經病變、糖尿病性神經病變、化學療法誘發的神經病變引起的痛、枕神經痛、膝狀神經痛、舌咽神經痛、交感反射性營養不良及幻肢痛；各種形式的頭痛如偏頭痛、急性或慢性緊張頭痛、及叢集性頭痛；牙痛；癌癥痛；內臟痛；胃腸痛；神經受壓性痛；運動傷害痛；經痛；月經痛；腦膜炎、蛛網膜炎引起的痛；肌肉骨骼痛；下背痛如脊狹窄、脫盤、坐骨神經痛、咽痛、關節強直性脊推炎痛；痛風；灼傷；疤痕、癢疹痛；頸椎痛；肩肘痛；及丘腦痛例如中風后的丘腦痛。具體地說，本發明藥物組合物也可用于炎癥的治療或預防，包括但不限于哮喘、流行性感冒、慢性支氣管炎及風濕性關節炎中的炎癥；胃腸道炎癥例如但不限于克羅恩氏癥、潰瘍性結腸炎、大腸炎、胃炎及非留體抗炎藥誘發的傷害；皮膚炎癥例如皰疹及濕疹；膀胱炎癥例如膀胱炎及欲望性尿失禁；及眼和牙齒發炎。具體地講，本發明藥物組合物也可用于過敏性障礙的治療或預防，包括但不限于皮膚過敏性障礙例如但不限于風疹；及氣道過敏性障礙例如但不限于鼻炎。具體地說，本發明藥物組合物可用于治療或預防由多種原因造成的精神分裂癥，包括狂躁型、抑郁型、混合型的精神分裂癥；妄想型、錯亂型、緊張型、混合型及殘留型精神分裂癥；精神分裂癥樣的疾病；妄想型精神病；短暫的精神病疾病；感應性精神病；物質誘發的精神病及無特別確定的精神病。具體地講，本發明藥物組合物可用于包括(但不限于)重性抑郁癥的治療或預防，包括兩極性抑郁；單極性抑郁；有或無精神病特征、緊張性特征、憂郁性特征、非典型特征或產后發作的一次性或周期性重性抑郁癥，以及在周期性發作情況下，有或無季節性模式。其他包括在術語“重性抑郁障礙”范圍內的情緒障礙包括早期或晚期發作的及有或無非典型特征的心情惡劣障礙、循環性精神障礙、周期性短暫抑郁障礙、混合型情感障礙、神經性抑郁、創傷后應力障礙及社交恐懼癥；有抑郁情緒的血管障礙癡呆；物質誘發的情緒障礙，如由酒精、可卡因、迷幻劑、鴉片、鎮靜劑、催眠藥、抗焦慮劑及其他物質引起的情緒障礙；抑郁型精神分裂癥 ；及具有抑郁情緒的適應性障礙。具體地說，本發明藥物組合物可用于焦慮癥的治療或預防，包括但不限于恐慌發作；廣場恐怖；特定的恐懼癥；社交恐懼癥；強迫性神經失調；創傷后應激障礙；急性應激障礙；一般性焦慮癥；由于全身健康情況的焦慮癥；物質誘發的焦慮癥；及無特別確定的焦慮癥。具體地講，本發明藥物組合物用于與抑郁和/或焦慮有關的應激相關障礙的治療或預防，包括但不限于急性應激反應；適應性障礙，如短暫抑郁反應、延長抑郁反應、混合型焦慮和抑郁反應、顯著干擾其他情緒的適應性障礙、帶有顯著干擾行為的適應性障礙、帶有混合干擾情緒和行為的適應性障礙、具有其他特定顯著癥狀的適應性障礙；及對嚴重應激的其他反應。具體地講，本發明藥物組合物可用于睡眠障礙的治療或預防，包括但不限于作為主要睡眠障礙的和/或深眠狀態；失眠；睡眠呼吸暫停；嗜眠發作；生理節奏失調；與其他精神失調相關的睡眠障礙；及物質誘發的睡眠障礙。具體地講，本發明藥物組合物可用于認知障礙的治療或預防，包括但不限于癡呆癥；健忘癥及無特別確定的認知障礙，尤其是由退化障礙、損傷、創傷、感染、血管疾病、毒物、缺氧、維生素缺乏或內分泌失調引起的癡呆癥；退化障礙、血管疾病或其他原因造成的健忘癥。此外，本發明藥物組合物也可用于無認知和/或記憶缺陷的健康人的記憶和/或認知的提高。具體地說，本發明藥物組合物可用于個性障礙的治療或預防，包括但不限于妄想狂個性障礙；精神分裂個性障礙；精神分裂型個性障礙；反社會個性障礙；邊緣型個性障礙；自戀型個性障礙；回避性個性障礙；依賴性個性障礙；強迫觀念與強迫行為性個性障礙及無特別確定的個性障礙。具體地說，本發明藥物組合物也可用于飲食障礙的治療或預防，包括但不限于神經性厭食；非典型神經性厭食；神經性貪食；非典型神經性貪食；與其他心理干擾相關的過度飲食；與其他心理干擾相關的嘔吐及不確定的飲食障礙。具體地說，本發明藥物組合物也可用于神經變性疾病的治療或預防，包括但不限于慢性舞蹈病；脫髓鞘障礙；其他神經病和神經痛；多發性硬化；肌萎縮性側索硬化；中風及頭創傷。具體地講，本發明藥物組合物也可用于上癮障礙的治療或預防，包括但不限于有或無生理依賴的物質依賴或濫用，特別是當物質是酒精、安非他明、安非他明樣物質、咖啡因、可卡因、迷幻劑、吸入劑、尼古丁、鴉片(如大麻、海洛因及嗎啡)、苯環己派吮、苯環己呱吮樣藥物組合物、鎮靜劑一催眠藥、苯并二氮雜草和/或其他物質，具體是用于治療戒除上述物質和酒精以及戒除妄想。具體地說，本發明藥物組合物也可用于情緒障礙的治療或預防，特別是由酒精、安非他明、咖啡因、大麻、可卡因、迷幻劑、吸入劑、尼古丁、鴉片、苯環己派吮、鎮靜劑、催眠藥、杭焦慮藥及其他物質弓I起的情緒障礙。具體地講，本發明藥物組合物也可用于性功能障礙的治療或預防，包括但不限于性欲失調；性勃起障礙；性高潮障礙；性交疼痛障礙；由于一般醫學疾病引起的性功能障礙；物質引起的性功能障礙及不確定的性功能障礙。具體地說，本發明藥物組合物也可用于嘔吐的治療或預防，即反胃、干嘔及嘔吐，包括但不限于急性嘔吐、延遲性嘔吐及預期性嘔吐；藥物例如癌癥化學療法藥劑誘發的嘔吐；放射嘔吐；放射治療，例如癌癥的治療；毒藥；毒素(例如由代謝失調或感染例如胃炎造成的毒素，或在細菌性或病毒性胃腸感染期間釋放的毒素)；懷孕；前庭障礙(例如暈動病、眩暈、頭暈及美尼爾氏癥)；手術后暈；胃腸阻塞；降低的胃腸蠕動；增加的顱內壓；降低的顱內壓(例如高山反應)；鴉片類止痛藥(例如嗎啡)；胃一食管回流癥；酸性消化不良；食物或飲料過度放縱；胃酸；反胃；胃灼熱坡胃；胃灼熱(例如發作性胃灼熱、夜間性胃灼熱及食物誘發的胃灼熱)；及消化不良。具體地說，本發明藥物組合物也可用于皮膚病的治療或預防，包括但不限于皮癬、皮疹、牛皮癬、瘙癢癥、蟲叮咬、斑尤其是曬斑。具體地說，本發明藥物組合物也可用于與免疫增進或抑制有關的疾病的治療或預防，包括但不限于類風濕性關節炎、克隆病、糖尿病、紅斑狼瘡及排異反應。具體地說，本發明藥物組合物也可用于治療或預防風濕病、高血壓、水腫、慢性疲
勞綜合癥。本發明藥物組合物可用于制造治療或預防精神分裂癥、嘔吐、焦慮、抑郁、腸應激綜合癥、生理節律紊亂、疼痛、神經性炎癥、哮喘、風濕性炎癥、感染引起的炎癥、過敏及痛覺的藥物。本發明的膽堿酯酶也可用于化妝品或皮膚護理用品，如祛斑、止癢、防止瘢痕增生。改善皮膚癥狀包括:皮膚炎癥、潰瘍、糜爛、斑疹、斑丘疹、丘疹、皰疹、風疹、紅斑、紅腫、水腫、水皰、膿皰、水痘、結痂、疣、丹毒、疔、癤、癰、疥瘡、皮炎、皮膚病、毛囊炎、角質壞死、風團、過敏、創傷、燒燙傷、瘙癢、疼痛、蟲叮咬、疤痕、口腔潰瘍、口腔異味、面部泛黃、無光澤、松弛、面部皺紋、毛孔粗大、粉刺、痤瘡、色斑、紅血絲、曬傷、劃傷、皮膚敏感以及醫療或美容手術傷口。具體地說，本發明的化妝品或皮膚護理組合物的應用，主要用于治療或改善皮膚癥狀和日常美容皮膚的護理，以及問題皮膚的護理，這些問題皮膚可由各種原因產生，如碰傷、擦傷、運動傷、戰傷、極端溫度、紫外線、藥源、化妝品及疾病、免疫反應、微生物感染等。微生物感染包括:細菌、真菌、病毒、放線菌、螺旋體、衣原體、立克次體感染。具體地說，本發明的化妝品或皮膚護理組合物可以使用任何方法施用，如涂抹、噴灑或其他類似方法施于皮膚、毛發、口唇 粘膜、和外生殖道.等人體表面任何部位。.
具體地說，本發明的化妝品或皮膚護理組合物可以是任意劑型，包括但不限于凍干粉劑、水劑、膏劑、霜劑、乳劑、噴劑、水凝膠劑、軟膠囊劑。在本發明的一個實施例中，使用了凍干粉劑，即將經過過濾初步純化比活恒定的膽堿酯酶凍干，分裝西林瓶或安瓿瓶，在儲運、分銷及用戶保存階段均冷凍。使用時以純凈水稀釋，根據不同用途稀釋不同倍數，單獨使用。需要分多次使用時可冷藏保存。或加入其它組分例如營養物質、中草藥等使用。具體地說，本發明的膽堿酯酶，其水溶液，還可直接或在加入賦型劑后加入到皮膚學上可接受的載體，包括但不限于:敷料、消毒巾、紗布、海綿、明膠海綿、衛生巾、避孕套等，用于創傷、燒燙傷、灼傷、曬傷、褥瘡、皸裂及醫療手術、美容手術等受損皮膚的護理和修復，消除其已存在的疼痛及預防活動中可能引起的皮膚疼痛如性交疼痛。方法是將膽堿酯酶溶液預先或現場加入到上述載體中。具體地說，本發明的膽堿酯酶，其水溶液，還可加入到日用化工品中作為活性成分使用，如牙膏、口腔清潔劑、花露水、沐浴露等。這里描述的被治療的疾病在文獻中都是已知的，并進行過評價。還應認識到，有經驗的專業人員使用有效量的膽堿酯酶，對正受疾病折磨的病人進行治療或預防，可以產生影響。這里使用的“病人”一詞是指處于特殊的炎癥狀態的包括人在內的哺乳動物。這里使用的“治療有效量”一詞是指能夠有效地控制與炎癥、疼痛、及中樞神經系統有關的病情。比如治療偏頭痛時，治療有效量應該是足以減輕頭痛或病人的不舒服感的劑量。通過文獻已知的傾向性診斷，即使用常規技術并觀察在類似循環下得到的結果，很容易確定治療有效量。在確定治療的有效量時，通過傾向性診斷考慮一系列因素，包括動物的種，大小，年齡，一般健康狀況，疾病類別，疾病的嚴重程度或深度或廣度，個體響應情況，服用的特定藥物組合物，服藥模式，制劑的生物活性特點，選擇的劑量規則，使用的輔加劑，以及別的有關情形，當然不僅僅限于這些。當使用酶比活力為1，000U/毫克蛋白質的膽堿酯酶時，治療有效量為0.01 μ g-lmg,優選0.1 μ g_lmg,最佳量可由有經驗的專家確定。為了對患有上述病情的病人進行有效的治療，可以用任何能使膽堿酯酶在治療治療有效量內被利用的劑型服用膽堿酯酶，包括注射，吸入、黏膜吸收或局部給藥。例如，膽堿酯酶可以以氣霧劑、噴霧劑或干粉形式吸入，皮下注射，肌肉注射，靜脈注射，電極給藥，鼻內給藥，直腸給藥，陰道給 藥，透皮或粘膜給藥，局部給藥，例如體表涂敷，以及類似的給藥途徑服用。對于呼吸道疾病，例如哮喘，一般提倡吸入給藥如對鼻腔或呼吸道使用氣霧劑或噴霧劑，噴霧裝置可附加發熱機構，使水溶液有35°C至45°C溫度，更有利于提高酶的活性；對于中樞神經系統疾病以及慢性疲勞綜合癥等，除了傳統給藥方式，對于本發明的膽堿酯酶，可以以水溶液的形式通過口腔粘膜給藥，如將酶水溶液含于口腔并保留一段時間，以促進吸收。還可以以酶水溶液同木聚糖或木糖醇混合為流質，封裝于軟膠囊，用時咬破，含于口中；對于創傷、體表疼痛，一般以噴霧劑、凝膠劑、貼劑、透皮吸收劑等在疼痛部位直接施用，或以水溶液劑在疼痛部位作皮內、皮下或關節腔注射；對于腸道或陰道疾病，可以適宜的載體浸有膽堿酯酶水溶液，塞入肛門或陰道。藥劑專家，根據服用的藥物組合物的特型，被治療的疾病的情形和狀況，疾病的發展階段，以及其它相關的情形，可以很容易地選擇合適的劑型和給藥模式。本發明的膽堿酯酶可以單獨給藥，也可與其它可以藥用的載體或賦形劑一塊以藥物組合物的形式給藥，組合物中的比例和性質由選擇的藥物組合物的溶解度和化學性質，選擇的給藥途徑，以及標準的制藥實踐決定。本發明的膽堿酯酶，可以以單體給藥，也可以以混合物給藥。在另一個具體例中，本發明還提供了包括治療有效量的膽堿酯酶與一種或多種可以藥用的載體或賦形劑混合或聯合的藥物組合物。該藥物組合物按照藥學文獻中的已知方法制備。使用的載體或賦形劑可以是固體、半固體或液體物料，這些物料作為活性成分的載體或介質起作用。適宜的載體或賦形劑為文獻已知。該藥物組合物適合于局部給藥，也適合于全身給藥，包括口服、吸入和非腸道給藥，并可以采用膠囊、氣霧劑、噴霧劑、吸入劑、栓劑、凝膠劑、溶液劑、懸浮劑以及類似的劑型給藥。本發明的藥物組合物可以口服給藥，例如與可使用的載體一塊服用。它們可裝入膠囊或為了達到治療的目的，這類藥物組合物可以與賦形劑配方，以膠囊，懸浮劑，糖漿劑，薄荷糖，口香糖，木糖醇口含片等類似的劑型使用。這些制劑中至少應含千萬分之一酶比活力折算為1，000的本發明的酶為活性組分，不過根據特定的劑型，活性成分的含量可以在單位劑型的含量10%至100%之間變化。本發明的酶在組合物中的含量應以能夠獲得適合的劑量為宜。本發明的優選的組合物和制劑由專業人員確定。為了達到非腸道給藥的目的，本發明的藥物組合物可制成溶液或懸浮劑。本發明的藥物組合物亦可以吸入劑，例如氣霧劑或干粉的形態使用，通過液化氣或壓縮氣或泵系統可以釋放本發明的藥物組合物。用于吸入給藥的優選的氣霧劑和干粉劑型可由專業人員確定。本發明的藥物組合物還可以局部給藥，這樣給藥時可以適宜地包括溶液、糖類、脂質體等賦形劑。非腸道制劑可以放入安瓿中，可分散的注射器中或玻璃或塑料制作的多次劑量的小瓶中。為更好地理解本發明的實質，以下用生物化學實驗來說明膽堿酯酶水解P物質在內的速激肽的活性，用藥理實驗來說明膽堿酯酶的制藥用途。應該明白，這些實施例僅用于說明本發明而不是限制本發明。實施例1水解SP試驗用市場上用作酶抑制法檢測農藥殘留的丁酰膽堿酯酶和乙酰膽堿酯酶分別做水解P物質試驗。反應及檢測條件:一.所用膽堿酯酶:(I) 丁酰膽堿酯酶，比活力200U干粉50mg以5ml含鐵離子水(F3+含量lmg/L)溶解，10000轉離心4分鐘；(2) 丁酰膽堿酯酶，比活力`200U，50mg以5ml雙蒸水溶解，10000轉離心4分鐘；(3)乙酰膽堿酯酶，比活力300U，20mg以Iml雙蒸水溶解，10000轉離心4分鐘。二.底物SP純度98%，水溶液濃度0.5ug/ml。三.反應底物+酶100ul+100ul，反應初始溫度22°C。四.檢測飛行質譜法，基質CHCA+反應物，lul+lul，混合直接進行質譜測定。參考圖1 圖5，分別為含鐵離子丁酰膽堿酯酶水溶液水解SP反應0、25、60、120、180分鐘時取樣質譜分析的質譜圖。由質譜圖可以看出，在25分鐘時檢測到分子量為1217的產物，其為SP (分子量1348)肽鏈被切去Met (分子量131)的片斷，在60分鐘時檢測到新增產物分別是分子量為1104及分子量為900的兩個片斷，他們分別是SP肽鏈被切去了Met+Leu (分子量 113)和 Met+Leu+Gly (分子量 57)+Phe (分子量 147)。參考圖6 圖9，分別為丁酰膽堿酯酶雙蒸水溶液水解SP反應0、25、60、180分鐘時取樣質譜分析的質譜圖。由質譜圖可以看出，在25分鐘出現分子量分別為1217、1104產物，它們分別是SP肽鏈(分子量1348)被切去Met (分子量131)、Met+Leu (分子量113)的片段。圖8與圖3中圖譜相似，只是前者中分子量為1104的產物稍多。參考圖10-圖15，分別為乙酰膽堿酯酶水解SP反應0、2、4、6、8和30分鐘時取樣分析的質譜圖。底物SP在乙酰膽堿酯酶的作用下，位于C端的Metll迅速地被水解，最先出現的酶切點是Leuic1-Met11,其后是Gly9-1euici; Phe7-Phe8,最后只留下I —5妝段。由此，確定無論是乙酰膽堿酯酶還是丁酰膽堿酯酶，均具有水解P物質的能力，且第一酶切點均在SP的C端的Leuw和Met11之間；其后的酶切點在Gly9和Leuui和Phe7Phe8之以及Gln5Gln6之間。而我們知道，SP的C端六個氨基酸中任何一個氨基酸被置換或被切去，SP的活性都基本喪失。實施例2制備乙酰膽堿酯酶水溶液采用SIGMA公司生產的乙酰膽堿酯酶凍干粉，加水溶解，同時加入穩定劑丙二醇、抗菌劑苯酚，按照每毫升溶液含乙酰膽堿酯酶酶活力從10到1000U/毫克蛋白質分若干數量級，根據使用方式，分別裝入一次性注射器、噴霧瓶或其它可醫用的小瓶，冷藏保存。存期可達I年，用時可直接 施用或按治療要求再稀釋。活力測定:1、理論依據:依據Ellman法碘化硫代乙酰膽堿(BTCI)在膽堿酯酶(AChE)作用下，被水解成硫代膽堿和乙酸，硫代膽堿可與二硫對硝基苯甲酸(DTNB)反應生成黃色產物，該產物在紫外波長405nm處有最大吸收峰，因此可在此波長下進行比色測定。2、試劑配制:a磷酸緩沖液:用0.lmol/L的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉溶液以適當比例混合，pH8.0。b膽堿酯酶液:根據酶活性情況按要求用磷酸緩沖液溶解，A值控制在0.4 0.8之間。c碘化硫代乙酰膽堿(BTCI)溶液:取IOOmg BTCI溶于IOml上述pH8.0磷酸緩沖液中。d 二硫對硝基苯甲酸(DTNB)溶液:取60mg DTNB溶于IOml上述磷酸緩沖液中。3、測定步驟:取A、B兩支試管，分別加入0.lmol/L.pH8.0磷酸緩沖液3.0ml,加入膽堿酯酶酶液50 μ I和二硫對硝基苯甲酸(DTNB)溶液50 μ 1，置于37C水浴中保溫15min后于A試管中加入0.1mp I/LPH8.0磷酸緩沖液50 μ 1，作為標準調零；Β試管加入50 μ I碘化硫代乙酰膽堿(BTCI)溶液，混勻后立即倒入玻璃比色杯中比色，記錄3分鐘前后的OD值，每一酶液重復測定三次，取平均值(A0D412)進行分析。酶活力為U=A0D412/0.0136*T，其中T為反應時間，Τ=3(分鐘)。酶粉中的蛋白含量，可參照Bradford考馬斯亮藍G-250 (CBBG-250)染色法測定。酶比活力=酶活力(U)/毫克蛋白質。實施例3水溶液劑2水溶液I加入丙二醇5%、月桂氮卓酮0.5%作為促滲劑，配合離子導入法或超聲波法等透皮吸收方法，作皮外使用。實施例4水溶液甘油劑按照水溶液I的配置方法，將其中的部分水置換為甘油，甘油所占比重可從20%到70%不等，制成不同使用場合的劑型，分別裝入小瓶，冷藏或常溫保存。常溫可保存6個月。實施例5水凝膠劑聚丙烯酸即卡波姆0.8%，甘油23%，兩者充分研磨使濕潤，加水適量，按水溶液I的配置比例加入酶粉，慢速攪拌均勻即可。主要用于皮膚涂敷。實施例6對小鼠醋酸扭體法的鎮痛作用實驗
(一)材料和試劑1.藥品:醋酸，由廣東新寧化工廠生產；按照實施例2中的方法制得的每毫升溶液含酶活力200U的丁酰膽堿酯酶水溶液；芬必得檫劑(布洛芬)，由中美史克生產，產品批號:04050471o2.動物:昆明小鼠，40只，體重20 ± 2克，雌雄兼用。(二)方法1.分組:生理鹽水組(陰性對照組)；實驗I組，用丁酰膽堿酯酶水溶液涂藥實驗2組，用丁酰膽堿酯酶水溶液腹腔注射芬必得組(陽性對照組)2.實驗操作:將40只昆明小鼠隨機分組，每組10只；陰性對照組腹腔注射0.9%生理鹽水0.lml/10g ;實驗I組先在背部剪毛，剪成lxlcm，并涂每毫升溶液含酶活力200U 丁酰膽堿酯酶水溶液；實驗2組腹腔注射每毫升溶液含酶活力200U 丁酰膽堿酯酶水溶液0.lml/10g ;陽性對照組先在背部剪毛，剪成lxlcm，并涂上芬必得。每組小鼠分籠飼養，給藥5分鐘后，參照《藥理實驗方法學》(第三版，徐叔云等主編，人民衛生出版社，2002，I)記載的方法，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.lml/10g,記錄15分鐘內小鼠扭體的次數，與
0.9%生理鹽水組比較，并計·算小鼠扭體反應抑制率。(三)結果見表I表I
￥1j扭體次數j抑制率(%)
生理鹽水組 37.1 + 6.53 O 實驗 I 組29.9 + 5.17* 24.0
實驗 2 組27.2 + 9.50* Δ 26.6
芬必得組35.7 + 8.40注:與生理鹽水組比較*P〈0.05 ;與芬必得組比較Λ Ρ〈0.05。從表I看出，丁酰膽堿酯酶水溶液無論是腹腔注射還是皮膚涂擦，與生理鹽水組比較，均明顯降低醋酸腹腔注射后所致小鼠的扭體次數(P < 0.05);與陽性抗炎鎮痛藥物芬必得相比，丁酰膽堿酯酶水溶液也有較明顯的作用優勢(實驗腹腔注射組比芬必得組，(P <0.05);對小鼠扭體反應抑制率丁酰膽堿酯酶水溶液明顯高于芬必得組。提示丁酰膽堿酯酶水溶液對小鼠醋酸扭體法的急性疼痛反應具有良好的鎮痛作用。實施例7對大鼠免疫佐劑性關節上的消炎作用實驗(一)材料與試劑
1.藥品:實施例2中制得的每毫升溶液含酶活力300U的丁酰膽堿酯酶水溶液；芬必得(布洛芬)由中美史克生產(批號:04050471 )。2.動物:Wister大鼠，30只，體重200±20克，雌雄兼用，由中山大學實驗動物中心提供。(二)方祛1.分組:陰性對照組實驗組芬必得組2.實驗操作將Wister大鼠隨機分成3組，每組10只；參照《藥理實驗方法學》(第三版，徐叔云等主編，人民衛生出版社，2002，I)記載的方法，每組動物在給藥前進行右后足跖皮內注射弗氏佐劑(FCA) 0.1ml/只，致炎0.5h后，實驗組、芬必得組分別在致炎處(右后跖皮膚)注射所列的丁酰膽堿酯 酶水溶液和芬必得，每天一次，連續給藥一周，并在2h、6h、12h、24h、48h、72h、7天用游標卡尺測右后跖的腫脹度。(三)結果見表2表權利要求
1.在C端水解P物質的膽堿酯酶在制備治療或預防哺乳動物體內速激肽介導的病癥的速激肽拮抗劑中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述膽堿酯酶選自: 乙酰膽堿酯酶； 丁酰膽堿酯酶； 乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶的同工酶； 乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶的基因重組物。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述膽堿酯酶為從動植物細胞、組織或血液提取純化或通過基因重組從表達載體分離純化得到的、以乙酰膽堿或丁酰膽堿為底物作酶活檢測具有膽堿酯酶活性的非均一狀態粗提物。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于其中所述速激肽為P物質、神經激肽A，或神經激肽B。
5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述膽堿酯酶可以水溶液劑、凍干粉或凍干粉復溶劑施用。
6.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述膽堿酯酶可以注射，吸入、黏膜吸收或體表局部施用。
7.根據權利要求1所述的應用，其特征在于膽堿酯酶劑量范圍為0.0Ol微克至I毫克。
全文摘要
在C端水解P物質的膽堿酯酶在制備速激肽拮抗劑中的應用，本發明涉及制藥領域，本發明的目的是提供在C端水解P物質的膽堿酯酶的一個新用途，具體是指膽堿酯酶在制備速激肽拮抗劑中的應用。由于本發明的膽堿酯酶可以是乙酰膽堿酯酶、或丁酰膽堿酯酶及它們的同工酶、或它們的衍生物，它們可以來源于動物的細胞、組織或血液，也可以來源于植物及通過基因重組的方法得到，來源廣泛，而且不需要高度提純，適宜產業化生產。
文檔編號A61P1/00GK103230588SQ20131016940
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月10日 優先權日2013年5月10日
發明者陶國良, 徐漢虹 申請人:陶國良