專利名稱：雙啟動子雙表達特異性shRNA慢病毒載體及其應用的制作方法
技術領域：
:本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種使用雙啟動子同時表達兩種shRNA的重組慢病毒載體和穿梭質粒。本發明還涉及所述載體和穿梭質粒在制備防治HIV感染藥物中的應用。
背景技術：
:RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。RNA干擾可以通用用化學合成的成熟的小的干擾RNA (small interfering RNAs,siRNA)去瞬時轉染細胞，或者是通過將能夠表達短發卡RNA (shRNA)的載體整合進入細胞，進行穩定表達。表達出來的shRNA包含兩個短的反向重復序列(其中一個與目的基因互補)，中間由一個loop序列分割,組成發夾結構,在體內shRNA可以在Dicer酶的作用下加工成為成熟siRNA，其干擾效果等同于siRNA。體外合成和質粒介導的RNA干擾持續時間較短，不適用于長期抑制基因表達。使用病毒載體來介導shRNA的表達可以達到長期穩定地抑制基因的表達。慢病毒載體是一種新型基因轉移載體，具有獨特的特點，可高效地感染非分裂期的細胞，特別是造血系統來源細胞，具有穩定整合染色體并能夠長期穩定表達、細胞毒性低、免疫反應小等特點，在基因治療研究中展現出良好的應用的前景。現如今，常規商品化的病毒載體只能單獨表達出一種shRNA。單獨的shRNA不足以完全干擾目的基因的表達。 如果靶向的基因是RNA病毒基因，由于病毒基因容易發生變異，RNA干擾是序列高度特異性的，即使靶向基因中有一個堿基發生突變，就會嚴重影響siRNA的干擾效果。譬如，在RNA干擾技術應用于HIV的基因治療中，由于HIV基因組具有很高的突變率，突變產生的病毒逃逸就成為siRNA治療的一個潛在問題。因此,如果能夠同時表達出兩個或者多個siRNA,針對于病毒基因的同一個基因或者不同的基因，將兩個siRNA的干擾效果聯合作用，不僅可以更加高效的干擾病毒基因和腫瘤癌基因的表達水平，而且可以降低病毒產生病毒逃逸株的出現，就可以解決上述問題
發明內容
:本發明的目的是構建一種慢病毒載體，達到在同一載體中用兩種啟動子，可同時表達出兩種shRNA，更加高效抑制靶向基因的表達，且能夠同時靶向于兩個不同的基因。本發明選擇的兩種啟動子是U6和Hl啟動子，它們都是RNA聚合酶III依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉錄區的上游，適合于表達大小約21ntRNA和50ntRNA莖環結構(stem loop)，且沒有物種特異性，在所有的哺乳細胞中都能夠啟動高效表達。采用兩種不同的啟動子不僅可以同時高效地表達出兩種shRNA，還可以有效地避免在載體整合進入到細胞過程中相同的啟動子因為同源匹配引起的丟失交換等，更加穩定和安全。本發明以plvx-shRNA2為骨架構建出同時表達出兩種shRNA的慢病毒載體。在構建shRNA雙表達系統時，在多克隆位點引入含有BamH1、EcoR1、Xba1、XhoI四個限制性酶切位點的linker序列(
圖1)，在限制性酶切位點EcoRI和XbaI之間插入Hl啟動子，形成 PU6-BamH1-EcoR1-PHl-Xba1-XhoI (SEQ NO:3)。 在BamHI和EcoRI酶切位點可以插入一種表達shRNA的雙鏈DNA寡核苷酸，(設計要求如oligol,經過退火后可以形成兩端帶有BamHI和EcoRI粘性末端的雙鏈寡核苷酸)，通過U6啟動子進行啟動。在XbaI和XhoI酶切位點可以引入表達另外一種shRNA的雙鏈寡核苷酸(設計要求見oligo2，經過退火后可以形成兩端帶有XbaI和XhoI粘性末端的雙鏈寡核苷酸)，由Hl啟動子進行啟動。Oligol (+):5’ -gatcccc (siRNA 序列)ttcaagaga (siRNA 序列的反向互補序列)Oligol (-):5’ -aattcaaaaa (siRNA 序列)tctcttgaa (siRNA 序列的反向互補序列)ggg-3’01igos2 (+):5’ -ctagacc (siRNA 序列)ttcaagaga (siRNA 序列的反向互補序列)01igos2 (-):5' -tcgagaaaaa (siRNA 序列)tctcttgaa (siRNA 序列的反向互補序列)ggt-3’其中下劃線_部分為限制性酶切位點，可以形成粘性末端，+鏈中ttcaagaga
和-鏈tctcttgaa為loop序列。表I
權利要求
1.一種能夠同時表達出兩種ShRNA的慢病毒載體，其特征為包含核苷酸序列為SEQ IDNO: I的U6啟動子和核苷酸序列為SEQ ID NO: 2的Hl啟動子。
2.權利要求I所述的慢病毒載體，其特征為包含SEQID NO:3所示核苷酸序列的雙啟動子區。
3.權利要求I或2所述的慢病毒載體，其特征為 1)U6啟動子啟動的shRNA引入酶切位點為BamHI和EcoRI，分別位于SEQ ID NO:3中253-258 位和 262-267 位； 2)Hl啟動子啟動的shRNA引入酶切位點為XbaI和Xhol，分別位于SEQ ID N0:3中483-488 位和 SEQ ID NO:3 中 492-497 位。
4.權利要求3所述的慢病毒載體，其特征為 1)在BamHI和EcoRI酶切位點插入了表達shRNA的雙鏈DNA寡核苷酸，其正向序列和反向序列如oligol (+)和oligol(-)所示,退火后兩段形成BamHI和EcoRI酶切粘性末端，通過U6啟動子進行啟動； 2)在XbaI和XhoI酶切位點插入了表達另外一種shRNA的雙鏈寡核苷酸，其正向序列和反向序列如oligo2(+)和oligo2(_)所示,退火后兩段形成XbaI和XhoI酶切粘性末端，由Hl啟動子進行啟動； 所述 Oligol (+)序列是 5’ -gatcccc一N1一ttcaagaga一M1一tttttg-3’，其中 N1 是長度為19 22bp的siRNA序列，M1是N1的反向互補序列； 所述 Oligol (-) 5’ -aattcaaaaa—N2—tctcttgaa—M2—ggg_3’，其中 N2 是長度為 19 22bp的siRNA序列，M2是N2的反向互補序列； 所述 01igo2 (+) 5’_ctagacc—N3—ttcaagaga—M3—tttttc-3’，其中 N3 是長度為 19 22bp的siRNA序列，M3是N3的反向互補序列； 所述 01igo2 (_) 5’ -tcgagaaaaa—N4—tctcttgaa—M4—ggt_3’，其中 N4 是長度為 19 22bp的siRNA序列，M4是N4的反向互補序列。
5.一種同時表達靶向HIV病毒中vpr基因和tat基因的慢病毒載體，其特征是包含SEQID NO:4 SEQ ID NO:7 所示的 shRNA。
6.權利要求I或5所述慢病毒載體在研制防治HIV感染藥物中的應用。
7.權利要求6所述的應用，所述防治HIV感染藥物是抑制vpr基因表達和/或下調tat基因的表達水平的藥物。
8.—種構建shRNA雙表達慢病毒表達質粒的方法，在多克隆位點引入含有BamHl-EcoRI-XbaI-XhoI的寡核苷酸序列；且在限制性酶切位點EcoRI和XbaI之間插入SEQ ID N0:2所示序列的Hl啟動子,形成SEQ ID NO :3所示序列的雙啟動子區； 所述BamHI、EcoRI、XbaI和XhoI如權利要求3所示； 所述 BamHl-EcoRI-XbaI-XhoI 的序列為 5’ -GGATTC GAATTC TCTAGA CTCGAG-3’。
全文摘要
一種雙啟動子雙表達特異性shRNA慢病毒載體，包含核苷酸序列為SEQ ID NO:1的U6啟動子和核苷酸序列為SEQ ID NO:2的H1啟動子。經實驗證實，該慢病毒載體能夠同時表達出兩種shRNA，可抑制vpr基因表達和/或下調tat基因的表達水平，可用于研制防治HIV感染藥物。
文檔編號A61K48/00GK103255173SQ201310157030
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月28日 優先權日2013年4月28日
發明者曾毅, 滕智平, 郝彥哲, 楊怡姝 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所, 北京工業大學, 曾毅, 滕智平, 郝彥哲