載胎盤生長因子納米粒及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開載胎盤生長因子納米粒及其制備方法和應用。方法步驟：1內水相（含有胎盤生長因子的水溶液）分散在油相（含有聚乳酸聚羥基乙酸共聚物和有機溶劑的有機溶液）中形成初乳；有機溶劑的極性為4.0～6.0；內水相：油相為（1:3）～（1:10）；2初乳在外水相（含HLB值8～18的親水性非離子表面活性劑的水溶液）中乳化形成復乳；油相：外水相為（1:3）～（1:6）；3復乳與擴散相（水或含有穩定劑的水溶液）混合，去除有機溶劑和穩定劑，凍干；外水相：擴散相為（1:5）～（1:15）。本發明的產品的緩釋效果好，制備方法中減少蛋白變性，提高包封率，穩定性較好，有機溶劑可以不為二氯甲烷等溶劑，反應的毒性降低。
【專利說明】載胎盤生長因子納米粒及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種載胎盤生長因子納米粒及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI)是由于冠狀動脈病變引發其 部分或完全性閉塞，供血急劇減少或中斷，導致心肌因持久而嚴重的缺血缺氧而壞死的疾 病。急性心肌梗死發病急、并發癥多、死亡率高，是一種常見的心血管疾病。急性心肌梗死 目前主要的治療方法包括藥物治療、心臟移植、左心室植入式協助等。由于器官捐獻配型的 局限性，植入左心室輔助裝置造價昂貴過程復雜，藥物治療成為主要的治療方法。一種新 型藥物治療方法是在心梗區注射胎盤生長因子（Placental growth factor, PLGF)，促進缺 血區域血管再生成，改善心肌功能恢復。直接心肌內注射，可以將藥物精確傳遞至心肌梗死 區。其局限性是具有侵入性損傷。盡管胎盤生長因子在治療急性心肌梗死方面表現出良好 的應用前景，但其最大的障礙就是活性成分無法長期存留在心梗區域發揮療效。為了使藥 物直接作用在心梗區域，外源性胎盤生長因子只能注射給藥。目前普遍采用的方式是在術 中直視下，向梗死區心外膜下點狀注射，但是點狀注射的方式加上心肌收縮，容易導致藥物 流失，同時胎盤生長因子是一種蛋白類藥物，容易局部酶解。總之該方法恢復心功能效果不 甚理想。
[0003] 納米給藥系統物理、化學和生物學性能卓越，己經成為藥物新劑型研究中非常活 躍的領域。它們可改變藥物在體內的藥動學特征，增加藥物在靶器官的分布量，從而提高療 效、減輕毒副作用，同時納米粒比表面積大，有利于表面功能化修飾；粒徑小，有利于更好地 滲透于細胞間隙，發揮微觀靶向效應。
[0004] 目前已有 Binsalamah 等人（Binsalamah, Ziyad Mohammed, et al. ''Intramyocardial sustained delivery of placental growth factor using nanoparticles as a vehicle for delivery in the rat infarct model. ''International journal of nanomedicine6(2011) :2667.)采用靜電交聯法制備海藻酸鹽-殼聚糖納米粒， 用于包載胎盤生長因子，提高了胎盤生長因子的治療作用。但這種方法采用親水性載體能 夠達到較高的包封率，但釋藥時長短，一般僅為5天左右。
[0005] 聚乳酸聚輕基乙酸共聚物（poly-lactide-co-glycolic acid, PLGA)是廣泛應用 于蛋白多肽類藥物緩控釋體系的一種納米載體材料。聚乳酸聚羥基乙酸共聚物具有良好 的生物相容性、生物可降解性，降解產物安全無毒，是食品和藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA)批準可用于人體的緩釋材料。可根據單體比例的不同控制降解速度， 為實現藥物的緩控釋放提供可能。PLGA載體材料多用于包載香豆素-6、紫杉醇等疏水性藥 物制備納米粒、微球等達到較好的緩釋效果，也有用于胰島素等親水性藥物，但普遍包封率 較低，無法達到很好的藥效。
[0006] 現有技術中尚不存在能同時實現緩釋效果好和包封率高的載胎盤生長因子納米 粒的制備方法，該現象極大的制約了胎盤生長因子在治療急性心肌梗死方面的發展，該現 象亟待解決。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題在于克服現有技術中載胎盤生長因子納米粒的制備 方法不能同時實現緩釋效果好和包封率高的缺陷，提供一種新的載胎盤生長因子納米粒及 其制備方法和應用，該載胎盤生長因子納米粒緩釋效果好，包封率高，毒性低，可以向心肌 梗死區穩定、持續、有效地遞送胎盤生長因子。
[0008] 本發明的目的之一是，提供一種載胎盤生長因子納米粒的制備方法，其包括下述 步驟：
[0009] (1)將內水相分散在油相中形成初乳；其中，所述的內水相為含有胎盤生長因子 的水溶液；所述的油相為含有聚乳酸聚羥基乙酸共聚物和有機溶劑的有機溶液；所述的 有機溶劑為極性在4. 0?6. 0之間的半極性有機溶劑；所述的內水相與油相的體積比為 (1:3)?（1:10);
[0010] (2)將上述初乳在外水相中乳化，形成復乳；其中，所述的外水相為含有穩定劑的 水溶液；所述的穩定劑為HLB值8?18的親水性非離子表面活性劑；所述的油相與外水相 的體積比為（1:3)?（1:6);
[0011] (3)將上述復乳與擴散相混合，去除有機溶劑和穩定劑，得待凍干溶液，凍干， 即可；所述的擴散相為水或含有穩定劑的水溶液；所述的外水相與擴散相的體積比為 (1:5)?（1:15)。
[0012] 本發明中，所述的HLB值（Hydrophilic Lipophilic Balance)為表面活性劑的親 水親油平衡值，用于表示表面活性劑分子中親水基和親油基之間的大小和力量平衡程度。
[0013] 步驟（1)中，所述的聚乳酸聚羥基乙酸共聚物為本領域常規的聚乳酸聚羥基乙酸 共聚物，所述的聚乳酸聚羥基乙酸共聚物的粘均分子量較佳的為10, 〇〇〇?100, 〇〇〇,更佳 的為60, 000。所述的聚乳酸聚羥基乙酸共聚物中乳酸、羥基乙酸嵌段比例為（50/50)? (85/15)，所述的乳酸、羥基乙酸嵌段比為乳酸嵌段和羥基乙酸嵌段的重量比。
[0014] 步驟（1)中，內水相中所述的胎盤生長因子的濃度為本領域常規濃度，較佳的為 0. 15?0. 30mg/mL，所述的濃度為胎盤生長因子的質量與內水相的體積比。
[0015] 較佳的，步驟（1)中，所述的胎盤生長因子為美國R&D公司的重組人源胎盤生長因 子。
[0016] 較佳的，步驟（1)中，所述的胎盤生長因子和聚乳酸聚羥基乙酸共聚物的質量比為 (3:200)?（1:1500)。
[0017] 較佳的，步驟（1)中，所述的內水相還可以含有親水性生理相容性高分子。所述的 親水性生理相容性高分子較佳的為含多羥基的能穩定蛋白的多糖類物質、含多羥基的能穩 定蛋白的聚氨基酸類物質、聚丙烯酸和聚乙二醇中的一種或多種。所述的含多羥基的能穩 定蛋白的多糖類物質較佳的為肝素、殼聚糖和透明質酸中的一種或多種。所述的含多羥基 的能穩定蛋白的聚氨基酸類物質較佳的為聚谷氨酸。
[0018] 內水相中，所述的生理相容性高分子的濃度為本領域常規濃度，較佳的，所述的生 理相容性高分子的濃度為1%?5%，所述百分比為生理相容性高分子占內水相的重量百分 比。
[0019] 步驟（1)中，所述的聚乳酸聚羥基乙酸共聚物的濃度為本領域常規濃度，較佳的為 5?50mg/mL，更佳的為10?40mg/mL，所述的濃度為聚乳酸聚輕基乙酸共聚物的質量與有 機溶液的體積比。
[0020] 步驟（1)中，所述的有機溶劑較佳的為乙酸乙酯、乙醇和丙酮中的一種或多種。
[0021] 步驟（1)中所述的分散的方法為本領域常規方法；所述的分散較佳的為機械分 散，更佳的為超聲分散。較佳的，所述的超聲分散的功率為200W，所述的超聲分散的時間為 1 ?2min〇
[0022] 步驟（1)中，所述的內水相與油相的體積比較佳的為（1:4)?（1:6)，更佳的為 1:5。
[0023] 本發明中，步驟（1)后，制備得到油包水（W1/0)型乳液。
[0024] 步驟（2)中，所述的穩定劑為本領域常規的穩定劑；所述的穩定劑較佳的為普 朗尼克、聚乙烯醇和吐溫80中的一種或多種；更佳的，所述的聚乙烯醇的分子量范圍為 13000 ?23000。
[0025] 步驟（2)中，所述的外水相中穩定劑的濃度為本領域常規的濃度，所述的外水相中 穩定劑的濃度較佳的為15%?20%，所述百分比為穩定劑占外水相的重量百分比。
[0026] 步驟（2)中，所述的乳化的方法為本領域常規方法；較佳的，所述的乳化的方法 為高速剪切乳化或高壓乳勻。所述的高速剪切乳化較佳的使用分散乳化機。所述的高速 剪切乳化較佳的在冰浴條件下進行。所述的高速剪切乳化的剪切速度較佳的為10000? 30000rpm，更佳的為llOOOrpm。所述的高速剪切乳化的時間較佳的為0. 5?3min。
[0027] 本發明中，步驟（2)后，制備得到水包油包水（W1/0/W2)型復乳。
[0028] 較佳的，步驟（3)中，所述的含有穩定劑的水溶液中的穩定劑的濃度為2%以下，但 不為〇,所述百分比為穩定劑占擴散相的重量百分比。
[0029] 步驟（3)中，所述的有機溶劑的去除方法為本領域常規方法；較佳的，所述的有機 溶劑的去除方法為磁力攪拌揮干或真空旋轉蒸發。所述的磁力攪拌揮干的轉速較佳的為 lOOrpm?500rpm，所述的磁力攪拌揮干的時間較佳的為6h?12h。所述的真空旋轉蒸發的 時間較佳的為3h?6h。
[0030] 步驟（3)中，所述的穩定劑的去除方法為本領域常規方法，較佳的，所述的穩定劑 的去除方法為高速離心。所述的離心的速度較佳的為3000?8000rpm，更佳的為6000rpm ; 所述的離心的時間較佳的為3?lOmin，更佳的為8min。
[0031] 步驟（3)中，所述的凍干的方法為本領域常規方法，較佳的，所述的凍干的方法為 直接凍干或與支架劑混合后凍干。
[0032] 本發明中，所述的支架劑為一種藥物輔料，所述的支架劑為本領域常規的支架劑， 較佳的，所述的支架劑為甘露醇、葡聚糖、乳糖和右旋糖苷中的一種或多種。所述的支架劑 的濃度為本領域常規濃度，較佳的為20?50mg/mL，所述濃度為支架劑的質量與待凍干溶 液的體積比。
[0033] 本發明的目的之二是，提供由上述載胎盤生長因子納米粒的制備方法制得的載胎 盤生長因子納米粒。
[0034] 較佳的，所述的載胎盤生長因子納米粒的粒徑為100?500nm。
[0035] 較佳的，所述的載胎盤生長因子納米粒的包封率為30%?50%。
[0036] 本發明中，所述的包封率的計算公式為：
[0037]
【權利要求】
1. 一種載胎盤生長因子納米粒的制備方法，其特征在于：其包括下述步驟： (1) 將內水相分散在油相中形成初乳；其中，所述的內水相為含有胎盤生長因子的水 溶液；所述的油相為含有聚乳酸聚羥基乙酸共聚物和有機溶劑的有機溶液；所述的有機溶 劑為極性在4. 0?6. 0之間的半極性有機溶劑；所述的內水相與油相的體積比為（1:3)? (1:10)； (2) 將上述初乳在外水相中乳化，形成復乳；其中，所述的外水相為含有穩定劑的水溶 液；所述的穩定劑為HLB值8?18的親水性非離子表面活性劑；所述的油相與外水相的體 積比為（1:3)?（1:6); (3) 將上述復乳與擴散相混合，去除有機溶劑和穩定劑，得待凍干溶液，凍干，即可； 所述的擴散相為水或含有穩定劑的水溶液；所述的外水相與擴散相的體積比為（1:5)? (1:15)。
2. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于： 步驟（1)中，所述的聚乳酸聚羥基乙酸共聚物的粘均分子量為10, 〇〇〇?100,000 ;所 述的聚乳酸聚羥基乙酸共聚物中乳酸、羥基乙酸嵌段比例為（50/50)?（85/15)，所述的乳 酸、羥基乙酸嵌段比為乳酸嵌段和羥基乙酸嵌段的重量比； 和/或，步驟（1)中，內水相中所述的胎盤生長因子的濃度為〇. 15?0. 30mg/mL，所述 的濃度為胎盤生長因子的質量與內水相的體積比； 和/或，步驟（1)中，所述的胎盤生長因子和聚乳酸聚羥基乙酸共聚物的質量比為 (3:200)?（1:1500)。
3. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（1)中，所述的內水相還含有親水 性生理相容性高分子； 所述的親水性生理相容性高分子較佳的為含多羥基的能穩定蛋白的多糖類物質、含多 羥基的能穩定蛋白的聚氨基酸類物質、聚丙烯酸和聚乙二醇中的一種或多種；所述的含多 羥基的能穩定蛋白的多糖類物質較佳的為肝素、殼聚糖和透明質酸中的一種或多種；所述 的含多羥基的能穩定蛋白的聚氨基酸類物質較佳的為聚谷氨酸； 內水相中，所述的生理相容性高分子的濃度較佳的為1%?5%，所述百分比為生理相容 性商分子占內水相的重量百分比。
4. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（1)中，所述的聚乳酸聚羥基乙酸 共聚物的濃度為5?50mg/mL，較佳的為10?40mg/mL，所述的濃度為聚乳酸聚輕基乙酸共 聚物的質量與有機溶液的體積比； 和/或，步驟（1)中，所述的有機溶劑為乙酸乙酯、乙醇和丙酮中的一種或多種； 和/或，步驟（1)中所述的分散的方法為機械分散，較佳的為超聲分散；較佳的，所述的 超聲分散的功率為200W，所述的超聲分散的時間為1?2min ; 和/或，步驟（1)中，所述的內水相與油相的體積比為（1:4)?（1:6)。
5. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（2)中，所述的穩定劑為普朗尼克、 聚乙烯醇和吐溫80中的一種或多種； 和/或，步驟（2)中，所述的外水相中穩定劑的濃度為15%?20%，所述百分比為穩定劑 占外水相的重量百分比； 和/或，步驟（2)中，所述的乳化為高速剪切乳化或高壓乳勻；所述的高速剪切乳化較 佳的使用分散乳化機；所述的高速剪切乳化較佳的在冰浴條件下進行；所述的高速剪切乳 化的剪切速度較佳的為10000?30000rpm ;所述的高速剪切乳化的時間較佳的為0. 5? 3min〇
6. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（3)中，所述的含有穩定劑的水溶 液中的穩定劑的濃度為2%以下，但不為0,所述百分比為穩定劑占擴散相的重量百分比。
7. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（3)中，所述的有機溶劑的去除 方法為磁力攪拌揮干或真空旋轉蒸發；所述的磁力攪拌揮干的轉速較佳的為lOOrpm? 500rpm，所述的磁力攪拌揮干的時間較佳的為6h?12h ;所述的真空旋轉蒸發的時間較佳 的為3h?6h ; 和/或，步驟（3)中，所述的穩定劑的去除方法為高速離心；所述的離心的速度較佳的 為3000?8000rpm ;所述的離心的時間較佳的為3?lOmin ; 和/或，步驟（3)中，所述的凍干的方法為直接凍干或與支架劑混合后凍干；較佳的，所 述的支架劑為甘露醇、葡聚糖、乳糖和右旋糖苷中的一種或多種；較佳的，所述的支架劑的 濃度為20?50mg/mL，所述濃度為支架劑的質量與待凍干溶液的體積比。
8. -種由權利要求1-7中任一項所述的載胎盤生長因子納米粒的制備方法制得的載 胎盤生長因子納米粒。
9. 如權利要求8所述的載胎盤生長因子納米粒，其特征在于：所述的載胎盤生長因子 納米粒的粒徑為100?500nm，包封率為30%?50%。
10. 如權利要求8或9所述的載胎盤生長因子納米粒在制備用于急性心肌梗死的藥物 中的應用；較佳的，所述的載胎盤生長因子納米粒的使用方法為：載胎盤生長因子納米粒 采用生理鹽水混懸后，向梗死區心外膜下點狀注射。
【文檔編號】A61K9/113GK104117056SQ201310157029
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月28日 優先權日:2013年4月28日
【發明者】何軍, 連鋒, 毛立麗, 路喆鑫, 劉潔, 卞瑋, 潘偉祥 申請人:上海現代藥物制劑工程研究中心有限公司, 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院