原花青素衍生物的制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】一種原花青素衍生物，采用葡萄籽提取的原花青素與乙酸酐發生乙酰化反應制備。制備方法：新鮮的葡萄籽經粉碎、脫脂，加入60％乙醇水溶液為提取劑，在超聲波提取器中震蕩提取20min，重復提取三次，濃縮體積、低溫離心過濾后，用乙酸乙酯萃取3次。萃取液用旋轉蒸發儀蒸餾、濃縮得到紅褐色原花青素。然后與乙酸酐乙酰化反應得到乙酰基原花青素。它也可以以60％乙醇水溶液為提取劑，溫度50℃，浸提4次，每次1h。浸提濃縮、低溫離心過濾后，用2倍量乙酸乙酯萃取。然后與乙酸酐乙酰化反應得到乙酰基原花青素。所述的原花青素衍生物，用于制備防治腫瘤的保健食品及藥品。
【專利說明】原花青素衍生物的制備方法和應用
【技術領域】:
[0001]本發明屬于醫藥【技術領域】，涉及原花青素衍生物的制備方法和用途，具體地說是涉及其在制備防治腫瘤保健食品和藥品方而的應用。
【背景技術】:
[0002]原花青素，國外多稱為procyanidine或proanthocyanidins,是一種由不同數量的兒茶素或表兒茶素單體聚合而成的天然植物化學物，廣泛存在于桔、檸檬、橄欖、葡萄等多種植物體中，具有良好的抗氧化、清除自由基功效，在食品、保健品、藥品等領域有較多應用。其中葡萄籽易于保藏和處理，并且含有豐富的原花青素，所以在現有的技術中多是以葡萄籽為原料提取原花青素。葡萄籽原花青素含有2-10個兒茶素單體，通常將含有2-4個單體的兒茶素稱為低聚體原花青素(oligomersic procyanidine),含有4個以上單體的兒茶素稱為高聚體原花青素(polymersic procyanidine)。目前認為低聚體原花青素的生物活性大于高聚體原花青素，高聚體原花青素的水溶性較差。因而在原花青素產品中低聚體成分含量高低成為評價產品質量的主要指標。
[0003]原花青素是由兒茶酚和表兒茶酸組成的低聚或多聚酚類化合物，具有抗氧化、清除自由基、抗炎和抗癌的生理活性。
[0004]因為原花青素在植物體內通常與蛋白質、多糖等以氫鍵和疏水鍵形式形成穩定的分子復合物，原花青素分子間也是如此。因此原花青素的提取劑，不僅要求對其有很好的溶解性，而且還必須有氫鍵斷裂作用。因此有機溶劑和水的復合體系(有機溶劑占總體積的50%?70% )最適合提取。有機溶劑的提取能力順序為丙醇< 乙醇< 甲醇<丙酮< 四氫呋喃，其中應用較多的是丙酮-水體系和甲醇-水體系。
【發明內容】
:
[0005]本發明的目的為了克服目前原花青素二聚體及以上多聚體常溫在水中溶解度不高的缺點，提供一種原花青素衍生物的制備方法。
[0006]本發明的優點是:制取的原花青素衍生物在常溫下容易溶于水，利于吸收，以獲得更好的治療預防腫瘤的效果。
[0007]本發明是以如下技術方案實現的:
方法一
[0008]新鮮的葡萄籽經處理后，收集葡萄籽，自然風干。將干燥好的葡萄籽用粉碎機粉碎至30-40目。
[0009]稱取IOOg上述處理好的濾渣I份，加入500mL錐形瓶中，在索氏提取器上用石油醚脫脂8h，去除脂溶性色素，抽濾，脫去溶劑和油脂。加入60%乙醇水溶液為提取荊，料液比1: 4，在超聲波提取器中震蕩提取20min，重復提取三次，合并提取液。提取液濃縮至原來體積一半時加入一定量飽和NaCI溶液。低溫離心過濾后，用2倍量乙酸乙酯萃取3次。萃取液用旋轉蒸發儀蒸餾、濃縮得到紅褐色原花青素。[0010]將制取的原花青素100g加100ml乙酸酐、2ml濃硫酸，短暫加溫30_50°C，劇烈乙
酰化反應開始。等反應液溫度下降，反應終止，立即過濾得到乙酰基原花青素。然后用乙醇洗2-3次,干燥備用。
方法二
[0011]新鮮的葡萄經處理后，收集葡萄籽，自然風干。將干燥好的葡萄籽用粉碎機粉碎至30-40 目。
[0012]脫脂:為了實現對葡萄籽的綜合利用，加入石油醚，葡萄籽:石油醚(重量/體積)=1: 3常溫浸泡48h，間歇攪拌。抽濾，脫去溶劑和油脂。
[0013]將脫脂后的葡萄籽粉陰干，用5% NaCI溶液以1: 5料液比于室溫下攪拌Ih以去除其中的蛋白質，抽濾，蒸餾水洗滌，濾渣陰干備用。
[0014]稱取100g上述處理好的濾渣1份，以60%乙醇水溶液為提取劑，原料粒度為40-60目，料液比1: 12，浸提溫度50°C，浸提4次，每次lh。浸提濃縮液加入一定量飽和NaCI溶液，低溫離心過濾后，用2倍量乙酸乙酯萃取3次。萃取液用旋轉蒸發儀蒸餾、濃縮得到紅褐色原花青素。
[0015]將制取的原花青素100g加100ml乙酸酐、2ml濃硫酸，短暫加溫30_50°C，劇烈乙
酰化反應開始。等反應液溫度下降，反應終止，立即過濾得到乙酰基原花青素。然后用乙醇洗2-3次,干燥備用。
[0016]原花青素衍生物對腫瘤細胞抑制作用的實驗
[0017]細胞及分組鼻咽癌XB-5-8F細胞系、食管癌TE8細胞系，均惠贈于新鄉醫學院腫瘤與信號傳導實驗室楊萬才教授。原花青素衍生物的濃度為1.5mg/L(I組)、15mg/L(II組)、150mg/L(III組)、1500mg/L(IV組)培養液培養和正常培養液培養空白對照組(C組)
[0018]制備單細胞懸液用含雙抗和10%小牛血清的RPM1-1640培養基制備單細胞懸液，調細胞濃度為5 X 105/ml。臺盼蘭計活細胞數，要求活細胞達97%以上。
[0019]加藥方案取96孔板，每孔加入癌細胞懸液100 μ 1，每孔加藥20 μ 1，每個濃度設三個孔，另設三個不加藥的癌細胞對照孔。加藥孔中各加入80 μ I含10%胎牛牛血清的RPM1-1640培養基，對照孔中各加入含100 μ I含10%胎牛血清的RPM1-1640培養基以使各孔的培養液量均為200 μ I
[0020]細胞培養5% C02，37°C培養。
6.MTT測OD值培養24h后，加入MTT(5mg/ml) 100 μ 1，共同孵育4小時。小心棄上清，加入DMSO ( 二甲基亞砜)150 μ I，振搖10分鐘，測試各孔490nm的OD值。
[0021]細胞存活率)=實驗孔光吸收值(A)/對照孔光吸收值(B) X 100%
[0022]統計學處理所有實驗數據均以x±s(均數土標準差)表示，輸入SPSS11.5軟件進行處理，組間比較采用單因素方差分析。檢驗標準:α =0.05。
[0023]MTT實驗結果(0D值與細胞活性成正比).[0024]XB-5-8F細胞5組XB_5_8F細胞的OD值比較:C組、I組與II組3組間無顯著性差別；π?組、IV組的OD值小于C組、I組與II組；111組OD值小于IV組。上述結果具有統計學意義。(見表1)
表1XB-5-8F細胞MTT法實驗結果
【權利要求】
1.一種原花青素衍生物，其特征在于采用葡萄籽提取的原花青素與乙酸酐發生乙酰化反應。
2.按權利要求1所述的原花青素衍生物的制備方法，其特征在于:新鮮的葡萄籽經粉碎、脫脂，加入60%乙醇水溶液為提取劑，料液比1: 4，在超聲波提取器中震蕩提取20min，重復提取三次，濃縮體積、低溫離心過濾后，用2倍量乙酸乙酯萃取3次。萃取液用旋轉蒸發儀蒸餾、濃縮得到紅褐色原花青素。然后與乙酸酐乙酰化反應得到乙酰基原花青素。
3.按權利要求1所述的原花青素衍生物的制備方法，其特征在于:新鮮的葡萄籽經粉碎、脫脂，以60%乙醇水溶液為提取劑，料液比1: 12，浸提溫度50°C，浸提4次，每次lh。浸提濃縮液加入一定量飽和NaCI溶液，低溫離心過濾后，用2倍量乙酸乙酯萃取3次。萃取液用旋轉蒸發儀蒸餾、濃縮得到紅褐色原花青素。然后與乙酸酐乙酰化反應得到乙酰基原花青素。
4.按權利要求1所述的原花青素衍生物，其特征在于:原花青素衍生物在制備防治腫瘤的保健食品及藥品中的用途。
【文檔編號】A61K31/353GK103833718SQ201310142881
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年4月24日 優先權日:2013年4月24日
【發明者】千智斌, 牛秉軒, 孫冰, 馬敬, 尹延彥 申請人:新鄉醫學院