Cd40的抗體的制作方法

Cd40的抗體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種特異性結(jié)合CD40(優(yōu)選為人類(lèi)CD40)且具有作為CD40激動(dòng)劑功能的抗體及其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明也涉及人類(lèi)抗-CD40抗體及其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明也涉及嵌合性、雙特異性、衍生化的單鏈抗體或融合蛋白質(zhì)的部份。本發(fā)明也涉及衍生自人類(lèi)抗-CD40抗體的分離的重鏈與輕鏈免疫球蛋白及編碼這些免疫球蛋白的核酸分子。本發(fā)明也涉及制造人類(lèi)抗-CD40抗體的方法，包含這些抗體的組合物，及使用所述抗體與組合物進(jìn)行診斷與治療的方法。本發(fā)明也提供一種使用編碼包含人類(lèi)抗-CD40抗體的重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白分子的核酸分子進(jìn)行的基因療法。本發(fā)明也涉及一種含有本發(fā)明核酸分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】CD40的抗體
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2002年11月8日、申請(qǐng)?zhí)枮?2824570.9、發(fā)明名稱(chēng)為“⑶40的抗體”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]本申請(qǐng)主張2001年11月9日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/348，980的權(quán)益。
現(xiàn)有技術(shù)
[0003]CD40抗原為屬于腫瘤壞死因子受體(TNF-R)家族的50kDa細(xì)胞表面糖蛋白(Stamenkovic等人的EMBO J.8:1403-10 (1989))。CD40表達(dá)于許多正常及腫瘤細(xì)胞類(lèi)型中，包括B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、胸腺表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、及平滑肌細(xì)胞(Paulie S.等人的 Cancer Immunol.1mmunother.20:23-8(1985)；Banchereau J.等人的 Adv.Exp.Med.&Biol.378:79-83(1995) ；Alderson M.R.等人的 J.0fExp.Med.178:669-74(1993) ；Ruggiero G.等人的 J.0f Immunol.156:3737-46(1996)；Hollenbaugh D.等人的 J.0f Exp.Med.182:33-40(1995) ；Yellin M.J.等人的 J.0fLeukocyte Biol.58:209-16(1995)；及 Lazaar A.L.等人的 J.0f Tmmunol.161:3120-7(1998))。⑶40表達(dá)在所有B-淋巴瘤及70%的所有實(shí)體瘤中。雖然為組成型表達(dá)，但⑶40仍可在抗原呈遞細(xì)胞中利用成熟信號(hào)(如:LPS、IL-li3、IFN-y及GM-CSF)增量調(diào)節(jié)其表達(dá)。
[0004]CD40活化作用在調(diào)節(jié)體液與細(xì)胞免疫反應(yīng)上扮演重要角色。沒(méi)有CD40活化作用的抗原呈遞，會(huì)造成耐受性，而CD40信號(hào)可以逆轉(zhuǎn)此類(lèi)耐受性，增強(qiáng)所有抗原呈遞細(xì)胞(APCs)的抗原呈遞作用，幫助分泌輔助細(xì)胞因子及趨化因子，提高共同刺激分子表達(dá)與信號(hào)傳遞，及刺激免疫細(xì)胞的溶胞活性。
[0005]⑶40在B細(xì)胞增殖作用、成熟及分類(lèi)轉(zhuǎn)型上扮演關(guān)鍵角色(Foy T.M.等人的Ann.Rev.0f Immunol.14:591-617(1996))。CD40信號(hào)傳遞途徑中斷時(shí) ，造成血清免疫球蛋白同種型異常分布、缺乏CD4+T細(xì)胞初始化、及第二體液反應(yīng)缺陷。例如:X-連鎖的過(guò)多-1gM綜合征是一種與人類(lèi)CD40L基因的突變相關(guān)的疾病，且其特征為患者沒(méi)有能力產(chǎn)生IgM同種型以外的抗體，這表示有效的免疫反應(yīng)需要⑶40與⑶40L之間的生產(chǎn)性相互作用。
[0006]⑶40與⑶40L的關(guān)聯(lián)性造成⑶40細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與TRAFs (TNF-R相關(guān)因子)的結(jié)合(Lee H.H.等人的 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96:1421-6 (1999) ；Pullen S.S.等人的 Biochemistry37:11836-45(1998) ；Grammar A.C.等人的 J of Immunol.161:1183-93(1998) ；Ishida T.K.等人的 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:9437-42 (1996);Pullen S.S.等人的 J.0f Biol.Chem.274: 14246-54(1999)) ? 與 TRAFs 的相互作用最后可同時(shí)活化 NFk B 與 Jun/API 途徑(Tsukamoto N.等人的 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96:1234-9(1999) Sutherland C.L.等人的 J.0f Immunol.162:4720-30 (1999))。依細(xì)胞類(lèi)型而定，此信號(hào)傳遞會(huì)加強(qiáng)細(xì)胞因子的分泌，如:IL_6(Jeppson J.D.等人的J.0fImmunol.161:1738-42 (1998) ；Uejima Y.等人的 Int.Arch, of Allergy&Immunol.110:225-32，(1996))、IL-8 (Gruss H.J.等人的 Blood84:2305-14 (1994) ；von LeoprechtingA.等人的 Cancer Res.59: 1287-94 (1999) ；Denfeld R.ff.等人的 Europ.J.0f Tmmunol.26:2329-34(1996))、IL-12 (Celia M.等人的 J.0f Exp.Med.184:747-52(1996) ；Ferlinff.G.等人的 Europ.J.0f Tmmunol.28:525-31 (1998) ；Armant M.等人的 Europ.J.0fImmunol.26:1430-4(1996) ；Koch F.等人的 J.0fExp.Med.184:741-6(1996) ;SeguinR.與 L.H.Kasper 的 J.0f Infect.Diseasesl79:467-74 (1999) ；Chaussabel D.等人的Infection & Immunity67: 1929-34(1999))> IL-15(Kuniyoshi J.S.等人的 CellularImmunol.193:48-58(1999))及趨化因子(MIP1 α、MIPl β、RANTES,等等)(McDyerJ.F.等人的 J.0f Tmmunol.162:3711-7 (1999) ；Schaniel C.等人的 J.0f Exp.Med.188:451-63 (1998) ；Altenburg A.等人的 J.0f Immunol.162:4140-7 (1999) ；Deckers J.G.等人的 J.0f the Am.Society of Nephrology9:1187-93 (1998));提高 I 與 II 類(lèi) MHC 的表達(dá)(Santos-Argumedo L.等人的 Cellular Immunol.156:272-85 (1994)),及提高粘著分子的表達(dá)(例如:ICAM) (Lee H.H.等人的 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.96:1421-6 (1999)；GroussonJ.等人的 Archives of Dermatol.Res.290:325-30(1998) ；Katada Y.等人的 Europ.J.0f Immunol.26:192-200(1996) ；Mayumi M.等人的 J.0f Allergy&Clin.1mmunol.96:1136-44(1995) ；Flores-Romo L.等人的 Immunol.79:445-51 (1993))及提高共同刺激分子的表達(dá)(例如:B7) (Roy Μ.等人的Europ.J.0f Immunol.25:596-603(1995)；Jones K.ff.與 C.J.Hackett 的 Cellular Immunol.174:42-53(1996) ；Caux C.等人的 Journal of Exp.Med.180: 1263-72(1994) ；KienerP.A.等人的 J.0f Tmmunol.155:4917-25(1995))。由⑶40參與作用誘發(fā)的細(xì)胞因子可加強(qiáng)T細(xì)胞存活及活化。
[0007]除了加強(qiáng)細(xì)胞功能與免疫功能外，CD40活化作用的影響還包括:趨化因子與細(xì)胞因子的細(xì)胞募集作用與分化作用；活化單核細(xì)胞；提高溶胞性T淋巴細(xì)胞(CTL)與天然殺傷(NK)細(xì)胞的溶胞活性；誘發(fā)CD40陽(yáng)性腫瘤中的細(xì)胞凋亡；加強(qiáng)CD40陽(yáng)性腫瘤的免疫原性；及產(chǎn)生腫瘤特異性抗體。CD40活化作用在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中的角色也已完全確認(rèn)且已說(shuō)明于:Grewal 等人的 Ann.Rev.0f Tmmunol.16:111-35 (1998) ；Mackey 等人的 J.0fLeukocyte Biol.63:418-28 (1998) JNoelle R.J., Agents&Actions-Suppl.49:17-22,1998)。
[0008]使用交叉初始化模型系統(tǒng)的試驗(yàn)顯示，APCs的⑶40活化作用可替代溶胞性T淋巴細(xì)胞(CTL)的形成過(guò)程中所需的輔助T細(xì)胞(Bennett等人的Nature393:478-480 (1998))。由缺乏⑶40L小鼠的證據(jù)可見(jiàn)，輔助T細(xì)胞初始化時(shí)，顯然需要⑶40信號(hào)傳遞。(Grewal1.S.等人的 Science273:1864-7(1996) ；Grewal 1.S.等人的 Nature378:617-20 (1995))。CD40活化作用使可產(chǎn)生耐受性的帶抗原的B細(xì)胞轉(zhuǎn)化成有能力的APCs (Buhlmann J.E.等人的Immunity2:645-53 (1995))。⑶40活化作用誘發(fā)脊索祖先血細(xì)胞成熟及分化成樹(shù)突細(xì)胞(Flores-Romo L.等人的 J.0f Exp.Med.185:341-9(1997) ；Mackey M.F.等人的 J.0fImmunol.161:2094-8 (1998))。⑶40活化作用也誘發(fā)單核細(xì)胞分化成功能性樹(shù)突細(xì)胞(Brossart P.等人的 Blood92:4238-47 (1998))。此外，CD40 活化作用通過(guò)APC-CD40誘發(fā)的細(xì)胞因子加強(qiáng)NK細(xì)胞的溶胞活性(Carbone E.等人的J.0f Exp.Med.185:2053-60(1997)；Martin-Fontecha A.等人的 J.0f Immunol.162:5910-6 (1999))。此類(lèi)觀察結(jié)果顯不，CD40通過(guò)誘發(fā)APCs成熟、分泌輔助細(xì)胞因子、增量調(diào)節(jié)共同刺激分子及加強(qiáng)效應(yīng)子功能而在開(kāi)始及加強(qiáng)免疫反應(yīng)的過(guò)程中扮演基本角色。
[0009]CD40信號(hào)傳遞作用在體液與細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)的開(kāi)始與成熟過(guò)程中的關(guān)鍵角色使得此系統(tǒng)成為加強(qiáng)免疫的理想目標(biāo)。此類(lèi)加強(qiáng)作用對(duì)產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原的有效免疫反應(yīng)特別重要，此類(lèi)腫瘤抗原通常通過(guò)活化的APCs的交叉初始化而呈遞給免疫系統(tǒng)。(HuangA.Y.等人的 Ciba Foundation Symp.187:229-44 (1994) ；Toes R.E.Μ.等人的 Seminars inImmunol.10:443-8 (1998) ；Albert M.L.等人的 Nature392:86-9 (1998) ；Bennett S.R.等人的 J.0f Exp.Med.186:65-70 (1997))。
[0010]有幾個(gè)工作小組已證實(shí)⑶40活化作用于體外及體內(nèi)對(duì)于抗腫瘤反應(yīng)的有效性(Toes R.E.Μ.等人的 Seminars in Immunol.10:443-8 (1998))。其中有兩個(gè)小組使用由病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的腎細(xì)胞癌瘤與皮下腫瘤的肺轉(zhuǎn)移模型，已分別證明CD40活化作用可逆轉(zhuǎn)對(duì)腫瘤特異性抗原的耐受性，造成T細(xì)胞的有效抗腫瘤初始化(prime) (SotomayorE.Μ.等人的 Nature Medicine5:780-787 (1999) ；Diehl L.等人的 Nature Medicine5:774-9 (1999))。在SCID小鼠體內(nèi)的人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞株模型中，⑶40L與抗-⑶40抗體處理也證明其在沒(méi)有免疫細(xì)胞下的抗腫瘤活性(Hirano A.等人的Blood93:2999-3007 (1999))。近來(lái)也在小鼠模型中證實(shí)抗-⑶40抗體對(duì)⑶40的活化作用可根除⑶40+與⑶40-淋巴瘤。(French R.R.等人的 Nature Medicine5:548-53 (1999))。此外，過(guò)去由 Glennie 等人進(jìn)行的試驗(yàn)得到的結(jié)論為:抗-CD40抗體產(chǎn)生的信號(hào)傳遞活性在活體內(nèi)誘發(fā)清除腫瘤的效果比可募集效應(yīng)子的其它抗表面標(biāo)記抗體更有效(Tutt A.L.等人的J.0f Immunol.161:3176-85(1998))。當(dāng)于活體內(nèi)測(cè)試抗-⑶40抗體對(duì)抗⑶40+腫瘤細(xì)胞的活性時(shí)，同樣也觀察到大多數(shù)，但非所有抗腫瘤活性均與CD40信號(hào)傳遞相關(guān)，而非與ADCC相關(guān)(FunakoshiS.等人的 J.0f Immunotherapy with Emphasis on Tumor Immunol.19:93-101 (1996))。另一項(xiàng)試驗(yàn)中，使用多種試劑離體處理骨髓樹(shù)突細(xì)胞,并測(cè)試其活體內(nèi)抗腫瘤活性。此類(lèi)試驗(yàn)證實(shí)，受:CD40L刺激的DCs為可提供抗腫瘤反應(yīng)的最成熟且最有效的細(xì)胞。
[0011]CD40在抗腫瘤免疫性中的基本角色已在野生型與CD40-/-小鼠對(duì)腫瘤疫苗反應(yīng)的比較結(jié)果中證實(shí)。此類(lèi)試驗(yàn)顯示，CD40-/-小鼠無(wú)法達(dá)到正常小鼠所出現(xiàn)的腫瘤免疫性(Mackey M.F.等人的 Cancer Research57:2569-74(1997))。另一項(xiàng)試驗(yàn)中，從帶腫瘤的小鼠取得的脾細(xì)胞用腫瘤細(xì)胞離體刺激，及使用活化性抗-CD40抗體處理，其顯示具有加強(qiáng)的腫瘤特異性CTL活性(Donepudi M.等人的Cancer Immunol.1mmunother.48:153-164(1999))。此類(lèi)試驗(yàn)證實(shí)，⑶40在抗腫瘤免疫性中均占有重要地位，不論⑶40陽(yáng)性或陰性腫瘤。由于CD40表達(dá)于淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、大多數(shù)鼻咽、膀胱、卵巢及肝的癌瘤，及有些乳腺癌與及結(jié)腸直腸癌中，因此CD40的活化作用可以有很廣泛臨床用途。
[0012]抗-⑶40活化性單克隆抗體可經(jīng)多種重要機(jī)制根除腫瘤。其中主要為活化宿主樹(shù)突細(xì)胞，以加強(qiáng)腫瘤抗原加工與呈遞，并加強(qiáng)CD40陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞本身的抗原呈遞或免疫原性，以活化腫瘤特異性CD4+與CD8+淋巴細(xì)胞。其它抗腫瘤活性可受CD40信號(hào)傳遞的其它免疫-加強(qiáng)效應(yīng)介導(dǎo)(產(chǎn)生趨化因子與細(xì)胞因子，募集與活化單核細(xì)胞，及加強(qiáng)CTL與NK溶胞活性)，及通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞凋亡或刺激針對(duì)ADCC的體液反應(yīng)而直接消滅CD40+腫瘤。凋亡及死亡的腫瘤細(xì)胞可成為腫瘤特異性抗原的重要來(lái)源,這些抗原被CD40活化的APCs處理及呈遞。
[0013]因此極需要醫(yī)療性的臨床用相關(guān)抗-⑶40激動(dòng)劑抗體。
[0014]附圖簡(jiǎn)沭
[0015]圖1抗體可變結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)序列與種系(GL)序列的比對(duì)(CDRs用下劃線表示；相對(duì)種系的突變用黑體/陰影表示)。圖1A-1H顯示所分離的抗-CD40單克隆抗體輕鏈與重鏈可變結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)的氨基酸序列與相應(yīng)輕鏈與重鏈基因的種系氨基酸序列的序列比對(duì)。克隆與種系序列之間的差異以陰影表示。種系⑶R1XDR2、與⑶R3序列以下劃線表示。重鏈序列的比對(duì)中，CDR3區(qū)域的明顯插入片段以種系序列中的短折線㈠表示，CDR3區(qū)域的明顯刪除位置則以克隆序列中的短折線(_)表示。
[0016]圖1A:V K = A3/A19及J = J κ I基因種系氨基酸序列，以及所預(yù)測(cè)的mAbs3.1.1與7.1.2的K -輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；
[0017]圖1B:來(lái)自克隆15.1.1的預(yù)測(cè)的K -輕鏈可變區(qū)氨基酸序列與種系氨基酸序列(Vk =A3/A19與 J = Jk2)；
[0018]圖1C:來(lái)自mAbsl0.8.3與21.4.1的預(yù)測(cè)的κ -輕鏈可變區(qū)氨基酸序列及種系氨基酸序列(V K = L5 (DP5)與 J = J K 4)；
[0019]圖1D:來(lái)自mAb3.1.1的預(yù)測(cè)的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與種系氨基酸序列(Vh =3-30+(DP-49)，D = D4+DIR3 與 J = JH6)；
[0020]圖1E:來(lái)自mAb7.1.2的預(yù)測(cè)的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與種系氨基酸序列(Vh =
3-30+(DP-49)，D= DIR5+D1-26 與 J = JH6)；
[0021]圖1F:來(lái)自mAbl0.8.3的預(yù)測(cè)的重鏈氨基酸序列與種系氨基酸序列(Vh =
4.35 (VIV-4)，D = DIR3 與 J = JH6)；
[0022]圖1G:來(lái)自mAbl5.1.1的預(yù)測(cè)的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與種系氨基酸序列(Vh =
4-59(DP-71)，D = D4- 23 與 J = JH4);及
[0023]圖1H:來(lái)自mAb21.4.1的預(yù)測(cè)的重鏈可變區(qū)氨基酸序列與種系氨基酸序列(Vh =1-02 (DP-75)，D = DLRl 與 J = JH4)。
[0024]圖2抗體可變結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)序列與種系(GL)序列的比對(duì)(⑶Rs用下劃線表示；相對(duì)種系的突變用黑體/陰影表示)。圖2A-2H顯示所分離的抗-CD40單克隆抗體中的輕鏈與重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與相應(yīng)輕鏈與重鏈基因的種系氨基酸序列的比對(duì)?？寺∨c種系序列之間的差異以黑體表示。種系⑶R1XDR2、與⑶R3序列以下劃線表示。在重鏈序列的比對(duì)中，CDR3區(qū)域中的明顯插入片段以種系序列中的短折線(_)表示，CDR3區(qū)域的明顯刪除位置則以克隆序列中的短折線(_)表示。
[0025]圖2A:來(lái)自mAbs22.1.1、23.5.1與23.29.1的預(yù)測(cè)的κ -輕鏈氨基酸序列及種系氨基酸序列(Vk= Α3/Α19與J = J κ I);
[0026]圖2Β:來(lái)自mAb21.2.1的預(yù)測(cè)的κ -輕鏈氨基酸序列與種系氨基酸序列(Vk =Α3/Α19 與 J = Jk 3)；
[0027]圖2C:來(lái)自mAbs23.28.1、23.28.1L-C92A與24.2.1的預(yù)測(cè)的κ -輕鏈氨基酸序列及種系氨基酸序列(Vk = Α27與J = J κ 3);
[0028]圖2D:來(lái)自mAb21.2.1的預(yù)測(cè)的重鏈氨基酸序列與種系氨基酸序列(Vh = 3-30+,D = DIR3+D6-19 與 J = JH4)；
[0029]圖2E:來(lái)自mAbs22.1.1,22.1.1H-C109A的預(yù)測(cè)的重鏈氨基酸序列及種系氨基酸序列(VH = 3-30+, D = Dl-1 與 J = Jh6)；
[0030]圖2F:來(lái)自mAb23.5.1的預(yù)測(cè)的重鏈氨基酸序列與種系氨基酸序列(Vh = 3-30+,D = D4-17 與 J = Jh6)；[0031]圖2G:來(lái)自mAb23.29.1的預(yù)測(cè)的重鏈氨基酸序列與種系氨基酸序列(Vh =3-30.3，D = D4-17 與 J = JH6);及
[0032]圖2H:來(lái)自mAb23.28.1、23.28.1H-D16E與24.2.1的預(yù)測(cè)的重鏈氨基酸序列及種系氨基酸序列(Vh = 4-59，D = DIR1+D4-17 與 J = JH5)。
[0033]圖3為劑量-反應(yīng)曲線，其說(shuō)明本發(fā)明抗-CD40抗體(21.4.1)加強(qiáng)人類(lèi)樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生IL-12p40的能力。
[0034]圖4為劑量-反應(yīng)曲線，其說(shuō)明本發(fā)明抗-CD40抗體(21.4.1)加強(qiáng)人類(lèi)樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生IL-12p70的能力。
[0035]圖5說(shuō)明本發(fā)明抗-CD40抗體(21.4.1)提高Jy刺激性細(xì)胞的免疫原性及加強(qiáng)CTL對(duì)抗Jy目標(biāo)細(xì)胞的活性的能力。
[0036]圖6為腫瘤生長(zhǎng)抑制曲線，其說(shuō)明經(jīng)本發(fā)明抗-⑶40抗體(21.4.1)處理的SCID-米色小鼠中⑶40陽(yáng)性Daudi腫瘤的生長(zhǎng)降低結(jié)果。
[0037]圖7為腫瘤生長(zhǎng)抑制曲線，其說(shuō)明經(jīng)本發(fā)明抗-⑶40抗體(21.4.1)及人類(lèi)樹(shù)突細(xì)胞與T細(xì)胞處理的SCID-米色小鼠中⑶40陰性K562腫瘤的生長(zhǎng)降低結(jié)果。
[0038]圖8說(shuō)明經(jīng)不同濃度抗-⑶40激動(dòng)劑mAb23.29.1處理的SCID小鼠中⑶40陰性K562腫瘤的生長(zhǎng)抑制結(jié)果。
[0039]圖9顯示經(jīng)不同濃度抗-⑶40激動(dòng)劑mAb3.1.1處理的SCID小鼠中⑶40陰性K562腫瘤的生長(zhǎng)抑制結(jié)果。
[0040]圖10顯示于T細(xì)胞與樹(shù)突細(xì)胞存在或不存在下經(jīng)抗-⑶40激動(dòng)劑mAb處理的SCID小鼠中⑶40陽(yáng)性Raji腫瘤的生長(zhǎng)抑制結(jié)果。
[0041]圖11顯示經(jīng)抗-⑶40激動(dòng)劑抗體處理的SCID小鼠中⑶40陽(yáng)性Raji腫瘤的生長(zhǎng)抑制結(jié)果。
[0042]圖12顯示經(jīng)抗-⑶40激動(dòng)劑抗體處理的SCID-米色小鼠中BT474乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制結(jié)果。
[0043]圖13顯示經(jīng)抗-⑶40激動(dòng)劑抗體處理的SCID-米色小鼠中PC_3前列腺腫瘤的生長(zhǎng)抑制結(jié)果。
[0044]圖14為經(jīng)靜脈接受Daudi腫瘤細(xì)胞注射(iv)并經(jīng)抗-⑶40激動(dòng)劑抗體處理的SCID-米色小鼠的存活曲線。
[0045]圖15為針對(duì)還原(R)與未還原(NR)人類(lèi)⑶40的抗-⑶40激動(dòng)劑抗體的蛋白質(zhì)印跡分析。
[0046]圖16為小鼠與人類(lèi)⑶40的D1-D4結(jié)構(gòu)域的比對(duì)。
[0047]圖17為小鼠與人類(lèi)⑶40氨基酸的比對(duì)，其中顯示嵌合體的融合位置。
[0048]圖18為嵌合性⑶40構(gòu)建體圖式。
[0049]發(fā)明概沭
[0050]本發(fā)明提供一種可與⑶40結(jié)合且可作為⑶40激動(dòng)劑的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。[0051]本發(fā)明提供一種組合物，其包含抗-⑶40抗體、或其抗原結(jié)合部分，及藥物可接受的載體。該組合物可進(jìn)一步包含另一種成分，如:抗腫瘤劑或顯象劑。本發(fā)明也提供診斷及醫(yī)療方法。[0052]本發(fā)明提供一種分離的細(xì)胞系，如:可產(chǎn)生抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合部分的雜交瘤。
[0053]本發(fā)明也提供一種編碼抗-⑶40抗體的重鏈和/或輕鏈或其抗原結(jié)合部分的核酸分子。
[0054]本發(fā)明提供包含該核酸分子的載體與宿主細(xì)胞，及重組產(chǎn)生該核酸分子所編碼多肽的方法。
[0055]本發(fā)明也提供一種表達(dá)抗-CD40抗體的重鏈和/或輕鏈，或其抗原結(jié)合部分的非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
[0056]本發(fā)明也提供一種使用有效量的編碼該抗-⑶40抗體的重鏈和/或輕鏈或其抗原結(jié)合部分的核酸分子治療有此需要的個(gè)體的方法。
[0057]本發(fā)明的詳細(xì)i兌明
[0058]定義與一般技術(shù)
[0059]除非另有說(shuō)明，否則本文中所使用的科學(xué)與技術(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)具有那些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。此外，除非本文中另有要求，否則單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)，且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括單數(shù)。通常，本文中所描述的細(xì)胞及組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)及蛋白質(zhì)與核酸化學(xué)，及雜交法所涉及的命名法與其技術(shù)均是本領(lǐng)域已知且常用的。
[0060]本發(fā)明的方法與技術(shù)通常依據(jù)本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法進(jìn)行，且說(shuō)明于本說(shuō)明書(shū)所摘錄和討論的多種一般性及較專(zhuān) 業(yè)性參考書(shū)中，除非另有說(shuō)明。參見(jiàn)例如=Sambrook等人的Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版(Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))及 Ausubel 等人的 Current Protocols inMolecular Biology (Greene Publishing Associates (1992)),及 Harlow 與 Lane 的Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor,N.Y.(1990))，其內(nèi)容已以引用的方式并入本文中。酶反應(yīng)與純化技術(shù)是根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，通?？梢辣绢I(lǐng)域已知的方法或依本文說(shuō)明的方法進(jìn)行。與本文中描述的分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)、及醫(yī)學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)相關(guān)的命名法，及實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)是本領(lǐng)域已知且常用的?；瘜W(xué)合成法、化學(xué)分析法、醫(yī)藥制法、調(diào)配法與傳送法，及患者的治療法均采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
[0061]除非另有說(shuō)明，否則下列術(shù)語(yǔ)具有如下定義:
[0062]"多肽"一詞包含天然或人造蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段及蛋白質(zhì)序列的多肽類(lèi)似物。多肽可為單體或聚合體。
[0063]"分離的蛋白質(zhì)"、"分離的多肽"或"分離的抗體"一詞指該蛋白質(zhì)、多肽或抗體的衍生來(lái)源基本(I)未與其天然狀態(tài)下所伴隨出現(xiàn)的天然聯(lián)結(jié)成分聯(lián)結(jié)，(2)不含來(lái)自相同物種的其它蛋白質(zhì)，(3)由不同物種的細(xì)胞表達(dá)，或(4)不會(huì)天然發(fā)生。因此，若該多肽是經(jīng)化學(xué)合成或于不同于其天然細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系統(tǒng)中合成時(shí)，則該多肽可認(rèn)為是與其天然聯(lián)結(jié)成分"分離"的。蛋白質(zhì)也可使用本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)分離，而使其實(shí)質(zhì)上不含天然聯(lián)結(jié)成分。
[0064]分離的抗體的實(shí)例包括已經(jīng)使用⑶40進(jìn)行親和性純化的抗-⑶40抗體，于活體外使用雜交瘤或其它細(xì)胞系合成的抗-CD40抗體，及衍生自轉(zhuǎn)基因小鼠的人類(lèi)抗-CD40抗體。
[0065]蛋白質(zhì)或多肽為"實(shí)質(zhì)上純的"、"實(shí)質(zhì)上均質(zhì)"或"實(shí)質(zhì)上已純化"是指該樣品中至少約60至75%為單一種類(lèi)的多肽。多肽或蛋白質(zhì)可為單體或多聚體。實(shí)質(zhì)上純的多肽或蛋白質(zhì)典型地構(gòu)成約50%、60%、70%、80%或90%胃/胃蛋白質(zhì)樣品，更常為約95%，優(yōu)選為純度99%以上。蛋白質(zhì)純度或均質(zhì)性可依本領(lǐng)域已知的多種方法判定，如:由蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，使用本領(lǐng)域已知的染料為凝膠染色，檢查單一多肽條帶。為了有些目的，可能使用HPLC或其它本領(lǐng)域已知的手段提供較高分辨率的純化。
[0066]本文所使用"多肽片段"一詞指刪除氨基末端和/或羧基末端，但其余氨基酸序列仍與該天然序列的相應(yīng)位置相同的多肽。有些實(shí)施方案中，片段長(zhǎng)度至少為5、6、8或10個(gè)氨基酸。其它實(shí)施方案中，片段至少為14個(gè)、至少20個(gè)、至少50個(gè)、至少70、80、90、100、150或200個(gè)氨基酸。
[0067]本文中所使用"多肽類(lèi)似物"一詞指這樣一種多肽，其包含的節(jié)段實(shí)質(zhì)上與氨基酸序列的一部分相同且具有下列性質(zhì):(I)在適宜結(jié)合條件下，與CD40特異性結(jié)合，(2)有能力活化⑶40，(3)有能力增量調(diào)節(jié)細(xì)胞表面分子(如:ICAM、MHC-11、B7-l、B7-2、ra71、CD23與CD83)的表達(dá)，或(4)有能力加強(qiáng)分泌細(xì)胞因子，如JFN-β 1、IL-2、IL-8、IL-12、IL-15、IL-18與IL-23。典型地，多肽類(lèi)似物相對(duì)于天然序列，包含保守性氨基酸取代(或插入或刪除)。類(lèi)似物典型地長(zhǎng)為至少20或25個(gè)氨基酸，優(yōu)選為至少50、60、70、80、90、100、150或200個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)，且經(jīng)常長(zhǎng)達(dá)天然多肽的全長(zhǎng)度。
[0068]優(yōu)選氨基酸取代為:(I)降低對(duì)蛋白質(zhì)水解作用的敏感性，⑵降低對(duì)氧化作用的敏感性，(3)改變形成蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合親合性，及(4)賦與或修改此類(lèi)類(lèi)似物的其它生理化學(xué)或功能性質(zhì)。類(lèi)似物可包括序列不同于天然肽序列的多種突變蛋白質(zhì)。例如:可在天然序列中(優(yōu)選為形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域外圍的多肽部份中)進(jìn)行單一或多重氨基酸取代(優(yōu)選為保守性氨基酸取代)。保守性氨基酸取代實(shí)質(zhì)上不應(yīng)改變親本序列的結(jié)構(gòu)特性(例如:替代的氨基酸不應(yīng)有打破親本序列螺旋或瓦解親本序列特有的二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向)。本領(lǐng)域已知的多肽二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)實(shí)例說(shuō)明于Creighton編輯的Proteins, Structuresand Molecular Principles(W.H.Freeman and Company, New York (1984)) ;C.Branden 與T.Tooze 編輯的 Introduc tion to Protein Structure (Garland Publishing, New York,N.Y.(1991)) ;&Thornton等人的Nature354:105(1991),其內(nèi)容已以引用的方式并入本文中。
[0069]非肽類(lèi)似物具有類(lèi)似肽模板的性質(zhì)，因此常于制藥界中用為藥物。此類(lèi)類(lèi)型的非妝化合物稱(chēng)為"妝模擬物"。Fauchere 的 J.Adv.Drug Res.15:29 (1986) ;Veber 與Freidinger 的 TINS, p.392(1985);及 Evans 等人的 J.Med.Chem.30:1229(1987)，其內(nèi)容已以引用的方式并入本文中。此類(lèi)化合物經(jīng)常藉助于計(jì)算機(jī)化分子建模開(kāi)發(fā)出來(lái)。肽模擬物在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似具有醫(yī)療用途的肽，可用于產(chǎn)生同等醫(yī)療效力或預(yù)防效力。通常，肽模擬物在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似模范多肽(也即具有所需生化性質(zhì)或醫(yī)藥活性的多肽)，如:人類(lèi)抗體，但其中一個(gè)或多個(gè)肽聯(lián)結(jié)可選地利用本領(lǐng)域已知的方法，被選自下列的聯(lián)結(jié)置換:-ch2nh-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH = CH-(順式與反式)、-coch2-、-ch(oh) CH2-、與-ch2so-。一致序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸用相同種類(lèi)型的D-氨基酸(例如:以D-賴(lài)氨酸置換L-賴(lài)氨酸)進(jìn)行系統(tǒng)性取代時(shí)，可產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽。此外，包含一致序列或?qū)嵸|(zhì)上相同一致序列變化的受限定的妝可依本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生(Rizo與Gierasch的Ann.Rev.Biochem.61:387 (1992)，其內(nèi)容已以引用的方式并入本文中)；例如:添加可以形成分子內(nèi)二硫鍵而使肽環(huán)化的內(nèi)部半胱氨酸殘基。
[0070]"抗體"指完全抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗原結(jié)合部分會(huì)與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)特鼻性結(jié)合。其一般說(shuō)明參見(jiàn)Fundamental Immunology,第7章(Paul,W.編輯,第2版,RavenPress, N.Y.(1989))(其內(nèi)容已以引用的方式完全并入本文中，供所有目的用)?？乖Y(jié)合部分可利用重組DNA技術(shù)或酶性或化學(xué)性裂解完整抗體而產(chǎn)生。抗原結(jié)合部分包括:Fab、Fab'、F(ab' )2、Fd、Fv、dAb、與補(bǔ)體決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙重抗體(diabodies)與多肽，所述多肽包含足以賦與特異性抗原與多肽的結(jié)合性的抗體的至少一部份。
[0071]從N-末端至C-末端，輕鏈與重鏈可變結(jié)構(gòu)域均包含F(xiàn)R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、Q)R3與FR4區(qū)。各結(jié)構(gòu)域的氨基酸分配是根據(jù)Kabat的"Sequences ofProteins of Tmmunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda,Md.(1987andl991))，或Chothia與 Lesk 的 J.Mol.Biol.196:901-917(1987) ;Chothia等人的 Nature342:878-883(1989)中的定義。
[0072]本文中以數(shù)字表示的抗體是指得自相同編號(hào)的雜交瘤的單克隆抗體。例如:單克隆抗體3.1.1得自雜交瘤3.1.1。
[0073]本文中所使用Fd片段指該由Vh與ChI結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段；Fv片段由抗體的單臂中Vlj與Vh結(jié)構(gòu)域組成；及dAb片段(Ward等人的Nature341:544-546(1989))由Vh結(jié)構(gòu)域組成。
[0074]有些實(shí)施方案中，抗體為單鏈抗體(scFv)，其中' 與Vh結(jié)構(gòu)域經(jīng)由合成的連接體配對(duì)形成單價(jià)分子，該連接體使所述結(jié)構(gòu)域得以形成單一蛋白質(zhì)鏈。(Bird等人的 Science242:423-426(1988)與 Huston 等人的 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883 (1988)) ο有些實(shí)施方案中，抗體為雙重抗體(diabodies)，也即Vh與Vl結(jié)構(gòu)域均表達(dá)在單一多肽鏈上的二價(jià)抗體，但其中使用的連接體太短，無(wú)法在同一條鏈上兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間形成配對(duì)，以致迫使結(jié)構(gòu)域必需與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而創(chuàng)造出兩個(gè)抗原結(jié)合位置。(參見(jiàn)例如:Holliger P.等人的Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448(1993)，及 Poljak R.J.等人的 Structure〗:1121-1123 (1994))。有些實(shí)施方案中，可將來(lái)自本發(fā)明抗體的一個(gè)或多個(gè)CDRs，經(jīng)由共價(jià)性或非共價(jià)性方式引進(jìn)分子中，形成可特異性結(jié)合CD40的免疫粘附素。此類(lèi)實(shí)施方案中，CDR(S)可作為較大多肽鏈的一部分引進(jìn)，可與另一條多肽鏈共價(jià)聯(lián)結(jié)，或可以非共價(jià)性方式引進(jìn)。
[0075]具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位置的實(shí)施方案中，此類(lèi)結(jié)合位置可相同或相異。
[0076]本文所使用"人類(lèi)抗體"一詞指其中所有可變性及恒定性結(jié)構(gòu)域序列均為人類(lèi)序列的任何抗體。此類(lèi)抗體可依下文中說(shuō)明的多種方式制備。
[0077]本文所使用"嵌合抗體"一詞指包含來(lái)自兩種或多種不同抗體的區(qū)段的抗體。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)CDRs衍生自人類(lèi)抗-CD40抗體。另一項(xiàng)實(shí)施方案中，所有CDRs均衍生自人類(lèi)抗-CD40抗體。另一項(xiàng)實(shí)施方案中，于嵌合抗體中組合來(lái)自一種以上人類(lèi)抗-CD40抗體的CDRs。例如:嵌合抗體可包含來(lái)自第一種人類(lèi)抗-CD40抗體中輕鏈的⑶Rl、來(lái)自第二種人類(lèi)抗-⑶40抗體中輕鏈的⑶R2、與來(lái)自第三種人類(lèi)抗-⑶40抗體中輕鏈的⑶R3與⑶R3，且來(lái)自重鏈的⑶Rs可衍生自一種或多種其它抗-⑶40抗體。此外，構(gòu)架區(qū)可衍生自相同抗-CD40抗體或衍生自一個(gè)或多個(gè)不同人體。[0078]本文所使用"活化型抗體"(本文中也稱(chēng)為"激動(dòng)劑抗體")指該抗體當(dāng)加至表達(dá)⑶40的細(xì)胞、組織或生物體中時(shí)，可使一種或多種⑶40活性提高至少約20%。有些實(shí)施方案中，抗體活化⑶40活性達(dá)至少40 %、50%、60 %、70%、80%、85 %。有些實(shí)施方案中，于CD40L的存在下添加活化型抗體。有些實(shí)施方案中，使用全血表面分子增量調(diào)節(jié)分析法測(cè)定活化型抗體的活性。參見(jiàn)實(shí)例VII。另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用樹(shù)突細(xì)胞分析法測(cè)定IL-12的釋出，來(lái)測(cè)定活化型抗體的活性。參見(jiàn)實(shí)例VIII。另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用活體內(nèi)腫瘤模型測(cè)定活化型抗體的活性。參見(jiàn)實(shí)例X。
[0079]抗體或免疫球蛋白分子的片段或類(lèi)似物很容易由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員依據(jù)本說(shuō)明書(shū)的教示制備。片段或類(lèi)似物的優(yōu)選氨基-與羧基-末端出現(xiàn)在功能性結(jié)構(gòu)域的臨界處。結(jié)構(gòu)性與功能性結(jié)構(gòu)域可經(jīng)由比對(duì)核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與已公開(kāi)或?qū)Ｓ械男蛄袛?shù)據(jù)庫(kù)來(lái)判別。優(yōu)選采用計(jì)算機(jī)化比對(duì)法來(lái)判別序列基元或預(yù)測(cè)出現(xiàn)在其它已知結(jié)構(gòu)和/或功能的蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)域。可采用已知方法判別折疊成已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列。參見(jiàn)Bowie等人的Science253:164(1991)。
[0080]本文所使用"表面胞質(zhì)團(tuán)共振(surface plasmon resonance)"指可經(jīng)由檢測(cè)生物感應(yīng)器基質(zhì)中蛋白質(zhì)濃度的變化，來(lái)分析實(shí)時(shí)生物特異性相互作用的光學(xué)現(xiàn)象，例如:使用 BIAcore 系統(tǒng)進(jìn)行(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)。進(jìn)一步的說(shuō)明可參見(jiàn) Jonsson U.等人的 Ann.Biol.Clin.51:19-26 (1993) ； JonssonU.等人的 Biotechniquesll:620-627(1991) ；Jonsson B.等人的 J.Mol.Recognit.8:125-131 (1995);及 Johnsson B.等人的 Anal.Biochem.198:268-277(1991)。
[0081]" KD" —詞指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數(shù)。
[0082]"表位"一詞包括任何可特異性結(jié)合免疫球蛋白或T-細(xì)胞受體的蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常由化學(xué)活性表面分子群組成，如:氨基酸或糖側(cè)鏈，且通常具有特定三維結(jié)構(gòu)特性，及特定電荷特性。當(dāng)抗體的平衡解離常數(shù)< 14 1，優(yōu)選為< ΙΟΟηΜ，最優(yōu)選為(IOnM時(shí),可認(rèn)為抗體與抗原特 異性結(jié)合。
[0083]本文所采用的20種常見(jiàn)氨基酸與其縮寫(xiě)是依其常見(jiàn)用法。參見(jiàn)ImmunolQRy-ASynthesis (第二 版，E.S.Golub 與 D.R.Gren 編輯，Sinauer Associates, Sunderland,Mass.(1991))，其內(nèi)容已以引用的方式并入本文中。
[0084]"多核苷酸"一詞在本文中指至少長(zhǎng)10個(gè)堿基的聚合型核苷酸，其可為核糖核苷酸或脫氧核苷酸或此兩種型式核苷酸的修飾型。此術(shù)語(yǔ)包括單鏈與雙鏈。
[0085]本文所采用的"分離的多核苷酸"一詞指基因組、cDNA或合成的多核苷酸，或其某些組合，"分離的多核苷酸"基本(I)不與天然發(fā)現(xiàn)的"分離的多核苷酸"相關(guān)聯(lián)的多核苷酸的全部或部份結(jié)合，(2)與原本非天然聯(lián)結(jié)的多核苷酸進(jìn)行可操作性連接，或(3)不會(huì)在天然界中以較大序列的一部份出現(xiàn)。
[0086]本文所使用"寡核苷酸"一詞包括利用天然與非天然寡核苷酸鍵共同聯(lián)結(jié)的天然與經(jīng)修飾的核苷酸。寡核苷酸為多核苷酸子序列，通常長(zhǎng)度包含200個(gè)堿基或更少。優(yōu)選寡核苷酸為長(zhǎng)10至60個(gè)堿基，最優(yōu)選為長(zhǎng)12、13、14、15、16、17、18、19、或20至40個(gè)堿基。寡核苷酸通常為單鏈，例如:引物與探針，但寡核苷酸也可為雙鏈，例如:用于構(gòu)建基因突變體時(shí)。本發(fā)明寡核苷酸可為有義或反義寡核苷酸。
[0087]本文所使用"天然核苷酸"一詞包括脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸。本文所使用"經(jīng)修飾的核苷酸"一詞包括具有經(jīng)修飾或經(jīng)取代糖基等等的核苷酸。"寡核苷酸聯(lián)結(jié)"在本文中包括這樣一些寡核苷酸聯(lián)結(jié)，如:硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯氨基磷酸酯、苯氨基磷酸酯、氨基磷酸酯，等等。參見(jiàn)例如=LaPlanche等人的 Nucl.Acids Res.14:9081 (1986) ;Stec 等人的 J.Am.Chem.Soc.106:6077 (1984)；Stein 等人的 Nucl.Acids Res.16:3209 (1988) ;Zon 等人的 Ant1-Cancer Drug Design6:539(1991) ；Zon 等人的 Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,pp.87-108 (F.Eckstein 編輯，Oxford University Press, Oxford England) (1991));美國(guó)專(zhuān)利 N0.5, 151, 510 ;Uhlmann 與 Peyman 的 Chemical Reviews90:543 (1990)，其內(nèi)容已以引用的方式并入本文中。若需要時(shí)，寡核苷酸可包括檢測(cè)標(biāo)記。
[0088]"可操作性連接"序列包括緊鄰目標(biāo)基因的表達(dá)控制序列及具有反向作用或與目標(biāo)基因具有一段距離的表達(dá)控制序列。本文中所使用"表達(dá)控制序列"指其連接的編碼序列為了進(jìn)行表達(dá)及處理而必需的多核苷酸序列。表達(dá)控制序列包括適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄開(kāi)始、終止、啟動(dòng)子與增強(qiáng)子序列；有效的RNA處理信號(hào)如:剪接與聚腺苷酸化信號(hào)；穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mRNA的序列；加強(qiáng)翻譯效率的序列(也即Kozak —致序列)；加強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；及若需要時(shí)，促進(jìn)蛋白質(zhì)分泌的序列。此類(lèi)控制序列的性質(zhì)差異依宿主生物體而定；在原核生物中，此類(lèi)控制序列通常包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位置、及轉(zhuǎn)錄終止序列；在真核生物中，此類(lèi)控制序列通常包括啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄終止序列。"控制序列"一詞應(yīng)至少包括所有為了表達(dá)與加工處理所必要的成分，也可包括其它有益的成分，例如:前導(dǎo)序列與融合對(duì)象序列(fusion partner sequence)。
[0089]本文所使用"載體"一詞指可運(yùn)送與其連接的另一種核酸的核酸分子。有些實(shí)施方案中，載體為質(zhì)粒，也即環(huán)形雙鏈DNA，其中可連接其它DNA節(jié)段。有些實(shí)施方案中，載體為病毒載體，其中外加的DNA節(jié)段可連接至病毒基因組中。有些實(shí)施方案中，載體可于其所引入的宿主細(xì)胞中(例如:具有細(xì)菌性復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌性載體與游離型哺乳動(dòng)物載體)進(jìn)行自主性復(fù)制。其它實(shí)施方案中，載體(例如:非游離型哺乳動(dòng)物載體)可于引進(jìn)宿主細(xì)胞中后整合入宿主細(xì)胞的基因 組中，藉以與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體可指導(dǎo)其所操縱性聯(lián)結(jié)的基因表達(dá)。此類(lèi)載體在本文中稱(chēng)為"重組表達(dá)載體"(或簡(jiǎn)稱(chēng)"表達(dá)載體")。
[0090]本文所使用"重組宿主細(xì)胞"(或簡(jiǎn)稱(chēng)"宿主細(xì)胞")一詞指其中已引進(jìn)重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)了解，"重組宿主細(xì)胞"與"宿主細(xì)胞"不僅指特定的某個(gè)體細(xì)胞，也指此類(lèi)細(xì)胞的子代。由于某些修飾可能因突變或環(huán)境影響而發(fā)生在下一代中，此類(lèi)子代事實(shí)上不一定與母細(xì)胞相同，但仍包括在本文所使用的"宿主細(xì)胞"一詞的范圍內(nèi)。
[0091]"選擇性雜交"在本文中指可檢測(cè)到的特異性結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明多核苷酸、寡核苷酸與其片段可于盡可能降低與非特異性核酸產(chǎn)生可檢測(cè)到的結(jié)合作用的雜交及洗滌條件下，與核酸鏈進(jìn)行選擇性雜交。"高嚴(yán)格性"或"高度嚴(yán)格"條件可用于達(dá)到本領(lǐng)域已知且將于本文中討論的選擇性雜交條件。"高嚴(yán)格性"或"高度嚴(yán)格"條件的一項(xiàng)實(shí)例為由多核苷酸與另一種多核苷酸孵育，其中一種多核苷酸可固定在固體表面上(如:膜)，于雜交緩沖液中(6X SSPE 或 SSC、50% 甲酰胺、5XDenhardt' s 試劑、0.5% SDS、100 μ g/ml 變性鮭魚(yú)精子DNA片段)，于42°C雜交溫度下培養(yǎng)12-16小時(shí)后，隨后于55°C下，使用洗滌緩沖液(1XSSC、0.5% SDS)洗滌2次。也參見(jiàn)如上述Sambrook等人的文獻(xiàn)，pp.9.50-9.55。[0092]核酸序列說(shuō)明中的"序列同一性百分比"一詞指兩種序列進(jìn)行最大相關(guān)性比對(duì)時(shí)，為相同的殘基。序列同一性比較的長(zhǎng)度至少約9個(gè)核苷酸，通常至少約18個(gè)核苷酸，更通常至少約24個(gè)核苷酸，典型為至少約28個(gè)核苷酸，更典型為至少約32個(gè)核苷酸，優(yōu)選為至少約36、48或更多個(gè)核苷酸。本領(lǐng)域已知有多種不同算法可用于測(cè)量核苷酸序列同一'I"生。例如:可使用FASTA、Gap或Bestfit比對(duì)多核苷酸序列，其是威斯康星州麥迪遜市遺傳計(jì)算機(jī)小組(GCG)的Wisconsin Packagel0.0版程序。FASTA包括例如:FASTA2與FASTA3程序,提供疑問(wèn)序列(query sequence)與搜尋序列(search sequence)之間最優(yōu)重迭區(qū)的排列及同一性百分比(Pearson, Methods Enzymo1.183:63-98 (1990) ；Pearson,Methods Mol.Biol.132:185-219 (2000) ；Pearson,Methods Enzymol.266:227-258 (1996)；Pearson, J.Mol.Biol.276:71-84(1998);其內(nèi)容已以引用的方式并入本文中)。除非另有說(shuō)明，否則特定程序或算法使用默認(rèn)參數(shù)。例如:核酸序列之間的序列同一性百分比可使用FASTA，以其默認(rèn)參數(shù)測(cè)定(字長(zhǎng)為6，計(jì)分矩陣中使用NOPAM因子)或使用GCG6.1版所提供的Gap，以其默認(rèn)參數(shù)測(cè)定，其內(nèi)容已以引用的方式并入本文中。
[0093]除非另有說(shuō)明，否則所提及的核苷酸序列包含其互補(bǔ)鏈。因此，應(yīng)了解，所提及的具有特定序列的核酸應(yīng)包含其具有互補(bǔ)序列的互補(bǔ)鏈。
[0094]分子生物學(xué)領(lǐng)域中，研究者可互換使用"序列同一性百分比"、"序列相似性百分比"及"序列同源性百分比"等術(shù)語(yǔ)。本申請(qǐng)案中，此類(lèi)術(shù)語(yǔ)僅用在核酸序列時(shí)具有相同含義。
[0095]當(dāng)提及核酸或其片段時(shí)，"實(shí)質(zhì)相似性"或"實(shí)質(zhì)序列相似性"指當(dāng)經(jīng)過(guò)適當(dāng)插入或刪除后，與另一種核酸(或其互補(bǔ)鏈)進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)時(shí)，依任何已知的序列同一性算法(如:上述FASTA、BLAST或Gap)測(cè)定的核苷酸序列同一性為至少約85%，優(yōu)選為至少約90%，更優(yōu)選為至少約95%、96%、97%、98%或99%。
[0096]應(yīng)用在多肽上時(shí)，" 實(shí)質(zhì)同一性"一詞指當(dāng)經(jīng)過(guò)最適比對(duì)后，如:采用GAP或BESTFIT程序，使用默認(rèn)缺口值測(cè)定兩種肽序列之間具有至少70、75或80%序列同一性，優(yōu)選為至少90或95%序列同一性,更優(yōu)選為至少97、98或99%序列同一性。優(yōu)選的,不相同的殘基位置的差異最好為保守性氨基酸取代。"保守性氨基酸取代"指其中氨基酸殘基被另一種具有化學(xué)性質(zhì)(例如:電荷或親水性)類(lèi)似的側(cè)鏈R基的氨基酸殘基取代。通常，保守性氨基酸取代實(shí)質(zhì)上不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。若其中兩種或多種氨基酸序列的差異在于保守性取代時(shí)，可使序列同一性百分比或相似度上調(diào)，以校正取代作用的保守性質(zhì)。參見(jiàn)例如:Pearson, Methods Mol.Biol.243:307-31 (1994)。具有相似化學(xué)性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸基團(tuán)實(shí)例包括:1)脂肪族側(cè)鏈:甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、與異亮氨酸；2)脂肪族-羥基側(cè)鏈:絲氨酸與蘇氨酸；3)含酰胺側(cè)鏈:天冬酰胺與谷氨酰胺；4)芳香族側(cè)鏈:苯丙氨酸、酪氨酸、與色氨酸；5)堿性側(cè)鏈:賴(lài)氨酸、精氨酸、與組氨酸；6)酸性側(cè)鏈:天冬氨酸與谷氨酸 '及7)含硫側(cè)鏈:半胱氨酸與甲硫氨酸。優(yōu)選保守性氨基酸取基組為:纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴(lài)氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、及天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0097]或者，保守性置換為在Gonnet等人的Science256:1443-45(1992)(其內(nèi)容已以引用的方式并入本文中)所揭示的PAM250對(duì)數(shù)-近似值矩陣中得到正值的任何變化。"適度保守性"置換為在PAM250對(duì)數(shù)-近似值矩陣中得到非負(fù)值的任何變化。[0098]多肽的序列相似性(也稱(chēng)為序列同一性)典型地是使用序列分析軟件測(cè)定。蛋白質(zhì)分析軟件依據(jù)不同取代、刪除及其它修飾(包括保守性氨基酸取代)指定的相似性測(cè)定值，將相似的序列配對(duì)。例如=GCG包含的程序如:"Gap"與"Bestfit"可利用默認(rèn)參數(shù)來(lái)確定極相關(guān)的多肽之間的序列同源性或序列同一性(如:來(lái)自不同生物品種的同源肽)或野生型蛋白質(zhì)與其突變蛋白質(zhì)之間的序列同源性或序列同一性。參見(jiàn)例如:6.1版GCG。多肽序列也可利用FASTA (6.1版GCG程序)，使用默認(rèn)參數(shù)或推薦參數(shù)進(jìn)行比對(duì)。FASTA (例如:FASTA2與FASTA3)提供疑問(wèn)序列與搜尋序列之間最優(yōu)重迭區(qū)的比對(duì)及序列同一性百分比(Pearson, Methods Enzymol.183:63-98(1990) ；Pearson, Methods Mol.Biol.132:185-219(2000))。當(dāng)用本發(fā)明序列與含有大量來(lái)自不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)時(shí)，另一項(xiàng)優(yōu)選算法為計(jì)算機(jī)程序BLAST,尤指blastp或tblastn,其使用默認(rèn)參數(shù)測(cè)定。參見(jiàn)例如:Altschul 等人的 J.Mol.Biol.215:403-410 (1990) ；Altschul 等人的 NucleicsAcids Res.25:3389-402(1997);其內(nèi)容已以引用的方式并入本文中。
[0099]用于比對(duì)同源性的多肽序列長(zhǎng)度通常為至少約16個(gè)氨基酸殘基，通常至少約20個(gè)殘基，更通常為至少約24個(gè)殘基，典型為至少約28個(gè)殘基，優(yōu)選為超過(guò)約35個(gè)殘基。當(dāng)搜尋含有來(lái)自大量多種不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，最好比對(duì)氨基酸序列。
[0100]本文所使用"標(biāo)記"或"標(biāo)記的"術(shù)語(yǔ)指將另一種分子整合入抗體中。一項(xiàng)實(shí)施方案中，標(biāo)記為可檢測(cè)的標(biāo)記，例如:整合入放射性標(biāo)記的氨基酸或附接在生物素化部份的多肽上，其可利用標(biāo)記的抗生物素蛋白檢測(cè)(例如:含熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素或可使用光學(xué)或比色法檢測(cè)的酶活性)。另一項(xiàng)實(shí)施方案中，標(biāo)記可為醫(yī)療性的，例如:藥物綴合物或毒素。本領(lǐng)域已知有多種標(biāo)記多肽與糖蛋白的方法可以使用。多肽的標(biāo)記實(shí)例包括(但不限于)下列:放射性同位素或放射性核素(例如:3H、14C、15N、35S、9°Y、99Tc、mIn、1251、mI)、熒光標(biāo)記(例如:FITC、羅丹明、鑭系無(wú)機(jī)發(fā)光材料)、酶標(biāo)記(例如:辣根過(guò)氧化酶、β -半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物素基團(tuán)、可由第二報(bào)導(dǎo)體識(shí)別的預(yù)定多肽表位(例如:亮氨酸拉鏈型配對(duì)序列，第二抗體的結(jié)合位置、金屬結(jié)合性結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽)，磁性試劑，如:釓螯合物、毒素如百日咳毒素、紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌素D、溴乙啶、吐根堿、絲裂霉素、鬼曰亞乙苷、丹特賽(tenoposide)、長(zhǎng)春花新堿、長(zhǎng)春花堿、秋水仙素、阿霉素、道諾紅菌素、dihydroxy anthracin dione、mitoxantrone、光神霉素、放線菌素D、l-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾與嘌羅霉素及其類(lèi)似物或同源物。有些實(shí)施方案中，標(biāo)記是利用不同長(zhǎng)度的間隔臂連接的，以降低潛在的空間位阻。
[0101]患者一詞包括人類(lèi)及動(dòng)物受試者。
[0102]本說(shuō)明書(shū)與權(quán)利要求全文中，"包括"或其變體如"包含"意指包括所述實(shí)體或一群實(shí)體，但不排除任何其它實(shí)體或?qū)嶓w群。[0103]人類(lèi)抗-CD40抗體與其表征
[0104]人類(lèi)抗體可避免某些與具有非-人類(lèi)(例如:嚙齒類(lèi)動(dòng)物)可變區(qū)或恒定區(qū)的抗體相關(guān)的問(wèn)題。此類(lèi)問(wèn)題包括抗體的快速清除或?qū)箍贵w的免疫反應(yīng)。因此，在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供人源化的抗-CD40抗體。另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供人類(lèi)抗-CD40抗體。有些實(shí)施方案中，人類(lèi)抗-CD40抗體是由其基因組中包含人類(lèi)免疫球蛋白基因的嚙齒類(lèi)動(dòng)物經(jīng)免疫接種而產(chǎn)生人類(lèi)抗體。人類(lèi)抗-CD40抗體應(yīng)可使原本對(duì)非人類(lèi)單克隆抗體或非人類(lèi)衍生的單克隆抗體(Mabs)的免疫原性及過(guò)敏反應(yīng)降至最低，因此可提高所施用抗體的效力與安全性。完全人類(lèi)抗體應(yīng)可用在治療慢性及復(fù)發(fā)的人類(lèi)疾病上以提供實(shí)質(zhì)優(yōu)點(diǎn)，如:可能需要重復(fù)施用抗體的發(fā)炎與癌癥上。
[0105]本發(fā)明提供11種活化型人類(lèi)抗-CD40單克隆抗體(mAbs)及產(chǎn)生此類(lèi)抗體的雜交瘤細(xì)胞系。表A列出編碼全長(zhǎng)重鏈與輕鏈(包括前導(dǎo)序列)的核酸、推導(dǎo)的相應(yīng)的全長(zhǎng)氨基酸序列、及重鏈與輕鏈可變區(qū)的核苷酸與推導(dǎo)的氨基酸序列的序列號(hào)(SEQ ID NOS:)。
[0106]表A
[0107]
【權(quán)利要求】
1.一種特異性結(jié)合及活化人類(lèi)CD40的嵌合或人類(lèi)單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其抗原結(jié)合部分包含: a)包含來(lái)自重鏈可變區(qū)的重鏈CDRl、重鏈CDR2與重鏈CDR3的氨基酸序列的重鏈； 其中重鏈⑶Rl與重鏈⑶R2的該氨基酸序列分別獨(dú)立選自重鏈可變區(qū)的⑶Rl與⑶R2，其中該重鏈可變區(qū)的序列包含不超過(guò)18個(gè)相對(duì)于種系Vh3-30+、4-59、1-02、4.35或3-30.3基因所編碼的氨基酸序列的氨基酸變化； 其中重鏈CDR3的該氨基酸序列來(lái)自重鏈可變區(qū)的CDR3，其中該重鏈可變區(qū)選自下列: i)選自下列的抗體的重鏈可變區(qū):3.1.1,3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H_C109A、23.5.1,23.25.1、23.28.1,23.28.1H_D16E、23.29.1 與 24.2.I ; ii)包含氨基酸序列SEQ ID NOS:2、10、18、26、34、42、50、58、66、74 或 82 的重鏈可變區(qū)，或包含重鏈氨基酸序列SEQ ID NOS:90、92、96或98的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；或缺乏信號(hào)序列的所述氨基酸序列；及 iii)由選自SEQ ID NOS:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73 與 81 的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)，或包含由選自89、91、95與97的重鏈核酸序列編碼的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的重鏈可變區(qū)； 其中該重鏈CDR3的氨基酸序列可具有至多2個(gè)保守性氨基酸取代和/或2個(gè)非保守性氨基酸插入、刪除或取代；或 b)包含來(lái)自輕鏈可變區(qū)的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2與輕鏈CDR3的氨基酸序列的輕鏈； 其中輕鏈⑶Rl與輕鏈⑶R3的該氨基酸序列分別獨(dú)立選自輕鏈可變區(qū)的⑶Rl與⑶R3，其中該輕鏈可變區(qū)包含不超 過(guò)10個(gè)相對(duì)于種系VKA3/A19、L5或A27基因所編碼的氨基酸序列的氨基酸變化；及 其中輕鏈CDR2的該氨基酸序列來(lái)自輕鏈可變區(qū)，其中該輕鏈可變區(qū)選自下列: i)選自下列抗體的輕鏈可變區(qū):3.1.1,3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1,21.2.1,22.1.1,23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1L_C92A、23.29.1 與 24.2.I ; ii)包含選自SEQ ID NOS:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76 與 84 的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，或包含選自SEQ ID NOS:94與100的輕鏈氨基酸序列的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或缺乏信號(hào)序列的所述氨基酸序列；及 iii)由選自SEQ ID NOS:3、11、19、27、35、43、51、59、67、75 與 83 的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)，或包含由選自SEQ ID NOS:93與99的輕鏈核酸序列編碼的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的輕鏈可變區(qū)； 其中該輕鏈CDR2的氨基酸序列可具有至多2個(gè)保守性氨基酸取代和/或2個(gè)非保守性氨基酸插入、刪除或取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中: (a)該重鏈CDRl與該重鏈CDR2的氨基酸序列相對(duì)于種系VH3_30+、4_59、1_02、4.35或3-30.3基因分別含有至多4個(gè)保守性氨基酸取代與2個(gè)非保守性氨基酸插入、刪除或取代；或 (b)該輕鏈CDRl與該輕鏈CDR3的氨基酸序列相對(duì)于種系VKA3/A19、L5或A27基因分別含有至多3個(gè)保守性氨基酸取代與2個(gè)非保守性氨基酸插入、刪除或取代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中: (a)該重鏈⑶Rl與該重鏈⑶R2的氨基酸序列分別選自重鏈可變區(qū)的⑶Rl與⑶R2，其中該重鏈可變區(qū)選自下列: i)選自下列抗體的重鏈可變區(qū):3.1.1,3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、`7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1H_C109A、23.5.1,23.25.1、`23.28.1,23.28.1H_D16E、23.29.1 與 24.2.I ; ii)包含選自SEQ ID NOS:2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96 與 98 的氨基酸序列或缺乏信號(hào)序列的該氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；及 iii)由選自SEQ ID NOS:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95 與 97 的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的重鏈可變區(qū)； 其中該重鏈⑶Rl與該重鏈⑶R2的氨基酸序列可以分別具有至多2個(gè)保守性氨基酸取代和/或2個(gè)非保守性氨基酸插入、刪除或取代；或 b)該輕鏈CDRl與該輕鏈CDR3的氨基酸序列獨(dú)立選自輕鏈可變區(qū)的CDRl與CDR3，其中該輕鏈可變區(qū)選自下列: i)選自下列抗體的輕鏈可變區(qū):3.1.1,3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1、`21.4.1,21.2.1,22.1.1,23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1L_C92A、23.29.1 與 24.2.I ; ii)包含選自SEQ ID NOS:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94 與 100 的氨基酸序列或缺乏信號(hào)序列的所述氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；及 iii)由選自SEQ ID NOS:3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93 與 99 的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的輕鏈可變區(qū)； 其中該輕鏈CDRl與該輕鏈CDR3的氨基酸序列可各自具有至多2個(gè)保守性氨基酸取代和/或2個(gè)非保守性氨基酸插入、刪除或取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中: (a)該重鏈⑶Rl、該重鏈⑶R2與該重鏈⑶R3的氨基酸序列各自獨(dú)立選自重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)選自下列: i)選自下列抗體的重鏈可變區(qū):3.1.1,3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、`7.1.2,10.8.3,15.1.1,21.4.1,21.2.1,22.1.1,22.1.1H_C109A、23.5.1,23.25.1、`23.28.1,23.28.1H_D16E、23.29.1 與 24.2.I ; ii)包含選自SEQ ID NOS:2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96 與 98 的氨基酸序列或缺乏信號(hào)序列的所述氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；；及 iii)由選自SEQ ID NOS:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95 與 97 的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的重鏈可變區(qū)；或 b)該輕鏈⑶Rl與該輕鏈⑶R3的氨基酸序列各自獨(dú)立選自輕鏈可變區(qū)的⑶Rl與⑶R3，其中該輕鏈可變區(qū)選自下列: i)選自下列抗體的輕鏈可變區(qū):3.1.1,3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2,10.8.3,15.1.1、`21.4.1,21.2.1,22.1.1,23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1L_C92A、23.29.1 與 24.2.I ; ii)包含選自SEQ ID NOS:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94 與 100 的氨基酸序列或缺乏信號(hào)序列的所述氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；及 iii)由選自SEQ ID NOS:3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93 與 99 的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的輕鏈可變區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中: (a)該重鏈包含選自下列的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列: i)選自下列抗體的重鏈可變區(qū):3.1.1,3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、7.1.2,10.8.3,15.1.1,21.4.1,21.2.1,22.1.1,22.1.1H_C109A、23.5.1,23.25.1、23.28.1,23.28.1H_D16E、23.29.1 與 24.2.I ;
ii)包含選自SEQ ID NOS:2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96 與 98 的氨基酸序列或缺乏信號(hào)序列的該氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；及
iii)由選自SEQ ID NOS:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95 與 97 的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的重鏈可變區(qū)； 其中該重鏈可變區(qū)的氨基酸序列可具有至多6個(gè)保守性氨基酸取代和/或4個(gè)非保守性氨基酸插入、刪除或取代；或 b)該輕鏈包含選自下列的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列:
i)選自下列抗體的輕鏈可變區(qū):3.1.1,3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2,10.8.3,15.1.1、21.4.1,21.2.1,22.1.1,23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1L_C92A、23.29.1 與 24.2.I ; ii)包含選自SEQ ID NOS:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94 與 100 的氨基酸序列或缺乏信號(hào)序列的該氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；及
iii)由選自SEQ ID NOS:3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93 與 99 的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的輕鏈可變區(qū)； 其中該輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列可具有至多6個(gè)保守性氨基酸取代和/或4個(gè)非保守性氨基酸插入、刪除或取代。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中: (a)該重鏈包含選自下列重鏈可變區(qū)的氨基酸序列:i)選自下列抗體的重鏈可變區(qū):3.1.1,3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、7.1.2,10.8.3,15.1.1,21.4.1,21.2.1,22.1.1,22.1.1H_C109A、23.5.1,23.25.1、23.28.1,23.28.1H_D16E、23.29.1 與 24.2.I ;
ii)包含選自SEQ ID NOS:2、10、18、26、34、42、50、58、66、74、82、90、92、96 與 98 的氨基酸序列或缺乏信號(hào)序列的該氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；及
iii)由選自SEQ ID NOS:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73、81、89、91、95 與 97 的核酸序列編碼的重鏈可變區(qū)，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的重鏈可變區(qū)；或 b)該輕鏈包含選自下列輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列:
i)選自下列抗體的輕鏈可變區(qū):3.1.1,3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2,10.8.3,15.1.1、21.4.1,21.2.1,22.1.1,23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1L_C92A、23.29.1 與 24.2.I ; ii)包含選自SEQ ID NOS:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84、94 與 100 的氨基酸序列或缺乏信號(hào)序列的該氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；及 iii)由選自SEQ ID NOS:3、11、19、27、35、43、51、59、67、75、83、93 與 99 的核酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的輕鏈可變區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中: (a)該重鏈包含選自下列的氨基酸序列:i)選自下列抗體的重鏈:3.1.1,3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A_V97A、7.1.2、.10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1,22.1.1,22.1.1H_C109A、23.5.1,23.25.1,23.28.1、.23.28.1H-D16E、23.29.1 與 24.2.I ; ii)包含選自SEQ ID NOS:6、14、22、30、38、46、54、62、70、78 與 86 的氨基酸序列或缺乏信號(hào)序列的該氨基酸序列的重鏈；及 iii)由選自SEQ ID NOS:5、13、21、29、37、45、53、61、69、77 與 85 的核酸序列編碼的重鏈，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的重鏈； 其中該氨基酸序列可具有至多6個(gè)保守性氨基酸取代和/或4個(gè)非保守性氨基酸插入、刪除或取代；或 b)該輕鏈包含選自下列的氨基酸序列: i)選自下列抗體的輕鏈:3.1.1,3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2,10.8.3,15.1.1,21.4.1、.21.2.1,22.1.1,23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1L_C92A、23.29.1,23.29.1L-R174K 與.24.2.1 ； ii)包含選自SEQ ID NOS:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88 與 102 的氨基酸序列或缺乏信號(hào)序列的該氨基酸序列的輕鏈；及 iii)由選自SEQ ID NOS:7、15、23、31、39、47、55、63、71、79、87 與 101 的核酸序列編碼的輕鏈，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的輕鏈； 其中，該氨基酸序列在輕鏈的各CDR區(qū)中可具有至多6個(gè)保守性氨基酸取代和/或4個(gè)非保守性氨基酸插入、刪除或取代。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中: (a)該重鏈包含選自下列的氨基酸序列: i)選自下列抗體的重鏈:3.1.1,3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A_V97A、7.1.2、.10.8.3,15.1.1,21.4.1,21.2.1,22.1.1,22.1.1H_C109A、23.5.1,23.25.1,23.28.1、.23.28.1H-D16E、23.29.1 與 24.2.I ; ii)包含選自SEQ ID NOS:6、14、22、30、38、46、54、62、70、78、86、90、92、96 與 98 的氨基酸序列或缺乏信號(hào)序列的該氨基酸序列的重鏈；及 iii)由選自SEQ ID NOS:5、13、21、29、37、45、53、61、69、77、85、89、91、95 與 97 的核酸序列編碼的重鏈，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的重鏈；或 b)該輕鏈包含選自下列的氨基酸序列:i)選自下列抗體的輕鏈:3.1.1,3.1.1L-L4M-L83V、7.1.2、10.8.3、15.1.1,21.4.1、.21.2.1,22.1.1,23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1L_C92A、23.29.1,23.29.1L-R174K 與.24.2.1 ； ii)包含選自SEQ ID NOS:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88 與 102 的氨基酸序列或缺乏信號(hào)序列的該氨基酸序列的輕鏈；及 iii)由選自SEQ ID NOS:7、15、23、31、39、47、55、63、71、79、87 與 101 的核酸序列編碼的輕鏈，或缺乏信號(hào)序列的所述編碼的輕鏈。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8項(xiàng)中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其抗原結(jié)合部分包含根據(jù)(a)的重鏈與根據(jù)(b)的輕鏈。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其部份包含重鏈與輕鏈，且其中重鏈與輕鏈的氨基酸序列選自下列: a)3.1.1的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； b)7.1.2的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； c)10.8.3的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； d)15.1.1的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； e)21.4.1的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； f)21.2.1的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； g)22.2.1的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； h)22.1.1H-C109A的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； i)23.5.1的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； j)23.25.1的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； k)23.28.1的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； 1)23.28.1L-C92A的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； m)23.28.1H-D16E的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； η) 23.29.1的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； 0)24.2.1的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； P) 3.1.1Η-Α78Τ的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； q)3.1.1H-A781-V88A- V97A的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； r)3.1.1L-L4M-L83V的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列；與 s)23.29.1L-R174K的重鏈氨基酸序列與輕鏈氨基酸序列； 其中重鏈與輕鏈的氨基酸序列可分別具有至多6個(gè)保守性氨基酸取代和/或4個(gè)非保守性氨基酸插入、刪除或取代。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其部份包含重鏈與輕鏈，其中該重鏈的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與該輕鏈的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列選自下列: a)選自SEQID NOS:2、90與92的氨基酸序列，及選自SEQ ID NOS:4與94的氨基酸序列； b)氨基酸序列SEQID NO:10與氨基酸序列SEQ ID NO:12 ； c)氨基酸序列SEQID NO:18與氨基酸序列SEQ ID NO:20 ； d)氨基酸序列SEQID NO:26與氨基酸序列SEQ ID NO:28 ； e)氨基酸序列SEQID NO:34與氨基酸序列SEQ ID NO:36 ； f)氨基酸序列SEQID NO:42與氨基酸序列SEQ ID NO:44 ； g)選自SEQID NO:50與96的氨基酸序列及氨基酸序列SEQ ID NO:52 ； h)氨基酸序列SEQID NO:58與氨基酸序列SEQ ID NO:60 ； 1)選自SEQID NOS:66與98的氨基酸序列，及選自SEQ ID NOS:68與100的氨基酸序列；與 j)氨基酸序列SEQ ID NO:74與氨基酸序列SEQ ID NOS:78 ； 其中該氨基酸序列可選的缺乏信號(hào)序列，且 其中重鏈與輕鏈的氨基酸序列可分別具有至多6個(gè)保守性氨基酸取代和/或4個(gè)非保守性氨基酸插入、刪除或取代。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其部份不包含任何保守性氨基酸取代或非保守性氨基酸插入、刪除或取代。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中該抗體選自下列:3.1.1,3.1.1H-A78T、.3.1.1H-A78T-V88A-V97A.3.1.1L-L4M、L83V、7.1.2,10.8.3,15.1.1,21.4.1,21.2.1、.22.1.1,22.1.1H-C109A、23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1L_C92A、23.28.1H-D16E、.23.28.1L-C92A、23.29.1,23.29.1L-R174K 與 24.2.1。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其部份具有至少一種選自下列的性質(zhì): a)不與小鼠、大鼠、狗和/或兔子B細(xì)胞結(jié)合； b)會(huì)與人類(lèi)、獼猴和/或恒河猴B細(xì)胞結(jié)合； c)其對(duì)CD40的選擇性比其對(duì)核因子K-B受體激活劑(RANK)、4-1BB(⑶137)、腫瘤壞死因子受體-1 (TNFR-1)及腫瘤壞死因子受體-2(TNFR-2)的選擇性高出至少100倍； d)其與CD40結(jié)合的Kd為4X10-1QM或以下； e)其與CD40解離的Koff為2χ10-4或以下； f)可于活體內(nèi)，于人類(lèi)T細(xì)胞和/或人類(lèi)樹(shù)突細(xì)胞的存在下抑制腫瘤生長(zhǎng)； g)可于沒(méi)有人類(lèi)免疫細(xì)胞下，抑制CD40-陽(yáng)性腫瘤生長(zhǎng)； h)提高人類(lèi)B-細(xì)胞表面上10八1、]\^(:-11、87-2、^71、0023和/或^71的表達(dá)； i)提高人類(lèi)樹(shù)突細(xì)胞分泌IL-12p40、IL-12p70和/或IL-8； j)提高人類(lèi)樹(shù)突細(xì)胞表面上ICAM、MHC-11、B7-2和/或⑶83的表達(dá)； k)在同種異基因刺激作用期間，提高人類(lèi)T細(xì)胞的干擾素-Y的表達(dá)； I)可于人類(lèi)CD40L的存在下與人類(lèi)CD40結(jié)合； m)會(huì)與CD40的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域I或結(jié)構(gòu)域2中所含的人類(lèi)CD40的表位結(jié)合；及 η)會(huì)與CD40的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域2或結(jié)構(gòu)域3中所含的人類(lèi)CD40的表位結(jié)合。
15.一種特異性結(jié)合及活化人類(lèi)CD40的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其部份具有至少一種選自下列的性質(zhì): a)會(huì)與選自下列的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD40:3.1.1,3.1.1H-A78T、.3.1.1H-A78T-V88A-V97A.3.1.1L-L4M、L83V、7.1.2,10.8.3,15.1.1,21.4.1,21.2.1、.22.1.1,22.1.1H-C109A、23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1L_C92A、23.28.1H-D16E、.23.28.1L-C92A、23.29.1,23.29.1L-R174K 及 24.2.1 ； b)其與選自下列的抗體結(jié)合CD40的相同表位:3.1.1,3.1.1H-A78T、.3.1.1H-A78T-V88A-V97A.3.1.1L-L4M、L83V、7.1.2,10.8.3,15.1.1,21.4.1,21.2.1、.22.1.1,22.1.1H-C109A、23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1L_C92A、23.28.1H-D16E、.23.28.1L-C92A、23.29.1,23.29.1L-R174K 及 24.2.1 ； c)其與⑶40結(jié)合的Kd實(shí)質(zhì)上與選自下列的抗體與⑶40結(jié)合的Kd相同:3.1.1、.3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、3.1.1L-L4M、L83V、7.1.2,10.8.3,15.1.1、.21.4.1,21.2.1,22.1.1,22.1.1H_C109A、23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1L-C92A、.23.28.1H-D16E、23.28.1L_C92A、23.29.1,23.29.1L-R174K 及 24.2.1 ;及 d)其與⑶40結(jié)合的Ktjff實(shí)質(zhì)上與選自下列的抗體與⑶40結(jié)合的Ktjff相同:3.1.1、.3.1.1Η-Α78Τ、3.1.1H-A78T-V88A-V97A、3.1.1L-L4M、L83V、7.1.2,10.8.3,15.1.1、.21.4.1,21.2.1,22.1.1,22.1.1H_C109A、23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1L-C92A、.23.28.1H-D16E、23.28.1L_C92A、23.29.1,23.29.1L-R174K 及 24.2.1。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，其是: a)一種免疫球蛋白G(IgG)、IgM, IgE, IgA、或IgD分子；或由此類(lèi)分子衍生；或 b)一種Fab片段、F(ab' )2片段、Fv片段、單鏈抗體、人源化抗體、嵌合抗體或雙特異性抗體。
17.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的抗體或其部份，與藥物可接受的載體。
18.一種使用特異性結(jié)合及活化人類(lèi)CD40的抗體或其抗原結(jié)合部分以治療人類(lèi)癌癥的方法，其包括的步驟為對(duì)該人體施用治療該癌癥有效量的抗體。
19.一種使用抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合部分治療有此需要的患者的方法，其包括的步驟為對(duì)該患者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的抗體或根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物。
20.一種對(duì)有此需要的人類(lèi)加強(qiáng)免疫反應(yīng)的方法，其包括的步驟為對(duì)該患者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分或根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物。
21.一種分離的細(xì)胞系，其產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分，或該抗體或該部份的重鏈或輕鏈。
22.根 據(jù)權(quán)利要求21的細(xì)胞系，其產(chǎn)生選自下列的抗體:3.1.1、3.1.1H-A78T、.3.1.1H-A78T-V88A-V97A.3.1.1L-L4M、L83V、7.1.2,10.8.3,15.1.1,21.4.1,21.2.1、.22.1.1,22.1.1H-C109A、23.5.1,23.25.1,23.28.1,23.28.1L_C92A、23.28.1H-D16E、.23.28.1L-C92A、23.29.1,23.29.1L-R174K與24.2.1，或其中該抗體具有與其相同的氨基酸序列。
23.一種分離的核酸分子，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈或其抗原結(jié)合部分或者輕鏈或其抗原結(jié)合部分的核酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的分尚的核酸分子,其中該核酸分子包含選自下列的核酸序列:
a)編碼選自3.1.1,3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A_V97A、3.1.1L-L4M、L83V、7.1.2、.10.8.3,15.1.1,21.4.1,21.2.1,22.1.1,22.1.1H_C109A、23.5.1,23.25.1,23.28.1、.23.28.1L-C92A、23.28.1H_D16E、23.28.1L_C92A、23.29.1,23.29.1L-R174K 與 24.2.1 的抗體的重鏈或其抗原結(jié)合部分的氨基酸序列的核酸序列；
b)編碼選自3.1.1,3.1.1H-A78T、3.1.1H-A78T-V88A_V97A、3.1.1L-L4M、L83V、7.1.2、.10.8.3,15.1.1,21.4.1,21.2.1,22.1.1,22.1.1H_C109A、23.5.1,23.25.1,23.28.1、.23.28.1L-C92A、23.28.1H_D16E、23.28.1L_C92A、23.29.1,23.29.1L-R174K 與 24.2.1 的抗體的輕鏈或其抗原結(jié)合部分的氨基酸序列的核酸序列； c)編碼選自SEQ ID NOS:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、.38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、.88、90、92、94、96、98、100與102的氨基酸序列，或缺乏信號(hào)序列的該氨基酸序列的核酸序列；及d)選自 SEQ ID NOS:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、.41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、.91、93、95、97、99與101的核酸序列。
25.—種載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求23或24的核酸分子,其中該載體任選地包含與核酸分子可操縱性連接的表達(dá)控制序列。
26.—種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求25的載體或根據(jù)權(quán)利要求23或24的核酸分子。
27.一種制造抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，其包括使根據(jù)權(quán)利要求26的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求21的細(xì)胞系于適當(dāng)條件下培養(yǎng)，并回收該抗體或其抗原結(jié)合部分。
28.一種非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物，其包含根據(jù)權(quán)利要求23或24的核酸分子，其中非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)該核酸。
29.一種制造特異性結(jié)合人類(lèi)CD40的抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，其包括自根據(jù)權(quán)利要求28的非人類(lèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物中分離所述抗體的步驟。
30.一種使用特異性結(jié)合人類(lèi)CD40的抗體或其抗原結(jié)合部分治療有此需要的患者的方法，其包括的步驟為 (a)施用有效量的編碼重鏈或其抗原結(jié)合部分的分離核酸分子、編碼輕鏈或其抗原結(jié)合部分的分離核酸分子、或編碼重鏈與輕鏈或其抗原結(jié)合部分的此兩種核酸分子；及 (b)表達(dá)該核酸分子。
31.一種特異性結(jié)合并活化人類(lèi)CD40的嵌合性或人類(lèi)單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其中該抗體或其部份包含重 鏈與輕鏈，且其中重鏈與輕鏈的氨基酸序列選自下列: a)氨基酸序列SEQID NO:6，與氨基酸序列SEQ ID NO:8 ； b)氨基酸序列SEQID NO: 14，與氨基酸序列SEQ ID NO:16 ； c)氨基酸序列SEQID NO:22，與氨基酸序列SEQ ID NO:24 ； d)氨基酸序列SEQID NO:30，與氨基酸序列SEQ ID NO:32 ;及 e)氨基酸序列SEQID NO:46，與氨基酸序列SEQ ID NO:48。
【文檔編號(hào)】A61K31/7088GK103450360SQ201310141396
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2002年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2001年11月9日
【發(fā)明者】V·貝迪安, R·P·格拉迪尤, J·科瓦蘭, X－C·佳, X·馮 申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司, 安進(jìn)弗里蒙特公司