專利名稱：體外誘導生成含L-ASPase II的紅細胞藥物的方法
技術領域：
本發明涉及一種使用慢病毒載體系統改造誘導性多能干細胞(IPS細胞)并將其在體外誘導生成含L-天冬酰胺酶II藥物紅細胞的方法，屬于再生醫學領域。
背景技術：
L-天門冬酰胺是某些腫瘤細胞生長必不可少的氨基酸，對人體正常細胞而言，自身具有合成L-天門冬酰胺的能力，而腫瘤細胞缺乏天門冬酰胺合成酶不能合成天門冬酰胺，其細胞需要從外源的L-天門冬酰胺攝取才能存活。L-天門冬酰胺酶
II(L-asparaginase, L-ASPase II)能催化水解L-天門冬酰胺生成L-天門冬氨酸和氨，因此能夠有效地抑制癌細胞的生長，最終使癌細胞消亡。所以L-ASPase II是治療腫瘤的一種重要藥物，尤其對急性淋巴細胞白血病(Actute lymphoblastic leukemia, ALL)和非何杰淋巴瘤(NHL)有較好療效。雖然L-ASPase II在臨床應用中有較好的療效，但L-ASPaseII在臨床應用過程會產生嚴重的毒副作用，引起過敏、急性胰腺炎、糖尿病、高血糖及血液系統異常等甚至危及生命的嚴重不良反應，這些毒副作用限制了 L-ASPase II在臨床的應用。目前如何減少L-ASPase II的毒副作用是臨床使用面臨的一個重要難題。紅細胞是血液中數量最多的血細胞，它具有極大的變形能力，可使其順利通過比自身直徑還小的毛細血管。研究表 明，當紅細胞處于輕度低滲(約為血漿滲透壓的1/2)的環境中，外界水分可進入紅細胞使之發生可逆性膨脹154% 174%，變為橢圓形，當達到溶血臨界點時，紅細胞膜上一些直徑20 50nm的孔隙將短暫開放，外界多肽、蛋白質、酶及藥物等均可通過這些孔道進入紅細胞腔內。而當紅細胞周圍環境恢復等滲狀態時，紅細胞又可縮小恢復原狀，膜上孔道亦隨之收縮，紅細胞的這些特性決定了可以將特定藥物包封于紅細胞內。此外，紅細胞作為藥物載體還有合成藥物載體無法比擬的優勢:1)理想的生物相容性及生物降解性；2)降低外源物質的免疫原性；3)提高藥物在體內的穩定性。研究表明，使用紅細胞來包埋L-ASPase II可以有效延長L-ASPase II在體內半衰期，減少L-ASPaseII用量，增加藥物靶向性，從而能夠有效降低L-ASPase II的毒副作用。雖然紅細胞藥物的研究取得了巨大的進展，但目前生產紅細胞藥物基本上采用的都是以改變滲透壓為基礎的制備方法，包括早期的低滲溶血法(hypotonic hemolysis)、低滲稀釋法(hypotonic dilution)以及改良后的低滲透析法(hypotonic dialysis)和低滲預漲法(hypotonic preswelling),以上方法都是通過改變滲透壓而改變紅細胞膜的通透性從而起到包埋藥物的目的。改變紅細胞膜通透性包埋藥物存在如下幾個問題:1)載體紅細胞存在不同程度的變形性降低；2)載體紅細胞存在不同程度膜損傷；3)載體紅細胞存在不同程度的形態異常；4)載體紅細胞脆性增大；以上這些改變會直接影響載藥紅細胞在體內的清除時間和藥物釋放效果。迫切需要生產一種既能夠發揮紅細胞藥物載體優勢又能保持紅細胞形態功能基本正常的紅細胞藥物是該領域研究的主要方向之一。誘導性多能干細胞(IPS細胞)作為一種無限來源的體外多能干細胞，業已證明在體外能夠生成形態功能正常的紅細胞，我們通過對IPS細胞使用慢病毒載體系統進行基因改造，并將之在體外誘導生成含有L-ASPase II的紅細胞，生成的紅細胞既能夠作為L-ASPase II的緩釋載體使用，又能夠保持紅細胞原有的形態功能，進一步降低了 L-ASPaseII的毒副作用，為今后的臨床應用打下堅實的基礎。
發明內容
針對上述現有技術，本發明提供了一種使用慢病毒載體系統改造誘導性多能干細胞(IPS細胞)并將其在體外誘導生成含L-ASPase II的紅細胞藥物的方法。本發明是通過以下技術方案實現的:體外誘導生成含L-ASPase II的紅細胞藥物的方法，包括以下步驟:I)使用慢病毒載體系統改造誘導性多能干細胞(IPS細胞):1.構建 pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA-L-ASPase II 質粒；I1.使用293T細胞包裝生成高滴度的含L-ASPase II的病毒顆粒；II1.使用病毒顆粒轉染誘導性多能干細胞(IPS細胞)；2)體外誘導誘導性多能干細胞(IPS細胞)生成含L-ASPase II的紅細胞:I.IPS細胞體外分化誘導成紅細胞體EB (Erythroid Body)；I1.EB誘導分化成成熟紅細胞。所述步驟2) I具體為:傳代12 30代的人的IPS細胞(hIPS)(步驟I) III制備)使用膠原蛋白酶IV (collagenase IV)消化后,轉移到由IMDM (Biochrome)為基礎培養液配制的培養液中，培養液中含SCF (Sigma, 100ng/mL) TPO (Sigma, 100ng/mL), FLT3配體(Sigma, 100ng/mL)，BMP4 (Peprotech,lOng/mL), VEGF-A165 (Sigma,5ng/mL)，IL-3(Sigma, 5ng/mL), IL-6 (Peprotech, 5ng/mL)以及促紅細胞生成素 EPO (Sigma, 3U/mL);細胞置于37°C，5%C02條件下培養20天形成EB ;形成EB后，用膠原蛋白酶B(Sigma，0.4U/mL)在37°C消化30分鐘后細胞置于緩沖液(Invitrogen)中10分鐘。所述步驟2) II具體為:①消化后EB細胞以5xl05/ml鋪瓶，培養液以MDM培養基(GIBIC0公司)為基礎培養基配制，培養液中含EPO (sigma公司，3 6U/ml), INSULIN (sigma公司，50 IOOng/ml), SCF (R&D 公司，50 100ng/ml), DEX (Sigma 公司，5 10 μ M), IL—3 (sigma 公司，5ng/ml),Heparin (sigma 公司,2U/ml)以及 Transferrin (sigma 公司 50 μ g/ml);置 37。。、5%C02條件下培養；②培養至第4天，細胞由培養瓶以lX105/ml轉入培養袋，培養液以IMDM培養基(GIBIC0公司)為基礎培養基配制，培養液中含EP0( sigma公司，3 6U/ml )，INSULINCsigma公司，50 100ng/ml)，SCF(R&D 公司，50 100ng/ml)，DEX(SIGMA 公司，5 10yM),IL-3(sigma 公司，5ng/ml)以及 Heparin (sigma 公司，2U/ml);置 37°C、5%C02 條件下培養；③培養至第8天，細胞培養液以IMDM培養基(GIBIC0公司)為基礎培養基配制，培養液中含 EPO (sigma 公司，3 6U/ml)，SCF (R&D 公司，50 100ng/ml)，DEX (SIGMA 公司，5 10 μ Μ)以及！feparin (sigma 公司，2U/ml);置 37°C、5%C02 條件下培養；④培養至第11天，換用以MDM培養基(GIBIC0公司)為基礎培養基配制的培養液，培養液中含DEX (SIGMA公司，5 10 μ M)和!feparin (sigma公司，2U/ml)，細胞密度調整為2xl06/ml ;置37°C、5%C02條件下培 養；
⑤培養至25天，收集終產物，即為含L-ASPase II的藥物紅細胞。所涉及的培養液中的試劑因子具體名稱如下:促紅細胞生成素(EPO);白介素6(IL-6);白介素3 (IL-3);促血小板生成素(TPO);骨形態發生蛋白4 (BMP4);干細胞刺激因子(SCF) ；FLT3配體；血管內皮生長因子(VEGF-A165);胰島素(Insulin);干細胞刺激因子(SCF);轉鐵蛋白(Transferrin);地塞米松(DEX);肝素(Heparin)。本發明通過對IPS細胞使用慢病毒載體系統進行基因改造，并將之在體外誘導生成含有L-ASPase II的紅細胞，生成的紅細胞既能夠作為L-ASPase II的緩釋載體使用，又能夠保持紅細胞原有的形態功能，進一步降低了 L-ASPase II的毒副作用，為今后的臨床應用打下堅實的基礎。
圖1:含目的基因 L-ASPase II 慢病毒載體(載體 pLenti6.3/V5-GW/Em_GFPVerA-L-ASPase II)的圖譜。圖2:使用慢病毒載體對IPS細胞進行基因改造流程圖。圖3:體外誘導IPS細胞生成紅細胞不同時期紅細胞成熟度比較示意圖，其中，
(I):培養當天；(2)培養第8天；(3)培養第11天；(4)培養第15天；(5)培養第20天；
(6)培養第25天。
4 =L-ASPase II SDS-PAGE 圖。(I 欄為刻度標記，2，3，4 欄為純化 L-ASPase II)圖5:L-ASPase II紫外吸收光譜圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例1:慢病毒載體構建及包裝從NCBI上查詢得到大腸桿菌L-天冬酰胺酶II基因序列(981bp，最后一組為終止子)及氨基酸序列(326aa)，如序列表中1、2所示。慢病毒載體構建實驗流程如下(流程如圖2所示):I)構建克隆載體:目的基因L-天冬酰胺酶II基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，得到目的基因通過BamH I和EcoR I酶切位點連接到pUC57載體上，構建成克隆載體pUC57-L-ASPase II。2)構建表達 載體:質粒 pUC57-L-ASPase II 和載體質粒 pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA (Invitrogen公司)同時使用BamH I和EcoR I酶進行雙酶切，酶切體系:IOx buffer2 μ I,BamH I 和 EcoR I 各 0.4 μ 1，質粒溶液 4 μ I (質粒濃度為 0.35 μ g/ μ 1)，ddH2013.2 μ 1，總體積10 μ I。酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。回收L-ASPase II基因片段和載體片段pLenti6.3/V5-GW/Em_GFP VerA, 16°C連接，過夜(12h)，連接產物轉化至E.coliDH5a感受態菌。在瓊脂平板上挑取大約10個克隆，每個克隆放入一個試管，每管加入對應抗性LB培養基(含氨芐青霉素100mg/ml)4ml，37°C、250rpm搖床過夜(12h)。將菌液做質粒抽提，并進行雙酶切鑒定，確認構建的載體pLenti6.3/V5-GW/Em_GFP VerA-L-ASPaseII(圖1)準確。3)質粒大抽:利用無內毒素質粒大量提取試劑盒(EndoFree plasmid giga kit,Qiagen 公司)抽提正確的重組質粒 pLenti6.3/V5-GW/Em_GFP VerA-L-ASPase II,并且利用雙酶切和測序法鑒定序列的準確性。4)病毒包裝(該步為生物領域常規的慢病毒包裝實驗操作,所涉及的試劑均為常規試劑，在此不再贅述):第一天:使用無抗生素DMEM+10%FBS鋪板293FT細胞，2ml/孔，確保第二天細胞密度達到80% 90%融合度。第二天:用500ul無血清培養基稀釋①2ug重組質粒(pLenti6.3/V5-GW/Em_GFPVerA-L-ASPase II+l.5ug psPAX2+l.5ug pMD2.G)；用500ul無血清培養基稀釋②15ul脂質體(lipofectamine2000)；5分鐘后，將質粒溶液和脂質體溶液(①和②)混合,室溫靜止20min。從含有293FT細胞的6孔板中吸出Iml無血清培養基，然后滴加入Iml上述質粒和脂質體混合物。6 IOh后，移除含有DNA-脂質體復合物的培養基，代之以正常培養液DMED+10%FBS (從此刻開始算轉染時間)。第三天:轉染24h后，熒光顯微鏡下觀察，轉染效率應達到70%以上。第四天、第五天:轉染后72h收獲含病毒的上清，3000rpm離心20min，0.45um濾膜過濾，去除細胞沉淀。12000轉離心濃縮細胞、分裝-80°C貯存，即為含L-ASPase II的病毒顆粒，同時進行病毒滴度測定(測定結果是5xl06TU/ml)。實施例2:使用慢病毒載體對IPS細胞基因改造I)鋪板:將對數生長期的IPS用0.05%胰酶消化重懸于PBS液后，按l*105/ml密度接種于12孔板，生長過夜(12h)。2)感染:將70 80%鋪滿12孔板中的培養液吸除，換新鮮的培養液，同時加入PBS濃度梯度稀釋的病毒液(總共5個梯度，準備5個1.5ml EP管，每管加入90μ 1PBS，往第一個管中加入10 μ I病毒原液,混勻后,吸取10 μ I加入第二個管混勻,依此類推,做5個稀釋度(10 10_4))，混合均勻后放入37°C，5%C02培養箱中培養。3)培養24h換液，48小時即可看熒光，將細胞置于MEF滋養層細胞上進行低密度培養(l*104/ml)，12 14天后挑取克隆，進行下一步的紅細胞培養。實施例3:體外誘導IPS細胞生成含L-ASPase II的紅細胞藥物I) IPS細胞體外分化誘導成紅細胞體EB (Erythroid Body)傳代12 30代的人的IPS細胞(hIPS)(實施例2制備)使用膠原蛋白酶IV(collagenase IV)消化后，轉移到由IMDM (Biochrome)為基礎培養液配制的培養液中，培養液中含 SCF (Sigma, 100ng/mL) TPO (Sigma, 100ng/mL), FLT3 配體(Sigma, IOOng/mL), BMP4 (Peprotech,lOng/mL), VEGF-A165 (Sigma,5ng/mL)，IL-3 (Sigma, 5ng/mL), IL-6(Peprotech, 5ng/mL)以及促紅細胞生成素EPO (Sigma, 3U/mL);細胞置于37°C，5%C02條件下培養20天形成EB ;形成EB后，用膠原蛋 白酶B (Sigma, 0.4U/mL)在37°C消化30分鐘后細胞置于緩沖液(invitrogen)中10分鐘。2) EB誘導分化成成熟紅細胞①消化后EB細胞以5xl05/ml鋪瓶，培養液以IMDM培養基(GIBIC0公司)為基礎培養基配制，培養液中含 EPO (sigma 公司，5U/ml )，INSULIN (sigma 公司，75ng/ml )，SCF (R&D公司，75ng/ml)，DEX (Sigma 公司，5 μ M)，IL-3 (sigma 公司，5ng/ml)，Heparin (sigma 公司，2U/ml),以及 Transferrin (sigma 公司 50 μ g/ml);置 37°C、5%C02 條件下培養；②培養至第4天，細胞由培養瓶以lX105/ml轉入培養袋，培養液以MDM培養基(GIBIC0公司)為基礎培養基配制，培養液中含EPO (sigma公司，5U/ml)，INSULIN (sigma公司，75ng/ml)，SCF (R&D 公司，75ng/ml )，DEX (Sigma 公司，5 μ M)，IL-3 (sigma 公司，5ng/ml)以及 Heparin (sigma 公司，2U/ml)。置 37°C、5%C02 條件下培養；③培養至第8天(從①中的培養開始算的)，細胞培養液以MDM培養基(GIBIC0公司)為基礎培養基配制，培養液中含EPO (sigma公司，5U/ml)，SCF (R&D公司，75ng/ml)，DEX (Sigma 公司，5μΜ)，以及！feparin (sigma 公司，2U/ml);置 37°C、5%C02 條件下培養；④培養至第11天(從①中的培養開始算的)，換用以MDM培養基(GIBIC0公司)為基礎培養基配制的培養液，培養液中含DEX(Sigma公司，5 μ Μ),以及Heparin(sigma公司，2U/ml)。細胞密度調整為2x107ml ;置37°C、5%C02條件下培養；⑤分別收集培養至11、15、20天的產物，進行成熟度比較；培養至25天時，收集終產物，即為含L-ASPase II的紅細胞藥物，進行紅系細胞形態分析(如圖3所示)。載藥紅細胞(終產物)各項血液學參數分析如表I所示，表I檢測結果表明載藥紅細胞在血液學參數指標上與正常紅細胞一致，載藥未對紅細胞正常形態及其他特性產生大的影響。載藥紅細胞(培養20天的產物，以及培養25 天的終產物)表型流式細胞分析如表2所示，表2結果顯示在培養末期紅細胞高表達紅細胞成熟標記包括CD71及CD235a，而低表達分化標記包括⑶45，⑶133及⑶36等，表明最后培養獲得的紅細胞為成熟紅細胞。表I
權利要求
1.體外誘導生成含L-ASPaseII的紅細胞藥物的方法，其特征在于:包括以下步驟: O使用慢病毒載體系統改造誘導性多能干細胞:1.構建 pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA-L-ASPase II 質粒； I1.使用293T細胞包裝生成高滴度的含L-ASPase II的病毒顆粒； III.使用病毒顆粒轉染誘導性多能干細胞； 2)體外誘導誘導性多能干細胞生成含L-ASPase II的紅細胞: I.IPS細胞體外分化誘導成紅細胞體EB ； I1.EB誘導分化成成熟紅細胞。
2.根據權利要求1所述的體外誘導生成含L-ASPaseII的紅細胞藥物的方法，其特征在于:所述步驟2) I具體為:傳代12 30代的人的IPS細胞使用膠原蛋白酶IV消化后，轉移到由MDM為基礎培養液配制的培養液中，培養液中含SCF100ng/mL，TP0100ng/mL, FLT3配體 100ng/mL，BMP410ng/mL, VEGF-A1655ng/mL, IL-35ng/mL, IL_65ng/mL 以及促紅細胞生成素EP03U/mL ;細胞置于37°C，5%C02條件下培養20天形成EB ;形成EB后，用膠原蛋白酶B在37°C消化30分鐘后細胞置于緩沖液中10分鐘。
3.根據權利要求1所述的體外誘導生成含L-ASPaseII的紅細胞藥物的方法，其特征在于:所述步驟2) II具體為: ①消化后EB細胞以5xl05/ml鋪瓶，培養液以IMDM培養基為基礎培養基配制，培養液中含 EP03 6U/ml，INSULIN50 100ng/ml，SCF50 100ng/ml，DEX5 10 μ M，IL_35ng/ml, Heparin2U/ml 以及 Transferrin50 μ g/ml ;置 37°C、5%C02 條件下培養； ②培養至第4天，細胞由培養瓶以lX105/ml轉入培養袋，培養液以IMDM培養基為基礎培養基配制，培養液中含 EP03 6U/ml，INSULIN50 100ng/ml，SCF50 100ng/ml，DEX5 10 μ M, IL 35ng/ml 以及！feparin2U/ml，置 37°C、5%C02 條件下培養； ③培養至第8天，細胞培養液以MDM培養基為基礎培養基配制，培養液中含EP03 6U/ml, SCF50 100ng/ml，DEX5 10 μ M 以及 H印arin2U/ml ； ④培養至第11天，換用以MDM培養基為基礎培養基配制的培養液，培養液中含DEX5 10 μ M 和！feparin2U/ml，細胞密度調整為 2xl06/ml ； ⑤培養至25天，收集終產物，即為含L-ASPaseII的藥物紅細胞。
全文摘要
本發明公開了一種體外誘導生成含L-ASPase II的紅細胞藥物的方法，包括以下步驟1)使用慢病毒載體系統改造誘導性多能干細胞Ⅰ.構建pLenti6.3/V5-GW/Em-GFP VerA-L-ASPase II質粒；Ⅱ.使用293T細胞包裝生成高滴度的含L-ASPase II的病毒顆粒；Ⅲ.使用病毒顆粒轉染誘導性多能干細胞；2)體外誘導誘導性多能干細胞生成含L-ASPase II的紅細胞Ⅰ.IPS細胞體外分化誘導成紅細胞體EB；Ⅱ.EB誘導分化成成熟紅細胞。本發明通過對IPS細胞使用慢病毒載體系統進行基因改造，并將之在體外誘導生成含有L-ASPase II的紅細胞，生成的紅細胞既能夠作為L-ASPase II的緩釋載體使用，又能夠保持紅細胞原有的形態功能，進一步降低了L-ASPase II的毒副作用，為今后的臨床應用打下堅實的基礎。
文檔編號A61K38/50GK103224957SQ20131013290
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月16日 優先權日2013年4月16日
發明者葉永清 申請人:葉永清