一種表皮組織培養方法、制得的表皮組織培養物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種表皮組織培養方法、該方法獲得的表皮組織培養物以及該表皮組織培養物在皮膚美容領域中的應用。所述表皮組織培養方法包括將黑色素細胞和表皮角質細胞所組成的培養混合物在以表皮角質細胞數量為100的情況下，黑色素細胞數量在0.01～50之間的細胞數量比進行培養。
【專利說明】-種表皮組織培養方法、制得的表皮組織培養物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于細胞培養領域，具體涉及一種表皮組織培養方法，該方法獲得的表皮 組織培養物以及該表皮組織培養物在皮膚美容領域中的應用。
【背景技術】
[0002] 表皮組織培養物在醫療和美容領域有著廣泛的應用。例如，從表皮細胞核真皮細 胞培養得到的表皮片組織可用于燒傷部位的治療。對于一些疤痕情況也可采用這種治療方 法。大面積黑痣切除后，通常也需要貼上培養的表皮組織，治療黑痣而不留疤痕。
[0003] 決定皮膚顏色最重要的因子是一種被稱為黑色素的色素性物質。黑色素的形成是 由存在于表皮基底層的黑色素細胞產生的。而后天性色素脫失癥的尋常型白癜風，就是由 于黑色素的形成受到了異常的阻礙，或者黑色素細胞消失所引起的。目前，治療白癜風的方 法包括激素治療以及光化學療法。但是，這些療法的預后不穩定，需要持續性治療。
[0004] 除上述治療方法外，也有從其他部位取皮或毛囊進行移植的治療方法。但是，這種 療法會造成與治療部位同等面積的皮膚缺損，因此當治療部位面積相對大時就不能進行此 類治療了。另外，也有從自體采取黑色素細胞，經過體外培養后再注射移植的治療方法。此 療法與自體取皮相比，可以進行相對大面積的治療，但是在注射部位造成色素分布不均，大 面積治療時要達到色素的均勻分布是非常困難的。
[0005] 針對上述問題，本發明提供了一種新的表皮組織培養方法，該方法包括在以表皮 角質細胞數量為100的情況下，黑色素細胞數量在0. 01?50之間的細胞數量比進行培養。 出人意料的是，該方法制備得到的表皮組織培養物具有完整的成片狀形狀，在美容和醫療 應用時能夠實現大面積的色素均勻分布。
【發明內容】
[0006] 白癜風是一種常見多發的色素性皮膚病，該病以局部或泛發性色素脫失形成白斑 為特征，是一種獲得性的，皮膚色素脫失形成的白色斑片。尋常型白癜風的主要病因為色素 異常，所以普遍認為尋常型白癜風的治療不需要表皮角質細胞。但是，本發明的
【發明者】使用 黑色素細胞和表皮角質細胞共同培養的混合物，成功地對大面積尋常型白癜風患者進行了 移植治療，且術后效果顯著，色素亦能均勻地再生。
[0007] 因此，在本發明的一方面，提供了一種表皮組織培養方法，該方法包括將黑色素細 胞和表皮角質細胞所組成的培養混合物在以表皮角質細胞數量為1〇〇的情況下，黑色素細 胞數量在0. 01?50之間的細胞數量比進行培養。
[0008] 在本發明的一個實施方式中，表皮組織培養物的培養時間為10-50天。
[0009] 在本發明的一個實施方式中，在沒有使用小鼠等動物來源的異種滋養細胞層的情 況下進行培養。
[0010] 在本發明的另一方面，提供了一種表皮組織培養物，該表皮組織培養物是通過將 黑色素細胞和表皮角質細胞所組成的培養混合物在以表皮角質細胞數量為100的情況下， 黑色素細胞數量在0. 01?50之間的細胞數量比進行培養得到的。
[0011] 在本發明的一個實施方式中，表皮組織培養過程中使用的黑色素細胞和表皮角質 細胞是自體獲得的。
[0012] 在本發明的一個實施方式中，本發明方法的培養得到的表皮組織培養物有完整的 成片狀的形狀。
[0013] 在本發明的一個實施方式中，本發明方法的培養得到的表皮組織培養物累積有 2?10層的細胞層狀態。
[0014] 在本發明的一個實施方式中，本發明方法的培養得到的表皮組織培養物中的黑色 素細胞有樹枝狀結構。
[0015] 在本發明的又一方面，提供了 一種表皮組織培養物在制備皮膚美容產品中的應 用。
[0016] 在一些實施方式中，本發明提供了表皮組織培養物在制備美白產品中的應用。在 一些實施方式中，本發明提供了表皮組織培養物在制備白癜風治療產品中的應用。在一些 實施方式中，本發明提供了表皮組織培養物在制備痤瘡治療產品中的應用。在一些實施方 式中，本發明提供了表皮組織培養物在制備燒傷治療產品中的應用。在一些實施方式中，本 發明提供了表皮組織培養物在制備大面積黑痣治療產品中的應用。在一些實施方式中，本 發明提供了表皮組織培養物在制備紋身治療產品中的應用。在一些實施方式中，本發明提 供了表皮組織培養物在制備過度曬傷治療產品中的應用。
[0017] 本發明表皮組織培養方法的優點包括：
[0018] (1)適用于治療大面積的皮膚損傷（例如，尋常型白癜風、過度曬傷、大面積黑痣、 燒傷、疤痕、痤瘡、紋身等等），并能達到色素均勻分布的再生效果；
[0019] (2)適用于美白產品，例如適用于考核美白效果時對黑色素細胞進行的藥效評 價；
[0020] (3)由于所得表皮組織培養物的形態是皮片狀的，所以進行移植也非常簡易；以及
[0021] (4)在優選的實施方式中，黑色素細胞和表皮角質細胞來源于同一個體，移植后不 會有排異反應發生，預后也良好。
[0022] 黑色素細胞是形成黑色素的色素細胞。本發明對于黑色素細胞的采集沒有部位的 局限性，可以從表皮基底層或毛囊基底部充分獲取。表皮角質細胞是構成表皮的上皮細胞， 所以也可以從表皮基底部或毛囊基底部（Bulge位置）獲取。
[0023] 本發明是著重于黑色素細胞和表皮角質細胞共同培養，通過細胞間的相互作用， 從而使黑色素細胞形成了近似人體內的樹枝狀結構，并使其保有很高的黑色素產生機能。 而且在移植前，因為必須將治療部位的表皮先打磨掉，同時本發明的表皮組織培養物含有 表皮角質細胞，所以附著率非常高，預后良好。而且表皮角質細胞發揮了構建組織形態的機 能，使其更易保持片狀的結構，移植手術也更易操作。
[0024] 黑色素細胞和表皮角質細胞的數量比，當表皮角質細胞為100時，黑色素細胞常 規為0.01?50之間，其中較好是0.05?30之間，很好是0. 1?20之間，非常好是1?10 之間。低于上述數量比下限的話，黑色素細胞的密度低，對于尋常型白癜風的治療則不理 想。高于上述數量比上限的話，由于培養混合物的黑色濃度過高，不僅不利于色素的改善， 且術后容易產生色素分布不均勻的現象。上述比例應該根據不同人種在以上范圍內進行適 當的調節。這個比例可根據之后所描述的培養方法和培養基等進行適當的調整。這個數量 比可以使用光學顯微鏡進行觀測計算，而培養物則可以通過消化酶處理后，使用細胞計數 器或庫爾特計數器來進行計算。
[0025] 本發明中的表皮組織培養物，對尋常型白癜風患者的治療時優選自體由來的。而 且，黑色素細胞及表皮角質細胞都采自同一自體，因此可以給同一自體提供自己的表皮組 織培養物。
[0026] 本發明的表皮組織培養物中的黑色素細胞因為是和表皮角質細胞共同培養，會形 成多個樹枝狀突起形態，因此能夠提供近似身體狀態的環境。這類形態可以通過多巴染色 等方法對黑色素細胞混合物進行染色，然后通過光學顯微鏡來觀察。根據觀察顯示該形態 標志著此表皮組織培養物形成黑色素的能力非常高。
[0027] 本發明的表皮組織培養物，以持有完整的皮片狀的形態為優。因為，它不僅非常適 用于移植手術，對于大面積治療也能夠作到同一地處置。另外本發明的表皮組織培養物，以 有2層以上的細胞層的構造為優。因為是2層以上的厚度，所以在移植的時候不僅容易操 作，并且術后的生長也非常理想。細胞層的層數雖然沒有規定上限，但控制在10層以下比 較好，最好是在8層以下。層數如果超過上述上限的話，培養中的表皮組織培養物的一部分 容易發生壞死現象。
[0028] 表皮組織培養物的制作方法雖然沒有特別限制，但按照以下方法能夠順利地制作 出來。
[0029] 從腰部，腹部，背部，臀部等，主要是從能被衣服所遮蓋的部位采集表皮組織。采集 的組織片在培養前，以將其浸在含消化酶的培養基中進行處理為佳。作為此類消化酶，胰蛋 白酶（trypsin),膠原酶（collagenase)，分散酶（dispase)等都有效。作為溶解消化酶的 培養基，可以使用用于原代培養的無血清培養基或同類產品。另外，例如Dulbecco's MEM 等也用的很好。
[0030] 表皮組織培養物這項發明雖然使用滋養細胞也能夠很好的制作出來。但是為了確 保更高的安全性，更好地提高身體適應性，以不使用小鼠等動物來源的異種滋養細胞的培 養方法為佳。作為無滋養細胞的培養方法，有使用滋養細胞培養懸液或者滋養細胞提取物 的，但是本發明所用的是上面所描述的用特定比率的對黑色素細胞和表皮角質細胞進行共 同培養，可以制作出更合適的表皮組織培養物。
[0031] 作為適用于黑色素細胞以及表皮角質細胞培養用的培養基，從可以培養單一細胞 這點出發，Ca 2+濃度不高于0. 1mm，使用不含ΒΡΕ (牛下垂體提煉物）的無血清培養基，類似 于這樣的培養基有：DEFINED KERATINOCYTE-SFM(商品名），由GIBC0公司提供。
[0032] 這類無血清培養基之中也能添加胰島素，EGF，FGF之類的激素或成長因子。另 夕卜，作為常規的細胞培養用的培養基也是可以使用的，比如說：除上面記載之外，MCDB153、 Mediuml99、DMEM(Dulbecco' s MEM)、RPMI1640、F-10、F-12、MMEM、Keratinocyte SFM ; GIBCO, 17005-042、EpiLife，Cascade 公司提供，M-EPIcf-500、Dulbecco, s MEM+10%FBS 等。 作為添加物，除了上述之外，加入氫化可的松，轉鐵蛋白，孕酮，乙醇胺等也是可以的。
[0033] 為了更大范圍的適用，也能夠通過細胞傳代培養更多的細胞。但是，傳代過多時， 黑色素細胞的黑色素的生成能力就會降低，所以最好是〇?3代之間的細胞。在細胞傳代 的時候，使用常規的像胰蛋白酶等的處理方法即可。
[0034] 為了得到較好的有復數細胞層的表皮狀的培養混合物，細胞在到達飽和后，需要 使用分化培養用的培養基。在無血清培養基中添加使Ca 2+濃度達到0. 2?2. 2之間的氯化 鈣，可以把它作為分化用培養基使用，或者使用比他更合適的KGM培養基。在分化培養基中 經過3?14天，或者5?12天的培養，細胞就能形成多層片狀的培養混合物。用于分化誘 導的無血清培養液Ca 2+合適的濃度0. 5?1. 9mM較好，0. 8?1. 6mM更好，1. 0?1. 4mM的 范圍更理想。
[0035] 表皮組織培養物根據上述培養方法培養，常規在10?50天之間，最好是控制在 12?35天之間。
[0036] 表皮組織培養物這項發明雖然非常適用于尋常型白癜風的治療，但也適用于燒 傷，過度曬傷，痣，刺青等各類色素異常的治療。另外，不僅在醫療方面，也應用于考核美白 效果時對黑色素細胞進行的藥效評價。
[0037] 附圖簡述
[0038] 圖1顯示了根據本發明方法培養得到的表皮組織培養物。
[0039] 圖2顯示了本發明方法培養得到的表皮組織培養的顯微鏡觀察影像，以及多巴染 色影像。箭頭所指的是黑色素細胞。 具體實施方案
[0040] 以下是對于此項發明的表皮組織培養物以及用途和制造方法的實例展示以及具 體說明，但是本發明并不局限于此。
[0041] (1)皮膚樣品采集以及表皮組織培養物的制作：
[0042] 在受試者腰部使用70%酒精棉球進行消毒，從患者身體采集組織片。采集的組 織片浸泡在碘液中進行消毒，然后用PBS清洗。將組織片切碎，浸漬到用DMEM5倍稀釋的 TryPLE (Gibco公司）中，4°C環境下放置16?24個小時。常溫攪拌30分鐘，使用cell strainer過濾設備（BD公司）將殘漁除去。形成的細胞懸液進行離心處理，回收細胞。然 后關于殘渣的處理，使用膠原蛋白酶在37°C環境處理3小時，然后與上述方法同樣進行細 胞回收。回收的細胞播種到60mm培養皿中，使用無血清培養液（DK-SFM ;GIBC0公司）放置 于37°C 5%二氧化碳培養箱中培養。培養10?20天，長滿后，更換培養液KGM，再培養7? 10天，獲得了表皮組織培養物（圖1)。
[0043] (2)多巴染色等
[0044] 將表皮組織培養物進行多巴染色，使黑色素細胞著色。使用光學顯微鏡，觀察被 多巴染色的黑色素細胞的形狀，黑色素細胞和表皮角質細胞的數量以及堆積成層的細胞數 (圖 2)。
[0045] (3)向人體移植
[0046] 對受試者的尋常型白癜風部位使用70%酒精棉球進行充分消毒，打磨掉表皮。將 表皮組織培養物平鋪于被打磨的部位。覆蓋消毒紗布，纏繃帶，固定。3?5個月后目測移 植部位，和非白癜風部位進行比較，無色素斑，判定良好。
[0047] 表 1?
[0048]
【權利要求】
1. 一種表皮組織培養方法，該方法包括將黑色素細胞和表皮角質細胞所組成的培養混 合物在以表皮角質細胞數量為100的情況下，黑色素細胞數量在0. 01?50之間的細胞數 量比進行培養。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法培養10-50天。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，在沒有使用小鼠等動物來源的異種滋養細 胞層的情況下進行培養。
4. 如權利要求1所述的方法得到的表皮組織培養物。
5. 如權利要求4所述的表皮組織培養物，其特征在于，所述黑色素細胞和表皮角質細 胞是自體獲得的。
6. 如權利要求4所述的表皮組織培養物，其特征在于，所述表皮組織培養物有完整的 成片狀的形狀。
7. 如權利要求4所述的表皮組織培養物，其特征在于，所述表皮組織培養物累積有2? 10層的細胞層狀態。
8. 如權利要求4所述的表皮組織培養物，其特征在于，所述表皮組織培養物中的黑色 素細胞有樹枝狀結構。
9. 如權利要求4所述的表皮組織培養物在制備皮膚美容產品中的應用。
10. 如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述皮膚美容產品包括：美白產品、白癜風 治療產品、過度曬傷治療產品、燒傷治療產品、大面積黑痣治療產品、疤痕治療產品、痤瘡治 療產品和紋身治療產品。
【文檔編號】A61L27/38GK104099289SQ201310119790
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月8日 優先權日:2013年4月8日
【發明者】宇山太郎, 吳復躍, 大槻忠男, 何振東 申請人:瑞田投資有限公司, 上海尚瑞生物醫藥科技有限公司