免疫原性組合物的制作方法

專利名稱：免疫原性組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及葡萄球菌免疫原性組合物和疫苗領域，它們的制備以及這些組合物在醫學中的用途。更特別地，它涉及疫苗組合物，其包含來自金黃色葡萄球菌的5型和/或8型多糖，其中0-乙酰化的程度是30-100%。也提供了使用這些疫苗來治療或預防葡萄球菌感染的方法。背景近年來，隨著血管內設備的使用增加，在社區獲得的和在醫院獲得的感染數量都已經增加。在醫院獲得的(醫源性)感染是發病和死亡的主要原因，更特別是在美國，它們每年影響了超過200萬患者。根據各種研究，美國患者的大約6%在他們住在醫院期間將獲得感染。估計1992年在美國的經濟負擔超過45億美元(Emori和Gaynes，1993，Clin.Microbiol.Rev.6 ;428)。大多數頻發感染是尿道感染(UT1-感染的33%)，接下來是肺炎(15.5%)，手術部位感染(14.8%)以及原發血流感染(13%) (Emori和Gaynes，1993，Clin.Microbiol.Rev.6 ;428)。金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性的葡萄球菌(大多數是表皮葡萄球菌)、腸球菌種、大腸桿菌以及綠膿桿菌是主要的醫源性病原體。盡管那些病原體差不多引起同樣數量的感染，但是它們可引起的病癥的嚴重性再加上抗生素抗性的分離菌的頻率，使這個排位朝向金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌進行平衡，它們成為了最重要的醫源性病原體。金黃色葡萄球菌是有著顯著發病率和死亡率的醫源性感染的最通常原因(Romero-Vivas等人，1995，Infect.Dis.21 ;1417)。它是骨髓炎、心內膜炎、膿毒性關節炎、肺炎、膿腫以及中毒性休克綜合征的一些病例的原因。

表皮葡萄球菌是正常的皮膚共生生物，也是引起植入的醫療設備的感染以及在手術部位的感染的重要機會致病菌。被金黃色葡萄球菌感染的醫療設備包括心臟起搏器、腦脊液分流器、連續流動的腹膜透析導管、整形外科設備以及人工心臟瓣膜。用抗生素治療金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染，青霉素是選擇的藥物，而萬古霉素用于甲氧苯青霉素抗性的分離菌。自1980年代以來，對抗生素呈現廣譜抗性的葡萄球菌菌株的百分比已經變得日益普遍(Panlilo等人，1992, Infect.Control.Hosp.Epidemiol.13 ;582)，造成了對有效的抗菌治療的威脅。此外，近來出現的萬古霉素抗性的金黃色葡萄球菌已經引起了恐懼，害怕甲氧苯青霉素抗性的金黃色葡萄球菌菌株將會產生并擴散，對此還沒有可用的有效治療。已經研究了在被動免疫療法中使用抗葡萄球菌抗原的抗體這一備選方法。包括給予多克隆抗血清的療法(W000/15238，W000/12132),以及用抗脂磷壁酸質的單克隆抗體進行治療(W098/57994)正在研發之中。備選方法將是使用主動接種來產生對葡萄球菌的免疫應答。已經確定了用作疫苗組分而包含的幾種候選物。這些候選物包括纖連蛋白結合蛋白(US5840846)、MHC II類似物(US5648240)、纖維蛋白原結合蛋白(US6008341)、GehD(US2002/0169288)、膠原蛋白結合蛋白(US6288214)、SdrF、SdrG 和 SdrH (WOOO/12689)、突變 SEA 和 SEB 外毒素(W000/02523)以及52kDa玻連蛋白結合蛋白(W001/60852)。金黃色葡萄球菌基因組已經被測序，并已經確定了許多編碼序列(EP786519，W002/094868)。對于表皮葡萄球菌同樣如此(W001/34809)。作為該方法的改進，其他人已經確定了被來自患有葡萄球菌感染的患者的超免疫血清所識別的蛋白(W001/98499，W002/059148)。靶向金黃色葡萄球菌或靶向它所產生的外蛋白的疫苗的首次產生已經獲得了有限成功(Lee1996TrendS Microbiol.4 ; 162)。仍然存在研發抗葡萄球菌感染的有效疫苗的需求。


圖1-用于包括在免疫原性組合物中的蛋白的多肽序列。表I提供了有關每個SEQID代表哪個蛋白的信息。圖2-編碼用于包括在免疫原性組合物中的蛋白的核苷酸序列。表I提供了有關每個SEQ ID編碼哪個蛋白的信息。圖3-天然條件下a毒素的純化。圖A顯示了 a毒素純化期間所制備樣品的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE。第I道-分子量標志，第2道-含有過量表達a毒素的可溶性級分，第3道-從N1-NTA柱流過,第4道-用10%緩沖液B洗脫的級分，第5道-用20%緩沖液B洗脫的級分，第6道-用30%緩沖液B洗脫的級分，第7道-用50%緩沖液B洗脫的級分，第8道-用75%緩沖液B洗脫的級分,第9道和第10道-用100%緩沖液B洗脫的級分，第11道-誘導前在T=O時的細菌，第12道-誘導后在T=4小時的細菌，第13道-細胞溶胞產物，第14道-可溶性級分，第15道-不溶性級分。圖B顯示了 10、5、2和I ill純化a毒素的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE。圖4-變性條件下的SdrC的純化。圖A顯示了 a毒素純化期間所制備樣品的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE。泳道M-分子量標志，泳道Start-由含有過量表達SdrC的不溶性級分所形成的上清液，泳道FTl-從N1-NTA柱流過，泳道C-用洗滌緩沖液C洗脫的級分，泳道D-用緩沖液D洗脫的級分，道E-用緩沖液E洗脫的級分。圖B顯示了 1、2、5和10 ill純化SdrC的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE。圖5-在包被了純化蛋白的平板中抗葡萄球菌蛋白抗血清的ELISA結果。合并小鼠pre_使用提取自接種前小鼠的合并的血清的結果。合并小鼠PostII1-使用免疫后提取的合并的小鼠血清的結果。合并兔Pre-使用提取自接種前兔的合并的血清的結果。合并兔Post II1-使用免疫后提取的合并的兔血清的結果。Blc-陰性對照。圖6-在包被了殺死的葡萄球菌的平板上產生的抗葡萄球菌蛋白的小鼠抗血清的ELISA結果。

圖A使用由金黃色葡萄球菌血清型5的殺死的完整細胞所包被的平板。圖B使用由金黃色葡萄球菌血清型8的殺死的完整細胞所包被的平板。圖C使用由表皮葡萄球菌的殺死的完整細胞所包被的平板。
用方塊符號標記的線顯示使用來自小鼠的抗血清的ELISA結果，所述小鼠用所標明的葡萄球菌蛋白免疫三次。用菱形符號標記的線顯示免疫前小鼠血清的ELISA結果。圖7-在包被了殺死的葡萄球菌的平板上產生的抗葡萄球菌蛋白的兔抗血清的ELISA結果。圖A使用由金黃色葡萄球菌血清型5的殺死的完整細胞所包被的平板。圖B使用由金黃色葡萄球菌血清型8的殺死的完整細胞所包被的平板。圖C使用由表皮葡萄球菌的殺死的完整細胞所包被的平板。用方塊符號標記的線顯示使用來自兔的抗血清的ELISA結果，所述小鼠用所標明的葡萄球菌蛋白免疫三次(HarA除外，其中僅僅給出了一次免疫)。用菱形符號標記的線顯示免疫前兔血清的ELISA結果。詳細描述本發明公開了免疫原性組合物，其包含金黃色葡萄球菌5型和/或8型多糖，其中5型和/或8型莢膜多糖或寡糖是30%-100%乙酰化的。在特定實施方案中，本發明的免疫原性組合物還包含PNAG或葡萄球菌蛋白。PNAG在革蘭氏陽性菌中是高度保守的，提供了抗大范圍的細菌的保護，而5型和8型多糖是引起抗大多數金黃色葡萄球菌菌株的免疫應答的有效免疫原，金 黃色葡萄球菌是醫源性感染最通常的原因。多糖本發明的免疫原性組合物包含PNAG和來自金黃色葡萄球菌的5型和8型多糖，其中之一或這兩者是30%-100%乙酰化的。聚N-乙酰化葡糖胺(PNAG)PNAG是多糖胞間粘附素，由任選被N-乙酰和0_琥珀酰成分取代的P - (I — 6)連接的葡糖胺的聚合物組成。該多糖存在于金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌兩者中，能夠從所述任一來源分離(Joyce 等人，2003, Carbohydrate Research338 ；903 ;Maira_Litran等人,2002, Infect.1mun.70 ；4433)0例如，PNAG可從金黃色葡萄球菌菌株MN8m分離(W004/43407)。dPNAG 的制備描述于 W004/43405。該多糖在以前被稱為聚-N-玻拍酸-P - (I — 6)-葡糖胺(PNSG),最近顯不它不具有預期結構，因為確定了 N-琥拍酰化是不正確的(Maira-Litran等人,2002, Infect.1mun.70 ;4433)。因此，以前稱為PNSG而現在發現是PNAG的多糖也被術語PNAG所包括。PNAG可以是不同大小的由最多達30個重復單元(任選被N-乙酰和0_琥珀酰成分取代的￠- (I —6)連接的葡糖胺的重復單元)所組成的寡糖，從超過400kDa、到75和400kDa之間、到10和75kDa之間變化。任何大小的PNAG多糖或寡糖都可用于本發明的免疫原性組合物中，例如可以使用超過40kDa的大小。大小分級可通過現有技術中已知的任何方法來獲得，例如通過微流化、超聲照射或者通過化學裂解(W003/53462，EP497524，EP497525)。PNAG 的大小范圍是例如 40-400kDa、50-350kDa、40-300kDa、60-300kDa、50-250kDa和 60_200kDa。PNAG可由于氨基被乙酸酯取代而具有不同程度的乙酰化。體外產生的PIA幾乎在氨基上被全部取代(95-100%)。作為選擇，可以使用脫乙酰化的PNAG，其具有少于50%、40%、30%、20%、10%或5%的N-乙酰化。使用脫乙酰化PNAG使得能夠調理性殺死革蘭氏陽性菌，任選金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌(W004/43405)。在一個實施方案中，PNAG具有40kDa和300kDa之間的大小并且是脫乙酰化的，使得少于50%、40%、30%、20%、10%或5%氨基被乙酰化。術語脫乙酰化的PNAG (dPNAG)是指少于50%、40%、30%、20%、10%或5%的氨基被乙酰化的PNAG多糖或寡糖。如本文使用的，術語PNAG包括乙酰化的和脫乙酰化形式的該糖。在一種實施方案中，通過化學處理天然多糖來使PNAG脫乙酰化以形成dPNAG。例如，用堿性溶液處理天然PNAG，以使得pH上升到超過10。例如用0.1-5M、0.2_4M、0.3_3M、
0.5-2M、0.75-1.5M或IM NaOH,KOH或NH4OH處理PNAG。處理進行至少10或30分鐘，或者
1、2、3、4、5、10、15或 20 小時，溫度在 20-100、25-80、30_60 或 30-50 或 35-45。。。可按照W004/43405的描述來制備dPNAG。在一種實施方案中，包括在本發明免疫原性組合物中的多糖被如下文所述綴合到載體蛋白上，或者作為選擇，不被綴合。來自金黃色葡萄球菌的5型和8型多糖在人體中引起感染的大多數金黃色葡萄球菌菌株含有5型或8型多糖。大約60%的人菌株是8型，大約30%是5型。5型和8型莢膜多糖抗原的結構描述于Moreau等人，Carbohydrate Res.201 ；285 (1990)以及 Fournier 等人，Infect.1mmun.45 ;87 (1984)中。兩者都在它們的重復單元中具有FucNAcp以及具有ManNAcA，可用于引入巰基。最近(JonesCarbohydrate Research340,1097-1106 (2OO5)) NMR 譜將莢膜多糖的結構修正為:5 型— 4)_@ -D-ManNAcA-(I — 4)-a -L-FucNAc (30Ac )-(1 — 3)-@ -D-FucNAc-(I —8 型— 3) - ^ -D-ManNAcA (40Ac) - (I — 3) - a -L-FucNAc (I — 3) - a -D-FucNAc 可以使用本領域技術人員公知的方法從合適的金黃色葡萄球菌菌株中提取多糖，例如按照 US6294177 或 Infection and Immunity (1990) 58 (7) ;2367 中的描述。例如，ATCC12902是5型金黃色葡萄球菌菌株，ATCC12605是8型金黃色葡萄球菌菌株。多糖是天然大小，或者作為選擇可以通過例如微流化、超聲照射或者通過化學處理進行大小分級。本發明也包括衍生自金黃色葡萄球菌5型和8型多糖的寡糖。包括在本發明免疫原性組合物中的5型和/或8型莢膜多糖或寡糖是0-乙酰化的。在一個實施方案中，5型莢膜多糖或寡糖的0-乙酰化程度是10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。在一個實施方案中，8型莢膜多糖或寡糖的0-乙酰化程度是10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。在一個實施方案中，5型和8型莢膜多糖或寡糖的0-乙酰化程度是10-100%、20-100%,30-100%,40-100%,50-100%,60-100%,70-100%,80-100%,90-100%,50-90%,60-90%,70-90% 或 80-90%。可以通過本領域已知的任何方法，例如，通過質子MMR (Lemercinier和 Jonesl996, Carbohydrate Resarch296 ;83_96, Jones 和 Lemercinier2002, JPharmaceutical and Biomedical analysis30 ;1233-1247,W005/033148或W000/56357)確定多糖或寡糖的0-乙酰化程度。另一種常用的方法是Hestrin (1949)J.Biol.Chem.180 ；249-261描述的方法。可以通過水解除去0-乙酰基，例如，通過用諸如無水酰肼的堿處理(Konadu等人，1994 ；Infect.1mmun.62 ;5048_5054)或用 0.1N NaOH 處理 1-8 小時。為了保持 5 型和 / 或8型多糖或寡糖上的高水平0-乙酰化，使將導致0-乙酰基水解的處理最少化。例如，使在極端pH的處理最少化。包括在本發明免疫原性組合物中的5型和8型多糖任選被如下文所述綴合到載體蛋白上，或者作為選擇，不被綴合。作為選擇，本發明的免疫原性組合物含有5型或8型多糖。金黃色葡萄球菌336抗原在一種實施方案中，本發明·的免疫原性組合物包含US6294177中描述的金黃色葡萄球菌336抗原。336抗原包含@ -連接的己糖胺，不含0-乙酰基，并且特異性結合到針對保藏為ATCC55804的金黃色葡萄球菌336型的抗體上。在一種實施方案中，336抗原是天然大小，或者作為選擇可以通過例如微流化、超聲照射或者通過化學處理進行大小分級。本發明也包括來源于336抗原的寡糖。包括在本發明免疫原性組合物中的336抗原任選被如下文所述綴合到載體蛋白上，或者作為選擇，不被綴合。
_0] 來自表皮葡萄球菌的1、II和III型多糖表皮葡萄球菌菌株ATCC-31432、SE-360和SE-10的特征分別在于三種不同的莢膜
1、11 和 III 型(Ichiman 和 Yoshidal981, J.Appl.Bacteriol.51 ;229)。提取自每種表皮葡萄球菌血清型的莢膜多糖構成1、II和III型多糖。可以通過幾種方法提取多糖，包括描述于US4197290中的方法或者按照Ichiman等人，1991，J.Appl.Bacteriol.71 ；176中所描述的方法。在本發明的一個實施方案中，免疫原性組合物包含來自表皮葡萄球菌的I和/或II和/或III型多糖或寡糖。多糖是天然大小，或者作為選擇可以通過例如微流化、超聲照射或者通過化學裂解進行大小分級。本發明也包括提取自表皮葡萄球菌菌株的寡糖。這些多糖不被綴合，或者任選地被如下所述進行綴合。
_5] 多糖的綴合在與疫苗接種中使用多糖相關的問題中，其中之一是多糖本身為弱免疫原的這一事實。已經設計來克服這一免疫原性缺乏的策略包括將多糖連接到大的蛋白載體上，其提供了旁觀T細胞輔助。在一個實施方案中，將本發明所利用的多糖連接到提供旁觀T細胞輔助的蛋白載體上。目前用于與多糖或寡糖免疫原偶聯的這些載體的例子包括白喉和破傷風類毒素(DT、DT Crml97和TT)、匙孔血藍蛋白(KLH)、綠膿桿菌外蛋白A (rEPA)和結核菌素的純化蛋白衍生物(PH))、來自流感嗜血桿菌的蛋白D、肺炎球菌溶血素或者上述任何之一的片段。適合使用的片段包括含有T輔助表位的片段。特別地，蛋白D片段將任選包含蛋白的N末端1/3。蛋白D是來自流感嗜血桿菌的IgD結合蛋白(EP0594610B1)。在本發明的免疫原性組合物中使用的備選載體蛋白是單一的葡萄球菌蛋白或其片段或其融合蛋白，其包含至少或正好1、2、3或4種或者更多下面部分所列出的葡萄球菌蛋白或其片段。特別有利于使用在葡萄球菌疫苗中的新載體蛋白是葡萄球菌a類毒素。可將天然形式綴合到多糖上，因為綴合步驟降低了毒性。任選地將遺傳去毒的a毒素諸如His35Leu或His35Arg變體用作載體，因為殘留毒性更低。作為選擇，通過用交聯試劑、甲醒或戊二醒處理將a毒素化學去毒。遺傳去毒的a毒素被任選化學去毒,任選通過用交聯試劑、甲醛或戊二醛處理以進一步降低毒性。可通過任何已知方法將多糖連接到載體蛋白上(例如通過Likhite的美國專利4，372，945, Armor等人的美國專利4，474，757以及Jennings等人的美國專利4，356，170)。任選地，實施CDAP綴合化學(參見W095/08348)。在CDAP中，氰化試劑1-氰基-二甲氨基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)被任選用于多糖-蛋白綴合物的合成。氰化反應可以在相對溫和的條件下進行，這避免了堿敏感性的多糖的水解。這種合成法使得能夠直接偶聯到載體蛋白上。可將多糖溶于水中或鹽溶液中。可將CDAP溶解在乙腈中，立即加入到多糖溶液中。CDAP與多糖的羥基反應形成氰酸酯。反應步驟之后，加入載體蛋白。賴氨酸的氨基與活化的多糖反應形成異脲共價連接。偶聯反應之后，然后加入大大過量的甘氨酸以淬滅殘留的活化官能團。然后將產物通過凝膠滲透柱以去除未反應的載體蛋白和殘留試劑。蛋白本發明的免疫原性組合物任選進一步包含葡萄球菌蛋白，例如，來自金黃色葡萄球菌或者表皮葡萄球菌的蛋白。本發明的一些實施方案含有來自金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌兩者的蛋白。本發明的免疫原性組合物包含分離的蛋白，其包含與圖1的任意序列具有至少85%同一性、任選至少90%同一性、至少95%同一性、至少97-99%或完全同一性的氨基酸序列。本文在明確提及蛋白時，任選指天然或重組的、全長蛋白或者任選地已經去除了任何信號序列的成熟蛋白。蛋白可直接從葡萄球菌菌株中分離或者通過重組DNA技術生產。可將蛋白的免疫原性片段加入到本發明的免疫原性組合物中。這些片段是包含從蛋白的氨基酸序列連續選取的至少10個氨基酸、至少20個氨基酸、至少30個氨基酸、至少40個氨基酸、至少50個氨基酸、或至少100個氨基酸的片段。此外，這樣的免疫原性片段典型地是與針對葡萄球菌蛋白而產生的抗體有免疫反應的，或者是與通過用葡萄球菌感染哺乳動物宿主而產生的抗體有免疫反應的，或者含有T細胞表位。在一個實施方案中，免疫原性片段也包括以有效劑量給予時 ，(單獨或者作為結合到載體上的半抗原)，引起抗葡萄球菌感染的保護性免疫應答的片段，任選是對金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌感染有保護性的。這樣的免疫原性片段可包括例如缺少N末端前導序列、和/或跨膜結構域和/或C末端錨定結構域的蛋白。在一個實施方案中，根據本發明的免疫原性片段包含蛋白基本上所有的胞外結構域，所述蛋白在片段序列的整個長度上具有與選自圖1的序列的至少85%、90%、95%、97 或 99% 同一性。
在一種實施方案中，本發明的免疫原性組合物可含有葡萄球菌蛋白或者葡萄球菌蛋白的片段的融合蛋白。這樣的融合蛋白可以重組制備，并且可包含至少2、3、4、5或6種葡萄球菌蛋白的一個部分，例如下文列出的葡萄球菌蛋白的組合。作為選擇，融合蛋白可包含至少2、3、4或5種葡萄球菌蛋白的多個部分。這些融合蛋白可以將不同的葡萄球菌蛋白或其片段組合到同一蛋白中。作為選擇，本發明也包括葡萄球菌蛋白或其片段的單個的融合蛋白，作為與異源序列諸如T細胞表位或純化標志的提供者的融合蛋白，所述T細胞表位或純化標志例如:P -半乳糖苷酶，谷胱苷肽-S-轉移酶，綠色熒光蛋白(GFP)，表位標志諸如FLAG>myc標志、聚組氨酸,或者病毒表面蛋白諸如流感病毒血凝素,或者細菌蛋白諸如破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197。融合蛋白可以存在于本發明的免疫原性組合物中，作為游離蛋白，或它可以是與糖連接的載體蛋白。蛋白在一種實施方案中，本發明的免疫原性組合物進一步包含一種或多種下面提及的蛋白或其免疫原性片段。許多所述蛋白落入胞外成分結合蛋白、轉運蛋白或者毒素以及毒力調節劑的范疇。本發明的免疫原性組合物任選進一步包含葡萄球菌胞外成分結合蛋白或者葡萄球菌轉運蛋白或者葡萄球菌毒素或毒力調節劑。本發明的免疫原性組合物任選包含至少或正好1、2、3、4、5或6種葡萄球菌蛋白。表I下表列出了分別在圖1和圖2中發現的優選蛋白序列和DNA序列的SEQ ID號。SA表示來自金黃色葡萄球菌的序列，SE表示來自表皮葡萄球菌的序列。
權利要求
1.免疫原性組合物，包含來自金黃色葡萄球菌的5型和/或8型莢膜多糖或寡糖，其中所述5型莢膜多糖或寡糖是30%-100%0_乙酰化的，并且包含葡萄球菌蛋白或其片段，所述葡萄球菌蛋白或其片段是胞外成分結合蛋白，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB (FIB), SBI,自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG> SdrH、脂肪酶 GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。
2.免疫原性組合物，包含來自金黃色葡萄球菌的5型和/或8型莢膜多糖或寡糖，其中所述8型莢膜多糖或寡糖是30%-100%0_乙酰化的，并且包含葡萄球菌蛋白或其片段，所述葡萄球菌蛋白或其片段是胞外成分結合蛋白，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB (FIB), SBI,自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE> SdrG> SdrH、脂肪酶 GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。
3.權利要求2的免疫原性組合物，其中所述5型莢膜多糖或寡糖是30%-100%0_乙酰化的。
4.權利要求1-3的任一項的免疫原性組合物，包含葡萄球菌PNAG。
5.權利要求 4的免疫原性組合物，其中所述PNAG是少于40%N乙酰化的。
6.權利要求1-5的任一項的免疫原性組合物，進一步包含來自表皮葡萄球菌的I型和/或II型和/或III型莢膜多糖或寡糖。
7.權利要求1-6的任一項的免疫原性組合物，進一步包含金黃色葡萄球菌336抗原。
8.權利要求1-7的任一項的免疫原性組合物，進一步包含葡萄球菌蛋白或其片段。
9.權利要求8的免疫原性組合物，包含兩種或更多種選自至少兩個下列不同組的葡萄球菌蛋白: a)至少一種葡萄球菌胞外成分結合蛋白或其片段，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB (FIB),SBI,自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE、SdrG、SdrH、脂肪酶 GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB, SSP-U SSP-2、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig和MAP ； b)至少一種葡萄球菌轉運蛋白或其片段，其選自免疫優勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB, IsdC、HarA、Mg2+轉運蛋白、SitC 和 NiABC 轉運蛋白； c)至少一種葡萄球菌毒力調節劑、毒素或其片段，其選自a毒素(Hla)、a毒素H35R突變體、RNAIII激活蛋白(RAP)。
10.權利要求1-9的任一項的免疫原性組合物，其中葡萄球菌多糖綴合到蛋白載體上。
11.權利要求4-10的任一項的免疫原性組合物，其中PNAG綴合到載體蛋白上。
12.權利要求10或11的免疫原性組合物，其中載體蛋白包含葡萄球菌蛋白或其片段，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS), EFB (FIB)、SB1、自溶素、ClfA、SdrC、SdrD、SdrE, SdrG, SdrH、脂肪酶 GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-l、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優勢的ABC轉運蛋白、ISdA、IsdB、IsdC、Mg2+轉運蛋白、SitC和NiABC轉運蛋白、a毒素(Hla)、a毒素H35R突變體和RNAIII激活蛋白(RAP)。
13.權利要求10或11的免疫原性組合物，其中載體蛋白選自破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197、流感嗜血桿菌蛋白D、綠膿桿菌外蛋白A、肺炎球菌溶血素和a類毒素。
14.權利要求1-13的免疫原性組合物，其中針對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌兩者，產生有效的免疫應答。
15.包含權利要求1-14的免疫原性組合物和藥學可接受賦形劑的疫苗。
16.制備疫苗的方法，包括混合抗原以制備權利要求1-14的免疫原性組合物以及加入藥學可接受賦形劑的步驟。
17.預防或治療葡萄球菌感染的方法，包括給有此需要的患者施用權利要求15的疫苗的步驟。
18.權利要求1-14的免疫原性組合物在制備用于治療或預防葡萄球菌感染的疫苗中的用途。
19.綴合來自金黃色葡萄球菌的5型或8型莢膜多糖或寡糖的方法，包括以下步驟: a)將所述5型或8型多糖或寡糖溶解在水或鹽溶液中； b)加入氰化試劑(例如CDAP)以形成活化的多糖或寡糖； c)加入載體蛋白，使得氨基與活化的多糖反應，以形成異脲共價連接。
20.權利要求19 的方法，其中所述5型莢膜多糖或寡糖是30%-100%0_乙酰化的。
全文摘要
本申請涉及包含來自金黃色葡萄球菌的、具有30-100%O-乙酰化的5型和/或8型莢膜多糖或寡糖的免疫原性組合物。也描述了疫苗、使用包含具有30-100%O-乙酰化的5型和/或8型莢膜多糖的免疫原性組合物的治療方法以及制備所述免疫原性組合物的方法。
文檔編號A61K39/116GK103169960SQ20131009957
公開日2013年6月26日 申請日期2007年3月29日 優先權日2006年3月30日
發明者P.德內爾, J.普爾曼 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司