一種抗腫瘤生物多糖的制作方法

專利名稱：一種抗腫瘤生物多糖的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物提取領域，提取物質是一種來源于SPF雞胚的多糖組分，具體的方法包括SPF雞胚培養，收獲，多糖物質的分離提取的全部過程，以及這種多糖物質的分析檢測和用途。
背景技術：
腫瘤(Tumor)是機體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細胞在基因水平上失去對其生長的正 常調控，導致其克隆性異常增生而形成的新生物。2010年全球將有超過800萬人死于癌癥，取代心血管病成為世界死亡人數最多的疾病。因此，癌癥治療藥物的研究關系到肝癌患者和全社會切身利益，一直是醫藥行業的研究熱點，具有重要的社會意義。從治療手段上來說，癌癥的治療主要是外科治療、放射、化療、生物與綜合治療等。癌癥外科主要是癌切除、局部栓塞治療等。切除和栓塞的治療方法適用于界限清楚、遠離大血管的腫瘤，而且手術切除的預后差、五年存活率低。移植需要解決的主要問題在于免疫排斥反應，后者往往成為患者和社會重大的經濟負擔，成功率也只有50%左右，5年存活率也很低。放療和化療對正常細胞也有殺傷作用，其特點是專一性差、副作用巨大，在殺傷腫瘤細胞的同時也極大地干擾機體的正常功能，不利于長期用藥。正由于癌癥缺乏有效控制方法，患者的預后極差。平均5年存活率低。因此，尋找腫瘤細胞特異性的藥物是科學界始終關注的焦點。生物大分子包括核酸、蛋白質以及多糖。尤其是多糖，成為近些年研究的熱點。目前，已經有包括香菇多糖、枸杞多糖、黃精多糖、大豆多糖被廣泛的研究其在腫瘤治療中的作用。并對其抗腫瘤機制進行了深入的研究和探討。我們研制的雞胚尿囊液和雞胚提取的多糖屬于免疫調節類產品。免疫調節是指在免疫反應中，各種免疫細胞及其亞群間，細胞與各種細胞因子間存在著的刺激與抑制，或正相與負相兩方面作用構成的互相制約的調節網絡，完成對抗原的識別和反應。這種調節作用對維護機體免疫功能的穩定和動態平衡十分重要。免疫調節共分成如下幾類:免疫細胞間的調節作用。免疫反應過程涉及多種免疫細胞間的相互作用，如T-M，T-BTh-Ts和Ts-Tc等細胞間的相互作用，而其中Ts與Th在免疫調節中起關鍵作用。活化的Th細胞輔助B細胞產生抗體，輔助Tc細胞殺傷靶細胞，誘導M，表現遲發型超敏反應。而Ts細胞反過來對Th、Tc、B細胞和M的功能產生抑制作用。同樣B細胞和M也可以通過多種機制對T細胞以及互相之間發揮促進和抑制的調節作用。細胞因子的免疫調節作用。在免疫反應中，免疫細胞的相互作用，除細胞間的直接接觸外、免疫細胞釋放的可溶性因子也參與免疫反應的調節。就目前所知，這些因子包括干擾素(interferon, IFN),白細胞介素-1 (interleukinl, IL-1),集落刺激因子(colonystimulating factor, CSF)等。這些細胞因子在介導機體多種免疫反應如腫瘤免疫、感染免疫、移植免疫、自身免疫等過程中發揮著重要的、甚至是中心的作用。它們各自具有多種生物學活性，彼此之間還在誘生、受體調節及生物效應等三個水平上相互作用，構成內容豐富、關系復雜的細胞因子網絡(cytokine network)。免疫調節劑就是作用于免疫反應的不同環節，發揮其作用，使機體的免疫反應處于所需要的范圍內，達到防治疾病的目的。腫瘤免疫治療的方法有非特異性免疫治療和特異性免疫治療。過去，人們在腫瘤免疫研究中過于強調特異性抗原和特異性免疫系統，免疫學的進展加深了人們對免疫系統抗腫瘤功能及免疫治療作用重要性的認識。近年的研究表明，非特異性免疫系統的重要性開始得到了認同。現在，人們認識到，與不能對自身組織產生良好免疫應答的特異性免疫系統形成鮮明對照的是，非特異性免疫系統具有很強的能力來消除單個畸變的自身細胞。這意味著非特異性免疫系統具有在單個細胞水平消除可能發展成為腫瘤細胞的早期遺傳變異的潛能。迪威立克抗腫瘤作用主要是通過對單核巨噬細胞系統強大而持久的刺激，引起巨噬細胞(Μφ)增生、活化、吞噬功能增強、誘導分泌腫瘤壞死因子(TNF-α)、干擾素(IFN-γ)、白細胞介素(IL-2)、活性氧(H202、N0)等癌細胞殺傷因子及增強NK細胞殺傷活性，達到抑制和殺傷腫瘤細胞及病原微生物的目的，且可通過促進造血多能干細胞分化為單核巨噬細胞，進一步調動機體免疫系統蘊藏抗癌、殺菌潛力。由于免疫調節的全身作用強，副作用少且輕特異性強的特點，適用范圍逐漸增加，安全性較其他類別的藥物具備明顯的提聞。首先，在作用機理上該藥物激活體液免疫與細胞免疫，直接作用于癌細胞，具有特異性，這明顯優于現有抗腫瘤藥物。此外，大量的實驗，包括臨床前藥效學試驗和臨床試驗的結果證實，對于多種腫瘤具有良好的治療作用。第三，生物提取法不但易于進行放大實現工業化，還有利于環境保護等工業化需要面對的嚴重問題，與化學合成相比優勢明顯。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于克服現有提取技術的不足，針對原有的提取技術-凍干、有機溶劑沉淀的繁瑣步驟入手，對雞胚尿囊液多糖和雞胚多糖的分離純化的手段的創新，使用鹽析和膜技術相結合的方法來提取生物多糖。來大幅度提高雞胚尿囊液和雞胚多糖中具備生物活性 的多糖分離純化后的純度和回收率。本發明解決的技術問題所采用的技術方案是在純化工藝中采用了鹽析和膜技術的分離純化步驟。包括步驟:a、SPF雞胚的培養；b、活雞胚尿囊液或雞胚培養物低溫預冷；
C、離心法和過濾法的使用對雞胚尿囊液或雞胚培養物進行澄清；d、鹽析法沉淀生物大分子；e、超濾法(高分子量的超濾膜包)除高分子量的生物大分子；f、超濾法(低分子量的超濾膜包)截流活性多糖。本發明提取所述多糖的工藝的優選的工藝步驟如下:1.將SPF雞胚在溫度為36_38°C的恒溫條件下培養9_13天。2.收獲后的雞胚燈檢，標記尿囊腔的位置，在溫度為4°C _18°C的環境下，放置8-48小時，然后提取活雞胚的(死雞胚顏色變黑，活雞胚顏色發紅)尿囊液或雞胚培養物。3.將上一步得到的尿囊液或雞胚培養物使用如下的純化工藝提取:I)尿囊液或雞胚培養物的澄清處理:使用IOmM IOOmM磷酸鹽緩沖液稀釋尿囊液或雞胚培養物混合均勻，其中磷酸鹽緩沖液與尿囊液或雞胚培養物的體積比為2-10: l，8000g-12000g，18°C以下，離心10-60分鐘，收集上清液，棄去沉淀;
2)上清液的進一步澄清處理:用0.22 μ m的微孔濾膜過濾上清液；3)向濾膜濾過的上清液中添加固體硫酸氨，其中上清:固體硫酸氨的質量比為5-20: I，混勻后放置于4°C _18°C儲存，時間不低于6小時；4)8000g_12000g，18°C 以下，離心 10-60 分鐘，取上清液；5)用10-30KD的超濾膜以0.1-0.5mol的NaCl對上清液進行超濾，取濾過液；6)用IKD的超濾膜進行過濾，取截流液，所得截流液即獲得本發明所述的多糖。同原有的化學提取相比較，采用本專利的鹽析和膜技術分離，目標多糖的回收率>80%，遠高于步驟繁瑣的化學法的不足10%的回收率，具有明顯的優勢。此外，在全部的純化工藝中，沒有使用有機溶劑，不存在生物危害性，更有利于環保。可見，采用本發明的純化下藝，可以大幅度的提高雞胚尿囊液中具備生物活性的多糖的回收率。本發明獲得的多糖用于小鼠體內移植性人體腫瘤的殺傷能力試驗，結果顯示活性多糖對人類原發性肝癌，卵巢癌具有確切的殺傷能力。臨床試驗用于食管癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤、肺癌、非何杰金淋巴瘤、急性粒細胞白血病和乳腺癌等治療，發現能夠明顯改善病人的生存質量，毒副作用小、有效率高等特點。


圖1尿囊液提取的生物多糖的高效液相色譜分析結果，色譜柱為凝膠排阻色譜柱，檢測器為視差折光檢測器，結果顯示提取的物質為單一組分；圖2雞胚培養物提取的生物多糖的高效液相色譜分析結果，色譜柱為凝膠排阻色譜柱，檢測器為視差折光檢測器，結果顯示提取的物質為單一組分；

圖3尿囊液提取的生物多糖的OD26tol檢測結果；圖4尿囊液提取的生物多糖的OD28tol檢測結果；圖5雞胚培養物提取的生物多糖的OD26tol檢測結果；圖6雞胚培養物提取的生物多糖的OD28tol檢測結果；圖7尿囊液提取的生物多糖紫外區和可見光區全波段掃描(掃描波長200nm-760nm)分析；圖8雞胚培養物提取的生物多糖紫外區和可見光區全波段掃描(掃描波長200nm-760nm)分析；圖9尿囊液提取的生物多糖的核磁檢測碳譜；圖10尿囊液提取的生物多糖的核磁檢測氫譜；圖11雞胚培養物提取的生物多糖的核磁檢測碳譜；圖12雞胚培養物提取的生物多糖的核磁檢測氫譜；
具體實施例方式通過參閱下述實施例可以更容易地了解本發明的內容，這些實施例只是為進一步說明本發明，并不意味著限定本發明的范圍。實施例1抗腫瘤生物多糖的制備本發明提取所述多糖的工藝的步驟如下:1.將SPF雞胚在溫度為36_38°C的恒溫條件下培養9_13天。
2.收獲后的雞胚燈檢，標記尿囊腔的位置，在溫度為4°C的環境下，放置8小時，然后提取活雞胚的(死雞胚顏色變黑，活雞胚顏色發紅)尿囊液或雞胚培養物。3.將上一步得到的尿囊液或雞胚培養物使用如下的純化工藝提取:I)尿囊液或雞胚培養物的澄清處理:使用IOmM磷酸鹽緩沖液稀釋尿囊液或雞胚培養物混合均勻，其中磷酸鹽緩沖液與尿囊液或雞胚培養物的體積比為2: l，8000g，18°C以下，離心60分鐘，收集上清液，棄去沉淀；2)上清液的進一步澄清處理:用0.22 μ m的微孔濾膜過濾上清液；3)向濾膜濾過的上清液中添加固體硫酸氨，其中上清:固體硫酸氨的質量比為5: 1，混勻后放置于4°C-18°C儲存，時間不低于6小時；4) 8000g, 18°C以下，離心60分鐘，取上清液；5)用10-30KD的超濾膜以0.1mol的NaCl對上清液進行超濾，取濾過液；6)用IKD的超濾膜進行過濾 ，取截流液，所得截流液即獲得本發明所述的多糖。實施例2抗腫瘤生物多糖的制備本發明提取所述多糖的工藝的步驟如下:1.將SPF雞胚在溫度為36_38°C的恒溫條件下培養9_13天。2.收獲后的雞胚燈檢，標記尿囊腔的位置，放置于4°C冰箱冷藏，放置12-16小時，然后提取活雞胚的(死雞胚顏色變黑，活雞胚顏色發紅)尿囊液或雞胚培養物。3.將上一步得到的尿囊液或雞胚培養物使用如下的純化工藝提取:I)尿囊液或雞胚培養物的澄清處理:使用20mM磷酸鹽緩沖液稀釋尿囊液或雞胚培養物5倍，混合均勻，12000g, 4°C離心20分鐘，收集上清液，棄去沉淀；2)上清液的進一步澄清處理:用0.22 μ m的微孔濾膜過濾上清液；3)向濾膜濾過的上清液中添加固體硫酸氨，其中上清:固體硫酸氨的質量比為10: 1，混勻后放置于4°C儲存，時間不低于6小時；4) 12000g，4°C離心20分鐘，取上清液；5)用30KD的超濾膜以0.1mol的NaCl對上清液進行超濾，取濾過液；6)用IKD的超濾膜進行過濾，取截流液，所得截流液即獲得本發明所述的多糖。實施例3抗腫瘤生物多糖的制備本發明提取所述多糖的工藝的步驟如下:1.將SPF雞胚在溫度為36_38°C的恒溫條件下培養9_13天。2.收獲后的雞胚燈檢，標記尿囊腔的位置，在溫度為4°C的環境下，放置48小時，然后提取活雞胚的(死雞胚顏色變黑，活雞胚顏色發紅)尿囊液或雞胚培養物。3.將上一步得到的尿囊液或雞胚培養物使用如下的純化工藝提取:I)尿囊液或雞胚培養物的澄清處理:使用IOOmM磷酸鹽緩沖液稀釋尿囊液或雞胚培養物混合均勻，其中磷酸鹽緩沖液與尿囊液或雞胚培養物的體積比為10: l，12000g，18°c以下，離心10分鐘，收集上清液，棄去沉淀；2)上清液的進一步澄清處理:用0.22 μ m的微孔濾膜過濾上清液；3)向濾膜濾過的上清液中添加固體硫酸氨，其中上清:固體硫酸氨的質量比為20: 1，混勻后放置于4°C-18°C儲存，時間不低于6小時；4) 12000g, 18°C以下，離心10分鐘，取上清液；
5)用10-30KD的超濾膜以0.5mol的NaCl對上清液進行超濾，取濾過液；6)用IKD的超濾膜進行過濾，取截流液，所得截流液即獲得本發明所述的多糖。實施例4抗腫瘤多糖的檢測分析方法1:雙縮脲反應原理:雙縮脲反應是指具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物在堿性條件下與Cu2+反應，生成紅紫色的絡合物。所有的蛋白質均有此顯色反應。雙縮脲試劑就是指能與具有兩個以上肽鍵的化合物發生紅紫色顯色反應的試劑。除-CONH-有此反應外，-C0NH2-, -CH2-，NH2-, -CS-CS-NH2，等基團亦有此反應。糖類物質的雙縮脲反應為陰性。試劑雙縮脲試劑。取硫酸銅(CuSO4.5H20) 3.0g、酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6.4Η20) 9.0g、碘化鉀5.0g、氫氧化鈉24g，加水溶解并稀釋至1000ml，搖勻，即得。標準蛋白質溶液的制備精密量取人血白蛋白標準品適量，用水定量稀釋成每Iml含50mg的溶液。供試品溶液的制備精密量取適量的供 試品，加水制成每Iml約含50mg的溶液。測定法分別精密量取供試品溶液與標準蛋白質溶液各0.05ml置玻璃試管中，分別加雙縮脲試劑4.0ml，混勻，置37°C水浴中30分鐘，照紫外-可見分光光度法(附錄IIA)，在波長540nm處測定吸光度。另精密量取水0.05ml,自“加雙縮脲試劑4.0ml”起，同法操作，作為空白對照。按下式計算
權利要求
1.一種抗腫瘤生物多糖的制備方法，包括以下步驟: I) SPF雞胚的培養；2)活雞胚尿囊液或雞胚培養物低溫預冷；3)對雞胚尿囊液或雞胚培養物進行澄清處理；4)澄清處理后的上清通過鹽析法沉淀生物大分子；5)超濾法去除高分子量的生物大分子，得到含活性多糖的過濾液；6)低分子量的超濾膜截流活性多糖。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的SPF雞胚的培養，其條件為在溫度為36-38 °C中雞胚培養時間為9-13天。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的活雞胚尿囊液或雞胚培養物低溫預冷，具體條件為收獲后的雞胚經過燈檢，標記標記尿囊腔的位置，在溫度為4°C -18°C的環境下，放置8-48小時。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的雞胚尿囊液或雞胚培養物進行澄清處理的具體條件為:使用IOmM IOOmM磷酸鹽緩沖液稀釋尿囊液或雞胚培養物混合均勻，其中磷酸鹽緩沖液與尿囊液或雞胚培養物的體積比為2-10: l，8000g-12000g，18°C以下，離心10-60分鐘，收集上清液，棄去沉淀，得到的上清液進一步用0.22 y m的微孔濾膜過濾。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的鹽析法沉淀生物大分子，其具體條件為:向濾膜濾過的上清液中添加固體硫酸氨，上清和固體硫酸氨的體積比為5-20: 1，混勻后放置于4°C _18°C儲存，時間不低于6小時。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超濾法去處高分子量的生物大分子，其具體條件為:8000g-12000g，18°C以下，離心10-60分鐘，取上清液，用10-30KD的超濾膜以0.1-0.5mol的NaCl對上清液進行超濾，取濾過液。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的低分子量的超濾膜截流活性多糖，具體條件為:用IKD的超濾膜過濾第5)步去除高分子量生物大分子的過濾液。
8.根據權利要求1-7中任意一項所述的方法制備的多糖。
9.權利要求8所述的多糖在制備治療腫瘤疾病藥物中的應用。
10.權利要求9所述的應用，其特征在于，所述的腫瘤為肝癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤、肺癌、非何杰金淋巴瘤、急性粒細胞白血病和乳腺癌。
全文摘要
本發明公開了一種抗腫瘤生物多糖，所述多糖是通過從雞胚尿囊液和雞胚中分離純化得到，本發明還公開了多糖的具體的純化工藝，所述工藝是通過使用鹽析和膜技術相結合的方法來提取生物多糖。本發明所述工藝大幅度提高了雞胚尿囊液和雞胚多糖分離純化的純度和回收率。本發明臨床前藥效學實驗證明，所述生物多糖在裸鼠體內對移植性人體腫瘤-人類原發性肝癌，卵巢癌具有確切的殺傷能力，給以足夠的劑量及時間可將裸鼠體內的移植性人體腫瘤細胞完全清除。本發明所述的多糖是一種無毒性、副作用小、十分安全的生物活性物質；并且給藥途徑廣泛，生產工藝簡單，回收率高，是一種可以產生巨大社會效益和經濟效益的抗腫瘤新藥。
文檔編號A61P35/00GK103145867SQ20131009359
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月22日 優先權日2013年3月22日
發明者喬民, 金蓮英 申請人:喬民, 金蓮英