專利名稱：一種食管癌相關基因-4的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種食管癌相關基因，更具體的說涉及一種食管癌相關基因-4的用途，屬于生物基因工程技術領域。
背景技術：
食管癌相關基因-4 (ECRG4)最初是Bi等人識別并克隆，他們發現與正常成人食管上皮相比，食管鱗狀細胞癌組織和細胞系中ECRG4的表達明顯降低。因此，認為ECRG4可能是一種新的候選腫瘤抑制基因。近年來對于食管癌相關基因_4 (ECRG4)在食道癌、結腸癌、膠質瘤和前列腺癌中的研究也較多。如李林蔚等在中國醫學科學院北京協和醫學博士研究生學位論文中披露的一種食管癌相關基因4在食管鱗狀細胞癌中的功能研究中提及的ECRG4是食管鱗狀細胞癌(ESCC)的候選抑癌基因，認為啟動子高甲基化可能是ECRG4在ESCC轉錄失活的主要機制，認為ECRG4可能是通過參與NF- κ B通路調控C0X-2的表達來發揮其抑癌功能，可以作為ESCC的潛在治療藥物。但是，現有技術中關于ECRG4的報道均是針對ECRG4在抑癌作用方面的研究，并沒有報道ECRG4在預防或治療肝炎(如丙肝)中應用的相關文獻。
發明內容
本發明針對以上現有技術中存在的問題，提供一種食管癌相關基因-4 (ECRG4)的新的用途，能夠實現預防或治療肝炎的技術效果。本發明的目的是通過以下技術方案得以實現的，一種食管癌相關基因_4的用途，所述的食管癌相關基因_4用于預防或治療肝炎。本發明通過研究發現食管癌相關基因-4 (ECRG4)在肝炎病毒感染的患者外周血單個核細胞中低表達，進一步研究發現ECRG4基因啟動子區甲基化是ECRG4在肝炎病毒感染細胞內低表達的原因。因此，本發明通過研究ECRG4對肝炎的預防或治療作用，發現將ECRG4基因轉入肝炎感染細胞，能夠逆轉肝炎病毒的免疫逃避，促進免疫細胞對肝炎病毒感染細胞的識別和殺傷作用，從而達到抗感染的目的，實現預防或治療的作用。在上述的食管癌相關基因-4的用途中，作為優選，所述的食管癌相關基因_4(ECRG4)用于預防或治療丙肝。在上述的食管癌相關基因_4的用途中，作為優選，所述食管癌相關基因_4通過克隆入真核表達質粒PCDNA3.1得到重組質粒pcDNA3.1-ECRG4后用于預防或治療丙肝。重組質粒pcDNA3.1-ECRG4能夠作為一個分子藥，同樣能夠促使ECRG4過表達，促進免疫細胞對丙肝病毒(HCV)感染細胞的識別和殺傷作用，實現預防或治療丙肝的效果。在上述的食管癌相關基因_4的用途中，作為優選，所述的食管癌相關基因_4(ECRG4)用于使免疫細胞識別和殺傷丙肝病毒感染細胞。綜上所述，本發明與現有技術相比，具有以下優點:
本發明的食管癌相關基因-4 (ECRG4)的新用途，與現有的將ECRG4用于抑癌的用途不同，本發明的ECRG4基因轉入肝炎病毒(尤其是HCV)感染細胞后，能夠逆轉肝炎病毒(尤其是HCV)的免疫逃避，促進免疫細胞對肝炎病毒感染細胞(尤其是HCV感染細胞)的識別和殺傷作用，從而達到抗感染(尤其是HCV感染)的目的，實現預防或治療肝炎的效果，優選情況下，本發明所述的ECRG4誘發免疫細胞識別和殺傷丙肝病毒(HCV)感染細胞，實現預防或治療丙肝的效果。
圖1是本發明實施例中的丙肝患者和正常人的外周血單個核細胞內的ECRG4表達的檢測結果圖。圖2是現有的pcDNA3.1的結構示意圖。圖3是本發明的重組質粒pcDNA3.1-ECRG4的結構示意圖。圖4是本發明對照組的CTL殺傷實驗檢測結果圖。圖5是本發明實驗組的CTL殺傷實驗檢測結果圖。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
和附圖，對本發明的技術方案作進一步具體的說明，但是本發明并不限于這些實施例。本發明的食管癌相關基因-4的用途，所述的食管癌相關基因_4 (ECRG4)用于預防或治療肝炎。作為優選，所述的食管癌相關基因_4 (ECRG4)用于預防或治療丙肝；更進一步的優選，通過將食管癌相關基因_4克隆入真核表達質粒pcDNA3.1得到重組質粒pcDNA3.1-ECRG4后再用 于預防或治療丙肝。更具體的說，通過將本發明的ECRG4基因轉入HCV感染細胞，逆轉HCV感染細胞的免疫逃避，實現促進免疫細胞對HCV感染細胞的識別和細胞殺傷，從而達到抗HCV感染的目的，實現預防或治療丙肝的效果。以下更進一步說明ECRG4基因能夠實現預防或治療丙肝的作用。一.丙肝患者外周血單個核細胞內ECRG4檢測取20份丙肝病毒(HCV)陽性患者肝素抗凝的外周血(以健康體檢的正常人外周血做對照)，將HCV患者肝素抗凝的外周血(以體檢健康的正常人外周血做對照)和淋巴細胞分離液加入離心管中，采用常規的方法進行密度梯度離心分離外周血淋巴細胞，以 RIPA 緩沖液(25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM EDTA, l%Triton-X-100, 1% 脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate) , 0.1%SDS, pH7.4)裂解細胞，加入IX蛋白酶抑制劑(購買自Pierce公司，美國)，在3500r/min且控制溫度在4°C的條件下進行離心IOmin,取上清。然后利用Bio-Rad分析試劑盒(購買自Bio-Rad公司，美國)來檢測蛋白濃度。以ant1-ECRG4(l:400,購買自 Sigma 公司，美國)和 β-actin (1:10000，購買自 Sigma 公司，美國)為一抗，40 μ g的上樣量來進行Western blot檢測，檢測其中ECRG4蛋白表達情況，具體分析結果如圖1所示。二.HCV感染的胎肝細胞制備1.培養人胎肝細胞取凍存的人胎肝細胞，經37°C復蘇后，加入含有10%胎牛血清的DMEM (購買自Gibco公司)5mL，在1000轉/分鐘的條件下離心5分鐘，去除凍存液，加入含有10%胎牛血清的DMEM，在37°C，5%C02的條件下進行培養，得到人胎肝細胞。2.HCV感染胎肝細胞取上述培養的人胎肝細胞以I X IO5細胞/孔的濃度種入6孔培養板，以含有10%胎牛血清的DMEM為培養液，進行培養過夜,然后,加入丙肝病毒(HCV)陽性患者血清0.5ml,以正常人血清做對照，進行體外感染人胎肝細胞，并以含有10%胎牛血清DMEM補足培養液，感染4h后，棄去培養上清，采用PBS緩沖液清洗4次后，加入含有10%胎牛血清的DMEM再進行培養，分別于培養24h、48h和72h時取培養細胞采用常規的免疫組化及RT-PCR加以鑒定即可，得到感染有HCV的人胎肝細胞。三.ECRG4過表達人胎肝細胞制備1.ECRG4表達質粒構建根據美國國立生物技術信息中心(NCBI)的參考序列NM_032411.2(C2orf40):以上游引物5’ -GCGGATCCCTGCCTCCCCCGCGCG-3’，和下游引物 5’ -CTAGCGGCCGCACAGCGTGTGGCAAGTCATGGT-3’為引物對，通過PCR擴增從人乳腺組織中擴增ECRG4基因片段，基因長度517bp，上述PCR擴增的條件為94°C變性5min后，進入循環程序，所述的循環程序為:94°C變性30秒，60°C退火30，72°C延伸I分鐘，共循環25次，然后再在72°C延伸lOmin，得到PCR擴增產物，將PCR產物經DNA純化試劑盒純化后，再經BamHI和Notl酶切后，克隆入真核表達質粒p cDNA3.1的BamHI和Notl酶切位點，得到重組質粒pcDNA3.1-ECRG4，將該重組質粒經酶切加以鑒定,具體的重組質粒pcDNA3.1-ECRG4的結構如圖2所示。2.ECRG4過表達的人胎肝細胞制備取上述感染有HCV的人胎肝細胞以I X IO5細胞/孔的濃度種入6孔培養板，以含有10%胎牛血清的DMEM為培養液，進行培養過夜，當細胞達到50%-80%融合時，在轉染試劑FuGENE6(購買自Roche公司，美國)的輔助下，用質粒pcDNA3.1-ECRG4 (以空白質粒pcDNA3.1做對照)去轉染。轉染8h后棄去培養上清，加入含有10%胎牛血清的DMEM進行培養，培養24h后用600mg/L的G418 (購買自Sigma公司)來篩選穩定轉染的細胞，即ECRG4過表達的人胎肝細胞。四.ECRG4抑制丙肝病毒(HCV)感染將淋巴細胞分離液和HCV感染患者的肝素抗凝的外周血加入離心管中，然后采用常規的方法進行密度梯度離心提取HCV感染患者的外周血單個核細胞，以此細胞作為效應細胞；另外，以上述pcDNA3.1-ECRG4穩定轉染的感染有HCV的人胎肝細胞為靶細胞(以轉染有空白質粒的細胞做對照)，以效靶比為5:1進行細胞殺傷實驗，24h后，消化所有的細胞，經PI染色后，采用流式細胞儀檢測細胞殺傷情況。具體的檢測結果如圖4和圖5所示。五.丙肝外周血單個核細胞中ECRG4啟動子區的甲基化情況分析取丙肝外周血單個核細胞樣本及體檢健康的正常人外周血淋巴細胞標本各15個樣本，提取基因組DNA,取0.5 2 μ g的DNA經EZ DNA Methylation Kit (購買自ZYMO Research公司，美國)處理后，選取ECRG4啟動子區特異性引物M-C2orf40-F:5’ -TGGGTTTTYGGAATTTAGTTTG-3’ 和 M_C2orf40-R: 5’ -RATCAAAACCAAAACAACAAACC-3’ 進行 PCR擴增，PCR擴增產物經QIAquick PCR Purification Kit (購買自QIAGEN公司，美國)純化后連入T載體(購買自上海生工生物工程有限公司)，然后，將連接產物轉化ToplO感受態(Invitrogen, San Francisco, CA, USA),從每個樣本隨機挑取10個克隆,采用質粒提取試劑盒提取質粒并進行測序，采用常規的方法測序即可，本實施例中的測序由上海生工生物工程有限公司完成。然后分析ECRG4啟動子區CpG島，與對照相比，高于均值二倍的被認為是甲基化。測序結果顯示，丙肝外周血單個核細胞中ECRG4啟動子區的甲基化比例非常高，15個樣本全部有不同程度的甲基化，而正常對照組則無甲基化出現，差異十分顯著，P< 0.05。因此，可以看出ECRG4啟動子區的甲基化是ECRG4在HCV感染細胞中低表達的原因。以下是對實驗結果的具體分析，從圖1中可以看出，證實了 HCV患者外周血淋巴細胞內ECRG4的表達水平明顯低于正常對照，差異顯著，P < 0.05。圖2是現有的pcDNA3.1的結構示意圖，圖3是重組質粒pcDNA3.1-ECRG4的結構示意圖。從圖5可以看出，HCV感染患者的外周血單個核細胞對ECRG4過表達組(實驗組)的殺傷比例為43.63%，顯著高于圖4所示的對照組的殺傷比例10.87%，P < 0.05。結果顯示，重組質粒pcDNA3.1-ECRG4介導ECRG4轉基因入胎肝細胞，逆 轉了 HCV的免疫逃避，誘發了免疫細胞對HCV感染細胞的識別和殺傷作用，從而也說明了所述的ECRG4能夠預防或治療丙肝的效果。以上實驗結果采用常規的SPSS17.0軟件進行統計學分析，組間差異進行t檢驗。本發明中所描述的具體實施例僅是對本發明精神作舉例說明。本發明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發明的精神或者超越所附權利要求書所定義的范圍。盡管對本發明已作出了詳細的說明并引證了一些具體實施例，但是對本領域熟練技術人員來說，只要不離開本發明的精神和范圍可作各種變化或修正是顯然的。
權利要求
1.一種食管癌相關基因-4的用途，其特征在于，所述的食管癌相關基因-4用于預防或治療肝炎。
2.根據權利要求1所述的食管癌相關基因_4的用途，其特征在于，所述的食管癌相關基因-4用于預防或治療丙肝。
3.根據權利要求2所述的食管癌相關基因_4用途，其特征在于，所述食管癌相關基因_4通過克隆入真核表達質粒pcDNA3.1得到重組質粒pcDNA3.1-ECRG4后用于預防或治療丙肝。
4.根據權利要求2-3任意一項所述的食管癌相關基因_4用途，其特征在于，所述的食管癌 相關基因_4用于使免疫細胞識別和殺傷丙肝病毒感染細胞。
全文摘要
本發明涉及一種食管癌相關基因-4的用途，屬于生物基因工程技術領域。提供一種食管癌相關基因-4(ECRG4)的新的用途，所述食管癌相關基因-4用于預防或治療肝炎，尤其用于預防或治療丙肝。與現有將ECRG4用于抑癌的用途不同，所述ECRG4基因轉入肝炎病毒(尤其是HCV)感染細胞后，能夠逆轉肝炎病毒(尤其是HCV)的免疫逃避，促進免疫細胞對肝炎病毒感染細胞(尤其是HCV感染細胞)的識別和殺傷作用實現抗感染(尤其是HCV感染)的目的，實現預防或治療肝炎的效果。
文檔編號A61P1/16GK103110960SQ20131007011
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者陳佳玉, 劉池波, 王海寶, 金曉燕 申請人:陳佳玉, 劉池波, 王海寶