生長(zhǎng)因子制劑及其生產(chǎn)方法

生長(zhǎng)因子制劑及其生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明是關(guān)于一種生長(zhǎng)因子制劑及其生產(chǎn)方法，包含以下步驟：取得一自體血液；從自體血液中分離出一血液組成物；以血液組成物制備一第一細(xì)胞培養(yǎng)液；以第一細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至少一自體細(xì)胞1至3天，使自體細(xì)胞分泌復(fù)數(shù)種生長(zhǎng)因子至第一細(xì)胞培養(yǎng)液中，形成一第二細(xì)胞培養(yǎng)液；取出第二細(xì)胞培養(yǎng)液；以及將第二細(xì)胞培養(yǎng)液，制備成一生長(zhǎng)因子制劑，生長(zhǎng)因子至少包含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，或更進(jìn)一步包含角質(zhì)生長(zhǎng)因子。
【專利說(shuō)明】生長(zhǎng)因子制劑及其生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是關(guān)于一種生長(zhǎng)因子制劑及其制備方法，特別是關(guān)于一種用于促進(jìn)皮膚組織再生的生長(zhǎng)因子制劑。
【背景技術(shù)】
[0002]健康的人體本身即具有完善的自我修復(fù)生理機(jī)制，尤其是代謝頻繁的特定器官或組織，例如皮膚組織或血液，這些組織中特定細(xì)胞具備活躍的分裂與汰換能力，足以適時(shí)支持受損或老化的組織進(jìn)行修復(fù)。其中最為人熟知的莫屬各種具有明顯的分化能力或分裂能力的干細(xì)胞或上皮細(xì)胞。而以人工方法取得同種同體的自體(autologous)組織例如皮膚、脂肪、干細(xì)胞達(dá)成臨床治療或修復(fù)的相關(guān)療法，便是基于上述的原理。此外，自體(autologous)組織或材料的使用，可免除其他種類的體細(xì)胞療法(somatic cell therapy)如同種異體(allogeneic)或異種異體(xenogeneic)療法所具有的傳染性疾病感染的隱憂或是產(chǎn)生免疫排斥引發(fā)后遺癥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0003]針對(duì)皮膚而言，其為人體抵御外界環(huán)境傷害或病源感染的重要防線，各式損傷，如:燒燙傷、手術(shù)、發(fā)炎的創(chuàng)傷、潰瘍或是久愈不合的傷口(尤其常見(jiàn)于糖尿病患者)，皆對(duì)人體健康造成威脅，故加速傷口愈合長(zhǎng)年以來(lái)都是重要的醫(yī)學(xué)議題。另一方面，「老化」也是皮膚趨于弱化而不健康的一種型態(tài)，而現(xiàn)代人對(duì)于外表益加重視，往往積極尋求延緩皮膚老化的方法，其中的途徑的一即是促進(jìn)表皮組織的修復(fù)與再生機(jī)制。 [0004]早期研究發(fā)現(xiàn)血液中的血漿中所含的血小板除了具有凝血功能外，在特定的環(huán)境下(例如提高血小板濃度、或是減少pH值，由7.0~7.2降到6.5~6.7左右呈略酸的狀態(tài))，血小板受刺激可大量產(chǎn)生皮膚生長(zhǎng)與修復(fù)所需的重要生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子可有效幫助修復(fù)損傷，進(jìn)而加速傷口愈合，以致于減輕疤痕組織的形成。因此，目前生長(zhǎng)因子已廣泛應(yīng)用于臨床治療及處置，包括外科手術(shù)、整形手術(shù)、骨科、牙科與皮膚移植等。是以自體血漿的療法通常立基于「血漿中富含血小板」的原理，采集具高濃度血小板的血漿作為材料進(jìn)行治療。
[0005]除了血漿外，血液中的「血清」亦有醫(yī)療應(yīng)用的價(jià)值。關(guān)于自體血清的醫(yī)療應(yīng)用，主要應(yīng)用于眼科護(hù)理居多，尤其是眼表相關(guān)癥狀，例如:受損的角膜、角膜愈合不良、角膜糜爛或潰瘍及重度干眼癥。血清對(duì)于眼科護(hù)理的有效作用機(jī)制在于其酸堿質(zhì)與成分類似淚液，除了蛋白質(zhì)、脂肪、電解質(zhì)、免疫蛋白、維生素等基本營(yíng)養(yǎng)外，還含有許多有助于眼球上皮細(xì)胞修復(fù)或再生所需要的生長(zhǎng)因子及細(xì)胞激素等，相對(duì)于使用藥物(如易引發(fā)副作用或衍生性不良反應(yīng)的類固醇或各類消炎藥物)等而言，是較安全又有效的護(hù)理方式。
[0006]就醫(yī)療應(yīng)用而言，血漿與血清的差異在于，血漿除富含血小板外，亦含電解質(zhì)、月旨類、蛋白質(zhì)、醣類等多種成分，其中的電解質(zhì)則包含了鈉、鉀、鈣、鎂、磷以及多種微量金屬離子，這些電解質(zhì)成分都可能影響細(xì)胞的生理功能；血漿中的蛋白質(zhì)種類繁多，例如「血漿蛋白」常用于統(tǒng)稱血漿中的蛋白質(zhì)(可大致區(qū)分為白蛋白、球蛋白及纖維蛋白原)，以及凝血機(jī)制相關(guān)的系列凝血因子蛋白、血纖維蛋白原(Fibrinogen)及水解酶等。至于血清與血衆(zhòng)最大的差異之一，是血清須經(jīng)凝血后取得，故血清不具纖維蛋白原，并且含有凝血過(guò)程中由血小板釋放的少量物質(zhì)，常于臨床上被用作生化值及免疫相關(guān)檢驗(yàn)的檢測(cè)材料。此外，血清中富含多種血清蛋白、抗體，對(duì)于個(gè)體的免疫能力更是扮演重要角色，而其他微量成分如激素或蛋白酶抑制分子等更是維持代謝作用與恒定所不可或缺。
[0007]關(guān)于皮膚傷口愈合機(jī)制，大致可分為凝血期(Haemostasis)、炎性期(Inflammation)、增生期(Proliferation)及成熟期(Remodeling)，各時(shí)期參與的細(xì)胞不同，生長(zhǎng)因子的角色與重要性亦有差異，例如，凝血期與炎性期主要參與的是血小板、巨噬細(xì)胞(Macrophage)與嗜中性球(Neutrophil);增生期主要餐與的是巨噬細(xì)胞(Macrophage)、淋巴細(xì)胞(Lymphocyte)、纖維母細(xì)胞(Fibroblast)、上皮細(xì)胞(Epithelialcell)及內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cell)等；成熟期的主要參與的則是纖維母細(xì)胞。其中「纖維母細(xì)胞」對(duì)于傷口愈合的機(jī)制中扮演重要角色，傷口產(chǎn)生初期血小板與巨噬細(xì)胞分泌趨化物質(zhì)(Cytokine或Chemokine)與生長(zhǎng)因子，刺激間葉細(xì)胞(mesenchymal cells)分化成纖維母細(xì)胞，而促使纖維母細(xì)胞生成膠原蛋白(collagen)，并引發(fā)血管新生作用(Angiogenesis)。纖 維母細(xì)胞繼而產(chǎn)生傷口愈合所必須的膠原蛋白纖維,增加傷口的彈性與張力，并形成疤痕組織，進(jìn)入成熟期，且疤痕組織中的膠原蛋白纖維會(huì)繼續(xù)增加并持續(xù)重組排列或規(guī)則化，使疤痕韌性提升，整個(gè)成熟期的過(guò)程可延續(xù)至數(shù)月甚至是數(shù)年。而整體而言，纖維母細(xì)胞同時(shí)具有接受生長(zhǎng)因子刺激并分泌生長(zhǎng)因子的功能，對(duì)于生長(zhǎng)因子所引起的訊息傳導(dǎo)(signal transduction)機(jī)制而言是不可或缺的一環(huán)。
[0008]關(guān)于皮膚老化(aging)機(jī)制，同樣涉及復(fù)雜的生理調(diào)控機(jī)制，是一持續(xù)而漫長(zhǎng)的過(guò)程。在皮膚老化的過(guò)程中，纖維母細(xì)胞亦扮演了重要的角色，簡(jiǎn)言之，纖維母細(xì)胞是皮膚中維持結(jié)締組織健康的重要角色，其分泌的膠原蛋白可維護(hù)表皮生長(zhǎng)與修復(fù)，其產(chǎn)生降解結(jié)締組織蛋白脂相關(guān)水解酶,例如基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMP),而各種生長(zhǎng)因子的刺激則使得纖維母細(xì)胞適時(shí)分泌產(chǎn)生結(jié)締組織蛋白或水解酶，并且回饋分泌生長(zhǎng)因子調(diào)控周邊細(xì)胞，使皮膚維持正常的增生與代謝機(jī)能。但隨著年紀(jì)的增長(zhǎng)，纖維母細(xì)胞的膠原蛋白產(chǎn)量逐漸降低，產(chǎn)出可溶性膠原蛋白的比例也隨著減少，取而代的的是不可溶性膠原蛋白，或是變異的膠原蛋白，使皮膚失去了彈性而開(kāi)始出皺紋等老化現(xiàn)象。因此，現(xiàn)今的醫(yī)藥美容產(chǎn)業(yè)通常是針對(duì)「刺激纖維母細(xì)胞增生膠原蛋白」或「減緩膠原蛋白的分解」為目標(biāo)，積極尋求更有效的抗皮膚老化方法。
[0009]針對(duì)受損皮膚或傷口的治療，傳統(tǒng)上常采用支持性療法，亦即由補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、充分休息、敷料護(hù)理、服用抗生素等方式，使病患主要依靠自身免疫力來(lái)對(duì)抗病原，并完成修復(fù)機(jī)制而痊愈。而隨著科學(xué)研究對(duì)于生長(zhǎng)因子與促進(jìn)皮膚再生與修復(fù)機(jī)制的了解，生長(zhǎng)因子逐漸廣泛地被使用于促進(jìn)傷口療愈的用途。
[0010]與傷口修復(fù)或維持皮膚正常機(jī)能相關(guān)生長(zhǎng)因子種類繁多，其中包含了表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor, EGF)、血小板衍生性生長(zhǎng)因子(Platelet derived growthfactor, F1DGF)、喊性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)(basic fibroblast growth factor, bFGF)、類膜島素生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor, IGF)、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Keratinocyte GrowthFactor,KGF,其別名 FGF-7 或FGF-10)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growthfactor, VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)等眾多因子，不逐一敘明。而各種生長(zhǎng)因子是針對(duì)不同時(shí)期的傷口狀態(tài)的組織微環(huán)境產(chǎn)生不同的影響力，其最后達(dá)成的生理功能即為修復(fù)傷口，達(dá)到療愈的效。而傷口愈合的過(guò)程中單一的生長(zhǎng)因子無(wú)法達(dá)成上述效果，而必須靠多種生長(zhǎng)因子協(xié)同作用才得以完成。
[0011]上述的生長(zhǎng)因子中，角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)在傷口愈合過(guò)程中的「上皮組織化現(xiàn)象」(epithelialization)有重要的影響力，此現(xiàn)象泛指?jìng)谟系脑錾谂c成熟期階段，上皮細(xì)胞(Epithelial cell)出現(xiàn)活躍增生(Proliferation)并移行(Migration)的現(xiàn)象，使增生的角質(zhì)上皮細(xì)胞(Keratinocyte)得以充分覆蓋傷口組織以形成傷口的保護(hù)膜。根據(jù)研究指出，在傷口組織中KGF的分泌來(lái)源主要是角質(zhì)上皮細(xì)胞，其引發(fā)的訊息傳遞路徑主要包括TGF-a、TGF-β傳導(dǎo)路徑，促使纖維母細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞(myofibroblast)、原肌纖維母細(xì)胞(proto-myofibroblast)協(xié)同生成胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)。
[0012]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)顧名思義與傷口修復(fù)過(guò)程中的「血管新生」(Angiogenesis)過(guò)程息息相關(guān),其對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelium cell)具有特異性，可誘導(dǎo)血管新生及影響淋巴管的生成與分化；而其本身也是個(gè)重要的訊號(hào)傳導(dǎo)分子，主導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞的增生、移動(dòng)及生長(zhǎng)及壽命，其亦可調(diào)節(jié)血管通透性，這些機(jī)制均在傷口愈合的過(guò)程中扮演重要角色。此外，更有研究指出，VEGF有助于治療缺血性心臟病(參見(jiàn)Journal ofthe American College of Cardiology)、促進(jìn)毛囊健康與毛發(fā)生成(參見(jiàn) Yano et al.,The Journal of Clinical Investigation.107:409-417 ;2001)、治療退化性神經(jīng)疾病(參見(jiàn) Wang et al., The Journal of Neuroscience.27 (2):304-307 ;2007 及 Yang et al.,The Journal of Neurochemistry.93:118-127 ；2005)等效用。
[0013]前述的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)亦在傷口愈合機(jī)制中扮演重要角色，可加速傷口療愈的進(jìn)程。在傷口組織中，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的主要來(lái)源包括纖維母細(xì)胞，而肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的C-Met受器(c-Met receptor)則主要分布在角質(zhì)上皮細(xì)胞中，故肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子作用機(jī)制主要是透過(guò)吸引嗜中性球(neutrophil)，單核球(monocyte)及巨細(xì)胞(mast cell)至傷口處，以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向創(chuàng)傷處移行，并促使角質(zhì)上皮細(xì)胞的移行及增生，以加速修復(fù)機(jī)制的進(jìn)展。值得注意的是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在慢性傷口(chronic)與急性(acute)傷口的作用機(jī)制有所不同(參見(jiàn)CurrentSignal Transduction Therapy.6 (2):152-155 ;2011),特別是慢性傷口中，這樣的現(xiàn)象顯示，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)于慢性傷口(常見(jiàn)于糖尿病患)的修復(fù)機(jī)制更顯重要。而研究報(bào)告亦指出肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子為傷口愈合過(guò)程所必須的生長(zhǎng)因子，其對(duì)于新生血管組織(Neovascularization)與顆粒組織(Granulation tissue)的修復(fù)與再生具有明顯的影響效用(參見(jiàn) Yoshida et al., Journal of Investigative Dermatology.120(2):335-43;2003)。除上述功能外，更有研究指出肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子在其他生理修復(fù)機(jī)制中的效用，例如，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可由抑制肺泡細(xì)胞死亡及促進(jìn)肺泡細(xì)胞再生，助于減緩肺氣腫的進(jìn)程(參見(jiàn) Shigemura et al.，Circulat on.1ll:1407-1414 ；2005);肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可由抑制肌纖維母細(xì)胞(myo-fibroblast)的活化并拮抗TGF-β訊息傳導(dǎo)路徑，減緩慢性腎纖維化的進(jìn)程(參見(jiàn) Liu, American Journal of Physiology-Renal Physiology);肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可由調(diào)控間葉干細(xì)胞(mesenchymal stem cell),降低自體免疫導(dǎo)致的脊髓神經(jīng)損傷,具有治療多發(fā)性硬化癥的潛力；且近期研究報(bào)導(dǎo)亦指出，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可有效改善外圍動(dòng)脈阻塞疾病造成的皮下組織缺血性潰瘍(參見(jiàn)Makino et al.,Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology32:2503-2509 ；2012)。
[0014]纖維母細(xì)胞(Fibroblasts)遍布人體全身，可從皮膚組織獲得細(xì)胞來(lái)源，其具有易于培養(yǎng)及分泌膠原蛋白的特性，對(duì)于維持皮膚健康而言非常重要。除了分泌膠原蛋白外，纖維母細(xì)胞亦具備了自我分泌生長(zhǎng)因子的能力，例如:表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor- β , TGF-β)、血小板衍生性生長(zhǎng)因子(TOGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等，且在體外培養(yǎng)的條件下亦保有此特性。
[0015]脂肪干細(xì)胞(Adipose derived stem cells,ADSC)是一群由脂肪細(xì)胞中分離出來(lái)的干細(xì)胞，具有顯著的分化潛能(multipotent),可分化成脂肪細(xì)胞以外的其他多種細(xì)胞，例如:硬骨、軟骨、神經(jīng)細(xì)胞等，因此在組織修復(fù)及細(xì)胞再生方面的運(yùn)用很廣泛。研究報(bào)導(dǎo)指出，脂肪干細(xì)胞具抑制發(fā)炎反應(yīng)、促進(jìn)血管新生及促進(jìn)纖維母細(xì)胞增生并分泌膠原蛋白的效果，且脂肪干細(xì)胞可分化形成上皮細(xì)胞，并分泌多種生長(zhǎng)因子，可啟動(dòng)或強(qiáng)化細(xì)胞的生理反應(yīng)包括增生(proliferation)或移行(migration)等，以促進(jìn)傷口愈合與修復(fù)皮膚老化現(xiàn)象(皺紋)等。
[0016]因應(yīng)上述對(duì)于生長(zhǎng)因子的需求，必須取得大量的人類生長(zhǎng)因子，而目前主要是利用基因工程方法產(chǎn)制生長(zhǎng)因子。亦即。將生長(zhǎng)因子的基因轉(zhuǎn)殖入載體表現(xiàn)對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)因子蛋白后，加以純化而取得。然而，上述基因工程方法雖可降低生產(chǎn)生長(zhǎng)因子的成本，卻具有以下缺點(diǎn): [0017](I)目前基因轉(zhuǎn)殖方法可負(fù)載并表現(xiàn)的基因數(shù)量(即插入載體的基因數(shù)量)與規(guī)模(各基因片段的核苷酸長(zhǎng)度)有限:如使用單一載體表現(xiàn)多種生長(zhǎng)因子的基因，操作上的難度顯著提高，例如將三種以上基因同時(shí)表現(xiàn)，將難以確保其正常表現(xiàn)與對(duì)應(yīng)的活性；而使用多個(gè)載體各自表現(xiàn)生長(zhǎng)因子，則在質(zhì)體的制備與蛋白表現(xiàn)的工序則更加繁復(fù)。
[0018](2)當(dāng)上述轉(zhuǎn)殖基因是利用原核生物或異種生物時(shí)，其產(chǎn)出的生長(zhǎng)因子蛋白的蛋白質(zhì)長(zhǎng)存有活性較差或純度不一的問(wèn)題，皆削弱了生長(zhǎng)因子的實(shí)際效用，更甚者，若生長(zhǎng)因子蛋白的蛋白質(zhì)純化物中含有內(nèi)毒素或其他雜質(zhì)時(shí)，不但會(huì)影響療效，更極有可能引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的負(fù)面影響。
[0019]由于上述現(xiàn)行取得生長(zhǎng)因子的方法的缺點(diǎn)，人們逐漸轉(zhuǎn)向?qū)で蟾硐氲纳L(zhǎng)因子來(lái)源，即為人體自然產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子，其中又以自體來(lái)源的材料為佳。在于安全操作的前提下，自體生物材料可免除異體生物材料引發(fā)的免疫排斥疑慮，還可避免傳染性病原(如肝炎、艾滋病)的感染風(fēng)險(xiǎn)。而人體中最容易取得的生物材料即為「血液」，故目前的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)往往利用血液取得生長(zhǎng)因子來(lái)源，并將生長(zhǎng)因子利用于促進(jìn)傷口愈合及抗老化等用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]本發(fā)明的目的在于提供一種自血液中制得高濃度生長(zhǎng)因子制劑的方法以及此方法所制備而得的生長(zhǎng)因子制劑。以改進(jìn)公知技術(shù)中存在的缺陷。
[0021]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，該方法包含以下步驟:
[0022](I)取得一自體血液；
[0023](2)自該自體血液中分離出一血液組成物；
[0024](3)以該血液組成物制備一第一細(xì)胞培養(yǎng)液；[0025](4)以該第一細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至少一自體細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間介于20-72小時(shí)，使該自體細(xì)胞分泌復(fù)數(shù)種生長(zhǎng)因子至該第一細(xì)胞培養(yǎng)液中，形成一第二細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0026](5)取出該第二細(xì)胞培養(yǎng)液；以及
[0027](6)將該第二細(xì)胞培養(yǎng)液，制備成一生長(zhǎng)因子制劑，該些生長(zhǎng)因子至少包含一血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及一肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；
[0028]其中，該第二細(xì)胞培養(yǎng)液所含的該血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度介于150~1000pg/ml，該肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度介于800~3000pg/ml。
[0029]所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，其中，該血液組成物為一血清。
[0030]所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，其中，該第一細(xì)胞培養(yǎng)液的成分含有90%以上的該血液組成物。
[0031]所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，其中，該些生長(zhǎng)因子包含一角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，而該第二細(xì)胞培養(yǎng)液所含的該角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度介于20~45pg/ml。
[0032]所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，其中，該自體細(xì)胞是選自一自體纖維母細(xì)胞、一自體脂肪干細(xì)胞，或是一自體纖維母細(xì)胞及一自體脂肪干細(xì)胞的組合所構(gòu)成的群組。
[0033]所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，其中，該步驟(5)或該步驟(6)之后可包含一過(guò)濾步驟。 [0034]本發(fā)明提供的生長(zhǎng)因子制劑，該生長(zhǎng)因子制劑是利用上述任一種所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制備，該生長(zhǎng)因子制劑含有復(fù)數(shù)種生長(zhǎng)因子，該些生長(zhǎng)因子包含一血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及一肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，該血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度介于150~1000pg/ml ;該肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度介于800~3000pg/ml。
[0035]所述的生長(zhǎng)因子制劑，其中，該些生長(zhǎng)因子包含一角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，該角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度介于20~45pg/ml。
[0036]本發(fā)明提供的用于促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑，該用于促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑包含:
[0037]—根據(jù)上述的生長(zhǎng)因子制劑，含有復(fù)數(shù)種生長(zhǎng)因子，該些生長(zhǎng)因子制劑至少包含一血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及一肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；
[0038]一緩沖液；以及
[0039]一營(yíng)養(yǎng)劑，其成分包含一葡萄糖及復(fù)數(shù)種電解質(zhì)。
[0040]所述的用以促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑，其中，該葡萄糖的重量比例濃度為5%。
[0041]綜合上述本發(fā)明提供的技術(shù)特征與發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種生長(zhǎng)因子制劑成份及其生產(chǎn)方法,可由自體血清培養(yǎng)自體細(xì)胞,使自體血清刺激自體細(xì)胞產(chǎn)生大量的生長(zhǎng)因子，其中尤以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度提升強(qiáng)況最為顯著，并產(chǎn)出富含自體生長(zhǎng)因子的生長(zhǎng)因子制劑，以獲得具高度安全性的醫(yī)療制劑或
美容產(chǎn)品。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1是根據(jù)本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的生長(zhǎng)制劑中生長(zhǎng)因子含量變化的數(shù)據(jù)圖，呈現(xiàn)本發(fā)明第一實(shí)施例利用自體脂肪干細(xì)胞，經(jīng)由本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的生長(zhǎng)因子制劑中特定生長(zhǎng)因子濃度變化情形。
[0043]圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例I的數(shù)據(jù)圖，呈現(xiàn)利用自體脂肪干細(xì)胞經(jīng)由本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的生長(zhǎng)因子制劑中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度變化趨勢(shì)。
[0044]圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例2的數(shù)據(jù)圖，呈現(xiàn)利用自體脂肪干細(xì)胞經(jīng)由本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的生長(zhǎng)因子制劑中，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度變化趨勢(shì)。
[0045]圖4是根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例3的數(shù)據(jù)圖，呈現(xiàn)利用自體脂肪干細(xì)胞經(jīng)由本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的生長(zhǎng)因子制劑中，角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度變化趨勢(shì)。
[0046]圖5是根據(jù)本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的生長(zhǎng)制劑中生長(zhǎng)因子含量變化的數(shù)據(jù)圖，呈現(xiàn)本發(fā)明第二實(shí)施例利用自體纖維母細(xì)胞，經(jīng)由本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的生長(zhǎng)因子制劑中特定生長(zhǎng)因子濃度變化情形。
[0047]圖6是根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例4的數(shù)據(jù)圖，呈現(xiàn)利用自體纖維母細(xì)胞經(jīng)由本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的生長(zhǎng)因子制劑中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度變化趨勢(shì)。
[0048]圖7是根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例5的數(shù)據(jù)圖，呈現(xiàn)利用自體纖維母細(xì)胞經(jīng)由本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的生長(zhǎng)因子制劑中，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度變化趨勢(shì)。
【具體實(shí)施方式】
[0049]本發(fā)明提出一種生 長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，此方法包含以下步驟:
[0050](I)取得一自體血液；
[0051](2)從自體血液中分離出一血液組成物；
[0052](3)以所述血液組成物制備一第一細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0053](4)以第一細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至少一自體細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間介于20-72小時(shí)，使自體細(xì)胞分泌復(fù)數(shù)種生長(zhǎng)因子至所述第一細(xì)胞培養(yǎng)液中，形成一第二細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0054](5)取出第二細(xì)胞培養(yǎng)液；以及
[0055](6)將第二細(xì)胞培養(yǎng)液，制備成一生長(zhǎng)因子制劑，所述生長(zhǎng)因子至少包含一血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及一肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
[0056]其中，第二細(xì)胞培養(yǎng)液所含的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度系介于150~1000pg/ml ；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度系介于800~3000pg/ml。
[0057]上述生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法中的血液組成物包含血清，且第一細(xì)胞培養(yǎng)液的成分含有90%以上的血清。而上述生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法中，自體細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子可進(jìn)一步包含一角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，而第二細(xì)胞培養(yǎng)液所含的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度介于20~45pg/mlο
[0058]上述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法中所采用的自體細(xì)胞可選自源自同一個(gè)體的自體纖維母細(xì)胞、自體脂肪干細(xì)胞，或是自體纖維母細(xì)胞與自體干細(xì)胞組合而成的混合細(xì)胞。
[0059]而在上述生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法的步驟(5)或步驟(6)之后可進(jìn)一步包含過(guò)濾步驟。
[0060]一種生長(zhǎng)因子制劑，是利用根據(jù)前述的任一生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制備而得，此生長(zhǎng)因子制劑含有復(fù)數(shù)種生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子至少包含一血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及一肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度系介于150~1000pg/ml ;肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度介于800~3000pg/ml。[0061]本發(fā)明提出的生長(zhǎng)因子制劑，是利用前述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制備，此生長(zhǎng)因子制劑含有復(fù)數(shù)種生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子包含一血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及一肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度介于150~1000pg/ml ;而肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度介于800 ~3000pg/ml。
[0062]上述的生長(zhǎng)因子制劑，其所含的復(fù)數(shù)種生長(zhǎng)因子可進(jìn)一步包含一角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，而此角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度介于20~45pg/ml。
[0063]本發(fā)明提出的用于促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑，包含:前述生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制備而得的生長(zhǎng)因子制劑，含有復(fù)數(shù)種生長(zhǎng)因子，其中至少包含一血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及一肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；一緩沖液；以及一營(yíng)養(yǎng)劑，其成分包含一葡萄糖及復(fù)數(shù)種電解質(zhì)。
[0064]基于上述的本發(fā)明提供的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法、生長(zhǎng)因子制劑與用于促進(jìn)皮膚組織再生的組合 制劑的精神，
[0065]本發(fā)明提供的簡(jiǎn)易而有效的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，經(jīng)由此方法制備而得的生長(zhǎng)因子制劑，以及利用前述生長(zhǎng)因子制劑所制得的用于促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑，具有多種高濃度的天然生長(zhǎng)因子，且上述生長(zhǎng)因子制劑及其衍生產(chǎn)品(例如其組合制劑)的安全性高于基因工程產(chǎn)制的生長(zhǎng)因子。
[0066]本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法采用的材料來(lái)源均為自體(Autologous)材料，故可并排除異體移植導(dǎo)致的感染風(fēng)險(xiǎn)與免疫排斥現(xiàn)象。
[0067]本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法是利用自體刺激原(包含自體血清或相關(guān)制劑)培養(yǎng)自體細(xì)胞，促使自體細(xì)胞分泌含有自體來(lái)源的多種生長(zhǎng)因子，以模擬天然的人體環(huán)境產(chǎn)生含有自體生長(zhǎng)因子，并制成制劑，使此制劑能高度發(fā)揮良好療愈或延緩老化效果，而不會(huì)因?yàn)橹苿┘兌然騻€(gè)體差異而引發(fā)毒性、過(guò)敏等負(fù)面反應(yīng)。
[0068]本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的制劑，由于其安全高，其可采用注射方式注入自體達(dá)成更佳的療愈或修復(fù)效果，以達(dá)到修復(fù)護(hù)或抗老化的目標(biāo)。
[0069]本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的制劑，基于其簡(jiǎn)易的制備流程、高安全性及可采用注射給予病患自體等優(yōu)點(diǎn)，并基于特定生長(zhǎng)因子的特性，進(jìn)一步將此生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法與生長(zhǎng)因子制劑應(yīng)用至除了皮膚組織傷口或老化以外的病癥，如神經(jīng)損傷修復(fù)、腎臟修復(fù)或治療缺血性心臟病的治療途徑。
[0070]綜合上述本發(fā)明提供的技術(shù)特征與發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種生長(zhǎng)因子制劑成份及其生產(chǎn)方法,可由自體血清培養(yǎng)自體細(xì)胞,使自體血清刺激自體細(xì)胞產(chǎn)生大量的生長(zhǎng)因子，其中尤以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度提升強(qiáng)況最為顯著，并產(chǎn)出富含自體生長(zhǎng)因子的生長(zhǎng)因子制劑，以獲得具高度安全性的醫(yī)療制劑或
美容產(chǎn)品。
[0071]此外，根據(jù)本發(fā)明的精神，可進(jìn)一步依照更廣泛的用途與需求，利用前述的生長(zhǎng)因子制劑添加緩沖液或是營(yíng)養(yǎng)劑，以生產(chǎn)一用于促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑，提供更廣泛的醫(yī)療與美容保養(yǎng)的用途。
[0072]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)特征及優(yōu)點(diǎn)，能更為相關(guān)【技術(shù)領(lǐng)域】人員所了解并得以實(shí)施本發(fā)明，在此配合附圖，于后續(xù)的說(shuō)明書(shū)闡明本發(fā)明的技術(shù)特征與實(shí)施方式，并列舉較佳實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明。以下文中所對(duì)照的附圖，是表達(dá)與本發(fā)明特征有關(guān)的示意，并未亦不需要依據(jù)實(shí)際情形完整繪制；而關(guān)于本發(fā)明實(shí)施方式的說(shuō)明中涉及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)內(nèi)容，亦不再加以贅述。
[0073]基于本發(fā)明的功效與應(yīng)用主要在于醫(yī)療與美容用途，故對(duì)于取樣的對(duì)象稱作「患者」，凡是來(lái)自于同一患者(即同一個(gè)體)來(lái)源的材料即視做「自體」(Autologous)材料。
[0074]本發(fā)明提供的生長(zhǎng)因子制劑及其生產(chǎn)方法。其中生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法包含以下步驟:
[0075](I)取得一自體血液。
[0076](2)自自體血液中分離出一血液組成物。
[0077](3)以血液組成物制備第一細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0078](4)以第一細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至少一自體細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間介于20-72小時(shí)，使自體細(xì)胞分泌復(fù)數(shù)種生長(zhǎng)因子至第一細(xì)胞培養(yǎng)液中，形成一第二細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0079](5)取出第二細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0080](6)將第二細(xì)胞培養(yǎng)液，制備成一生長(zhǎng)因子制劑，這些生長(zhǎng)因子至少包含一血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及一肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
[0081]以下針對(duì)上述步驟逐一說(shuō)明:
[0082]首先根據(jù)步驟(1)與(2)，以抽血方式自患者靜脈中，取得自體血液，而為利于后續(xù)取得特定的血液組成物即血清，整個(gè)抽血過(guò)程與抽血器材，均不使用任何抗凝血?jiǎng)谷〕鲶w外的血液自然啟動(dòng)凝血機(jī)制,完成血液凝集的過(guò)程。而此階段的抽血量較佳的體積范圍介于150至200毫升之間，目的在于以不影響患者實(shí)時(shí)健康狀態(tài)的前提下，取得充足的血液量。在取得自體血液后，隨即將血液分裝至無(wú)菌狀態(tài)的50毫升離心管，于室溫靜置I小時(shí)，使離體血液得以充分完成凝血作用。接著，將前述的血液移入4°C的環(huán)境下存放，存放時(shí)間以48小時(shí)的內(nèi)為佳，即須在48小時(shí)內(nèi)，接續(xù)處理血液，以免影響制備效果。
[0083]接著，自4°C的環(huán)境中取出血液，以1000g的離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，離心時(shí)間為10分鐘。完成離心程序后即可更明顯地觀察到血液分層的現(xiàn)象。繼續(xù)根據(jù)分層，分離出上清液，便取得本發(fā)明生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所采用的血液組成物，即血清(下稱「自體血清」)，其體積約占原抽血量的體積的50%。
[0084]而在取得自體血清后，可視后續(xù)的應(yīng)用需求將血清加以初步處理，較為常用的手段是以孔徑尺寸0.22微米的過(guò)濾器材或?yàn)V膜加以過(guò)濾，以除去可能存于血清中的病原或是于分離上清液過(guò)程中所產(chǎn)生的雜質(zhì)，維持血清無(wú)菌的狀態(tài)。因此根據(jù)上述目標(biāo)，只要能達(dá)成去除雜質(zhì)或無(wú)菌的目標(biāo)，其他滅菌手段亦可取代本發(fā)明的過(guò)濾器材，惟前提是應(yīng)避免采用可能顯著影響血清的組成與功能的滅菌手段。
[0085]以上述步驟(1)與(2)所取得的自體血清，繼續(xù)根據(jù)步驟(3)，是以自體血清制備第一細(xì)胞培養(yǎng)液。具體而言，此處所指的第一細(xì)胞培養(yǎng)液用途可用于初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)自體細(xì)胞；然而，第一細(xì)胞培養(yǎng)液除了可充分維持自體細(xì)胞的生理機(jī)能正常運(yùn)作之外，其更重要的功能是為提供一營(yíng)養(yǎng)優(yōu)渥且具有充分刺激源的培養(yǎng)環(huán)境，以刺激自體細(xì)胞，使其因應(yīng)外界的刺激對(duì)應(yīng)分泌或大量產(chǎn)出特定種類的生長(zhǎng)因子。
[0086]本發(fā)明采用的第一細(xì)胞培養(yǎng)液，是采用一定比例的自體血清與特定細(xì)胞培養(yǎng)基或等張緩沖溶液所組成，可依照使用者需求，將自體血清以等張緩沖液(如表1所列的緩沖液)加以稀釋，或另行加入添加物而得步驟(3)所述的第一細(xì)胞培養(yǎng)液，使第一細(xì)胞培養(yǎng)液的成分含有90%以上的自體血清，其中以全血清培養(yǎng)為較佳的實(shí)施態(tài)樣。此外,本發(fā)明對(duì)于自體血清以外的成分不加以特別限制，較佳為使用等張緩沖液，或是成分完備且安全的無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，而此培養(yǎng)基的選擇系根據(jù)自體細(xì)胞的種類而異。
[0087]根據(jù)步驟(4)，是將第一細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)自體細(xì)胞。將上述第一細(xì)胞培養(yǎng)液加入已培養(yǎng)有自體細(xì)胞的培養(yǎng)角瓶中，進(jìn)行培養(yǎng)，使自體細(xì)胞有充足的時(shí)間與刺激條件，以分泌多種特定生長(zhǎng)因子至第一細(xì)胞培養(yǎng)液中，以形成富含特定的生長(zhǎng)因子第二細(xì)胞培養(yǎng)液。上述培養(yǎng)過(guò)程，其整體時(shí)間如過(guò)短，將不足以讓自體細(xì)胞充分分泌生長(zhǎng)因子；但過(guò)長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間則易于第二細(xì)胞培養(yǎng)液中累積細(xì)胞代謝物，并可能衍生出生長(zhǎng)因子降解或衰敗的問(wèn)題，故較佳的培養(yǎng)時(shí)間系介于20-72小時(shí)。其中，在加入第一細(xì)胞培養(yǎng)液之前，自體細(xì)胞的培養(yǎng)滿度以5至7成滿為較佳，此狀態(tài)是自體細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況較穩(wěn)定而且生理機(jī)能活躍的時(shí)期，使細(xì)胞在接受第一細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)后，仍可繼續(xù)成長(zhǎng)，并同時(shí)充分地分泌出大量且質(zhì)量?jī)?yōu)良的特定生長(zhǎng)因子。
[0088]而上述自體細(xì)胞系選自富有分泌生長(zhǎng)因子能力的細(xì)胞，例如各種干細(xì)胞，均不脫離本發(fā)明的精神所涵蓋的范圍。而本發(fā)明則以自體纖維母細(xì)胞或自體脂肪干細(xì)胞為較佳的實(shí)施態(tài)樣。此外，本發(fā)明的實(shí)施范圍亦涵蓋了自體纖維母細(xì)胞及自體脂肪干細(xì)胞共同培養(yǎng)的混合細(xì)胞群，其混合比例可依使用者的應(yīng)用需求而調(diào)整。
[0089]在上述的培養(yǎng)過(guò)程中，自體細(xì)胞將會(huì)受到第一細(xì)胞培養(yǎng)液的刺激而密集且大量分泌特定生長(zhǎng)因子，并釋出至其液態(tài)的培養(yǎng)環(huán)境中。因此，根據(jù)步驟(5)，經(jīng)由收集上述培養(yǎng)后的培養(yǎng)液，即成為富含特定生長(zhǎng)因子的第二細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0090]根據(jù)步驟出)，可直接使用第二細(xì)胞培養(yǎng)液制備生長(zhǎng)因子制劑，或是根據(jù)需求先行將第二細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)由濃縮程序后，再次提升生長(zhǎng)因子濃度后再行制備生長(zhǎng)因子制劑。而此處的「濃縮」泛指提升第二細(xì)胞培養(yǎng)液的生長(zhǎng)因子濃度的手段，廣義而言，其亦可涵蓋特定純化手段，例如以濾膜或透析等方法，除去代謝物或潛在的病原體等。關(guān)于濃縮方法，舉例而言，管柱層析純化濃縮或其他本領(lǐng)域通常知識(shí)者可易于選用的透析方法，均可應(yīng)用在此階段。同時(shí)，在前述步驟(5)或(6)之后，可依照使用者需求增加采用過(guò)濾步驟，以維持或是提升最終產(chǎn)出的生長(zhǎng)因子制劑的質(zhì)量。
[0091]經(jīng)由上述步驟可制得的生長(zhǎng)因子制劑中，其所富含的生長(zhǎng)因子主要包含了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子。然而，根據(jù)采用不同種類的自體細(xì)胞，可產(chǎn)出除了上述的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，例如角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子。經(jīng)由本發(fā)明方法所制得的生長(zhǎng)因子中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間而顯著提升，以取得富含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的生長(zhǎng)因子制劑。例如，經(jīng)由本發(fā)明生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所得的第二細(xì)胞培養(yǎng)液，其所含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度系介于150~1000pg/ml而肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的 濃度介于800~3000pg/ml，皆遠(yuǎn)高于上述兩種長(zhǎng)因子于自體血清中的濃度。
[0092]經(jīng)由本發(fā)明所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法取得的生長(zhǎng)因子試劑的生長(zhǎng)因子組成，是與選用的自體細(xì)胞相關(guān)，根據(jù)不同種類的自體細(xì)胞，可制得富含多種生長(zhǎng)因子的生長(zhǎng)因子試劑。因此，根據(jù)前述步驟，本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法制備而得的第二細(xì)胞培養(yǎng)液可進(jìn)一步含有角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，且其濃度介于20~45pg/ml。
[0093]根據(jù)上述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，可取得一種生長(zhǎng)因子制劑，其富含了多種生長(zhǎng)因子。具體而言，當(dāng)采用自體脂肪干細(xì)胞時(shí)，可生產(chǎn)特別富含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的生長(zhǎng)因子制劑；而當(dāng)采用自體纖維母細(xì)胞實(shí)施本發(fā)明所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，可生產(chǎn)特別富含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的生長(zhǎng)因子制劑。而上述生長(zhǎng)因子制劑的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度介于150~1000pg/ml ;肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度介于800~3000pg/ml ;而角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度則介于20~45pg/ml。
[0094]而取得上述生長(zhǎng)因子制劑后，可直接以凍存方式保存直至使用，使用方式可以注射(包含局部注射或靜脈點(diǎn)滴)方式或外敷施予患者進(jìn)行治療；亦可將生長(zhǎng)因子濃縮凍干后儲(chǔ)存；還可將上述生長(zhǎng)因子制劑進(jìn)一步加工生產(chǎn)成制劑組合，使本發(fā)明所提出的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法與對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)因子制劑，可更加廣泛應(yīng)用于醫(yī)療與美容保養(yǎng)。
[0095]因此，根據(jù)上述生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制備而得的生長(zhǎng)因子制劑應(yīng)用相當(dāng)廣泛，是以使用者不但可選擇直接使用上述的生長(zhǎng)因子制劑至醫(yī)療或美容保養(yǎng)用途，更可進(jìn)一步利用上述生長(zhǎng)因子制劑進(jìn)行濃縮、純化或各類加工程序，以制造用于促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑。此促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑的組成包含了上述生長(zhǎng)因子制劑、緩沖液及營(yíng)養(yǎng)劑。其中，生長(zhǎng)因子制劑至少包含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，亦可進(jìn)一步包含角質(zhì)生長(zhǎng)因子。而本發(fā)明對(duì)于緩沖液的選擇，并不加以特別限制，只要是與體液兼容的緩沖液(以等張溶液為較佳)均可用于本發(fā)明所述的組合制劑；關(guān)于營(yíng)養(yǎng)劑的成分，主要包含葡萄糖，及復(fù)數(shù)種電解質(zhì)，其中，電解質(zhì)系包含了鈉、鉀、鈣、鎂等較佳的葡萄糖濃度為重量比例濃度為5%。人體體液的平均滲透壓范圍約為300m0sm/L，其確切量測(cè)值隨個(gè)體生理狀態(tài)(如電解質(zhì)流失或)而有微幅的變化(正負(fù)偏差值約30)。例如表1所列舉的緩沖液/輸液或其他實(shí)質(zhì)成分類似的緩沖液，均適用于本發(fā)明所述的促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑。
[0096]為了充分說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方法，以下列舉實(shí)施例，說(shuō)明如下。
[0097]第一實(shí)施例:
[0098]采用自體脂肪干細(xì)胞(Adipose derived stem cells,ADSC)依本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法生產(chǎn)生長(zhǎng)因子試劑。首先說(shuō)明取得自體脂肪干細(xì)胞的流程:
[0099]本發(fā)明所述的脂肪干細(xì)胞泛指由脂肪細(xì)胞中分離出來(lái)，具有顯著分化能力的多功能性細(xì)胞。關(guān)于本發(fā)明取得自體脂肪干細(xì)胞的實(shí)施方法是采用由患者自體所取得的脂肪細(xì)胞，其來(lái)源主要是經(jīng)由脂肪抽取手術(shù)。且取得自體脂肪干細(xì)胞的整體過(guò)程，均應(yīng)在無(wú)菌操作的環(huán)境下實(shí)施為佳。
[0100]具體而言，在取得混有多種細(xì)胞及結(jié)締組織的脂肪抽取物(lipoaspirate)后(約300毫升即足夠)，靜置使血液與脂肪組織充分分層后，取得脂肪組織并進(jìn)行沖洗程序，以HBSS緩沖液(可視需求添加抗生素或抗真菌試劑)對(duì)脂肪組織反復(fù)沖洗，方式為加入足量的HBSS緩沖液并靜置I至5分鐘，使脂肪組織于HBSS緩沖液浮起，之后以吸管抽取移除HBSS，接著重復(fù)上述步驟數(shù)次。此沖洗程序的主要目的為先行洗去抽取物中的血球細(xì)胞。 [0101]接著以新鮮制備的膠原蛋白水解酶(collagenase)溶液加入沖洗完畢的脂肪組織并稍加混合，置于37°C環(huán)境下，對(duì)結(jié)締組織進(jìn)行水解作用(digestion)約30至60分鐘，以分離出混合細(xì)胞群(processed lipoaspirate cells, PLA cells)。而經(jīng)由水解作用所得的細(xì)胞混合物(外觀呈現(xiàn)乳化狀態(tài))亦常稱作基質(zhì)血管混合物(stromal vascularfraction，下稱SVF)，其中即包含了自體脂肪干細(xì)胞。接著，對(duì)于上述SVF進(jìn)行以400g轉(zhuǎn)速離心10分鐘后，去除未充分水解的脂肪組織。接著將SVF分裝，再次以紅血球溶解液處理SVF以充分移除紅血球。繼續(xù)以多重離心手續(xù)去除細(xì)胞團(tuán)塊及雜質(zhì)，并以梯度分離方法(gradient cell separation)初步分離細(xì)胞。由于此階段取得的細(xì)胞仍混有內(nèi)皮細(xì)胞或白血球等他種細(xì)胞，因此，繼續(xù)采用細(xì)胞篩選(cell sorting)方法,根據(jù)特定細(xì)胞的特異性細(xì)胞標(biāo)記(specific cell type marker),例如內(nèi)皮細(xì)胞采用⑶31為其細(xì)胞標(biāo)記；而白血球細(xì)胞采用CD45為其細(xì)胞標(biāo)記并使用特定抗體抗原結(jié)合方法進(jìn)行辨認(rèn)，由此分離并移除內(nèi)皮細(xì)胞或白血球細(xì)胞。完成上述方法便可取得本發(fā)明所指的自體脂肪干細(xì)胞。取得自體脂肪干細(xì)胞后，便采用一般例行的細(xì)胞繼代培養(yǎng)方法，維持自體脂肪干細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，并使用此自體脂肪干細(xì)胞，以本發(fā)明所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法制備生產(chǎn)生長(zhǎng)因子制劑。
[0102]在執(zhí)行本發(fā)明所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法之前，應(yīng)提前依照前述取得自體脂肪干細(xì)胞的流程取得同一患者的自體脂肪干細(xì)胞。根據(jù)上述實(shí)施方法所取得的自體脂肪干細(xì)胞，進(jìn)行制備生長(zhǎng)因子制劑的流程如下述:
[0103]自患者收取200ml靜脈血液,分裝置至50ml離心管，于室溫放置I小時(shí)后，存放4°C冰箱備用。接著，將血液取出以1000g轉(zhuǎn)速離心10分鐘后取得分層的血液樣本。針對(duì)血液樣本取其上清液，即為血清。根據(jù)使用需求，將血清以適當(dāng)緩沖液加以稀釋或以血清原液，做為第一細(xì)胞培養(yǎng)液，并使用于后續(xù)步驟。將上述第一細(xì)胞培養(yǎng)液以孔徑0.22微米的濾杯進(jìn)行過(guò)濾。接著，取一培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)角瓶中的自體脂肪干細(xì)胞，其細(xì)胞生長(zhǎng)滿度為5-7分滿。將自體脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)液置換為第一細(xì)胞培養(yǎng)液，系將足量的第一細(xì)胞培養(yǎng)液加入培養(yǎng)角瓶(如175T培養(yǎng)角瓶使用約30毫升的第一細(xì)胞培養(yǎng)液)。繼續(xù)培養(yǎng)1-3天，取得一第二細(xì)胞培養(yǎng)液。如使用未經(jīng)稀釋的血清作為第一培養(yǎng)液，則此時(shí)取得富含有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的血清(第二細(xì)胞培養(yǎng)液)。在取得前述第二細(xì)胞培養(yǎng)液后，可直接作為生長(zhǎng)因子制劑使用，以冷凍干燥方式儲(chǔ)放；或是對(duì)生長(zhǎng)因子制劑進(jìn)一步添加緩沖液及營(yíng)養(yǎng)劑，制備用于促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑。 [0104]為充分呈現(xiàn)本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的生長(zhǎng)因子制劑含有大量特定的生長(zhǎng)因子，以酵素免疫分析法(EILISA)測(cè)定生長(zhǎng)因子制劑的特定生長(zhǎng)因子含量。
[0105]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(以下分別稱為VEGF、HGF及KGF)的測(cè)定
[0106]利用R&D公司生產(chǎn)的VEGF檢測(cè)套組、HGF檢測(cè)套組及KGF檢測(cè)套組，測(cè)定本發(fā)明生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的生長(zhǎng)因子制劑中VEGF、HGF及KGF含量。其主要利用的方法是三明治法(Sandwich ELISA)，其偵測(cè)原理及實(shí)施細(xì)節(jié)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的手段，故不加以詳述。簡(jiǎn)言的，先制備檢測(cè)用96孔盤:將具有一次抗體(capture antibody)稀釋至適當(dāng)濃度后得一次抗體液，以100微升的體積將一次抗體液加入于孔盤內(nèi)，于室溫反應(yīng)一夜的時(shí)間，使一次抗體充分附著(coating)于孔盤內(nèi)。完成后，洗去多余一次抗體，以封閉液(blocking reagent)進(jìn)行封閉反應(yīng)(blocking),防止后續(xù)非專一'丨生的鍵結(jié)。取得附有一次抗體的96孔盤后，便可針對(duì)樣本進(jìn)行反應(yīng)與偵測(cè):將100微升的樣本及標(biāo)準(zhǔn)品(standards)加入孔盤中的各孔,于室溫反應(yīng)2小時(shí)；接著加100微升二次抗體(detectionantibody)，于室溫反應(yīng)2小時(shí)；反應(yīng)完成后，執(zhí)行沖洗程序，以充分移除未連結(jié)的抗體或各種可能造成干擾的雜質(zhì)。于每孔中加入100微升辣根過(guò)氧化酵素(HRP)標(biāo)記的卵白素(Streptavidin),于室溫避光反應(yīng)20分鐘后,加入終止劑(Stop Solution)終止反應(yīng),最后以光譜儀偵測(cè)各樣本于波長(zhǎng)405nm狀態(tài)下的吸光讀值，此值即反映出生長(zhǎng)因子(VEGF、HGF及KGF)的含量。
[0107]由于本發(fā)明是采用「自體來(lái)源」的材料，故可能因個(gè)體不同，而產(chǎn)生個(gè)體差異的問(wèn)題，故下述所有呈現(xiàn)本發(fā)明可達(dá)成效果的所有數(shù)據(jù)，均采用同一個(gè)體來(lái)源的對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)與分析說(shuō)明，以求客觀。
[0108]請(qǐng)參照?qǐng)D1，其呈現(xiàn)本發(fā)明第一實(shí)施例所述，將自體脂肪干細(xì)胞經(jīng)由本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的生長(zhǎng)因子制劑中特定生長(zhǎng)因子濃度變化情形。圖1所示的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)方式是先根據(jù)培養(yǎng)后第1、2、3天的時(shí)間點(diǎn)，分別取得第二細(xì)胞培養(yǎng)液與對(duì)照組(即100%自體血清)的樣本，并分別測(cè)得其中各生長(zhǎng)因子數(shù)據(jù)。接著,取對(duì)照組的偵測(cè)數(shù)據(jù)加總后，取其平均值，作為「對(duì)照用平均值」(background value of blank controls)。接著，將上述第1、2、3天時(shí)間點(diǎn)的第二細(xì)胞培養(yǎng)液樣本所得的數(shù)據(jù)，以前述的對(duì)照用平均值加以處理分析，即可得知各樣本相對(duì)于對(duì)照用平均值(即下述的對(duì)照組數(shù)據(jù))的變化倍率(foldto blank control)。
[0109]因此，由圖1可知，本發(fā)明第一實(shí)施例所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法制得的生長(zhǎng)因子制劑(此指第二培養(yǎng)液)中VEGF、HGF及KGF的含量顯著增加，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，其VEGF、HGF及KGF的含量亦隨之增加。其中，以KGF的增加幅度最為顯著，在培養(yǎng)第I天即高于對(duì)照組達(dá)3.8倍，其濃度更隨培養(yǎng)時(shí)間而繼續(xù)增加，到培養(yǎng)第3天時(shí)，KGF的濃度已高于對(duì)照組達(dá)6.6倍。其次，VEGF的含量則于培養(yǎng)第2天時(shí)顯著上升至對(duì)照組的3倍左右，至培養(yǎng)第3天時(shí)，已高于對(duì)照組近6倍之多。至于HGF的含量同樣是在培養(yǎng)第2天起可顯著觀察到其增加的狀況(2.4倍)，至培養(yǎng)第3天時(shí)，已高于對(duì)照組達(dá)3.18倍。因此，根據(jù)圖1可知，本發(fā)明第一實(shí)施例采用的方法可成功制得富含VEGF、HGF及KGF的第二細(xì)胞培養(yǎng)液，且使用者可根據(jù)需求，取不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)(至少培養(yǎng)2天為佳)的第二細(xì)胞培養(yǎng)液，加以濃縮或純化制得生長(zhǎng)因子制劑，或更進(jìn)一步加工制造組合制劑。
[0110]為更詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所達(dá)成的效果，以及根據(jù)此方法制得的生長(zhǎng)因子制劑優(yōu)于其他生長(zhǎng)因子制劑的特征，列舉下列實(shí)驗(yàn)例，及對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)結(jié)果加以說(shuō)明。
[0111]實(shí)驗(yàn)例I
[0112]根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施例所記載的方法，取得使用自體脂肪干細(xì)胞(下稱ADSC)生產(chǎn)的第二細(xì)胞培養(yǎng)液，于培養(yǎng)過(guò)程中的第1、2、3天分別取樣，并分別以前述ELISA試劑套組測(cè)定其中VEGF的含量。而對(duì)照組則是采用未經(jīng)培養(yǎng)ADSC的第一細(xì)胞培養(yǎng)液(即第一實(shí)施例所使用的100%自 體血清)進(jìn)行測(cè)定，以比較本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所達(dá)成的效果。其結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖2 (圖中，圖例標(biāo)示W(wǎng)/0 ADSC代表未經(jīng)培養(yǎng)ADSC的對(duì)照組樣本；圖例標(biāo)示with ADSC則表示經(jīng)培養(yǎng)ADSC所取得的第二細(xì)胞培養(yǎng)液樣本，下文不再加以重復(fù)說(shuō)明)呈現(xiàn)VEGF濃度隨培養(yǎng)時(shí)間顯著上升的情況。其VEGF濃度在培養(yǎng)第I天時(shí)，濃度即已升高至近第I天對(duì)照組的2倍(191.6pg/ml)，而隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，VEGF濃度更顯著提高，至第三天時(shí)，其濃度已達(dá)859.3pg/ml，遠(yuǎn)高于第3天對(duì)照組的8.8倍以上，顯見(jiàn)本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法可顯著刺激ADSC分泌VEGF至培養(yǎng)環(huán)境中，明顯提升了生長(zhǎng)因子制劑的VEGF含量。
[0113]實(shí)驗(yàn)例2
[0114]根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施例所記載的方法，取得使用ADSC生產(chǎn)的第二細(xì)胞培養(yǎng)液，于培養(yǎng)過(guò)程中的第1、2、3天分別取樣，并分別以前述ELISA試劑套組測(cè)定其中HGF的含量。而對(duì)照組則是采用未經(jīng)培養(yǎng)ADSC的第一細(xì)胞培養(yǎng)液(即第一實(shí)施例所使用的100%自體血清)進(jìn)行測(cè)定，以比較本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所達(dá)成的效果。其結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖2，其呈現(xiàn)HGF濃度隨培養(yǎng)時(shí)間顯著上升的情況。其HGF濃度在培養(yǎng)第I天時(shí)，濃度微幅升高，而隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，培養(yǎng)第2天時(shí)，HGF濃度顯著提高至2230.7pg/ml，達(dá)第2天對(duì)照組的
2.65倍，至培養(yǎng)第3天時(shí)，其濃度已達(dá)2906.9pg/ml，遠(yuǎn)高于對(duì)照組數(shù)3.1倍，顯見(jiàn)本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法可顯著刺激ADSC分泌HGF至培養(yǎng)環(huán)境中，明顯提升了生長(zhǎng)因子制劑的HGF含量。
[0115]實(shí)驗(yàn)例3
[0116]根據(jù)本發(fā)明第一實(shí)施例所記載的方法，取得使用ADSC生產(chǎn)的第二細(xì)胞培養(yǎng)液，于培養(yǎng)過(guò)程中的第1、2、3天分別取樣，并分別以前述ELISA試劑套組測(cè)定其中KGF的含量。而對(duì)照組則是采用未經(jīng)培養(yǎng)ADSC的第一細(xì)胞培養(yǎng)液(即第一實(shí)施例所使用的100%自體血清)進(jìn)行測(cè)定，以比較本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所達(dá)成的效果。其結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖4，其呈現(xiàn)HGF濃度隨培養(yǎng)時(shí)間顯著上升的情況。其KGF濃度在培養(yǎng)第I天時(shí)，濃度即已升高至第I天對(duì)照組的4.7倍(24.5pg/ml)，而隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)至培養(yǎng)第2天時(shí)，KGF濃度更顯著提高至35.0pg/ml，遠(yuǎn)高于第2天對(duì)照組的10倍之多，至培養(yǎng)第3天時(shí)，其濃度已達(dá)
42.0pg/ml，達(dá)第3天 對(duì)照組數(shù)4倍，顯見(jiàn)本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法可顯著刺激ADSC分泌KGF至培養(yǎng)環(huán)境中，明顯提升了生長(zhǎng)因子制劑的KGF含量。
[0117]第二實(shí)施例:
[0118]采用自體纖維母細(xì)胞(Fibroblast，F(xiàn)B)，依本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法生產(chǎn)生長(zhǎng)因子試劑。首先說(shuō)明取得自體纖維母細(xì)胞的流程:
[0119]第二實(shí)施例所述的自體纖維母細(xì)胞系指由患者自體皮膚組織中分離出來(lái)的纖維母細(xì)胞，其來(lái)源主要是皮膚檢體，采樣后的皮膚檢體系存于運(yùn)送液中，且取得自體纖維母細(xì)胞的整體過(guò)程，均應(yīng)在無(wú)菌操作的環(huán)境下實(shí)施為佳。
[0120]首先，準(zhǔn)備多個(gè)6-cm無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿,并各加入8ml PBS及抗生素(gentamicin),以無(wú)菌滴管將皮膚檢體自運(yùn)送液中取出，置于無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中浸泡清洗，依序?qū)⑵つw檢體移置下一無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿，重復(fù)清洗程序共三次。接著，將皮膚檢體移至另一空無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，以無(wú)菌解剖刀片，將皮膚檢體切成0.立方大小的皮膚碎塊。將皮膚碎塊移至裝有新鮮配制的酵素反應(yīng)液(digestion buffer)的培養(yǎng)角瓶中，酵素反應(yīng)液的配置內(nèi)容為:4毫升纖維母細(xì)胞培養(yǎng)液(含抗生素gentamicin)、0.5毫升IOX collagenase、0.5毫升IOX dispase0將培養(yǎng)角瓶移入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使其充分進(jìn)行水解反應(yīng)18-24小時(shí)。接著，分離將水解后的檢體與酵素反應(yīng)液整體取出，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。將離心后的上清液去除，以吸管溫和抽吸下層物(即細(xì)胞及細(xì)胞團(tuán)塊)多次，以充分分散細(xì)胞，即得纖維母細(xì)胞液，將纖維母細(xì)胞液維持在2-5ml。
[0121]以無(wú)菌量管小心移去上清液，取1.5ml纖維母細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)吸吐以打散細(xì)胞及皮膚碎塊。
[0122]維持細(xì)胞培養(yǎng)液體積在2_5ml范圍內(nèi)，使纖維母細(xì)胞得以充分穩(wěn)定成長(zhǎng)，并例行更新或添加細(xì)胞培養(yǎng)液，約于培養(yǎng)后第1-2周后，細(xì)胞生長(zhǎng)密度可達(dá)90%，此時(shí)便可以例行的繼代方法，對(duì)纖維母細(xì)胞進(jìn)行繼代，待細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定生長(zhǎng)且充足的狀態(tài)上，以本發(fā)明發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，制備生長(zhǎng)因子制劑。
[0123]在執(zhí)行本發(fā)明所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法之前，應(yīng)提前依照前述取得自體纖維母細(xì)胞的流程取得同一患者的自體脂肪干細(xì)胞。根據(jù)上述實(shí)施方法所取得的自體纖維母細(xì)胞，進(jìn)行制備生長(zhǎng)因子制劑的流程如下述:
[0124]自患者收取200ml靜脈血液,分裝置至50ml離心管，于室溫放置I小時(shí)后，存放4°C冰箱備用。接著，將血液取出以1000g轉(zhuǎn)速離心10分鐘后取得分層的血液樣本。針對(duì)血液樣本取其上清液，即為血清。根據(jù)使用需求，將血清以適當(dāng)緩沖液加以稀釋或以血清原液，做為第一細(xì)胞培 養(yǎng)液，并使用于后續(xù)步驟。將上述第一細(xì)胞培養(yǎng)液以孔徑0.22微米的濾杯進(jìn)行過(guò)濾。接著，取一培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)角瓶中的自體纖維母細(xì)胞，其細(xì)胞生長(zhǎng)滿度為5-7分滿。將自體纖維母細(xì)胞的培養(yǎng)液置換為第一細(xì)胞培養(yǎng)液，系將足量的第一細(xì)胞培養(yǎng)液加入培養(yǎng)角瓶(如175T培養(yǎng)角瓶使用約30毫升的第一細(xì)胞培養(yǎng)液)。繼續(xù)培養(yǎng)1-3天，取得一第二細(xì)胞培養(yǎng)液。如使用未經(jīng)稀釋的血清作為第一培養(yǎng)液，則此時(shí)取得富含有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的血清(第二細(xì)胞培養(yǎng)液)。在取得前述第二細(xì)胞培養(yǎng)液后，可直接作為生長(zhǎng)因子制劑使用，以冷凍干燥方式儲(chǔ)放；或是對(duì)生長(zhǎng)因子制劑進(jìn)一步添加緩沖液及營(yíng)養(yǎng)劑，制備用于促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑。
[0125]本發(fā)明所述的第二時(shí)施例與第一實(shí)施例的差異主要在于采用的自體細(xì)胞不同，其余實(shí)施方法(包含生長(zhǎng)因子偵測(cè)方法)實(shí)質(zhì)上均同于第一實(shí)施例。
[0126]請(qǐng)參照?qǐng)D5，其呈現(xiàn)本發(fā)明第二實(shí)施例所述，將自體纖維母細(xì)胞經(jīng)由本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制得的生長(zhǎng)因子制劑中特定生長(zhǎng)因子濃度變化情形。圖5所示的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)方式是先根據(jù)培養(yǎng)后第1、2、3天的時(shí)間點(diǎn)，分別取得第二細(xì)胞培養(yǎng)液與對(duì)照組(即100%自體血清)的樣本，并分別測(cè)得其中各生長(zhǎng)因子數(shù)據(jù)。接著,取對(duì)照組的偵測(cè)數(shù)據(jù)加總后，取其平均值，作為「對(duì)照用平均值」(background value of blank controls)。接著，將上述第1、2、3天時(shí)間點(diǎn)的第二細(xì)胞培養(yǎng)液樣本所得的數(shù)據(jù)，以前述的對(duì)照用平均值加以處理分析，即可得知各樣本相對(duì)于對(duì)照用平均值(即下述的對(duì)照組數(shù)據(jù))的變化倍率(foldto blank control)。
[0127]因此，由圖5可知，本發(fā)明第二實(shí)施例所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法制得的生長(zhǎng)因子制劑(此指第二培養(yǎng)液)中VEGF與HGF的含量顯著增加，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，其VEGF及HGF的含量亦隨之增加。其中，以HGF的增加幅度最為顯著，在培養(yǎng)第I天即高于對(duì)照組達(dá)6.64倍，其濃度更隨培養(yǎng)時(shí)間而繼續(xù)增加，到培養(yǎng)第3天時(shí)，HGF的濃度已高于對(duì)照組達(dá)
21.9倍。其次，VEGF的含量則于培養(yǎng)第I天時(shí)即顯著上升至對(duì)照組的2.4倍左右，其濃度隨培養(yǎng)時(shí)間而繼續(xù)增加，至培養(yǎng)第3天時(shí)，已高于對(duì)照組3.77倍。因此，根據(jù)圖1可知，本發(fā)明第二實(shí)施例采用的方法可成功制得富含VEGF、HGF及KGF的第二細(xì)胞培養(yǎng)液，且使用者可根據(jù)需求，取不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)(至少培養(yǎng)I天為佳)的第二細(xì)胞培養(yǎng)液，加以濃縮或純化制得生長(zhǎng)因子制劑，或更進(jìn)一步加工制造組合制劑。
[0128]同樣地，根據(jù)第二實(shí)施例的內(nèi)容，為更詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所達(dá)成的效果，以及根據(jù)此方法制得的生長(zhǎng)因子制劑優(yōu)于其他生長(zhǎng)因子制劑的特征，繼續(xù)列舉下列實(shí)驗(yàn)例，及對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)結(jié)果加以說(shuō)明。
[0129]實(shí)驗(yàn)例4
[0130]根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施例所記載的方法，取得使用自體纖維母細(xì)胞(下稱FB)生產(chǎn)的第二細(xì)胞培養(yǎng)液，于培養(yǎng)過(guò)程中的第1、2、3天分別取樣，并分別以前述ELISA試劑套組測(cè)定其中VEGF的含量。而對(duì)照組則是采用未經(jīng)培養(yǎng)FB的第一細(xì)胞培養(yǎng)液(即第二實(shí)施例所使用的100%自體血清)進(jìn)行測(cè)定，以比較本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所達(dá)成的效果。其結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖6 (圖中，圖例標(biāo)示W(wǎng)/O FB代表未經(jīng)培養(yǎng)FB的對(duì)照組樣本；圖例標(biāo)示withFB則表示經(jīng)培養(yǎng)FB所取得的第二細(xì)胞培養(yǎng)液樣本，下文不再加以重復(fù)說(shuō)明)呈現(xiàn)VEGF濃度隨培養(yǎng)時(shí)間顯著上升的情況。其VEGF濃度在培養(yǎng)第I天時(shí)，濃度(187.9pg/ml)即已升高至近第I天對(duì)照組2倍，而隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，VEGF濃度繼續(xù)小幅提高，至第3天時(shí)，其濃度已達(dá)291.7pg/ml，遠(yuǎn)高于第3天對(duì)照組的3.7倍，顯見(jiàn)本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法可顯著刺激FB分泌VEGF至培養(yǎng)環(huán)境中，明顯提升了生長(zhǎng)因子制劑的VEGF含量。
[0131]實(shí)驗(yàn)例5
[0132]根據(jù)本發(fā)明第二實(shí)施例所記載的方法，取得使用FB生產(chǎn)的第二細(xì)胞培養(yǎng)液，于培養(yǎng)過(guò)程中的第1、2、3天分別取樣，并分別以前述ELISA試劑套組測(cè)定其中HGF的含量。而對(duì)照組則是采用未經(jīng)培養(yǎng)FB的第一細(xì)胞培養(yǎng)液(即第一實(shí)施例所使用的100%自體血清)進(jìn)行測(cè)定，以比較本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所達(dá)成的效果。其結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖7，其呈現(xiàn)HGF濃度隨培養(yǎng)時(shí)間顯著上升的情況。其HGF濃度在培養(yǎng)第I天時(shí)，濃度已顯著升高至869.5mg/ml，為第I天對(duì)照組的12.7倍，而隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，培養(yǎng)第2天時(shí)，HGF濃度更繼續(xù)顯著提高至1919.3pg/ml,達(dá)第2天對(duì)照組的14.7倍,至培養(yǎng)第3天時(shí),其濃度已高達(dá)2871.3pg/ml，遠(yuǎn)高 于對(duì)照組數(shù)14.9倍，顯見(jiàn)本發(fā)明的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法可顯著刺激FB分泌HGF至培養(yǎng)環(huán)境中，明顯提升了生長(zhǎng)因子制劑的HGF含量。
[0133]表1
【權(quán)利要求】
1.一種生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，該方法包含以下步驟: (1)取得一自體血液； (2)自該自體血液中分離出一血液組成物； (3)以該血液組成物制備一第一細(xì)胞培養(yǎng)液； (4)以該第一細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至少一自體細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間介于20-72小時(shí)，使該自體細(xì)胞分泌復(fù)數(shù)種生長(zhǎng)因子至該第一細(xì)胞培養(yǎng)液中，形成一第二細(xì)胞培養(yǎng)液； (5)取出該第二細(xì)胞培養(yǎng)液；以及 (6)將該第二細(xì)胞培養(yǎng)液，制備成一生長(zhǎng)因子制劑，該些生長(zhǎng)因子至少包含一血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及一肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子； 其中，該第二細(xì)胞培養(yǎng)液所含的該血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度介于150~1000pg/ml，該肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度介于800~3000pg/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，其中，該血液組成物為一血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，其中，該第一細(xì)胞培養(yǎng)液的成分含有90%以上的該血液組成物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，其中，該些生長(zhǎng)因子包含一角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，而該第二細(xì)胞培養(yǎng)液所含的該角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度介于20~45pg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，其中，該自體細(xì)胞是選自一自體纖維母細(xì)胞、一自體脂肪干細(xì)胞，或是一自體纖維母細(xì)胞及一自體脂肪干細(xì)胞的組合所構(gòu)成的群組。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法，其中，該步驟(5)或該步驟(6)之后可包含一過(guò)濾步驟。
7.—種生長(zhǎng)因子制劑，其特征在于:該生長(zhǎng)因子制劑是利用根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的生長(zhǎng)因子制劑生產(chǎn)方法所制備，該生長(zhǎng)因子制劑含有復(fù)數(shù)種生長(zhǎng)因子，該些生長(zhǎng)因子包含一血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及一肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，該血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度介于150~1000pg/ml ;該肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度介于800~3000pg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生長(zhǎng)因子制劑，其中，該些生長(zhǎng)因子包含一角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，該角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度介于20~45pg/ml。
9.一種用于促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑，其特征在于:該用于促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑包含: 一根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的生長(zhǎng)因子制劑，含有復(fù)數(shù)種生長(zhǎng)因子，該些生長(zhǎng)因子制劑至少包含一血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及一肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子； 一緩沖液；以及 一營(yíng)養(yǎng)劑，其成分包含一葡萄糖及復(fù)數(shù)種電解質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用以促進(jìn)皮膚組織再生的組合制劑，其中，該葡萄糖的重量比例濃度為5%。
【文檔編號(hào)】A61K38/18GK103977395SQ201310068917
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月7日
【發(fā)明者】黃美月 申請(qǐng)人:瑪旺干細(xì)胞醫(yī)學(xué)生物科技股份有限公司