專利名稱：聚乙二醇修飾的重組人干擾素β-1b及制備方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質化學領域，涉及一種聚乙二醇修飾的蛋白質及制備方法，更具體的涉及重組人干擾素β -1b氮末端的聚乙二醇定點修飾產物及制備方法。
背景技術：
隨著生物技術的發展，多肽和蛋白質等生物大分子治療藥物不斷涌現，在疾病治療過程中得到越來越廣泛的應用。蛋白質和多肽藥物具有高活性、低毒性、生物功能明確、特異性強的優點。但是也存在著諸如易被酶水解、循環半衰期短、免疫原性高及溶解度低等缺點。因此，開發安全、有效、生物利用度高的給藥系統對改善蛋白質藥物的臨床有效性具有非常重要的意義。經過40多年的發展，蛋白質的聚乙二醇修飾技術已經是一種成熟的改善蛋白質生理性質的技術，可以用來解決或緩解蛋白和多肽在藥用過程中存在的諸多問題。經聚乙二醇共價偶聯之后的蛋白質與原蛋白相比，其免疫原性更弱，體內半衰期更長，可以顯著改善藥物的藥理藥代性質。迄今為止，已經有多種聚乙二醇修飾的藥物通過FDA認證[Alconcel, S.N.S., Baas, A.S., Maynard H.D.,等人 FDA-approved poly (ethyleneglycol)protein conjugate drugs.Polymer Chemistry, 2011, 2:1442 - 1448.]。蛋白質的聚乙二醇修飾，通常的修飾位點是蛋白質序列中賴氨酸殘基的ε氨基，N末端的氨基，以及半胱氨酸的巰基。由于蛋白質結構上游離的氨基相對較多，對氨基的修飾會出現多種修飾產物，即使經過分離純化得到單修飾產物也可能出現異構體的情況。而巰基修飾則對蛋白質本身有較高的要求，需要蛋白質本身具有游離巰基或者通過基因工程的方法引入。對于蛋白質的聚乙二醇修飾來說，定點的單修飾是一種發展趨勢，因為采用這樣的修飾策略產生的是均一的修飾產物，產物的分離純化大為簡化，且有利于蛋白藥物的活性保留。具體到氮末端是 絲氨酸的蛋白質，可以采用高度特異性的氧化方法將蛋白質N末端絲氨酸衍生為醛基，與端基能與醛基反應的活化聚乙二醇進行共價偶聯，達到對該類蛋白質N末端定點修飾的目的。人干擾素(IFN)是由活化的成纖維細胞和某些上皮細胞產生的細胞因子類蛋白質藥物，具有抗病毒感染、抗腫瘤和較強的免疫調節作用。干擾素在應用中大多數都存在半衰期短，免疫原性強的缺點。針對這些問題，干擾素α的聚乙二醇修飾產物Pegintron (PEG-1FN- a -2b)和 Pegasys (PEG-1FN- a -2a)經 FDA 批準分別于 2000 年和2002年上市，與未修飾的原蛋白相比，PEG修飾的干擾素α具有更長的半衰期和更好的藥理藥代性質，在臨床上顯示出極大的藥用優勢[Yagyu, H.，Okada, K.，Sato, S.，等人.Pegylated interferon-a 2b and ribavirin combination therapy inducesHashitoxicosis followed by type I diabetes mellitus.Diabetes research andclinical practice, 2012，95:52-54.]。而已被證實可減少多發性硬化癥的復發次數、延長復發的間隔、減輕病痛和殘疾的程度、推遲殘疾的發生以及改善中樞神經系統腦部和脊髓的組織病理改變的干擾素β雖然同樣存在體內半衰期短、具有免疫原性、有一定副作用等問題，但由于它是一種強疏水性的蛋白，在水中的溶解需要添加促溶劑作為輔助，溶液狀態下容易形成聚集體，導致其分析和定量存在困難，并且經PEG修飾以后的產物分離純化也因為聚集體的存在而難以有效進行。多年以來科學工作者對于干擾素β的聚乙二醇修飾進行了一定的探索。例如，Katre等對干擾素β-1a的氨基進行了聚乙二醇修飾(見美國專利號4766106和4917888以及國際公開號W087/00056)，Alessandra對干擾素β -1a的巰基(Cys17)進行修飾(見美國專利號0239529)。對重組人干擾素β-1b來說，其序列上不存在游離巰基，對它的修飾主要集中在氨基上。如Basu等使用多種PEG修飾劑對重組人干擾素β -1b進行了化學修飾，并對相互之間的優劣進行比較[Basu, A., Yang, K., Wang, Μ.L.，等人.Structure-function engineering of interferon-β -1b for improvingstability，solubility，potency，immunogenicity，and pharmacokinetic properties bysite-selective mono-PEGylation.Bioconjugate chemistry，2006，17(3):618-630.]。最近又出現了在有機相溶液中對重組人干擾素β-1b進行化學修飾的新探索，使用聚乙二醇氮羥基琥珀酰亞胺碳酸酯(mPEG-SC)修飾重組人干擾素β _lb，相對于水相修飾在有機相中的修飾可以有效地提高修飾率[Su, Z.G., Peng, F., Wang, Y.J.,等人.PEGylation ofProteins in Organic Solution:a Case Study for Interferon beta-lb.Bioconjugatechemistry, 2012, 23:1812-1820.] 0但是這些探索都是針對重組人干擾素β-1b的氨基進行修飾，存在著諸如多修飾、分離困難等問題，最終沒有得到均一的定點單修飾產物。對于現在廣泛采用的通過控制溶液pH值對蛋白質進行N末端氨基修飾的方法(見日本專利公開號9-25298A)，近期也有報道指出這種方法同樣會產生多修飾的產物[Yu，D.Q.，Ghosh.R., Purification of pegylated protein using membrane chromatograph.Journal ofPharmaceutic·al Sciences, 2010, 99(8):3326-3333]。傳統的氨基修飾得到的產物其穩定性以及生理活性不能保證，使得這些產物在新藥申報的道路上困難重重，目前國內外也沒有聚乙二醇修飾的干擾素β藥物上市。因此，本領域中需要穩定并且可改善重組人干擾素β -1b的藥理藥代性質的聚乙二醇修飾的重組人干擾素β-lb。
發明內容
本發明基于重組人干擾素β -1b的N末端為絲氨酸的結構，將蛋白質N末端絲氨酸氧化為醛基，與端基能與醛基反應的活化聚乙二醇進行共價偶聯，得到N末端單修飾的重組人干擾素β-lb。本發明的具體技術方案如下:在第一方面，本發明提供了一種聚乙二醇(PEG)修飾的重組人干擾素β _lb，其特征在于，所述修飾產物結構如式I所示:PEG-1FN-^-1b (I)其中，所述重組人干擾素β -1b的N末端為絲氨酸，所述聚乙二醇與所述重組人干擾素β -1b的N末端共價偶聯；優選地所述聚乙二醇的端基結構如式II所示:PEG-A (II)其中，A為氨基(-NH2)、氧氨基(-O-NH2)或酰肼基(-CO-NH-NH2)；優選地所述聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
在本發明的聚乙二醇修飾的重組人干擾素β-lb中，所述聚乙二醇和所述重組人
干擾素β _lb的連接鍵可以為亞胺
權利要求
1.一種聚乙二醇(PEG)修飾的重組人干擾素β-lb，其特征在于，所述修飾產物結構如式I所示: PEG-1FN-^-1b (I) 其中，所述重組人干擾素β-1b的N末端為絲氨酸，所述聚乙二醇與所述重組人干擾素β -1b的N末端共價偶聯； 優選地所述聚乙二醇的端基結構如式II所示: PEG-A(II) 其中，A為氨基(-NH2)、氧氨基(-O-NH2)或酰肼基(-CO-NH-NH2)； 優選地所述聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
2.根據權利要求1所述的聚乙二醇修飾的重組人干擾素β-lb，其特征在于，所述聚乙二醇和所述重組人干擾素β -1b的連接鍵為亞膨
3.根據權利要求1或2所述的聚乙二醇修飾的重組人干擾素β-lb，其特征在于，所述聚乙二醇為直鏈、支鏈或者多臂聚乙二醇，優選為直鏈聚乙二醇。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的聚乙二醇修飾的重組人干擾素β-lb，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量范圍為2000Da-80000Da，優選為5000Da_50000Da，更優選為10000Da_30000Da。
5.如權利要求1-4中任一項所述的聚乙二醇修飾的重組人干擾素β-lb的制備方法，其特征在于，所述方法包括將重組人干擾素β -1b的N末端的絲氨酸氧化為醛基，之后與端基為氨、氧氨或酰肼的聚乙二醇共價偶聯。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (A)將重組人干擾素β-lb的N末端的絲氨酸氧化為醛基，如式(I)所示:
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟(A)中使用的氧化劑為氯化銨三氧化鉻、二氧化錳、高碘酸和高碘酸鹽，優選為高碘酸鹽，更優選為高碘酸鈉。
8.根據權利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，步驟(B)中使用的還原劑為硼氫化鈉、醋酸硼氫化鈉和氰基硼氫化鈉，優選為氰基硼氫化鈉。
9.一種藥物組合物，其包含如權利要求1至4中任一項所述的聚乙二醇修飾的重組人干擾素β -1b0
10.如權利要求1至4中任一項所述的聚乙二醇修飾的重組人干擾素β-1b在制備藥物中的應用，所述藥物用于預防和治療急性、慢性及復發性病毒感染疾病以及神經系統炎性免疫性疾病,緩解并治療復發型多發性硬化疾病，以及治療惡性腫瘤如宮頸上皮內腫瘤、腫瘤性胸腔積液、毛細胞性白血病、乳腺腫瘤或子宮內膜腫瘤。
全文摘要
本發明涉及一種聚乙二醇修飾的重組人干擾素β-1b(IFN-β-1b)及其制備方法。通過將重組人干擾素β-1b的氮末端絲氨酸(Ser)氧化為醛基，再與帶有能與醛基反應的聚乙二醇衍生物(PEG-NH2、PEG-O-NH2、PEG-HZ)進行共價偶聯，制備得到重組人干擾素β-1b的氮末端聚乙二醇定點修飾產物。本發明的聚乙二醇修飾重組人干擾素β-1b仍具有重組人干擾素β-1b的生理活性，但在免疫原性、藥理、藥代及藥效等方面優于原有蛋白。
文檔編號A61P35/02GK103113466SQ201310066150
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月1日 優先權日2013年3月1日
發明者張競, 周展, 蘇志國, 馬光輝 申請人:中國科學院過程工程研究所