專利名稱：一種制備高溫穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備高溫穩(wěn)定的含氧載體的藥物組合物的方法和由該方法制備的組合物。本發(fā)明還涉及所述高溫穩(wěn)定的含氧載體的藥物組合物在人和其他動(dòng)物的癌癥治療、缺氧病癥(oxygen-deprivation disorder)以及器官保存中的用途。
背景技術(shù)：
血紅蛋白在大多數(shù)脊椎動(dòng)物中對于血管系統(tǒng)和組織之間的氣體交換具有重要作用。其負(fù)責(zé)經(jīng)由血液循環(huán)將氧從呼吸系統(tǒng)運(yùn)送至體細(xì)胞，并且還將代謝廢物二氧化碳從體細(xì)胞運(yùn)離至呼吸系統(tǒng)，在呼吸系統(tǒng)二氧化碳被呼出。由于血紅蛋白具有此氧運(yùn)輸特性，因此如果其在離體狀態(tài)下可以被穩(wěn)定并且可以在體內(nèi)使用，則其可以被用作有效的供氧器。天然存在的血紅蛋白是四聚體，當(dāng)其存在于紅細(xì)胞內(nèi)時(shí)通常是穩(wěn)定的。然而，當(dāng)天然存在的血紅蛋白移出紅細(xì)胞中時(shí)，其在血漿中變得不穩(wěn)定，并且分裂成兩個(gè)α-β 二聚體。這些二聚體的每一個(gè)的分子量為約32kDa。這些二聚體當(dāng)通過腎臟過濾和分泌時(shí)可能導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性的腎損傷。四聚體鍵的斷裂也負(fù)面地影響了在循環(huán)系統(tǒng)中功能性血紅蛋白存在的持久性。為了防止四聚體的分解，近年來在血紅蛋白加工方面的發(fā)展已經(jīng)引入了多種交聯(lián)技術(shù)來形成四聚體內(nèi)的分子內(nèi)鍵以及四聚體之間的分子間鍵，從而形成聚合血紅蛋白?，F(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)聚合血紅蛋白是增加血紅蛋白的循環(huán)半衰期的優(yōu)選形式。然而，本發(fā)明人確定，聚合血紅蛋白在血液循環(huán)中更容易轉(zhuǎn)變成為聞鐵血紅蛋白。聞鐵血紅蛋白不能結(jié)合氧因此不能氧合組織。因此，現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)的導(dǎo)致形成聚合血紅蛋白的交聯(lián)作用是有問題的。在本領(lǐng)域中存在著對允許分子內(nèi)交聯(lián)從而形成穩(wěn)定的四聚體而不同時(shí)形成聚合血紅蛋白的技術(shù)的需求。現(xiàn)有技術(shù)為穩(wěn)定血紅蛋白進(jìn)行的嘗試所存在的更多問題包括:產(chǎn)生的四聚體血紅蛋白中包含無法接受的高百分比的二聚體單位；二聚體的存在使得血紅蛋白組合物不能令人滿意地施用于哺乳動(dòng)物。血紅蛋白的二聚體形式可以導(dǎo)致哺乳動(dòng)物身體的嚴(yán)重腎損傷；此腎損傷可以嚴(yán)重到足以導(dǎo)致死亡的程度。因此，本領(lǐng)域中存在著對在終產(chǎn)物中形成含有少量不需要的二聚體形式 的穩(wěn)定的四聚體血紅蛋白的需求?，F(xiàn)有技術(shù)為形成穩(wěn)定的血紅蛋白進(jìn)行的嘗試所存在的更多問題包括:蛋白雜質(zhì)諸如免疫球蛋白G的存在可以導(dǎo)致哺乳動(dòng)物中的變態(tài)反應(yīng)效應(yīng)。因此，本領(lǐng)域中存在著對可以產(chǎn)生穩(wěn)定的不含蛋白雜質(zhì)的四聚體血紅蛋白的工藝的需求?，F(xiàn)有技術(shù)血紅蛋白制劑的其他問題包括:在哺乳動(dòng)物中輸液后產(chǎn)生血管收縮。已經(jīng)表明此血管收縮是由于內(nèi)皮衍生舒張因子與血紅蛋白分子的活性巰基結(jié)合所引起的。因此，本領(lǐng)域中存在著對形成穩(wěn)定的四聚體血紅蛋白的需求，所述四聚體血紅蛋白在輸液后不會(huì)導(dǎo)致血管收縮。除了上述問題以外，在本領(lǐng)域中存在著對穩(wěn)定化的四聚體血紅蛋白的需求，而所述四聚體血紅蛋白須不含磷脂并且能夠以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種制備高溫穩(wěn)定的、純化的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的方法，所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白適合用于哺乳動(dòng)物而不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腎損傷、血管不利影響或其他嚴(yán)重的不良反應(yīng)(包括死亡)。本發(fā)明還包括高溫穩(wěn)定的、純化的交聯(lián)四聚體血紅蛋白和所述血紅蛋白用于氧合體內(nèi)和離體組織的用途。該方法包括哺乳動(dòng)物全血的起始材料，所述全血至少包括紅細(xì)胞和血漿。將哺乳動(dòng)物全血中的紅細(xì)胞與血漿分離，緊接著過濾從而獲得濾過的紅細(xì)胞級(jí)分。洗滌濾過的紅細(xì)胞級(jí)分從而去除血漿蛋白雜質(zhì)。在快速細(xì)胞裂解設(shè)備中以50-1000升/小時(shí)的流速通過可控的低滲裂解來裂解所述洗滌過的紅細(xì)胞，持續(xù)足以裂解紅細(xì)胞卻不裂解白細(xì)胞的時(shí)間。進(jìn)行過濾從而從所述裂解產(chǎn)物中去除至少一部分廢截留物。從所述裂解產(chǎn)物中提取第一血紅蛋白溶液。使用超濾濾器進(jìn)行第一超濾過程，所述超濾濾器被配置成從第一血紅蛋白溶液中去除分子量比四聚體血紅蛋白高的雜質(zhì)并且進(jìn)一步去除任何病毒和殘留的廢截留物，從而獲得第二血紅蛋白溶液。對所述第二血紅蛋白溶液進(jìn)行流通柱色譜(Flowthrough columnchromatography)以去除蛋白雜質(zhì)、二聚體血紅蛋白和磷脂以形成無磷脂和低含量的二聚體的血紅蛋白溶液。使用配置成去除雜質(zhì)的濾器對所述無磷脂和低二聚體的血紅蛋白溶液進(jìn)行第二超濾過程，產(chǎn)生濃縮純化的無磷脂和低二聚體的血紅蛋白溶液。在充分氧合的環(huán)境中通過巰基試劑封閉所述濃縮純化的無磷脂和低二聚體血紅蛋白溶液中血紅蛋白分子的巰基。得到的每個(gè)血紅蛋白分子具有至少一個(gè)包含巰基保護(hù)基團(tuán)的半胱氨酸部分，使得所述血紅蛋白分子不能在所述半胱氨酸位點(diǎn)處結(jié)合內(nèi)皮衍生舒張因子。通過富馬酸二-3,5_ 二溴水楊酸酯(bis-3, 5-dibromosalicy fumarate)交聯(lián)巰基保護(hù)的血紅蛋白的至少α-α和/或β-β亞單位從而形成高溫穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白而不形成聚合血紅蛋白使得得到的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的分子量為60_70kDa。用合適的生理緩沖液交換所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白。通過使用切向流超濾去除任何殘留的未交聯(lián)的四聚體血紅蛋白和任何殘留的化學(xué)物質(zhì)。向所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白加入0.2-0.4%的濃度的N-乙酰半胱氨酸從而將高鐵血紅蛋白的水平保持在5%以下。然后將所述無磷月旨、低二聚體、巰基保護(hù)的高溫穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白加入至藥學(xué)可接受的載體；所述藥學(xué)可接受的載體可以是生理緩沖液或水。緊接著此步驟，得到的血紅蛋白任選地包裝在氣密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、乙烯-乙烯醇(PE，EVA，EVOH)輸液包裝中。該包裝阻止氧污染，氧污染會(huì)導(dǎo)致形成無活性的高鐵血紅蛋白。通過上述方法制備的高溫穩(wěn)定的交聯(lián)血紅蛋白用于治療多種癌癥諸如白血病、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌和食管癌。破壞癌細(xì)胞的機(jī)制是改善腫瘤細(xì)胞中的氧合，從而提高對放射線和化療劑的敏感性。該高溫穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白也用于在移植期間保存器官組織或用于在體內(nèi)缺少供氧的情況下(諸如在缺氧心臟中)保存心臟。
圖1描繪了不同物種血紅蛋白的氨基酸序列比對，包括牛，人，狗，豬和馬。圖2描繪了本發(fā)明的方法的流程圖。圖3示意性描繪了本發(fā)明的方法中使用的快速細(xì)胞裂解設(shè)備(instantcytolysisapparatus)。圖4是顯示在氧合和缺氧環(huán)境中血紅蛋白與巰基試劑的反應(yīng)的圖。圖5描繪了對于交聯(lián)四聚體血紅蛋白的高效液相色譜分析。圖6描繪了對交聯(lián)四聚體血紅蛋白的電噴霧電離質(zhì)譜(ES1-MS)分析。圖7顯示了對(a)純化的血紅蛋白溶液和(b)交聯(lián)四聚體血紅蛋白的圓二色性(⑶)光譜分析。
圖8顯示了交聯(lián)四聚體血紅蛋白的體外化學(xué)增敏作用。圖9描繪了使用本發(fā)明的交聯(lián)四聚體血紅蛋白改善了正常組織中的氧合。圖10顯示了使用本發(fā)明的交聯(lián)四聚體血紅蛋白改善了極度低氧的腫瘤區(qū)域中的氧合。圖11顯示了在用本發(fā)明的穩(wěn)定化的交聯(lián)四聚體血紅蛋白治療后，嚴(yán)重失血性休克的大鼠模型中的平均動(dòng)脈壓變化。圖12是流通柱色譜的洗脫圖；血紅蛋白溶液處于流過級(jí)分中。圖13示意性描繪了用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的具有超濾作用的流通CM柱色譜系統(tǒng)。圖14是氧合環(huán)境中的巰基反應(yīng)和缺氧環(huán)境中的反應(yīng)之間的比較。圖15證明與現(xiàn)有技術(shù)血紅蛋白相比本發(fā)明的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的熱穩(wěn)定性更聞。圖16是用于本發(fā)明的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的輸液袋的示意圖。圖17是用來測試體外高鐵血紅蛋白形成的設(shè)備的示意圖。圖18描繪了在圖17的設(shè)備中聚合血紅蛋白和本發(fā)明的血紅蛋白形成高鐵血紅蛋白的速率。
具體實(shí)施例方式血紅蛋白是哺乳動(dòng)物和其他動(dòng)物的血液的紅細(xì)胞中含鐵的氧運(yùn)輸?shù)鞍?。血紅蛋白顯示蛋白的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)兩者的特性。血紅蛋白中的大多數(shù)氨基酸形成由短的非螺旋段連接的α螺旋。氫鍵穩(wěn)定血紅蛋白內(nèi)部的螺旋段，產(chǎn)生其分子內(nèi)的吸引力，將各個(gè)多肽鏈折疊成特定的形狀。血紅蛋白分子是四個(gè)球狀蛋白亞單位的組合體。每個(gè)亞單位由排列成一組α-螺旋結(jié)構(gòu)段的多肽鏈構(gòu)成，所述α-螺旋結(jié)構(gòu)段以具有包埋的血紅素基團(tuán)的“肌紅蛋白折疊”排列方式連接。血紅素基團(tuán)由固定在稱為卟啉的雜環(huán)中的鐵原子組成。鐵原子與位于一個(gè)平面中的環(huán)中心中所有4個(gè)氮原子同等地結(jié)合。然后氧能夠結(jié)合于與卟啉環(huán)的平面垂直的鐵中心。因此，單個(gè)血紅蛋白分子具有與四個(gè)氧分子結(jié)合的能力。在成人中，最常見類型的血紅蛋白是稱為血紅蛋白A的四聚體，其由稱為α2β2的兩個(gè)α和兩個(gè)β非共價(jià)結(jié)合的亞單位組成，每個(gè)亞單位分別由141和146個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。α和β亞單位的尺寸和結(jié)構(gòu)彼此非常類似。對于總分子量為約65kDa的四聚體，每個(gè)亞單位的分子量為約16kDa。四條多肽鏈通過鹽橋、氫鍵和疏水相互作用彼此結(jié)合。牛血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與人血紅蛋白類似(α鏈中的同一性為90.14% ；β鏈中的同一性為84.35% ) ο不同之處在于牛血紅蛋白中的兩個(gè)巰基位于PCys93處，而人血紅蛋白中的巰基分別位于aCysl04、0Cys93和0Cysll2處。圖1顯示分別標(biāo)記為B、H、C、P和E的牛、人、犬、豬和馬血紅蛋白的氨基酸序列比對。各種來源的氨基酸的不同之處用陰影表示。圖1表明當(dāng)比較其氨基酸序列時(shí)，人血紅蛋白與牛、犬、豬和馬血紅蛋白具有高度的相似性。在紅細(xì)胞內(nèi)部的天然存在的血紅蛋白中，a鏈與其相應(yīng)的β鏈的締合非常強(qiáng)并且在生理?xiàng)l件下不會(huì)離解。然而，在紅細(xì)胞外，一個(gè)α β 二聚體與另一個(gè)α β 二聚體的締合相當(dāng)弱。該結(jié)合具有分裂成兩個(gè)α β 二聚體的傾向，每個(gè)二聚體為約32kDa。這些不需要的二聚體足夠小從而被腎臟過濾和分泌，結(jié)果造成潛在的腎損傷和并導(dǎo)致其在血管內(nèi)的存留時(shí)間的實(shí)質(zhì)性減少。因此，從功效和安全性兩方面來看，穩(wěn)定在紅細(xì)胞外使用的任何血紅蛋白是必要的。下面概述了制備穩(wěn)定的血紅蛋白的方法；本發(fā)明的方法的概況呈現(xiàn)在圖2的流程圖中。首先，選擇全血來源作為來自紅細(xì)胞的血紅蛋白的來源。選擇哺乳動(dòng)物全血，包括，但不限于，人、牛、豬、馬和犬全血。將紅細(xì)胞與血漿分離，過濾，和洗滌以去除血漿蛋白雜質(zhì)。為了從紅細(xì)胞釋放血紅蛋白，需裂解細(xì)胞膜。盡管多種技術(shù)可以用來裂解紅細(xì)胞，但本發(fā)明利用精確可控的低滲裂解技術(shù)，且能夠滿足工業(yè)規(guī)模制備的需要。為此，用來裂解紅細(xì)胞的快速細(xì)胞裂解設(shè)備可見圖3。低滲裂解形成裂解產(chǎn)物溶液，其包含血紅蛋白和廢截留物。為了能夠進(jìn)行工業(yè)規(guī)模制備，小心地控制裂解作用使得僅紅細(xì)胞被裂解卻不裂解白細(xì)胞或其他細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇快速細(xì)胞裂解設(shè)備的尺寸使得紅細(xì)胞在約30秒內(nèi)穿越該設(shè)備并且所述快速細(xì)胞裂解設(shè)備包括靜態(tài)混合器。去離子水和蒸餾水用作低滲溶液。當(dāng)然要理解使用具有不同的鹽濃度的其他低滲溶液將導(dǎo)致紅細(xì)胞裂解的時(shí)限不同。由于可控的裂解步驟僅破壞紅細(xì)胞，不破壞白細(xì)胞或細(xì)胞性物質(zhì)，因此其使毒性蛋白、磷脂或DNA從白細(xì)胞的釋放或細(xì)胞性物質(zhì)的釋放最小化。在30秒后即，在含有紅細(xì)胞的溶液已經(jīng)穿越快速細(xì)胞裂解設(shè)備的靜態(tài)混合器部分后立即加入高滲溶液。得到的血紅蛋白與使用其他裂解技術(shù)得到的血紅蛋白相比具有較高的純度和較低水平的污染物諸如不合乎需要的DNA和磷脂。分別通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(檢出限=64pg)和HPLC (檢出限=I μ g/mL)方法沒有在該血紅蛋白溶液中檢測到來自白細(xì)胞的不合乎需要的核酸和磷脂雜質(zhì)。進(jìn)行兩個(gè)超濾過程；一個(gè)過程在流通柱色譜前去除分子量比血紅蛋白大的雜質(zhì)，另一個(gè)過程在流通柱色譜后去除分子量比血紅蛋白小的 雜質(zhì)。后一超濾過程濃縮血紅蛋白。在一些實(shí)施方案中，IOOkDa濾器用于第一超濾過程，而30kDa濾器用于第二超濾過程。
流通柱色譜用來去除純化血紅蛋白溶液中的蛋白雜質(zhì)諸如免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶。在一些實(shí)施方案中，通過使用一種市售離子交換柱或其組合來進(jìn)行柱色譜，所述離子交換柱諸如DEAE柱，CM柱，羥磷灰石柱等。用于柱色譜的典型pH為6-8.5。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用流通CM柱色譜步驟在pH8.0下去除蛋白雜質(zhì)。進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以檢測從柱色譜洗脫后樣品中殘留的蛋白雜質(zhì)和磷脂。此獨(dú)特的流通柱色譜分離能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)的分離方案，從而能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)規(guī)模的制備。ELISA結(jié)果顯示在洗脫的交聯(lián)四聚體血紅蛋白中這些雜質(zhì)的量非常低(免疫球蛋白-G:44.3ng/mL;白蛋白:20.37ng/mL ；碳酸酐酶:81.2 μ g/mL)。使用不同類型的柱采用不同的pH值去除蛋白雜質(zhì)的結(jié)果顯示在下面的表I中。表1:使用不同的離子交換柱去除不同的蛋白雜質(zhì)
權(quán)利要求
1.一種制備高度純化的和高溫穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物的方法，所述包含氧載體的藥物組合物包含血紅蛋白，所述方法包括: a)提供至少包含紅細(xì)胞和血漿的哺乳動(dòng)物全血； b)將所述哺乳動(dòng)物全血中的紅細(xì)胞與血漿分離； c)過濾與血漿分離的紅細(xì)胞從而獲得濾過的紅細(xì)胞級(jí)分； d)洗滌所述濾過的紅細(xì)胞級(jí)分從而去除血漿蛋白雜質(zhì)，得到洗滌過的紅細(xì)胞； e)在快速細(xì)胞裂解設(shè)備中，通過可控的低滲裂解以50-1000升/小時(shí)的流速來破裂所述洗滌過的紅細(xì)胞，持續(xù)足以裂解紅細(xì)胞卻不裂解白細(xì)胞的時(shí)間，從而形成包含破裂的紅細(xì)胞的裂解產(chǎn)物的溶液； f)進(jìn)行過濾以從所述裂解產(chǎn)物中去除至少部分廢截留物； g)從所述裂解產(chǎn)物提取第一血紅蛋白溶液； h)使用超濾濾器進(jìn)行第一超濾過程，所述超濾濾器被配置成去除分子量比四聚體血紅蛋白聞的雜質(zhì)，以從第一血紅蛋白溶液中進(jìn)一步去除任何病毒和殘留廢截留物，從而獲得第二血紅蛋白溶液； i)對所述第二血紅蛋白溶液進(jìn)行流通柱色譜以去除磷脂、蛋白雜質(zhì)和二聚體血紅蛋白并形成無磷脂、低蛋白雜質(zhì)和低二聚體血紅蛋白的溶液； j)使用被配置成去除雜質(zhì)的濾器對所述無磷脂、低蛋白雜質(zhì)和低二聚體血紅蛋白的溶液進(jìn)行第二超濾過程，產(chǎn)生濃縮純化的無磷脂、低蛋白雜質(zhì)和低二聚體血紅蛋白的溶液；k)在充分氧合的環(huán)境中通過巰基試劑封閉所述濃縮純化的無磷脂、低蛋白雜質(zhì)和低二聚體血紅蛋白的溶液中 血紅蛋白分子的巰基使得各血紅蛋白分子具有至少一個(gè)包含巰基保護(hù)基團(tuán)的半胱氨酸部分，使得所述血紅蛋白分子不能在所述半胱氨酸位點(diǎn)處結(jié)合內(nèi)皮衍生舒張因子； I)通過富馬酸二 _3，5- 二溴水楊酸酯交聯(lián)所述巰基保護(hù)的血紅蛋白，從而形成高溫穩(wěn)定的交聯(lián)四聚體血紅蛋白而不形成聚合血紅蛋白，使得得到的交聯(lián)四聚體血紅蛋白的分子量為60-70kDa，并且基本上由未聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白組成；m)用合適的生理緩沖液交換所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白；η)通過洗滌去除任何殘留的未交聯(lián)的四聚體血紅蛋白和任何殘留的化學(xué)物質(zhì)；ο)向所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白加入濃度為0.2-0.4%的N-乙酰半胱氨酸從而將高鐵血紅蛋白的水平保持在5%以下；和 P)將所述低二聚體、無磷脂、巰基保護(hù)的在高達(dá)80°C的溫度下高溫穩(wěn)定的不含聚合血紅蛋白的交聯(lián)四聚體血紅蛋白加入藥學(xué)可接受的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述快速細(xì)胞裂解設(shè)備包括靜態(tài)混合器。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述交聯(lián)四聚體血紅蛋白衍生自牛、豬、犬或馬血紅蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述柱色譜包含一個(gè)或多個(gè)陽離子交換柱和陰離子交換柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述離子交換柱為一個(gè)或多個(gè)DEAE柱、CM柱和/或羥磷灰石柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中通過富馬酸二-3，5-二溴水楊酸酯的血紅蛋白交聯(lián)包括至少α-α和/或β-β交聯(lián)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中選擇交聯(lián)條件使得β-β交聯(lián)大于總交聯(lián)的50%。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中選擇交聯(lián)條件使得β-β交聯(lián)大于總交聯(lián)的60%。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中選擇交聯(lián)條件使得β-β交聯(lián)大于總交聯(lián)的70%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，其中所述藥學(xué)可接受的載體為生理緩沖液或水。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備包含氧載體的藥物組合物的方法，所述方法還包括將已制備的組合物包裝在多層柔性輸液包裝中，所述輸液包裝在日常環(huán)境條件下的透氧性為每24小時(shí)小于0.0025cm3O
12.—種高度純化和高溫穩(wěn)定的包含氧載體的藥物組合物，所述藥物組合物包含血紅蛋白，所述血紅蛋白由通過權(quán)利要求1所述的方法形成的未聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白組成。
13.一種氧合組織的方法，所述方法包括在離體條件下向所述組織提供權(quán)利要求12所述的組合物。
14.一種未聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白，其由權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法形成。
15.權(quán)利要求14的未聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白在制備用于治療癌癥的藥物中的用`途。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述癌癥選自白血病、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌和食管癌。
17.權(quán)利要求14的未聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白在制備用于氧合組織或治療缺氧病癥的藥物中的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，其中所述缺氧病癥為失血性休克。
19.權(quán)利要求14的未聚合的交聯(lián)四聚體血紅蛋白制備用于器官保存的藥物中的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，其中所述器官保存包括在移植期間保存器官組織或用于在體內(nèi)缺少供氧的情況下保存心臟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高溫穩(wěn)定的和高度純化的交聯(lián)的(任選地≥70％β-β交聯(lián))的四聚體血紅蛋白，其具有高效的氧輸送功能，所述四聚體血紅蛋白適合用于哺乳動(dòng)物而不導(dǎo)致腎損傷和血管收縮。將二聚體形式的血紅蛋白變性并對來自全血的紅細(xì)胞進(jìn)行純化。在快速細(xì)胞裂解設(shè)備中進(jìn)行可控低滲裂解以防止白細(xì)胞的裂解。在裂解液中沒有檢測到來自白細(xì)胞的核酸和磷脂雜質(zhì)。在氧合環(huán)境中通過巰基試劑封閉活性巰基。流通柱色譜去除不同的血漿蛋白雜質(zhì)。將N-乙酰半胱氨酸加入至交聯(lián)的四聚體血紅蛋白以保持低水平的高鐵血紅蛋白。穩(wěn)定的血紅蛋白保存在帶有鋁外包裝的輸液袋中以防止氧侵入形成無活性的高鐵血紅蛋白。該產(chǎn)品用于組織氧合和癌癥治療。
文檔編號(hào)A61P35/02GK103169954SQ20131005497
公開日2013年6月26日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者黃炳镠, 郭瑞儀 申請人:黃炳镠, 郭瑞儀