一種預防和治療豬呼吸道綜合征的疫苗組合物及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種預防和治療豬呼吸道綜合征的疫苗組合物，該疫苗組合物包括免疫量的豬流感病毒抗原、免疫量的豬肺炎支原體抗原、免疫量的副豬嗜血桿菌抗原以及佐劑。該疫苗組合物能有效預防和控制由三種病原混合感染時造成的豬呼吸道綜合征，并可以減少疫苗接種次數，避免因漏種而不能得到全程免疫。
【專利說明】一種預防和治療豬呼吸道綜合征的疫苗組合物及其制備方
法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種預防和治療豬呼吸道綜合征的疫苗組合物，屬于獸用疫苗領域。【背景技術】
[0002]豬流感(swine influenza, SI)是由豬流感病毒(SI virus, SIV)引起的一種急性高度傳染性呼吸道疾病。臨床以突發、高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭、高發病率、低死亡率為特征。由于SIV可損害豬呼吸道上皮細胞，使患病豬易于繼發或并發其它的病毒病和細菌病。有其他病原體繼發或混合感染時病理變化會嚴重而復雜，多由于并發肺炎、支氣管肺炎、胸膜炎、豬肺疫、鏈球菌等而死亡，給養豬業帶來極大的危害。目前，SI已成為危害包括中國在內的許多國家豬群的疾病(Webby, R.J., Swenson, S.L., Krauss, S.L., Gerrish, P.J., Goyal, S.M., &ffebster, R.G.(2000), Evolution of swine H3N2influenza viruses inthe United States, Journal of Virology, 74 (18), 8243-8251;李海燕 & 李雁冰，(2002)豬流感病毒的分離鑒定，中國預防獸醫學報，24 (I)，12-17 ;崔尚金&李海燕(2002)，中國H3亞型流感病毒生態學與分子進化的研究，中國預防獸醫學報，24(002)，144-146)。
[0003]豬支原體肺 炎(Mycoplasma pneumonia of swine, MPS)是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)引起的一種慢性、接觸性傳染病，是一種重要的免疫抑制性疾病，也是豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex, PRDC)的重要病原之一。該病長期危害養豬業，并廣泛分布于世界各國。該病主要危害育肥豬，尤其是14周齡~20周齡的豬生長率降低，使其飼料轉化率降低，還可出現食欲減退、發熱、咳嗽、呼吸困難等癥狀。該病易發生繼發感染，如繼發出豬巴氏桿菌病、豬圓環病毒病、豬流感、豬繁殖與呼吸綜合征、豬胸膜肺炎等，出現呼吸困難，發熱等臨床癥狀，甚至死亡。本病一旦傳入豬群，很難徹底清除，對于混合感染的PRDC的防控帶來了挑戰。
[0004]副豬嗜血桿菌病是副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, Hps)引起的豬的多發性漿膜炎和關節炎，該病又稱為豬革拉澤氏病(Glasser’s Disease)。副豬嗜血桿菌可以影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶后和保育階段發病，通常見于5~8周齡的豬，發病率可達40%，死亡率可達50%。主要臨床癥狀表現為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行和被毛粗亂；主要剖檢病變表現為纖維素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關節炎和腦膜炎等。此外，副豬嗜血桿菌還可引起敗血癥，并且在急性感染后可能留下后遺癥，即母豬流產、公豬慢性跛行。在大量分離副豬嗜血桿菌的基礎上，發現該菌的血清型復雜多樣，按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)瓊脂擴散血清分型方法，至少可將副豬嗜血桿菌分為15個血清型；根據我國血清流行病學調查和分離菌株的鑒定，以4、5型最為流行。近年來，由于我國目前飼養技術的調整進行不當，以及突發新的呼吸道綜合征，使得該病日趨流行，危害日漸嚴重。
[0005]臨床PRDC中，上述三種病原即豬流感病毒、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌常常以混合感染形式出現。而目前針對這三種病原感染的疫苗僅有豬流感病毒、豬肺炎支原體二聯滅活疫苗和副豬嗜血桿菌單苗，無法實現一種疫苗免疫抵抗這三種病原引起的混合感染。然而，本發明人在一項重現PRDC時發現，當豬群中只感染豬肺炎支原體及副豬嗜血桿菌時，并不會引發PRDC，當豬群中存在豬流感病原的情況下，會引發嚴重的PRDC。表明具有這些癥狀的病豬是由這三種病原體協同作用引起，并且，一旦繼發感染其它病原菌即引發更復雜的疾病，各種抗菌藥物均難以奏效。
【發明內容】
[0006] 為解決現有技術的不足，本發明旨在提供一種疫苗，含有豬流感、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌三種抗原，以有效預防和控制由這三種病原混合感染時造成的豬呼吸道綜合征。不僅如此，聯合疫苗不僅方便、多效、低成本，與單一疫苗相比，還可以減少疫苗接種次數，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產、運輸、存貯、銷售乃至全部使用過程均需在較低溫度下進行，即所謂的“冷鏈”，這種環環相扣的冷鏈運作，費用極高，使疫苗成本居高不下，而使用聯合疫苗，則可以大大降低冷鏈運作的費用，因此具有顯著的優越性。
[0007]本發明的主題是抵抗PRDC綜合征的抗原制品，包括至少一種豬流感病毒、至少一種豬肺炎支原體和至少一種副豬嗜血桿菌抗原。根據本發明，豬流感病毒(優選HlNl型和/或H3N2型豬流感病毒)、豬肺炎支原體和副豬嗜血桿菌(優選血清4型和/或5型副豬嗜血桿菌)。抗原各自獨立地包含選自減毒活全抗原、滅活的全抗原、亞單位抗原、重組活載體和DNA載體的抗原。應該理解，根據本發明的組合可涉及任何適當抗原或抗原制品形式，應當理解，對于給定組合，不一定使用相同形式。
[0008]此外，正如人們所已知的，抗原制品可包含獸醫學上可接受的載體或賦形劑，并可選擇包含獸醫學上可接受的佐劑。
[0009]本發明的主題還涉及抵抗PRDC綜合征的免疫原性組合物或疫苗，其包含處于獸醫學上可接受的載體或賦形劑之中的有效劑量的上述豬流感病毒、豬肺炎支原體和副豬嗜血桿菌抗原制品，并可選擇包含獸醫學上可接受的佐劑。免疫原性組合物引起免疫應答，其可以但不必需具有保護性。疫苗組合物引起保護性應答。因此，術語“免疫原性組合物”包括“疫苗組合物”(因為前一術語可以是保護性的組合物)。
[0010]本發明的主要目的在于提供一種預防和治療豬呼吸道綜合征的疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的豬流感病毒抗原、免疫量的豬肺炎支原體抗原、免疫量的副豬嗜血桿菌抗原以及佐劑。
[0011]優選地，所述豬流感病毒抗原為滅活形式的豬流感全病毒，改良的豬流感活病毒，減毒的豬流感病毒，含有至少Siv免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或含至少SIV的免疫原性氨基酸序列的多肽、亞單位；所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的豬肺炎支原體；所述副豬嗜血桿菌抗原為滅活形式的副豬嗜血桿菌，改良的副豬嗜血桿菌，減毒的副豬嗜血桿菌。
[0012]本發明中的術語“SIV抗原”是指包含至少一種抗原的任何組合物，所述SIV抗原在對豬給藥后可誘導、刺激或增強抗豬流感病毒感染的免疫應答。
[0013]本發明中術語“副豬嗜血桿菌抗原”是指含有至少一種副豬嗜血桿菌抗原形式的組合物，所述抗原接種豬可誘導、刺激或增強抵抗副豬嗜血桿菌感染的免疫應答。副豬嗜血桿菌的野毒株，包括本領域技術人員熟知的臨床分離的野毒株，包含目前已鑒定的I~15個血清型或無法確定血清型的副豬嗜血桿菌。副豬嗜血桿菌抗原可以包含以下組合物的抗原，如勃林格殷格翰公司的Ingelvac HP-1 ;海博萊公司(Hipra)的Hiprasuis-Glasser ;武漢科前動物生物制品有限責任公司的副豬嗜血桿菌滅活疫苗(4型MD0322株+5型SH0165株)。
[0014]本發明中術語“豬肺炎支原體抗原”是指含有至少一種豬肺炎支原體抗原形式的組合物，所述抗原接種豬可誘導、刺激或增強抵抗豬肺炎支原體感染的免疫應答。副豬嗜血桿菌抗原可以包含以下組合物的任一種抗原豬肺炎支原體如勃林格殷格翰公司的I ngelvacQ< M.hyo ;哈藥集團公司的瑞倍適Respisure和RespisureOne ;美國普泰克公司的MycoGard;美國輝瑞公司的RespiFend MH ;梅里亞動物保健公司的豬克喘；國內生產的168株活疫苗。
[0015]更優選地，所述豬流感病毒抗原為滅活的血清型HlNl亞型ZJS株和血清型H3N2亞型WX株；所述豬肺炎支原體抗原為滅活的豬肺炎支原體HN0613株；所述副豬嗜血桿菌抗原為副豬嗜血桿菌血清4型JS株和副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株。
[0016]所述豬流感病毒HlNl亞型ZJS株(Swine influenza virus (H1N1 subtype) strainZjs)保藏號為CCTCC N0.V201233 ;所述豬流感病毒H3N2亞型WX株(Swine influenzavirus (H3N2subty e) strain WX)保藏號為CCTCC N0.V201234，均已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期:2012年8月13日，保藏地址:中國武漢.武漢大學。
[0017]所述豬肺炎支原體HN0613 株(Mycoplasma hyopneumoniae Strain HN0613),已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期:2012年6月13日，保藏號為CCTCCN0.M2012230，保藏地址:中國武漢.武漢大學。
[0018]所述的副豬嗜血桿菌血清4 型 JS 株(Haemophilus Parasuis Serotype4StrainJS)保藏號為CCTCC N0.M2011172 ;所述的副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株(HaemophilusParasuis Serotype5Strain ZJ)保藏號為CCTCC N0.M2011173，均已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期:2011年5月18日，保藏地址:中國武漢.武漢大學。
[0019]更優選地，所述豬流感病毒抗原為血清型HlNl亞型ZJS株和血清型H3N2亞型WX株的HA蛋白；所述豬肺炎支原體抗原為滅活的豬肺炎支原體HN0613株；所述副豬嗜血桿菌抗原為副豬嗜血桿菌血清4型JS株和副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株。
[0020]本發明對豬流感HA基因沒有限制，只要其保留對SIV的免疫原性，任何豬流感HA基因都可用作本文所述SIV HA基因DNA和/或多肽的來源。
[0021]優選地，所述豬流感病毒抗原≥IO7 0TCID50/頭份；更優地，所述豬流感病毒抗原為107_ 5TCID5tl/頭份；所述豬肺炎支原體抗原> 2 X IO8CCU/頭份；所述副豬嗜血桿菌抗原為5 X IO8~4X IO9CFU/頭份；更優地，所述副豬嗜血桿菌抗原為2 X IO9CFU/頭份。
[0022]更優選地，所述豬流感病毒抗原HlNl亞型HA蛋白> 50 μ g/頭份，H3N2亞型HA蛋白> 50 μ g/頭份；所述豬肺炎支原體抗原> 2X IO8CCU/頭份；所述副豬嗜血桿菌抗原為5 X IO8~4X IO9CFU/頭份；更優地，所述副豬嗜血桿菌抗原為2 X IO9CFU/頭份。
[0023]優選地，所述佐劑包括氫氧化鋁、磷酸鋁、皂苷如Quil A和QS-21、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑，所述乳劑包括Marcol52、由烯烴寡聚產生的類異戊二烯油如角S燒或角S烯、卡波姆、Montanide?GeI ;更優地,所述佐劑為Montanide?Ge1、招膠、白油、角鯊烷。
[0024]本發明的另一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法，其中，所述方法包括:
[0025]I)培養增殖所述豬流感病毒；培養增殖所述豬肺炎支原體；培養增殖所述副豬嗜血桿菌；2)滅活所述培養的豬流感病毒；滅活所述培養的豬肺炎支原體；滅活所述培養的副豬嗜血桿菌；3)取免疫量的所述滅活豬流感病毒、免疫量的所述滅活豬肺炎支原體、免疫量的所述滅活副豬嗜血桿菌，加入佐劑，攪拌均勻。
[0026]本發明的再一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法，其中，所述方法包括:
[0027]I)克隆表達所述豬流感病毒HA蛋白；培養增殖所述豬肺炎支原體；培養增殖所述副豬嗜血桿菌；2)滅活所述培養的豬肺炎支原體；滅活所述培養的副豬嗜血桿菌；3)取免疫量的所述豬流感病毒的HA蛋白、免疫量的所述滅活豬肺炎支原體、免疫量的所述滅活副豬嗜血桿菌,加入佐劑,攪拌均勻。
[0028]本發明的又一目的在于提供所述的疫苗組合物在制備預防和治療豬呼吸道綜合征的藥物中的應用。
[0029]此外，所述疫苗組合物還可以包含獸醫學上可接受的載體或賦形劑。
[0030]由上可知，本發明制備的疫苗組合物，可起到打一種疫苗即可預防和控制由上述三種病原混合感染引起的豬呼吸道綜合征的目的，與現有的注射兩種或三種疫苗才能預防這三種病原引起的感染比較 ，本發明的技術方案更加經濟實用，簡化了免疫程序，降低了生產成本和防疫成本，也避免了多次接種免疫出現的不良反應。同時，聯合疫苗以其方便、多效、低成本成為新一代疫苗研究的特點。與單一疫苗相比，聯合疫苗可以減少疫苗的接種次數，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產、運輸、儲存乃至全部使用過程均需在較低溫度下進行，即所謂的“冷鏈”，這種環環相扣的冷鏈運作，費用極高，使疫苗成本居高不下，而使用聯合疫苗，則可以大大降低冷鏈運作的費用，因此具有顯著的優越性。
【具體實施方式】
[0031]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0032]以下以豬流感病毒毒株H1N1ZJS株和H3N2WX株、副豬嗜血桿菌血清4型JS株和血清5型ZJ株以及豬肺炎支原體HN0613株為例說明本發明。
[0033]菌株(毒株)的來源
[0034]所選用的豬流感病毒毒株H1N1ZJS株和H3N2WX株保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號分別為V201233和V201234。
[0035]所選用的血清4型副豬嗜血桿菌(Haemophilus Parasuis, HPS)菌株為JS株，已在中國典型培養物保藏中心進行保藏，保藏日期:2011年5月18日，保藏號為CCTCCN0.M2011172o[0036]所選用的血清5型副豬嗜血桿菌(Haemophilus Parasuis, HPS)菌株為ZJ株，已在中國典型培養物保藏中心進行保藏，保藏日期:2011年5月18日，保藏號為CCTCCN0.M2011173o
[0037]所選用的豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)菌株為豬肺炎支原體HN0613株，已在中國典型培養物保藏中心進行保藏，保藏日期:2012年6月25日，保藏號為CCTCC N0.M2012230。
[0038]本發明實施例中肺病變指數評分標準:根據7個肺葉病變程度進行評定，最大得分為28分。特異性損傷的肺葉面積為0%時，記為O分，1%~25%記為I分，26%~50%記為2分，51%~75%記為3分，大于75%為4分。
[0039]本發明實施例統計分析方法為:統計7個肺葉的肺病變指數，確定病變程度。用SPSS計算機軟件進行ANOVA分析，比較各組間差異，確定病變差異的有效性。
[0040]本實施例中的疫苗組合物、三聯疫苗或聯苗均指預防或治療豬流感病毒、副豬嗜血桿菌和豬肺炎支原體感染的疫苗組合物，即至少包含豬流感病毒抗原、豬肺炎支原體抗原和副豬嗜血桿菌抗原的疫苗組合物。
[0041]本發明中所用的ρΗ7.2的PBS液配方為:1000ml蒸餾水中加入NaC19g、Na2HPO4.12H206g、NaH2PO4.2H200.4g，本發明中所用到的化學試劑均為分析純，購自國藥集團。
[0042]為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規實驗方法進行。
[0043]實施例1、豬流感病毒、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌的疫苗組合物中三種抗原的制備
[0044]1、豬流感病毒(ZJS株和WX株)抗原的制備
[0045]用轉瓶細胞培養法。將SIV HlNl亞型ZJS株和H3N2亞型WX株毒種分別按M.0.1=0.1的接種量分別接種于長滿單層的MDCK細胞(購自ATCC，編號CRL-34)，37°C吸附30min，加入含3% (v/v)犢牛血清的DMEM細胞維持液，置37°C旋轉(10~12轉/小時)培養。每日觀察I~2次，細胞生長良好，37°C培養2~5日收獲細胞和細胞液，凍融3次，將兩種病毒液(ZJS株和WX株)分別用中空纖維(孔徑1.2 μ m與0.45 μ m)濾柱過濾，除去細胞碎片，再加入0.2%~0.3%的甲醛溶液37°C滅活18h，置-20°C以下保存。
[0046]2、豬流感病毒(ZJS株和WX株)亞單位抗原的制備
[0047]分別將SIV (ZJS株和WX株)的HA基因分別克隆入桿狀病毒基因組中，ZJS株和WX株的HA基因序列分別為序列表中序列1、序列2，并使其處在多角體基因的控制下，通過將桿狀病毒感染昆蟲細胞表達SIV (ZJS株和WX株)的HA基因。將構建的重組病毒以M.0.1=0.01感染昆蟲細胞，在感染后5天收獲細胞培養液及細胞，反復凍融3次后，12000rpm離心，取上清，置_20°C以下保存。
[0048]3、豬肺炎支原體菌液的制備:凍干菌種啟封后，按10%接種量接種液體培養基，37°C振蕩培養3~7日，待pH值由7.5降至6.8時收獲，經純粹檢，作為一級生產種子。取一級種子按5%接種量接種液體培養基，37°C振蕩培養3~7日，待pH值由7.5降至6.8時收獲，經純粹檢，作為二級生產種子。將豬肺炎支原體HN0613株的二級種子分別按5% (v/V)接種于液體培養基，37°c振蕩培養3~7日，待pH值由7.5降至6.8時收獲。
[0049]豬肺炎支原體液體培養基的配方:牛心浸出液(BD公司)300ml，雙蒸水360ml，校正PH值到7.4，121°C滅菌15分鐘；再加入下列過濾除菌的成份:Hank’ s平衡鹽溶液(IOX) 40ml, 0.25(ff/V)酚紅 10ml,馬血清 200ml，5%(W/V)水解乳蛋白 100ml, 25%W/V 酵母浸出液 20ml，10000IU/ml 青霉素 10ml。
[0050]4、副豬嗜血桿菌(4型JS株與5型ZJ株)菌液的制備:將副豬嗜血桿菌4型JS株和副豬嗜血桿菌5型ZJ株劃線接種于含5%新生牛血清和0.005%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，美國BBI公司)的胰蛋白大豆瓊脂(TSA，購自美國BD公司)平板(簡稱TSA/NAD平板),37°C培養24~48小時,各挑選5個以上典型菌落,純粹檢驗合格后,作為一級種子。一級種子挑取單個菌落，接入含5%新生牛血清和0.005%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，美國BBI公司)的胰蛋白大豆肉湯(TSA，購自美國BD公司)(簡稱TSB/NAD液體培養基)，37°C搖床180rpm振蕩培養12小時，同時取樣革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察細菌形態均勻,符合副豬嗜血桿菌的形態特征，無任何雜菌生長，作為二級種子。將鑒定合格的副豬嗜血桿菌4型JS株與副豬嗜血桿菌5型ZJ株的二級種子分別按1:100 (v/v)接種于TSB/NAD液體培養基，置37°C搖床200rpm培養。培養至12~16小時，收獲。
[0051]含5%新生牛血清的TSB/NAD液體培養基:胰大豆蛋白肉湯(Tryptic Soy Broth,TSB, BD Difico產品)30克加入940ml蒸餾水，充分搖勻后加熱至充分溶解，121°C高壓蒸汽滅菌15min，加入50ml過濾除菌的牛血清，IOml過濾除菌的0.01%NAD即成。
[0052]5病毒液或菌液的處理
[0053]豬流感病毒液的處理:將步驟I和2的病毒液用中空纖維濾柱(Millipore公司孔徑10 μ m與0.45 μ m)過濾，除去細胞碎片。
[0054]副豬嗜血桿菌(4型JS株與5型ZJ株)菌液的處理:將步驟4的兩種菌液(副豬嗜血桿菌ZJ株與JS株)分別以連續離心機(10000轉/分鐘)離心后再以PBS(pH值為7.2~
7.4)復溶至離心前的體積。
[0055]6濃縮將豬流感病毒液用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量為300Kda)作5倍(體積比)濃縮，用同樣的方式對豬肺炎支原體HN0613株抗原液進行10倍濃縮。
[0056]7含量測定
[0057]7.1豬流感病毒(ZJS株和WX株)抗原含量測定:將滅活前的豬流感病毒ZJS株和WX株分別做10倍系列稀釋，取10_5、10_6、10' 10_8、10_9共5個稀釋度，分別接種MDCK細胞單層的96孔細胞培養板上，每個稀釋度接種8個孔，同時設立陰性不接毒對照，放入5%C02溫箱中37°C培養48~72h，觀察細胞病變(CPE)J^g Reed-Muench法計算病毒TCID5(I。
[0058]豬流感病毒(ZJS株和WX株)亞單位抗原含量測定:將豬流感病毒(ZJS株和WX株)HA抗原2倍稀釋后進行蛋白定量實驗，結果為豬流感ZJS株的抗原含量132 μ g/ml，豬流感WX株的抗原含量145 μ g/ml。
[0059]7.2副豬嗜血桿菌ZJ株與JS株菌液的活菌數測定
[0060]菌液取樣，按本領域技術人員熟知的方法作10倍系列稀釋，取10_6、10_72個稀釋度接種于前述TSA/NAD固體培養基，每個平板接種0.1ml，37 °C培養24小時后，選擇菌落數在30和300之間的平板進行菌落計數。
[0061] 7.3豬肺炎支原體的菌液活菌計數測定[0062]將含酚紅指示劑的液體培養基分裝至小試管中，設兩排，每排13支，1.8ml/支，取0.2ml待檢培養物接種至第一支小試管，混勻后依次10倍稀釋至第12支小試管，第13管為對照管，置37°C搖振培養，記錄21天為止產生顏色變化的最高管數，以判定CXU滴度，取兩排結果的平均值。
[0063]8病毒液或菌液含量測定結果:
[0064]豬流感病毒HlNl株、H3N2株、副豬嗜血桿菌4型JS株及副豬嗜血桿菌5型ZJ株以及豬肺炎支原體含量見表1。
[0065]表1含量測定
[0066]
【權利要求】
1.一種預防和治療豬呼吸道綜合征的疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的豬流感病毒抗原、免疫量的豬肺炎支原體抗原、免疫量的副豬嗜血桿菌抗原以及佐劑。
2.根據權利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述豬流感病毒抗原為滅活形式的豬流感全病毒，改良的豬流感活病毒，減毒的豬流感病毒，含有至少SIV的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或含至少SIV的免疫原性氨基酸序列的多肽、亞單位； 所述豬肺炎支原體抗原為滅活形式的豬肺炎支原體； 所述副豬嗜血桿菌抗原為滅活形式的副豬嗜血桿菌，改良的副豬嗜血桿菌，減毒的副豬嗜血桿菌。
3.根據權利要求2所述的疫苗組合物，其中，所述豬流感病毒抗原為滅活的血清型HlNl亞型ZJS株和血清型H3N2亞型WX株； 所述豬肺炎支原體抗原為滅活的豬肺炎支原體HN0613株； 所述副豬嗜血桿菌抗原為副豬嗜血桿菌血清4型JS株和副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株。
4.根據權利要求2所述的疫苗組合物，其中，所述豬流感病毒抗原為血清型HlNl亞型ZJS株和血清型H3N2亞型WX株的HA蛋白； 所述豬肺炎支原體抗原為滅活的豬肺炎支原體HN0613株； 所述副豬嗜血桿菌抗原為副豬嗜血桿菌血清4型JS株和副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株。
5.根據權利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述豬流感病毒抗原≥1O7tlTCID5c/頭份；更優地，所述豬流感病毒抗原為107_ 5TCID5tl/頭份； 所述豬肺炎支原體抗原≥ 2 X 1O8CCU/頭份； 所述副豬嗜血桿菌抗原為5 X IO8~4X IO9CFU/頭份；更優地，所述副豬嗜血桿菌抗原為 2 X 1O9CFU/ 頭份。
6.根據權利要求4所述的疫苗組合物，其中，所述豬流感病毒抗原HlNl亞型HA蛋白≥50 μ g/頭份，H3N2亞型HA蛋白≥50 μ g/頭份； 所述豬肺炎支原體抗原> 2 X 1O8CCU/頭份； 所述副豬嗜血桿菌抗原為5 X 1O8~4X IO9CFU/頭份；更優地，所述副豬嗜血桿菌抗原為 2 X 1O9CFU/ 頭份。
7.根據權利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述佐劑包括氫氧化鋁、磷酸鋁、皂苷如Quil A和QS-21、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑，所述乳劑包括Marcol52、由烯烴寡聚產生的類異戊二烯油如角鯊烷或角鯊烯、卡波姆、M0ntanideTMGel ;更優地，所述佐劑為Montanide?Gel、鋁膠、白油、角鯊烷。
8.一種制備權利要求1所述的疫苗組合物的方法，其中，所述方法包括: O培養增殖所述豬流感病毒； 培養增殖所述豬肺炎支原體； 培養增殖所述副豬嗜血桿菌； 2)滅活所述培養的豬流感病毒； 滅活所述培養的豬肺炎支原體； 滅活所述培養的副豬嗜血桿菌； 3)取免疫量的所述滅活豬流感病毒、免疫量的所述滅活豬肺炎支原體、免疫量的所述滅活副豬嗜血桿菌，加入佐劑，攪拌均勻。
9.一種制備權利要求1所述的疫苗組合物的方法，其中，所述方法包括: O克隆表達所述豬流感病毒HA蛋白； 培養增殖所述豬肺炎支原體； 培養增殖所述副豬嗜血桿菌； 2)滅活所述培養的豬肺炎支原體； 滅活所述培養的副豬嗜血桿菌； 3)取免疫量的所述豬流感病毒的HA蛋白、免疫量的所述滅活豬肺炎支原體、免疫量的所述滅活副豬嗜血桿菌，加入佐劑，攪拌均勻。
10.權利要求1~7任一項所述的疫苗組合物在制備預防和治療豬呼吸道綜合征的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P31/04GK103961695SQ201310047952
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月6日 優先權日:2013年2月6日
【發明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司