G蛋白偶聯(lián)受體相互作用蛋白2在制備抗炎癥藥物中的應(yīng)用的制作方法

G蛋白偶聯(lián)受體相互作用蛋白2在制備抗炎癥藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了G蛋白偶聯(lián)受體相互作用蛋白2在制備抗炎癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了GIT2蛋白在制備有如下功能產(chǎn)品中的應(yīng)用：（1）與TRAF6蛋白結(jié)合；（2）與TRAF6蛋白相互作用；（3）與CYLD蛋白結(jié)合；（4）與CYLD蛋白相互作用；（5）促進(jìn)TRAF6蛋白與CYLD蛋白的結(jié)合；（6）促進(jìn)CYLD蛋白對泛素化的TRAF6蛋白的去泛素化作用；（7）促進(jìn)泛素化的TRAF6蛋白發(fā)生去泛素化；（8）抑制NF-κB信號(hào)通路的活化；（9）治療和/或預(yù)防炎癥；（10）治療和/或預(yù)防炎癥性腸炎；（11）治療和/或預(yù)防膿毒癥；（12）抑制巨噬細(xì)胞活化；（13）治療和/或預(yù)防由巨噬細(xì)胞活化導(dǎo)致的炎癥。本發(fā)明對嚴(yán)重危害人類疾病的炎癥性腸炎及膿毒癥的治療具有重要的社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】G蛋白偶聯(lián)受體相互作用蛋白2在制備抗炎癥藥物中的應(yīng)
用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及G蛋白偶聯(lián)受體相互作用蛋白2在制備抗炎癥藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌感染是臨床常見疾病，可以導(dǎo)致機(jī)體局部或全身性感染，甚至?xí)?dǎo)致多器官功能障礙綜合癥。一旦重度感染導(dǎo)致多功能器官衰竭，死亡率高達(dá)80%。
[0003]隨著Toll樣受體的發(fā)現(xiàn)，機(jī)體針對微生物所產(chǎn)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞及分子學(xué)機(jī)制逐步得到了人們的認(rèn)識(shí)。Toll樣受體是一類模式識(shí)別受體，可以通過識(shí)別病原體的相關(guān)分子激活相應(yīng)的信號(hào)通路，如NF- K B信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。NF-kB信號(hào)通路是生物體內(nèi)重要的信號(hào)通路之一。該通路參與了許多生理過程的調(diào)節(jié)，其中包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡，特別在免疫和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵的調(diào)控作用。許多因素都能激活NF-K B通路，如細(xì)胞因子刺激、細(xì)菌或病毒感染、DNA雙鏈斷裂。在未激活的狀態(tài)下，NF- K B轉(zhuǎn)錄因子與I K B抑制蛋白結(jié)合，被阻滯在細(xì)胞質(zhì)中。IKK激酶復(fù)合體是NF- κ B通路活化的重要節(jié)點(diǎn)。IKK復(fù)合體包括3個(gè)亞基:催化亞基IKK a、IKK β和調(diào)節(jié)亞基IKK Y?；罨腎KK激酶復(fù)合體可以磷酸化I K B蛋白，磷酸化的I K B被泛素化降解，使NF- K B進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白2 (簡稱GIT2蛋白)含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，在很多種組織中都廣泛分布，通過與細(xì)胞內(nèi)的其他蛋白的相互作用調(diào)節(jié)這些分子在不同的細(xì)胞區(qū)室內(nèi)運(yùn)動(dòng)。
[0004]TRAF6蛋白和CYLD蛋白均為已知的參與炎癥反應(yīng)的蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供G蛋白偶聯(lián)受體相互作用蛋白2在制備抗炎癥藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供了 GIT2蛋白在制備廣品中的應(yīng)用；所述廣品的功能為如下(I)至(13)中的至少一種:(I)與TRAF6蛋白結(jié)合；(2 )與TRAF6蛋白相互作用；(3 )與CYLD蛋白結(jié)合；
(4)與CYLD蛋白相互作用；(5)促進(jìn)TRAF6蛋白與CYLD蛋白的結(jié)合；(6)促進(jìn)CYLD蛋白對泛素化的TRAF6蛋白的去泛素化作用；(7)促進(jìn)泛素化的TRAF6蛋白發(fā)生去泛素化；(8)抑制NF- K B信號(hào)通路的活化；(9)治療和/或預(yù)防炎癥；(10)治療和/或預(yù)防炎癥性腸炎；
(11)治療和/或預(yù)防膿毒癥；(12)抑制巨噬細(xì)胞活化；(13)治療和/或預(yù)防由巨噬細(xì)胞活化導(dǎo)致的炎癥。
[0007]本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，其活性成分為GIT2蛋白；所述產(chǎn)品的功能為如下(I)至
(13)中的至少一種:(1)與TRAF6蛋白結(jié)合；(2)與TRAF6蛋白相互作用；(3)與CYLD蛋白結(jié)合；(4)與CYLD蛋白相互作用；(5)促進(jìn)TRAF6蛋白與CYLD蛋白的結(jié)合；(6)促進(jìn)CYLD蛋白對泛素化的TRAF6蛋白的去泛素化作用；(7)促進(jìn)泛素化的TRAF6蛋白發(fā)生去泛素化；
[8]抑制NF-K B信號(hào)通路的活化；(9)治療和/或預(yù)防炎癥；(10)治療和/或預(yù)防炎癥性腸炎；(11)治療和/或預(yù)防膿毒癥；(12 )抑制巨噬細(xì)胞活化；(13 )治療和/或預(yù)防由巨噬細(xì)胞活化導(dǎo)致的炎癥。所述產(chǎn)品中還可包括可被接受的載體。產(chǎn)品可以制成注射劑、凍干粉針、微球、粉末、粉霧劑、腸溶衣、豪微球、微乳或復(fù)乳。
[0008]以上任一所述GIT2蛋白是如下(a)或(b)或(C)或(d)或(e)或(f)或(g):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(e)由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(f)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(g)將序列1、序列3、序列4、序列5、序列6或序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與生物體炎癥反應(yīng)相關(guān)的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0009]以上任一所述GIT2蛋白可為從體內(nèi)純化獲得的天然蛋白質(zhì)或體內(nèi)重組表達(dá)的蛋白質(zhì)。
[0010]以上任一所述TRAF6蛋白是如下(h)或(i):(h)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(i) 將序列8的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與生物體炎癥反應(yīng)相關(guān)的由序列8衍生的蛋白質(zhì)。以上任一所述CYLD蛋白是如下(j)或(k):(j)由序列表中序列10所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(k)將序列10的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與生物體炎癥反應(yīng)相關(guān)的由序列10衍生的蛋白質(zhì)。以上任一所述(8)中，所述NF-K B信號(hào)通路的活化是由脂多糖激活的TLR4蛋白激活的。以上任一所述(8)中，所述NF-K B信號(hào)通路的活化是由細(xì)胞因子IL-1 β激活的。
[0011]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)GIT2蛋白可以抑制細(xì)菌感染后炎癥因子的產(chǎn)生，提高內(nèi)毒素休克、大腸桿菌感染及腸炎的存活率，保護(hù)肝臟、腎臟等器官免于炎癥損傷。本發(fā)明對嚴(yán)重危害人類疾病的炎癥性腸炎及膿毒癥的治療具有重要的社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為實(shí)施例1中各組小鼠的存活率結(jié)果。圖2為實(shí)施例1中各組小鼠的平均體重變化。圖3為實(shí)施例1中的HE染色照片。圖4為實(shí)施例1中檢測細(xì)胞因子TNF-α和細(xì)胞因子IL-6的濃度的結(jié)果。圖5為實(shí)施例2中小鼠的存活率結(jié)果。圖6為實(shí)施例2中小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和血尿素氮的濃度結(jié)果。圖7為實(shí)施例2中的HE染色照片。圖8為實(shí)施例2中的脾臟并稱重結(jié)果。圖9為實(shí)施例2中檢測細(xì)胞因子TNF-α和細(xì)胞因子IL-6的濃度的結(jié)果。圖10為實(shí)施例3中檢測細(xì)胞因子TNF-α和細(xì)胞因子IL-6的濃度的結(jié)果。圖11為實(shí)施例5中的Western Blot檢測結(jié)果。圖12為實(shí)施例6中的WesternBlot檢測結(jié)果。圖13為實(shí)施例7中的Western Blot檢測結(jié)果。圖14為實(shí)施例8中的Western Blot檢測結(jié)果。圖15為實(shí)施例9中的Western Blot檢測結(jié)果。圖16為實(shí)施例10的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例2中所用的大腸桿菌，獲自ATCC，ATCC編號(hào)為25922。HEK293細(xì)胞:購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心。針對Flag的抗體:購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)F-3165。針對Myc的抗體:購自Santa Cruz公司，產(chǎn)品目錄號(hào)sc_40。針對HA的抗體:購自Cal1-bio公司，產(chǎn)品目錄號(hào)CB100301。細(xì)胞因子IL-1 β:購自P印roTech，200-01B。
[0014]GIT2基因如序列表的序列2所示,具有六種不同的剪輯方式，即GIT2蛋白如序列表的序列1、序列表的序列3、序列表的序列4、序列表的序列5、序列表的序列6或序列表的序列7所不。TRAF6蛋白如序列表的序列8所不,TRAF6基因如序列表的序列9所不。CYLD蛋白如序列表的序列10所不，CYLD基因如序列表的序列11所不。TLR4蛋白如序列表的序列12所示。
[0015]GIT2基因敲除小鼠是將C57BL/6小鼠進(jìn)行GIT2基因敲除得到的，提及C57BL/6小鼠和GIT2基因敲除小鼠(在文獻(xiàn)中對應(yīng)的名稱為“Git2v mice，，)的文獻(xiàn):Mazaki Y，Hashimoto S，Tsujimura T，Morishige M，Hashimoto A，Aritake K，YamadaA, Nam JMj Kiyonari H，Nakao K，Sabe H.(2006)Neutrophil direction sensing andsuperoxide production linked by the GTPase-activating protein GIT2.NatureImmunology7:724-727.)。
[0016]質(zhì)粒pcDNA3/poly-HA_tagged ubiquitin(簡稱質(zhì)粒 HA-Ubiquitin):參考文獻(xiàn):Zhang Yj Wang J，Yuan Y，Zhang Wj Guan Wj Wu Zj Jin C，Chen H，Zhang L，Yang X，HeF..(2010)Negative regulation of HDM2to attenuate p53degradation by ribosomalprotein L26.0ncogene.2010Jul22; 29 (29): 4157-69)。質(zhì)粒 HA-Ubiquitin 是在 HA 空載體中導(dǎo)入泛素蛋白酶體通路元件得到的質(zhì)粒。
[0017]pcDNA3-HA vector (簡稱 HA 空載體):參考文獻(xiàn):Nakahata S，YamazakiS，Nakauchi H，Morish ita K..(2010)Downregulationof ZEBland overexpression ofSmad7contribute to resistance to TGF-betal—mediated growth suppression in adultT-cell leukemia/lymphoma.Nucleic Acids Res.20100ct;38(19):6544-54.)。
[0018]質(zhì)粒 Flag-tagged TRAF6 (mammalian expression plasmids for Flag-taggedTRAF6 (簡稱質(zhì)粒 Flag-tagged TRAF6):參考文獻(xiàn):He X，Li Y，Li C，Liu LJj Zhang XDj LiuY，Shu ΗΒ..(2012)USP2a negatively regulates IL-1β-and virus-1nduced NF-κ Bactivation by deubiquitinating TRAF6.J Mol Cell Biol.2012Jul5)。質(zhì)粒Flag-taggedTRAF6表達(dá)具有Flag標(biāo)簽的TRAF6蛋白。
[0019]質(zhì)粒Myc_TLR4、含有NF-κΒ的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒在文獻(xiàn)中的名稱為luciferase reporter plasmid( κ B-Luc)，TK海腎焚光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒在文獻(xiàn)中的名稱為Renilla luciferase expression vector (pRL-TK)，提及上述三個(gè)質(zhì)粒的文獻(xiàn)如下:Zhang Wj Wang Jj Zhang Y，Yuan Y，Guan Wj Jin C，Chen H, Wang X，Yang X，He F.(2010)The scaffold protein TANK/1-TRAF inhibits NF-kappaB activation by recruitingpolo-like kinasel.Mol Biol Cell.2010Jull5;21 (14):2500-13.?
[0020]實(shí)施例1、GIT2基因敲除小鼠更容易患炎癥性腸炎
[0021]分組處理前一天作為實(shí)驗(yàn)第O天，實(shí)驗(yàn)第I天開始進(jìn)行分組處理如下:
[0022]第一組(WT+DSS ；10只C57BL/6小鼠):實(shí)驗(yàn)第I天至第5天，小鼠連續(xù)5天自由飲用含2g/100mL葡聚糖硫酸鈉(DSS)的水，以誘導(dǎo)腸炎，從實(shí)驗(yàn)第6天開始小鼠自由飲用正常水；
[0023]對照組(K0+DSS ；9只GIT2基因敲除小鼠):實(shí)驗(yàn)第I天至第5天，小鼠連續(xù)5天自由飲用含2g/100mL葡聚糖硫酸鈉(DSS)的水，以誘導(dǎo)腸炎，從實(shí)驗(yàn)第6天開始小鼠自由飲用正常水；
[0024]實(shí)驗(yàn)第I天至第11天，每天統(tǒng)計(jì)每組小鼠的存活率，存活率=(當(dāng)天還存活的小鼠只數(shù)/實(shí)驗(yàn)第O天該組小鼠的總只數(shù))X 100。各組小鼠的存活率結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，敲除GIT2基因后小鼠炎癥性腸炎的死亡率上升，即GIT2蛋白能夠降低小鼠炎癥性腸炎的
死亡率。
[0025]分別于實(shí)驗(yàn)第O天、第2天、第4天、第6天和第8天對存活小鼠進(jìn)行稱重(早晨和晚上各一次) ，以校正體重的波動(dòng)，每組小鼠的平均體重變化=(特定某天的平均體重/實(shí)驗(yàn)第O天的平均體重)X 100。各組小鼠的平均體重變化見圖2。結(jié)果表明，敲除GIT2基因后小鼠由于發(fā)生炎癥性腸炎導(dǎo)致的體重下降幅度顯著增加，即GIT2蛋白能抑制小鼠炎癥性腸炎引起的體重的下降。
[0026]實(shí)驗(yàn)第8天，處死小鼠，分別收集血清和結(jié)腸。將結(jié)腸切片后用甲醛固定，然后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，照片見圖3。結(jié)果表明，敲除GIT2基因后小鼠結(jié)腸組織的損傷程度增加了，即GIT2蛋白能降低硫酸葡聚糖鈉對結(jié)腸組織的損傷。分別利用小鼠TNF-α ELISA試劑盒(購自欣博盛生物科技有限公司，EMC102a)和小鼠IL-6ELISA試劑盒(購自欣博盛生物科技有限公司，EMC004a)按試劑盒說明書檢測血清中的細(xì)胞因子TNF-α和細(xì)胞因子IL_6的濃度，結(jié)果見圖4 (各組小鼠均取平均值)。結(jié)果表明，敲除GIT2基因后小鼠由結(jié)腸炎引起的炎癥因子水平升高了，即GIT2蛋白能降低由結(jié)腸炎引起的炎癥因子的分泌。
[0027]實(shí)施例2、GIT2基因敲除小鼠膿毒癥癥狀更為嚴(yán)重
[0028]1、用PBS緩沖液(pH7.4,0.01M)懸浮大腸桿菌，得到菌懸液。
[0029]2、將步驟I得到的菌懸液腹腔注射C57BL/6小鼠(WT)或GIT2基因敲除小鼠(K0)，每只小鼠的注射劑量為IO7CFU大腸桿菌。
[0030]以注射時(shí)刻計(jì)時(shí)，注射前作為第O小時(shí)。
[0031]每8個(gè)小時(shí)統(tǒng)計(jì)小鼠的存活率，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，敲除GIT2基因后小鼠患大腸桿菌導(dǎo)致的膿毒癥的死亡率上升了，即GIT2蛋白能降低小鼠大腸桿菌導(dǎo)致膿毒癥的死亡率。
[0032]第20小時(shí)，每組取5只存活的小鼠，檢測小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和血尿素氮(BUN)的濃度,結(jié)果見圖6。谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶表征肝功能,血尿素氮表征腎功能。結(jié)果表明，敲除GIT2基因后小時(shí)的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和血尿素氮濃度均高于野生型小鼠，即敲除GIT2基因后小鼠的肝功能和腎功能的異常程度增加，GIT2蛋白能降低由膿毒癥導(dǎo)致的肝功能異常和腎功能的異常。
[0033]第20小時(shí)，每組取5只存活的小鼠，取肺臟，切片后用甲醛固定，然后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，照片見圖7。結(jié)果表明，敲除GIT2基因后小鼠肺臟的損傷程度增加了，SPGIT2蛋白能降低由膿毒癥導(dǎo)致的肺臟的損傷。
[0034]第20小時(shí)，每組取5只存活的小鼠，取脾臟并稱重，重量見圖8。結(jié)果表明，敲除GIT2基因后小鼠脾臟的重量增加了，即GIT2蛋白能抑制膿毒癥引起的脾臟腫大。
[0035]第20小時(shí)，每組取5只存活的小鼠，利用小鼠TNF- a ELISA試劑盒和小鼠IL-6ELISA試劑盒按試劑盒說明書檢測血清中的細(xì)胞因子TNF-α和細(xì)胞因子IL-6的濃度，結(jié)果見圖9。結(jié)果表明，敲除GIT2基因后小鼠的炎癥因子水平升高，即GIT2蛋白能降低由膿毒癥引起的炎癥因子分泌。
[0036]實(shí)施例3、GIT2蛋白能夠抑制骨髓來源的巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子
[0037]C57BL/6小鼠或GIT2基因敲除小鼠各3只，引頸處死；將小鼠后肢的皮毛剝置足部，連同褪下的皮毛剪去足部，剪下后腿，放入盛有無菌PBS緩沖液(pH7.2、0.01M)的培養(yǎng)皿中，鑷子夾住腿骨一端后，用剪刀剔除肌肉，在關(guān)節(jié)處剪斷腿骨；用2mL注射器吸取無血清1640培養(yǎng)基，將針頭刺入骨髓腔，反復(fù)沖洗骨髓至骨髓變白，將骨髓沖洗液轉(zhuǎn)移到50mL離心管中；取將IXlO7個(gè)骨髓細(xì)胞加入25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后加入5mL含50ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子MCSF和10%血清的1640培養(yǎng)基中，置于37°C和5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天；棄上清，加入5mL含50ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子MCSF和10%血清的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)4天；加入15mL PBS緩沖液(pH7.2,0.01M)，洗滌貼壁細(xì)胞，然后加入3mL胰酶消化細(xì)胞至細(xì)胞脫落；進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將IX IO5個(gè)骨髓細(xì)胞加入到24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時(shí)，每孔加入10ng/ml脂多糖(LPS，脂多糖用于誘發(fā)炎癥)，從加入脂多糖開始計(jì)時(shí)，間隔時(shí)間收取上清，利用小鼠TNF-a ELISA試劑盒和小鼠IL-6ELISA試劑盒按試劑盒說明書檢測細(xì)胞因子TNF-α和細(xì)胞因子IL-6的濃度，結(jié)果見圖10 (黑色填充色代表C57BL/6小鼠，白色填充色代表GIT2基因敲除小鼠)。結(jié)果表明，敲除GIT2基因后小鼠的炎癥因子水平升高了，即GIT2蛋白能夠抑制骨髓來源的巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子。
[0038]實(shí)施例4、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0039]一、GIT2基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0040]1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0041]2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用MGIT2-1和MGIT2-2組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0042]MGIT2-1:5，-gtacGTCGACCatgtcgaaacggctccg-3?；
[0043]MGIT2-2:5，-tcagGCGGCCGCtcagttgttgttctc-3’。
[0044]3、用限制性內(nèi)切酶Sal I和Not I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0045]4、用限制性內(nèi)切酶Sal I和Not I雙酶切pCMV_Myc載體(購自Clontech公司)，回收約3800bp的載體骨架。
[0046]5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pMyc_GIT2。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pMyc-GIT2進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pCMV_Myc載體的Sal I和NotI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2自5’末端第166-2445位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。
[0047]二、CYLD基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0048]1、合成序列表的序列11所示的雙鏈DNA分子。
[0049]2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用MCYLD-1和MCYLD-2組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0050]MCYLD-1:5，-gtacGTCGACCatgagttcaggcttatgg-3?；
[0051]MCYLD-2:5，_tcagGCGGCCGCttatttgtacaaactc_3，。 [0052]3、用限制性內(nèi)切酶Sal I和Not I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。[0053]4、 用限制性內(nèi)切酶Sal I和Not I雙酶切pCMV_Myc載體，回收約3800bp的載體骨架。
[0054]5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pMyc-CYLD。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pMyc-CYLD進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pCMV_Myc載體的Sal I和Not I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列11自5’末端第416-3286位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。
[0055]三、CYLD基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0056]1、合成序列表的序列11所示的雙鏈DNA分子。
[0057]2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用FCYLD-1和FCYLD-2組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0058]FCYLD-1:5，-gtacGCGGCCGCGatgagttcaggcttatgg-3?；
[0059]FCYLD-2:5，_tcagGTCGACttatttgtacaaactc_3，。
[0060]3、用限制性內(nèi)切酶Not I和Sal I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0061]4、用限制性內(nèi)切酶Not I和Sal I雙酶切pFLAG_CMV_2載體(購自SIGMA公司，C6114)，回收約4300bp的載體骨架。
[0062]5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pFLAG-CYLD。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pFLAG-CYLD進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pFLAG_CMV_2載體的Not I和Sal I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列11自5’末端第416-3286位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。
[0063]實(shí)施例5、GIT2蛋白與TRAF6蛋白存在相互作用
[0064]1、分組處理(轉(zhuǎn)染均借助Liponfetamine2000并按其說明書進(jìn)行操作)
[0065]第一組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將6微克重組質(zhì)粒pMyc_GIT2和1.5微克pFLAG-CMV載體轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0066]第二組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將6微克pCMVMyc載體和1.5微克質(zhì)粒Flag-taggedTRAF6轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0067]第三組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將6微克重組質(zhì)粒pMyc_GIT2和1.5微克質(zhì)粒Flag-taggedTRAF6共轉(zhuǎn)染5X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0068]2、完成步驟I后，收集細(xì)胞，用PBS緩沖液(pH7.2,0.01M)沖洗后轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，每管加入500 μ I免疫共沉淀裂解液，超聲破碎至溶液清亮，然后4°C、12600rpm離心10分鐘，收集上清液(lysate),取40 μ I上清液進(jìn)行Western Blot檢測(一抗分別采用針對Flag的抗體或針對Myc的抗體)。
[0069]3、將步驟2剩余的上清液中上加入2 μ g針對Flag的抗體(購自Sigma公司),用旋轉(zhuǎn)混合儀4°C混合2小時(shí)以上,然后加入40 μ I蛋白A/G瓊脂糖(購自Santa Cruz公司)，旋轉(zhuǎn)混合儀4°C混合過夜，然后4°C、3000rpm離心5分鐘，收集沉淀。
[0070]4、重復(fù)進(jìn)行三次如下步驟:在沉淀中加入1ml預(yù)冷的裂解緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合儀4°C混合10分鐘，收集沉淀(IP)。[0071]5、將步驟5得到的沉淀進(jìn)行Western Blot檢測。Western Blot檢測結(jié)果見圖11。結(jié)果表明，GIT2蛋白能夠與TRAF6蛋白結(jié)合并相互作用。
[0072]實(shí)施例6、GIT2蛋白與CYLD蛋白存在相互作用
[0073]1、分組處理(轉(zhuǎn)染均借助Liponfetamine2000并按其說明書進(jìn)行操作)
[0074]第一組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將6微克重組質(zhì)粒pMyc_GIT2和4微克pFLAG_CMV_2載體共轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0075]第二組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將6微克pCMV_Myc載體和4微克重組質(zhì)粒Flag-CYLD共轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0076]第三組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將6微克重組質(zhì)粒pMyc_GIT2和4微克重組質(zhì)粒Flag-CYLD共轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0077]2、同實(shí)施例5的步驟2。
[0078]3、同實(shí)施例5的步驟3。、 [0079]4、同實(shí)施例5的步驟4。
[0080]5、同實(shí)施例5的步驟5。Western Blot檢測結(jié)果見圖12。結(jié)果表明，GIT2蛋白能夠與CYLD蛋白結(jié)合并相互作用。
[0081]實(shí)施例7、GIT2蛋白、TRAF6蛋白和CYLD蛋白的相互作用關(guān)系
[0082]1、分組處理(轉(zhuǎn)染均借助Liponfetamine2000并按其說明書進(jìn)行操作)
[0083]第一組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將1.5微克質(zhì)粒Flag-tagged TRAF6和8微克pCMV-Myc載體轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0084]第二組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將1.5微克質(zhì)粒Flag-tagged TRAF6、3微克重組質(zhì)粒Myc-CYLD和5微克pCMV-Myc載體共轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0085]第三組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將1.5微克質(zhì)粒Flag-tagged TRAF6、3微克重組質(zhì)粒Myc-CYLD和5微克重組質(zhì)粒pMyc_GIT2共轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0086]2、同實(shí)施例5的步驟2。
[0087]3、同實(shí)施例5的步驟3。、
[0088]4、同實(shí)施例5的步驟4。
[0089]5、同實(shí)施例5的步驟5。Western Blot檢測結(jié)果見圖13。結(jié)果表明，GIT2蛋白能夠促進(jìn)TRAF6蛋白與CYLD蛋白的結(jié)合。
[0090]實(shí)施例8、GIT2蛋白對TRAF6泛素化修飾的影響
[0091]1、分組處理(轉(zhuǎn)染均借助Liponfetamine2000并按其說明書進(jìn)行操作)
[0092]第一組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將I微克pFLAG_CMV_2載體、7微克pCMV-Myc載體和2微克質(zhì)粒HA-Ubiquitin轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。[0093]第二組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將 I 微克質(zhì)粒 Flag-tagged TRAF6、7 微克 pCMV-Myc載體和2微克質(zhì)粒HA-Ubiquitin共轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0094]第三組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將I微克質(zhì)粒Flag-tagged TRAF6、3微克重組質(zhì)粒pMyc-GIT2、2 微克質(zhì)粒 HA-Ubiquitin 和 4 微克 pCMV-Myc 載體共轉(zhuǎn)染 5 X IO6 個(gè) HEK293 細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0095]第四組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將I微克質(zhì)粒Flag-tagged TRAF6、2微克質(zhì)粒HA-Ubiquitin和7微克重組質(zhì)粒pMyc_GIT2共轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0096]2、同實(shí)施例5的步驟2。一抗分別采用針對Flag的抗體、針對Myc的抗體或針對HA的抗體。
[0097]3、同實(shí)施例5的步驟3。、
[0098]4、同實(shí)施例5的步驟4。
[0099]5、同實(shí)施例5的步驟5。Western Blot檢測結(jié)果見圖14。結(jié)果表明，GIT2蛋白可以抑制TRAF6蛋白的泛素 化，促進(jìn)TRAF6蛋白的去泛素化。
[0100]實(shí)施例9、GIT2蛋白對CYLD蛋白去泛素化修飾TRAF6的影響
[0101]1、分組處理(轉(zhuǎn)染均借助Liponfetamine2000并按其說明書進(jìn)行操作)
[0102]第一組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將 I 微克質(zhì)粒 Flag-tagged TRAF6、7 微克 pCMV-Myc載體和2微克HA空載體轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0103]第二組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將 I 微克質(zhì)粒 Flag-tagged TRAF6、7 微克 pCMV-Myc載體和2微克質(zhì)粒HA-Ubiquitin共轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0104]第三組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將I微克質(zhì)粒Flag-tagged TRAF6、3微克重組質(zhì)粒Myc-CYLD、2微克質(zhì)粒HA-Ubiquitin和4微克pCMV-Myc載體共轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0105]第四組:25cm2/50ml培養(yǎng)瓶中將I微克質(zhì)粒Flag-tagged TRAF6、3微克重組質(zhì)粒Myc-CYLD、2微克質(zhì)粒HA-Ubiquitin和4微克重組質(zhì)粒pMyc_GIT2共轉(zhuǎn)染5 X IO6個(gè)HEK293細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時(shí)，然后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時(shí)，吸棄上清。
[0106]2、同實(shí)施例5的步驟2。一抗分別采用針對Flag的抗體、針對Myc的抗體或針對HA的抗體。
[0107]3、同實(shí)施例5的步驟3。、
[0108]4、同實(shí)施例5的步驟4。
[0109]5、同實(shí)施例5的步驟5。Western Blot檢測結(jié)果見圖15。結(jié)果表明，TRAF6蛋白可以被泛素化，CYLD蛋白抑制所述泛素化(即CYLD蛋白具有去泛素化作用)，GIT2蛋白能夠促進(jìn)CYLD蛋白的去泛素化作用。[0110]實(shí)施例10、GIT2對NF- κ B信號(hào)通路的調(diào)節(jié)
[0111]一、實(shí)驗(yàn)一
[0112]脂多糖可以激活質(zhì)粒MyC-TLR4表達(dá)的TLR4蛋白，從而激活NF- κ B信號(hào)通路。
[0113]第一組:將0.05微克含有NF-κ B的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、0.002微克TK海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和0.05微克質(zhì)粒Myc-TLR4共轉(zhuǎn)染2 X IO5個(gè)HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)，然后用裂解液(Promega公司)裂解細(xì)胞30分鐘，用雙報(bào)告基因檢測儀(Promega公司)進(jìn)行檢測。
[0114]第二組:將0.05微克含有NF-κ B的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、0.002微克TK海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、0.05微克質(zhì)粒Myc-TLR4和1.00微克重組質(zhì)粒pMyc_GIT2共轉(zhuǎn)染2 X IO5個(gè)HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)，然后用裂解液裂解細(xì)胞30分鐘，用雙報(bào)告基因檢測儀進(jìn)行檢測。
[0115]第三組:將0.05微克含有NF-κ B的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、0.002微克TK海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和0.05微克Myc-TLR4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染2 X IO5個(gè)HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)18小時(shí)，然后加入脂多糖并使其濃度為I μ g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，然后用裂解液裂解細(xì)胞30分鐘，用雙報(bào)告基因檢測儀進(jìn)行檢測。
[0116]第四組:將0.05微克含有NF-κ B的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、0.002微克TK海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、0.05微克Myc-TLR4質(zhì)粒和0.25微克重組質(zhì)粒pMyc_GIT2共轉(zhuǎn)染2X IO5個(gè)HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)18小時(shí)，然后加入脂多糖并使其濃度為I μ g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，然后用裂解液裂解細(xì)胞30分鐘，用雙報(bào)告基因檢測儀進(jìn)行檢測。
[0117]第五組:將0.05微克含有NF-κ B的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、0.002微克TK海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、0.05微克Myc-TLR4質(zhì)粒和0.50微克重組質(zhì)粒pMyc_GIT2共轉(zhuǎn)染2 X IO5個(gè)HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)18小時(shí)，然后加入脂多糖并使其濃度為I μ g/ml脂多糖，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，然后用裂解液裂解細(xì)胞30分鐘，用雙報(bào)告基因檢測儀進(jìn)行檢測。
[0118]第六組:將0.05微克含有NF-κ B的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、0.002微克TK海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、0.05微克Myc-TLR4質(zhì)粒和1.00微克重組質(zhì)粒pMyc_GIT2共轉(zhuǎn)染2 X IO5個(gè)HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)18小時(shí)，然后加入脂多糖并使其濃度為I μ g/ml脂多糖，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，然后用裂解液裂解細(xì)胞30分鐘，用雙報(bào)告基因檢測儀進(jìn)行檢測。
[0119]相對熒光活性=含有NF-κ B的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒表達(dá)的熒光素的熒光強(qiáng)度/TK海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒表達(dá)的熒光素酶的熒光強(qiáng)度。
[0120]結(jié)果見圖16。結(jié)果表明，GIT2蛋白可以抑制NF-KB信號(hào)通路的活化，這一過程有一定的劑量依賴。
[0121]二、實(shí)驗(yàn)二
[0122]細(xì)胞因子IL-1 β可以激活NF-κ B信號(hào)通路。
[0123]用細(xì)胞因子IL-1 β (10ng/ml)代替脂多糖，每組均不轉(zhuǎn)染0.05微克1^(:-1'1^4質(zhì)
粒，其它同實(shí)驗(yàn)一。
[0124] 結(jié)果見圖16。結(jié)果表明，GIT2蛋白可以抑制NF-KB信號(hào)通路的活化，這一過程有一定的劑量依賴。
【權(quán)利要求】
1.GIT2蛋白在制備廣品中的應(yīng)用；所述廣品的功能為如下(I)至(13)中的至少一種: (1)與TRAF6蛋白結(jié)合； (2)與TRAF6蛋白相互作用； (3)與CYLD蛋白結(jié)合； (4)與CYLD蛋白相互作用； (5 )促進(jìn)TRAF6蛋白與CYLD蛋白的結(jié)合； (6)促進(jìn)CYLD蛋白對泛素化的TRAF6蛋白的去泛素化作用； (7)促進(jìn)泛素化的TRAF6蛋白發(fā)生去泛素化； (8)抑制NF-K B信號(hào)通路的活化； (9)治療和/或預(yù)防炎癥； (10)治療和/或預(yù)防炎癥性腸炎； (11)治療和/或預(yù)防膿毒癥； (12)抑制巨噬細(xì)胞活化； (13)治療和/或預(yù)防由巨噬細(xì)胞活化導(dǎo)致的炎癥。
2.如權(quán)利要求1所示的方法，其特征在于:所述GIT2蛋白是如下(a)、(b)、(C)、(d)、(e)、(f)或(g): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (C)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cd)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Ce)由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cf)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (g)將序列1、序列3、序列4、序列5、序列6或序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與生物體炎癥反應(yīng)相關(guān)的由其衍生的蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述TRAF6蛋白是如下(h)或(i): (h)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (i)將序列8的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與生物體炎癥反應(yīng)相關(guān)的由序列8衍生的蛋白質(zhì)。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述CYLD蛋白是如下(j)或(k): (j)由序列表中序列10所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (k)將序列11的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與生物體炎癥反應(yīng)相關(guān)的由序列11衍生的蛋白質(zhì)。
5.一種產(chǎn)品，其活性成分為GIT2蛋白；所述產(chǎn)品的功能為如下(I)至(13)中的至少一種: (1)與TRAF6蛋白結(jié)合； (2)與TRAF6蛋白相互作用； (3)與CYLD蛋白結(jié)合； (4)與CYLD蛋白相互作用；(5 )促進(jìn)TRAF6蛋白與CYLD蛋白的結(jié)合； (6)促進(jìn)CYLD蛋白對泛素化的TRAF6蛋白的去泛素化作用； (7)促進(jìn)泛素化的TRAF6蛋白發(fā)生去泛素化； (8)抑制NF-K B信號(hào)通路的活化； (9)治療和/或預(yù)防炎癥； (10)治療和/或預(yù)防炎癥性腸炎； (11)治療和/或預(yù)防膿毒癥； (12)抑制巨噬細(xì)胞活化； (13)治療和/或預(yù)防由巨噬細(xì)胞活化導(dǎo)致的炎癥。
6.如權(quán)利要求5所示的產(chǎn)品，其特征在于:所述GIT2蛋白是如下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (C)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cd)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Ce)由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； Cf)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (g)將序列1、序列3、序列4、序列5、序列6或序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與生物體炎癥反應(yīng)相關(guān)的由其衍生的蛋白質(zhì)。
7.如權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述TRAF6蛋白是如下(h)或(i): (h)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (i)將序列8的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與生物體炎癥反應(yīng)相關(guān)的由序列8衍生的蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求5至7中任一所述的方法，其特征在于:所述CYLD蛋白是如下(j)或(k): (j)由序列表中序列10所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (k)將序列10的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與生物體炎癥反應(yīng)相關(guān)的由序列10衍生的蛋白質(zhì)。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK103961687SQ201310045961
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月5日
【發(fā)明者】賀福初, 王建, 魏俊成, 韋超 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所