專利名稱：一種男性dna避孕疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種男性DNA避孕疫苗，屬于生物醫藥領域。
背景技術：
當前人口的快速增長是一個亟待解決的全球問題，尋找一種安全、有效、廉價、易接受的避孕方法對于全世界特別是發展中國家是十分迫切的。目前雖然已經有多種藥物、工具及手術等用于控制生育，但男性避孕方法還局限于傳統的體外排精、絕育術和使用避孕套等。因而開發一種使用方便、安全、高效、廉價、可逆的男性避孕方法一直是當前生殖與避孕研究領域的焦點問題之一。避孕疫苗由于具有靶特異性好、效果持續長久、作用可逆等特點，已成為男性避孕藥具中極具發展前途的研究方向。其基本原理就是應用機體自身的防御機制來產生對抗計劃外妊娠的免疫反應，具體地說，就是使用生殖過程中有關的抗原成分制成避孕疫苗，誘導受者產生相應的體液或細胞免疫應答，從而阻抑受孕。從理論上講，在受精卵形成、發育過程中的多種調控因素都可以作為免疫避孕的靶抗原，刺激機體產生的抗體可以通過中和、阻斷這些因素的生理作用達到避孕的目的。近年來，基因組學和蛋白質組學技術的應用篩選出了大量具有干擾精卵識別和抗生育作用精子特異性蛋白，但研究結果并不盡人意。目前尚沒有用于臨床的避孕疫苗，研究較多的精子疫苗有SP-10，SAMP32，FA-1, YLP-12,PH-20，Izumo,LDH-C4 ,Eppin蛋白，和SP56等，但沒有任何一種疫苗達到理想的避孕效果。目前所研究的避孕疫苗避孕效果不理想、制作工藝復雜、不利于保存、使用不方便。
發明內容
針對現有技術存在的不足，本發明所要解決的技術問題是提供一種性能穩定、抗生育效果良好的男性DNA避孕疫苗。其 制備工藝簡單、易于大量開發生產。為解決上述問題，本發明提供的男性DNA避孕疫苗由Crisp-1DNA疫苗和天然高分子物質殼聚糖組成。確切地說，本發明的男性DNA避孕疫苗由真核表達質粒pcDNA3. 1-Crisp-l和殼聚糖組成，為真核表達質粒pcDNA3. 1-Crisp-l經殼聚糖包裹后形成的納米微粒。上述方案中，所述的納米微粒粒徑范圍為70_500nm。本發明的男性DNA避孕疫苗，其核心成分為真核表達質粒pcDNA3. Ι-Crisp-l，載藥率達90%以上，納米微粒形態規則，近球形。本發明的男性DNA避孕疫苗，其制備方法是應用基因重組技術構建真核表達質粒pcDNA3. 1-Crisp-l,然后采用復凝法制備殼聚糖-pcDNA3.1-Crispl納米復合物。Crisp-ι是由附睪頭部的上皮細胞合成分泌的一種雄激素依賴型糖蛋白。由于它在生殖過程中的多個環節起著重要作用，如調控精子的獲能，參與精卵融合等，Crisp-1是一種極具前景的候選避孕疫苗。殼聚糖是一種帶正電荷的天然聚合物，無細胞毒性，來源廣泛，價格低廉，具有較高的生物相容性和生物降解性，并且易與DNA結合形成納米微粒，有文獻報導殼聚糖還具有免疫佐劑的功能，能優化DNA疫苗接種的效果。本發明中殼聚糖與質粒pcDNA3.1-Crisp-1形成納米微粒，作為一種基因疫苗的轉運載體，增強該DNA疫苗的免疫效果。一般情況下，殼聚糖分子在酸性條件下帶正電荷，而質粒DNA分子帶負電荷，細胞膜上也帶一定的負電荷，因此DNA難以通過脂質的細胞膜被細胞吸收，在體內又易被核酸酶降解而迅速清除。采用復凝聚法制備殼聚糖-DNA疫苗納米復合物，主要是利用殼聚糖與DNA疫苗之間的靜電作用和硫酸鈉對殼聚糖的鹽析作用，使殼聚糖分子和質粒DNA分子復合壓縮并包裹纏繞，形成帶正電荷的納米顆粒，增加DNA分子進入細胞內的量，并增強DNA疫苗在體內抗核酸酶的能力，使其免受生物環境的破壞，有效導入至靶細胞，從而增強DNA疫苗的主動免疫效果，更為持久地發揮效應。本發明的男性DNA避孕疫苗，較傳統的基因疫苗制備工藝簡單，可顯著延長藥物在體內外的釋放時間，保護DNA疫苗不受核酸酶的降解，并顯著增強DNA避孕疫苗的免疫效應和抗生育效果。
圖1本發明制備的制備殼聚糖-pcDNA3.1-Crispl納米復合物掃描電鏡圖。
具體實施例方式以小鼠Crisp-1cDNA為靶基因，應用基因重組技術構建真核表達質粒pcDNA3. 1-Crisp-l,然后采用復凝法制備殼聚糖-pcDNA3. 1-Crispl納米復合物,對其相關物理學、生物學活性進行鑒定，觀察其免疫避孕效果并對其進行安全性評價。1.真核表達質粒pcDNA3.1-Crisp-1的構建
取小鼠新鮮附睪組織約30mg立即勻漿，提取總RNA，逆轉錄獲取cDNA。設計I對引物， 上游引物 5’ - gcctAAGCTTACTCTGAAGCCAGCACCATG -3’ ( SEQ ID NO 1)
下游引物 5’ - tgagGGATCCCTACATGGTCCTGGCTAGGAG -3’ (SEQ ID NO 2)
以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用PCR產物清潔試劑盒回收PCR產物，進行TA亞克隆，雙酶切Crisp-1 TA克隆及真核表達載體pcDNA3. 1，T4DNA連接酶連接上述酶切回收產物，構建真核表達載體pcDNA3.1-Crisp-1，行雙酶切鑒定和測序驗證。酶切鑒定結果和測序結果均表明真核表達質粒pcDNA3.1-Crisp-1構建成功。2.殼聚糖-pcDNA3.1-Crispl納米復合物的制備及理化性質測定 采用復凝法制備殼聚糖納米粒，計算不同質粒濃度下的包埋率。稱取純化的殼聚糖10. Omg，溶解于1%冰乙酸溶液中，用NaOH調節pH至5. 5，稀釋溶液使殼聚耱濃度為O. 02%(ff/V)，O. 22 μ m針式濾器過濾除菌。取適量pcDNA3. 1-Crisp-l加入25mMNa2S04溶液中，調節其濃度分 別為50 μ g/mL、100 μ g/mL、200 μ g/mL。將0. 02%殼聚糖溶液和3種不同濃度的pcDNA3. l-Crisp-l/Na2S04(25mM)溶液均預熱至55°C，分別取等體積的殼聚糖溶液與pcDNA3.1-Crisp-1溶液迅速混勻，渦旋30S，室溫靜置30min，即得pcDNA3. 1-Crisp-l-殼聚糖納米粒懸液。結果顯示，三種濃度下，殼聚糖納米粒對質粒DNA的包裹率均達90%以上，透射電子顯微鏡觀察如圖1所示。結果顯示，載基因殼聚糖納米粒形態較為規則，近球形，大小較均一，散在分布，分散性好。激光粒度分析儀測定結果表明，納米粒粒徑直徑約189.3nm，多分散指數為O. 459，粒徑分布范圍較窄。Zeta電位約為+0.2 mV。1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，殼聚糖與DNA疫苗結合后使質粒DNA阻滯于加樣孔中，未觀察到質粒跑出，說明殼聚糖能有效地包裹質粒DNA。但是，向各組樣品加入DNase I后，電泳結果顯示裸質粒DNA被DNase I消化；而殼聚糖納米微粒中的質粒DNA并未受影響,說明殼聚糖能保護質粒DNA不受核酸酶降解。細胞毒性檢測(MTT)試驗結果顯示殼聚糖組與正常對照組細胞存活率差異無統計學意義(P>0. 05)，但明顯高于脂質體組，說明殼聚糖幾乎無細胞毒性。間接免疫熒光細胞化學檢測結果顯示，經載DNA殼聚糖納米微球直接轉染的COS-7細胞中可看到明亮的綠色熒光，說明殼聚糖可有效的介導Crisp-1DNA疫苗在真核細胞中表達。3.免疫避孕效果的研究
3.1動物分組
將雌、雄性BALB/c小鼠分別隨機分為5組A組生理鹽水組；B組pcDNA3.1 ( + )空載體組；C組裸質粒pcDNA3.1-CrisplDNA疫苗組；D組CS/Crispl納米粒組；E組重組mCRISPl蛋白組。3. 2免疫方式及血清樣本的收集
以75mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉，待實驗小鼠全身麻醉后，暴露股四頭肌，先注射25%的高滲蔗糖溶液50 μ L，15 min后在相同部位注射DAN疫苗50 μ L，每只動物兩側肢體輪流注射，初次免疫及加強免疫共3次(O周、2周和4周)，每次接種DNA量為50 μ g。A組給予等量的生理鹽水，重組mCRISPl蛋白組初次免疫時采用完全弗氏佐劑，加強免疫時使用不完全弗氏佐劑。分別于每次免 疫前一天及末次免疫后2、4、6、8周內眥靜脈取血100 150 μ L，室溫靜置2 h后，3000 Xg離心20 min，取上清-70 °C貯存備用。3. 3血清中Crispl抗體水平檢測
酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中Crispl抗體水平，結果顯示無論是雌性還是雄性小鼠，生理鹽水和空載體pcDNA3. 1(+)均未誘導特異性Crispl抗體產生，而pcDNA3.1-Crispl免疫組小鼠均在初次免疫后2周即產生特異性抗體，抗體滴度顯著高于空載體組和生理鹽水組，并于末次免疫后2周達到最高峰，停止免疫后8周抗體滴度又逐漸緩慢下降。CS/Crispl納米粒和重組mCRISPl蛋白免疫小鼠血清抗體滴度顯著高于裸質粒pcDNA3.1-Crispl免疫小鼠(p〈0. 05)。 但CS/Crispl納米粒免疫組小鼠和重組mCRISPl蛋白免疫組小鼠相比較，差異不具有統計學意義
3.4抗生育效果評價
第三次免疫后2周，將各組雌雄性小鼠分別與生育力正常的異性小鼠進行合籠，雌雄比例為2 :1。次日早晨檢測陰道栓，將可見陰道栓的雌鼠單獨喂養，3周后觀察各組小鼠的妊娠率和每窩產仔數。結果如表1、表2所示，與生理鹽水對照組相比，空載體pcDNA3.1 (+)組雌雄性小鼠妊娠率及平均每窩產仔數無明顯差別，但其他三組雌雄性小鼠妊娠率及平均每窩產仔數均呈不同程度降低。盡管pcDNA3. Ι-mCRISPl免疫組雌雄性小鼠生育率和平均每窩產仔數均顯著低于生理鹽水組和PCDNA3.1 (+)免疫組，但顯著高于CS/Crispl納米粒和重組mCRISPl蛋白免疫組。雌雄性CS/Crispl納米粒和重組mCRISPl蛋白免疫組小鼠生育率和平均每窩產仔數均無顯著性差異。雌雄性小鼠之間生育抑制率差異也無顯著性意義。提示殼聚糖納米粒可顯著提高DNA疫苗的抗生育效果。
表I雌性小鼠免疫后生育力的影響
權利要求
1.一種男性DNA避孕疫苗，其特征在于，由真核表達質粒PCDNA3.1-Crisp-1和殼聚糖組成，為真核表達質粒pcDNA3.1-Crisp-1經殼聚糖包裹后形成的納米微粒。
2.根據權利要求1所述的男性DNA避孕疫苗，其特征在于，所述的納米微粒粒徑范圍為7_500nmo
3.根據權利要求1所述的男性DNA避孕疫苗，其特征在于，所述的納米微粒近球形。
4.權利要求1所述的男性DNA避孕疫苗的制備方法，其特征是應用基因重組技術構建真核表達質粒pcDNA3. 1-Crisp-l,然后采用復凝法制備殼聚糖-pcDNA3.1-Crispl納米復合物。
全文摘要
本發明的男性DNA避孕疫苗由真核表達質粒pcDNA3.1-Crisp-1和殼聚糖組成，為真核表達質粒pcDNA3.1-Crisp-1經殼聚糖包裹后形成的納米微粒。所述的納米微粒粒徑范圍為70-500nm。本發明的男性DNA避孕疫苗，載藥率達90%以上，納米微粒形態規則，近球形。本發明可顯著延長藥物在體內外的釋放時間，保護DNA疫苗不受核酸酶的降解，并顯著增強DNA避孕疫苗的免疫效應和抗生育效果。
文檔編號A61K48/00GK103055308SQ201310031448
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月28日 優先權日2013年1月28日
發明者楊菁, 羅金, 徐望明, 林俊杰, 尹太郎, 李輝 申請人:武漢大學