專利名稱:一種人工肝生物反應器的制作方法
技術領域:
本發明涉及人工肝支持系統的技術領域,具體地說,涉及一種以納米纖維材料作為肝細胞培養的人工肝生物反應器。
背景技術:
人工肝臟是借助體外機械,化學或生物性裝置,暫時或部分替代肝臟功能,從而協助治療肝臟功能不全或相關疾病。人工肝作為肝功能不全、肝衰竭或相關疾病的有效輔助治療設備在臨床中具有極大應用潛力。按照人工肝組成及性質可以分成三類:非生物型人工肝、生物型人工肝、混合型人工肝。非生物型人工肝治療常用的方法是血液透析、血漿或全血灌流、血液置換和濾過等,主要可以實現肝臟最基本的解毒功能,該類型人工肝已在臨床廣泛應用。生物型人工肝則是將人或動物的肝細胞置于反應器中進行培養,同時控制細胞微環境使其盡可能接近于人體肝臟所處的環境,使肝細胞 能正常生存,實現肝臟的生化功能。混合型生物人工肝是生物與非生物人工肝技術的優化組合,更好地達到臨床治療效果。生物型人工肝和混合型人工肝目前尚處于臨床驗證階段,臨床應用潛力巨大。生物反應器是生物型人工肝和混合型人工肝的核心部件,其主要功能是為大量體外培養的肝臟細胞提供適宜的生長環境,促使肝臟細胞保持穩定的高水平細胞活性和肝功能表達水平。目前生物反應器的種類很多,按照細胞的培養方式可分為(I)中空纖維生物反應器;(2)平板單層生物反應器;(3)灌注床或支架生物反應器;(4)包被懸浮生物反應器。納米纖維主要是指在三維尺度上有兩維的尺寸處于納米范圍(小于0.1um)內的線(管)狀材料,具有極高的比表面積、高孔隙率和相互連通的三維網格狀結構,相對于傳統技術制備的支架材料能夠更好的模擬天然細胞外基質的結構特點,為細胞的生長提供良好的生長微環境。資料表明納米纖維膜有利于肝細胞球狀體的形成以及球狀體生物活性的保持,培養在納米纖維膜上的肝細胞其合成白蛋白、尿素的能力均大于利用傳統模式培養的肝細胞。目前,人工肝生物反應器在細胞培養方面存在很多問題,諸如生物反應器內培養的肝細胞密度過低達不到人體所需的2 SXKTcells/m2,肝細胞容易從培養基質上脫落從而造成肝細胞隨循環的培養液流走和在生物反應器內分布不均勻造成人工肝功能下降,以及培養液中氧氣供量不足造成的肝細胞死亡等。
發明內容
本發明的目的在于克服傳統細胞培養的細胞流失率高的問題,提供一種可用于大批量肝細胞培養的人工肝生物反應器。該人工肝生物反應器實現了肝細胞的大規模黏附生長,納米纖維的類生物體蛋白纖維結構可以促進肝細胞的增殖及提高活性,從而可以在很大程度上提高肝細胞在生物反應器中的密度以及生物活性。
為了實現上述目的,本發明采用如下技術方案:
一種人工肝生物反應器,包括外殼,所述外殼內設有中空支架和內置平板,內置平板由多層平板組成,每層平板中間開有圓孔,用于中空支架穿過固定,平板與平板之間隔開固定于中空支架上。在上述人工肝生物反應器中,所述內置平板為2 150層圓形平板,每層平板直徑20mm 400 mm,厚lmm 10 mm ;平板與平板之間的層距0.5 mm 20 mm。在上述人工肝生物反應器中,所述圓孔為直徑lmnT50mm的圓孔。在上述人工肝生物反應器中,所述內置平板的每層平板上雕刻有一定數量的鏤空孔,小孔直徑為0.1 mm^lO mm,相鄰的兩個小孔的圓心距為5在上述人工肝生物反應器中,整個反應器高度為50mnT2000 mm,有效體積為10mL 10000 mL。在上述人工肝生物反應器中,所述中空支架的上下兩端分別設有營養液進出口。在上述人工肝生物反應器中,還設有納米纖維膜,納米纖維膜平鋪于內置平板的表面之上。在上述人工肝生物反應器中,所述的納米纖維膜的材料為殼聚糖、海藻酸鹽、纖維素、瓊脂糖、聚乳酸、聚丙烯酸、聚己內酯、多聚賴氨酸、聚乙烯醇或其混合材料。在上述人工肝生物反應器中,所述納米纖維膜的纖維直徑在30 nnT400 nm之間,孔隙率85%。在上述人工肝生物反應器中,所述中空支架的側面上設有若干側孔,側孔均勻地分布在內置平板的中間部位,側孔尺寸為長0.1 mnT50mm,寬為0.lmnT50mm,側孔的作用是細胞加樣及培養液循環出口,側孔的長度從中空支架的上端開始逐漸減小,以保證不同壓強下側孔出液量的均一性。在上述人工肝生物反應器中,所述外殼為中空圓柱形,上端設有進氣孔,孔大小為lmm-50mm ;設有取樣孔,孔大小為lmm-50mm ;設有進液孔;下端設有出液孔,孔大小為1mm-10Omnin在上述人工肝生物反應器中,所述內置平板之間利用T型托架隔開,T型托架高度為lmm-30mm,可以保證兩個平板之間的中空支架有一層側孔,T型托架下端可以緊密插入平板中的圓孔。
與現有技術相比,本發明具有如下有益效果:本發明的人工肝生物反應器該生物反應器引入納米纖維膜,實現了利用納米纖維膜極高的比表面積、高孔隙率和相互連通的三維網格狀結構,相對于傳統技術制備的支架材料能夠更好的模擬天然細胞外基質的結構特點,為肝細胞的生長提供良好的微環境,利于細胞黏附、生長,可達到固定肝細胞進而提高生物型人工肝的肝細胞密度,并且有利于促進肝細胞球狀體的形成。針對肝細胞生物反應器培養液供氧不足及循環的 問題,在反應器內置平板上進行鏤空孔的雕刻,小孔的作用是增加細胞與培養液的接觸面積及加速培養液循環速度,進一步提高肝細胞的生物活性及功能的發揮。該生物反應器的設計新穎,肝細胞在平板上分布均勻,微環境一致,且制備方法在技術上均能實現,具有廣闊的應用前景。
圖1為人工肝生物反應器核心器件;
圖2為人工肝生物反應器核心器件剖視圖,箭頭方向為營養液流動方向。圖3為人工肝生物反應器內置平板俯視 圖4為人工肝生物反應器內置平板3D具體實施例方式如圖1 一 4所不,一種人工肝生物反應器,包括外殼I,外殼I內設有中空支架2和內置平板3,內置平板3由多層平板組成,每層平板中間開有圓孔,圓孔為直徑lmnT50 mm的圓孔,用于中空支架2穿過固定,平板與平板之間隔開固定于中空支架2上。多層平板3為2 150層圓形平板,每層平板直徑20mnT400 mm,厚ImnTlO mm ;平板與平板之間的層距
0.5 mnT20 mm。內置平板3的每層平板上雕刻有若干鏤空孔,鏤空孔直徑為0.1 mnTlO mm,相鄰的兩個鏤空孔的圓心距為5 mnT50mm。鏤空孔的作用是增加細胞與培養液的接觸面積及加速培養液循環速度,進一步提高肝細胞的生物活性及功能的發揮。整個反應器高度為50mnT2000 mm,有效體積為10 mL 10000 ml。中空支架2的上下兩端分別設有營養液進出口。利用靜電紡絲技術將天然材料如殼聚糖、海藻酸鹽、纖維素、瓊脂糖或人工合成的聚合物如聚乳酸、聚丙烯酸、聚己內酯、多聚賴氨酸、聚乙烯醇或上述混合材料制備成納米纖維膜4。納米纖維膜4平放于多層平板3之上,作為細胞附著的載體。納米纖維膜4的纖維直徑在30 nnT400 nm之間,孔隙率85%。中空支架2為一直徑I mnT50 mm的空心圓柱。在中空支架2的柱體側面上還開有2 1000條縱長的側孔5,側孔5均勻地分布在每層平板的中間部位,側孔5尺寸為長0.1mnT50mm,寬為0.lmm^50mm,側孔5的作用是細胞加樣及培養液循環出口,側孔5的長度從中空支架2的上端開始逐漸減小 ,以保證不同壓強下小孔出液量的均一性。外殼I為中空圓柱形,上端設有進氣孔,孔大小為lmm-50mm ;設有取樣孔,孔大小為lmm-50mm ;設有進液孔;下端設有出液孔,孔大小為Imm-lOOmm。內置平板3之間利用T型托架隔開,T型托架高度為lmm-30mm,可以保證兩個平板之間的中空支架有一層側孔5,T型托架下端可以緊密插入平板中的圓孔。納米纖維膜4的制備:選擇不同的溶劑將聚合物溶解制備成靜電紡絲溶液。根據聚合物溶液的不同性質制定不同的靜電紡絲條件(電壓、接受距離、注射速度),然后進行紡絲,在紡絲過程中通過移動接受器的位置和控制紡絲的時間對納米纖維膜的形狀和厚度進行調節。將不同材料的納米纖維膜進行相應的改性和消毒,制備成能放置于細胞培養液中作為細胞生長基質的納米纖維膜。實施例1:以殼聚糖和半乳糖化殼聚糖材料作為納米纖維支架的原材料來制作此新型生物反應器。納米纖維支架的具體制備方法:將殼聚糖和半乳糖化殼聚糖溶解在70%的甲酸溶液,濃度為3-5wt%。在攪拌條件下向上述溶液中加入10wt%(PE0/半乳糖化殼聚糖)的PE0,溶解3小時并離心除去溶液中的氣泡。隨后將溶液裝入5ml玻璃注射器,注射器針頭為6號。在微量注射泵的推動下以lml/h的速度推射溶液。在針頭和收集板的兩端施加15kV的電壓,收集器和針頭之間的距離為15cm。最終,電紡纖維被收集在生物反應器內置平板上,隨后置于40°C的真空條件下干燥兩天除去殘留的甲酸。
實施例2:以PLGA作為納米纖維支架的原材料來制作此新型生物反應器
納米纖維支架的具體制備方法:將PLGA溶解在氯仿中制備成濃度為21.5%的溶液,隨后將溶液充入配有6號針頭的一次性注射器中。在收集板與針頭之間施加10-15kV的直流電壓,利用微量注射泵以lml/h的速度將溶液從注射器中推出。針頭和踏板之間的距離為10-15cm。當紡絲完成后,將覆蓋有PLGA電紡纖維的內置平板取下并置于真空干燥器中兩天除去殘留的溶劑。生物反應器的封裝:將內置平板3固定于中空支架2上,整個地放入反應器外殼I內,加上蓋子,即制人工肝 生物反應器。
權利要求
1.一種人工肝生物反應器,其特征在于包括外殼(I),所述外殼(I)內設有中空支架(2)和內置平板(3),內置平板(3)由多層平板組成,每層平板中間開有圓孔,用于中空支架(2)穿過固定,平板與平板之間隔開固定于中空支架(2)上。
2.根據權利要求1所述的人工肝生物反應器,其特征在于:所述內置平板(3)為2 150層圓形平板,每層平板直徑20mnT400 mm,厚ImnTlO mm ;平板與平板之間的層距0.5 mnT20mm;所述內置平板(3) 的每層平板上雕刻有一定數量的鏤空孔,小孔直徑為0.1 mnTlO mm,相鄰的兩個小孔的圓心距為5 mnTOmm。
3.根據權利要求1所述的人工肝生物反應器,其特征在于:所述圓孔為直徑lmnT50_的圓孔。
4.根據權利要求1所述的人工肝生物反應器,其特征在于,整個反應器高度為50mnT2000 _,有效體積為 10 mL 10000 mL。
5.根據權利要求1所述的人工肝生物反應器,其特征在于:所述中空支架(2)的上端為營養液進口,下端封閉。
6.根據權利要求1所述的人工肝生物反應器,其特征在于:還設有納米纖維膜(4),納米纖維膜(4)平鋪于內置平板(3)的表面之上。
7.根據權利要求1所述的人工肝生物反應器,其特征在于:所述的納米纖維膜(4)的材料為殼聚糖、海藻酸鹽、纖維素、瓊脂糖、聚乳酸、聚丙烯酸、聚己內酯、多聚賴氨酸、聚乙烯醇或其混合材料;所述納米纖維膜(4)的纖維直徑在30 nnT400 nm之間,孔隙率85%。
8.根據權利要求1所述的人工肝生物反應器,其特征在于:所述中空支架(2)的側面上沿等角度方向開有設有2-10個側孔(5),側孔(5)均勻地分布在每層平板的中間部位,上下兩層側孔間的距離為側孔為方形或圓形,方形的尺寸為長0.1 mnT50mm,寬為mm^50mm ;圓形的孔徑為 lmm-50mm。
9.根據權利要求1所述的人工肝生物反應器,其特征在于:所述外殼(I)為中空圓柱形,上端設有進氣孔,孔大小為lmm-50mm ;設有取樣孔,孔大小為lmm-50mm ;設有進液孔;下端設有出液孔,孔大小為Imm-lOOmm。
10.根據權利要求1所述的人工肝生物反應器,其特征在于:所述內置平板(3)之間利用T型托架隔開,T型托架高度為lmm-30mm。
全文摘要
本發明公開了一種人工肝生物反應器,包括外殼,中空支架和內置鏤空平板。肝細胞生物反應器由多層鏤空平板組成,每層平板中間開有圓孔,用于中空支架穿過固定,平板與平板之間隔開固定于中空支架上。本發明的人工肝生物反應器該生物反應器引入納米纖維膜,實現了利用納米纖維膜極高的比表面積、高孔隙率和相互連通的三維網格狀結構,相對于傳統技術制備的支架材料能夠更好的模擬天然細胞外基質的結構特點,為肝細胞的生長提供良好的微環境,利于細胞黏附、生長,可達到固定肝細胞進而提高生物型人工肝的肝細胞密度,并且有利于促進肝細胞球狀體的形成。該生物反應器的設計新穎,肝細胞在平板上分布均勻,微環境一致。
文檔編號A61M1/20GK103100119SQ20131002661
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月24日 優先權日2013年1月24日
發明者馮章啟, 蔣慶 申請人:中山大學