miRNA-185的應用和含有其的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種miRNA-185的應用和含有其的藥物組合物，具體為miRNA-185在制備用于抗腫瘤或增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性的藥物中的應用，所述miRNA-185全長為22bp，具有促腫瘤細胞凋亡功能。本發明miRNA-185在細胞模型和裸鼠模型下均具有增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物敏感性的功能，在低濃度抗腫瘤藥物阿霉素處理的條件下即可有效的促進腫瘤細胞的凋亡，克服了腫瘤治療中腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的耐藥性問題，可將miRNA-185包裹成藥物分子，通過靜脈注射或肌肉注射的方式，輔助以低濃度的抗腫瘤藥物，達到治療腫瘤減少毒副作用的目的，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】miRNA-185的應用和含有其的藥物組合物
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥生物工程領域。本發明具體涉及一種內源性的非編碼小RNA的應用，尤其涉及一種內源性的非編碼miRNA-185的應用和含有其的藥物組合物；更具體地，本發明涉及該miRNA-185的增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性的應用，以及miRNA-185在制備治療腫瘤及制備新的抗腫瘤的藥物中的用途。
【背景技術】
[0002]腫瘤是危害人類健康和生命的重大殺手，目前全世界有腫瘤病人約1400萬，我國每年發病人數約200萬，死亡140-150萬，且發病人數和死亡人數呈現不斷增長的趨勢，目前腫瘤已超過心腦血管疾病成為威脅人類健康的頭號殺手。目前常用的腫瘤化療及放療是通過誘導腫瘤細胞凋亡而達到治療腫瘤的目的。
[0003]細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡，是細胞在特定的內源和外源信號誘導下，遵循自身的程序，發生的受遺傳調控的主動的高度有序的自我結束生命的過程，在生物體的進化、維持內環境的穩定以及系統生長發育中起著重要的作用。異常的細胞凋亡將會引起多種疾病的發生，例如過度的細胞凋亡會引發心血管疾病，神經退行性疾病等，而細胞凋亡不足則會誘發腫瘤。
[0004]但是細胞的凋亡過程調控異常，可抑制化療藥物誘導的凋亡，導致耐藥。治療后耐藥性的形成導致對抗腫瘤藥物的敏感性降低，從而導致了治療的失敗。因此化療藥物在治療腫瘤過程中的耐藥性問 題，已成為目前臨床治療中的重大難題。
[0005]隨著科技的發展和腫瘤細胞信號傳導途經研究的不斷深入，以生物靶分子為基礎的腫瘤生物治療成為研究抗腫瘤藥物的熱點。腫瘤的生物療法以分子生物學、細胞生物學和分析免疫學為基礎，與手術放療化療三大常規療法作用相互補充，大幅提高腫瘤的治療療效。將生物技術與放療化療結合起來，引入促凋亡的分子可以逆轉腫瘤細胞產生的耐藥性，增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性，從而避免了傳統的放療化療方法引起的耐藥性和毒副作用的缺點，達到治療腫瘤的效果。
[0006]本領域迫切需要了解促腫瘤細胞凋亡相關的因子，將其作為藥物治療的靶分子應用于臨床的治療中，因此尋找與促腫瘤細胞凋亡相關的因子與放療化療結合治療腫瘤疾病，具有廣闊的前景。
[0007]miRNA是最近研究發現的一類內源性非編碼小RNA分子，通過對其靶基因的表達的調控，影響了生物體內的多種信號通路。已有文獻研究在腫瘤發生發展過程中miRNA的表達水平發生變化，這提示了 miRNA與腫瘤的發生發展與治療可能都存在著密切的關系，因此為將miRNA作為靶點開發抗腫瘤藥物應用于腫瘤治療提供了理論依據和可能。
【發明內容】
[0008]因此，本發明的目的是提供一種內源性非編碼miRNA-185的新用途，為將miRNA作為靶點開發抗腫瘤的藥物，應用于腫瘤治療提供了理論依據和可能。[0009]除非另外說明，本文中的“miRNA-185”的序列為下述SEQ NO:1所示的核苷酸序列:5，-UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3，(SEQ IDNO:1)。
[0010]除非另外說明，本文中的“miRNA-185模擬物”是指，在miRNA-185的序列的每一個堿基上均進行了 2' -O-甲基修飾后所得的miRNA，其序列為下述SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列:5’ -UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3’ (SEQ ID NO:1)。
[0011 ] 除非另外說明，本文中的“細胞融合度”是指細胞覆蓋整個培養皿表面面積的百分比。
[0012]針對上述目的，本發明的技術方案如下:
[0013]一方面，本發明提供一種miRNA-185在制備用于抗腫瘤或增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性的藥物中的應用，所述miRNA-185的序列為下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列:[0014]5， -UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3’ (SEQ ID NO:1)。
[0015]優選地，所述miRNA-185的序列的在每一個堿基上均進行了 W _0_甲基修飾。
[0016]優選地，所述腫瘤為宮頸癌。
[0017]優選地，所述抗腫瘤藥物為抗腫瘤化療藥物。
[0018]優選地，所述抗腫瘤化療藥物為阿霉素。
[0019]另一方面，本發明還提供一種用于抗腫瘤或增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性的藥物組合物，該藥物組合物包括有效量的本發明所述的miRNA-185，以及一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。
[0020]優選地,所述藥物組合物還包括抗腫瘤藥物。
[0021]優選地，所述抗腫瘤藥物為抗腫瘤化療藥物。
[0022]更優選地，所述抗腫瘤化療藥物為阿霉素。
[0023]優選地，所述藥學上可接受的賦形劑或載體選自殼聚糖、膽固醇、脂質體和納米顆粒中的一種或多種。
[0024]優選地，所述藥物組合物可為肌肉或靜脈注射劑。
[0025]再一方面，本發明提供本發明所述的藥物組合物在制備用于抗腫瘤或增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性的藥物中的應用。
[0026]優選地，所述腫瘤為宮頸癌。
[0027]本發明人提供了一種新的編碼具有促腫瘤細胞凋亡功能的小RNA的miRNA-185，全長為22bp。通過轉染進入到腫瘤細胞內，發揮克服腫瘤細胞對抗腫瘤藥物耐藥性的功能。將轉染了 miRNA-185的腫瘤細胞進行低濃度的阿霉素處理及進行裸鼠皮下接種細胞通過尾靜脈注射低濃度阿霉素，觀察miRNA-185在細胞模型和裸鼠模型下的增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物敏感性的功能，表明miRNA-185在細胞模型和裸鼠模型下均具有增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物敏感性的功能，在低濃度抗腫瘤藥物阿霉素處理的條件下即可有效的促進腫瘤細胞的凋亡，克服了腫瘤治療中腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的耐藥性問題。因此，miRNA-185可成為一種治療腫瘤的藥物，具體的可以將miRNA-185包裹成藥物分子，即將miRNA-185與適當的載體或輔料連接成藥物，通過靜脈注射或肌肉注射的方式，輔助以低濃度的抗腫瘤藥物，達到治療腫瘤，減少毒副作用的目的。【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中:
[0029]圖1表明miRNA-185在阿霉素處理的Hela細胞中的表達水平變化，圖中dox表示抗腫瘤藥物阿霉素，橫坐標表示用抗腫瘤藥物阿霉素對Hela細胞進行處理的時間，縱坐標表示以未處理的Hela細胞中miRNA-185的表達量為基準，在阿霉素處理過程中Hela細胞中miRNA-185的表達水平；
[0030]圖2表明miRNA-185在Hela細胞中的促凋亡功能，臺盼藍染色法檢測細胞凋亡，其中NC表示負對照，dox表示抗腫瘤藥物阿霉素，a-f分別表示如下:
[0031]a表示在miRNA-185、負對照和阿霉素均不存在的情況下處理Hela細胞的結果，
[0032]b表示在miRNA-185存在，負對照和阿霉素不存在的情況下處理Hela細胞的結果，
[0033]c表示在miRNA-185和阿霉素不存在，負對照存在的情況下處理Hela細胞的結果，
[0034]d表示在miRNA-185和負對照不存在，0.2μ M的阿霉素存在的情況下處理Hela細胞的結果，
[0035]e表示在負對照不存在，miRNA-185和0.2μ M的阿霉素存在的情況下處理Hela細胞的結果，
[0036]f表示在miRNA-185不存在，負對照和0.2μ M的阿霉素存在的情況下處理Hela細胞的結果；
[0037]圖3表明自上海吉瑪制藥有限公司合成的miRNA-185模擬物:2' _0_甲基修飾的5’ -UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3’在Hela細胞中的促凋亡功能，臺盼藍染色法檢測細胞凋亡，其中，NC表示負對照，dox表示抗腫瘤藥物阿霉素，a-c分別表示如下:
[0038]a表示在miRNA-185模擬物、負對照和阿霉素均不存在的情況下處理Hela細胞的結果，
[0039]b表示在miRNA-185模擬物和0.2 μ M的阿霉素存在，負對照不存在的情況下處理Hela細胞的結果，
[0040]c表示在負對照和0.2 μ M的阿霉素存在，miRNA-185模擬物不存在的情況下處理Hela細胞的結果；
[0041]圖4表明miRNA-185在裸鼠水平上的促凋亡功能。
【具體實施方式】
[0042]除非另外說明，以下實施例中所用的負對照(NC)是指下式SEQ IDNO: 2:所示的核苷酸:5’-GAAGCAAGGAUCUGAUCAGGUG-3’ (SEQ IDN0:2)，(由上海吉瑪制藥有限技術公司合成)。
[0043]除非另外說明，以下實施例中所用的引物均由上海吉瑪制藥有限技術公司合成。
[0044]除非另外說明，以下實施例中所用的試劑均為分析純級試劑，且可從正規渠道商購獲得。 [0045]實施例1阿霍素處理的Hela細朐中miRNA-185的表汰水平檢測
[0046]Hela細胞使用DMEM培養基(購自GBICO公司)在37°C，CO2的濃度為5體積％的恒溫培養箱中培養。至細胞融合度達到80%時，分別用濃度為2μ M的抗腫瘤藥物阿霉素(購自Sigma公司)處理細胞Oh、lh、3h、6h、12h、24h后，棄去培養基，用Trizol收集細胞，按照提取RNA的常規步驟提取處理細胞的總RNA。紫外分光光度計檢測其提取的質量和濃度后，應用逆轉錄酶(購自Toyobo公司)將提取的RNA反轉錄成cDNA (轉錄條件為42°C條件下反應I小時，95°C條件下3分鐘滅活反轉錄酶，反轉錄的引物序列為5’-GTCGTATCCA GTGCAGGGTCCGAGGTi ATTCGCACTGGATACGACTCAGGA-3’ (SEQ IDN0:7))，其中標黑帶下劃線的為在PCR檢測中的下游引物，然后采用實時熒光定量PCR試劑盒(購自Takara公司)，按照試劑盒操作說明書，對miRNA-185的表達水平進行檢測，觀察在阿霉素處理Hela細胞的過程中miRNA-185的表達變化。
[0047]PCR引物設計如下:
[0048]上游引物:5’-CATGGAGAGAAAGGCAGT-3’ (SEQ ID NO:8)，其中 16 個堿基為miRNA-185的基因編碼序列中加黑框的部分；
[0049]下游引物:5，-GTGCAGGGTCCGAGGT-3，-3，(SEQID NO:9)
[0050]PCR 反應條件為:95°C 30s 預變性，95°C 5s, 58°C 30s, 72°C 30s，循環 45 個反應。
[0051]結果如圖1所述，結果顯示隨著阿霉素處理Hela細胞時間的增加，miRNA-185的表達水平呈現明顯上升的趨勢。
[0052]實施例2miRNA_185及貨對照(negative control)腺病毒構建
[0053]應用基因組提取試劑盒(購自北京全式金生物技術有限公司)提取HEK-293細胞(購自ATCC，保藏編號CRL-1573)的基因組DNA，以此為模板，進行PCR擴增，得到近600bp的目的片段(SEQ ID N0:4)，其包括miRNA-185的基因序列(SEQ ID N0:3)及上下游約各200bp序列，PCR引物設計如下:
[0054]上游引物:5’-GGCATGAGAGGGTGTTGGAAT-3，(SEQ ID NO:5)
[0055]下游引物:5’-GTAGGACAGACAGGCAGAAAG-3’ (SEQ ID NO:6)
[0056]擴增得到的目的片段的序列如下:
【權利要求】
1.miRNA-185在制備用于抗腫瘤或增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性的藥物中的應用，所述miRNA-185的序列為下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列:
SEQ ID N0:1:5’ -UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3’。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述miRNA-185的序列在每一個堿基上均進行了 2' -O-甲基修飾。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述腫瘤為宮頸癌。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的應用，其特征在于，所述抗腫瘤藥物為抗腫瘤化療藥物，優選地，所述抗腫瘤化療藥物為阿霉素。
5.一種用于抗腫瘤疾病或增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性的藥物組合物，該藥物組合物包括治療有效量的權利要求1至4任一項中所述的miRNA-185，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑或載體。
6.根據權利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物還包括抗腫瘤藥物，優選地，所述抗腫瘤藥物為抗腫瘤化療藥物，更優選地，所述抗腫瘤化療藥物為阿霉素。
7.根據權利要求5或6所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學上可接受的賦形劑或載體選自殼聚糖、膽固醇、脂質體和納米顆粒中的一種或多種。
8.根據權利要求5至7中任一項所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為肌肉或靜脈注射劑。
9.根據權利要求5至8中任一項所述的藥物組合物在制備用于抗腫瘤或增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性的藥物中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述腫瘤為宮頸癌。
【文檔編號】A61K45/00GK103933578SQ201310026000
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月22日 優先權日:2013年1月22日
【發明者】李培峰, 李倩 申請人:中國科學院動物研究所