專利名稱：用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種肉毒毒素的制劑，具體涉及ー種穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物及其制備方法和其應用，應用于經皮給藥系統和化妝品領域。
背景技術：
穿膜肽是ー些具有細胞膜穿透能力的小分子多肽，長度一般不超過30個氨基酸，可攜帯比其分子質量大100倍的外源性疏水大分子進入細胞，毒副作用小。穿膜肽可以通過共價鍵或非共價鍵等方式攜帯生物大分子物質透過細胞膜，如將蛋白質類、多肽類等大分子生物活性物質遞送進入細胞內從而發揮治療作用。肉毒毒素是肉毒桿菌產生的毒素，具有強烈的神經毒性，其生物學作用是在神經肌接頭處阻滯神經末梢釋放こ酰膽堿，從而治療痙攣、強直等疾病。自1992年報道肉毒毒素在治療眼肌痙攣時，同`時具有消除皺紋的作用，從此開創了肉毒毒素在美容領域的應用。2002年4月FDA批準肉毒毒素可以用于化妝品中，其效果顯著、安全性高的特點受到廣泛關注。目前肉毒毒素的主要給藥途徑為皮下注射或肌肉注射，肉毒毒素注射劑通過在面部肌肉內注射起到去除皺紋的治療效果，面部肌肉包括皺眉肌、降眉肌、眼輪匝肌、顳肌等，目前對于注射用肉毒毒素在臨床的使用的安全性和耐受性存在一定問題，且存在患者使用的順應性不好等問題。因此，急需將肉毒毒素開發為新型的經皮給藥制劑，基于穿膜肽的經皮轉運作用，能促進肉毒毒素穿過皮膚屏障，達到作用部位，用于治療包括眉間皺紋、鼻唇線、魚尾紋、嘴角紋和抬頭紋等，提高藥物使用的安全性和順應性，降低藥物的毒副作用及耐受性。現有研究通過將A型肉毒毒素與HIV-TAT穿膜肽進行組合，用于A型肉毒毒素的局部施用和透皮遞送，但是任然存在透皮吸收率差，應用范圍較差等缺點。因此，為了進ー步地提高肉毒毒素的透皮吸收率，很有必要在現有技術的基礎上設計研發一種透皮吸收率更高的肉毒毒素的外用經皮給藥制劑。
發明內容
發明目的:本發明的目的是解決現有技術的不足，通過大量實驗篩選，提供ー種高效透過率的穿膜肽與肉毒毒素進行組合，或將穿膜肽與肉毒毒素形成融合蛋白的方式，獲得高透過率的穿膜肽介導的肉毒毒素外用經皮給藥制劑。技術方案:為了實現以上目的，本發明采取的技術方案為:
一種用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，所述穿膜肽通過與肉毒毒素組合的形式存在或者穿膜肽通過與肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在。作為優選方案，以上所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，穿膜肽通過與肉毒毒素組合的形式存在時，所述的穿膜肽的氨基酸序列為精氨酸的直鏈聚合物Rn，其中n = 3 16。本發明通過大量實驗，篩選了大量不同的氨基酸序列，實驗結果表明，當肉毒毒素與精氨酸的直鏈聚合物Rn (其中n = 3 16)組合時，肉毒毒素的透皮轉運速率與透過率顯著高于現有技術的肉毒毒素經皮給藥系統。作為另ー優選方案，以上所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，穿膜肽通過與肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在時，所述的穿膜肽的序列為精氨酸的直鏈聚合物Rn，其中n = 3 16。作為另一更優選方案，穿膜肽通過與肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在時，所述的穿膜肽的序列為具有HIV-1轉錄激活因子Tat蛋白轉導結構域Tat_PTD49_57 序列片段。 作為優選方案，穿膜肽與肉毒毒素通過基因重組方式獲得的融合蛋白質，具體方法為:采用PCR方法擴增出穿膜肽與A型肉毒毒素的基因片段，采用overlap法連接后將擴增產物和大腸桿菌表達質粒pET-22b用限制性內切酶EcoR I以及Xho I雙酶切后連接，并轉化至大腸桿菌DH5ci中，用氨芐青霉素篩選陽性克隆，抽提經測序鑒定正確的重組質粒，轉化至大腸桿菌BL21中，利用氨芐青霉素抗性篩選出構建成功的轉化子，在37°C經IPTG誘導4小時后，收獲融合蛋白并使用Ni親和層析柱進行分離純化，獲得穿膜肽與A型肉毒毒素的融合蛋白。穿膜肽與肉毒毒素通過基因重組方式獲得的融合蛋白質，其中所述肉毒毒素融合蛋白質以約5単位到約為3000単位的量存在于所述的外用經皮給藥制劑中。為了更好的促進肉毒毒素的透皮轉運與透過，本發明通過大量實驗篩選研究，結果表明，當穿膜肽與肉毒毒素通過基因重組方式獲得的融合蛋白質時，其透皮轉運速率與透過率得到明顯提高，取得了非常好的技術效果。作為優選方案，所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，所述的肉毒毒素未A、B、C、D、E、F或G型肉毒毒素。作為優選方案，以上所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，將穿膜肽與肉毒毒素的組合物或者穿膜肽與肉毒毒素形成的融合蛋白采用天然或合成的磷脂包裹制備成脂質體。實驗結果表明，穿膜肽介導的肉毒毒素包裹制備成脂質體時，較未被脂質體包裹的肉毒毒素相比，其透皮轉運速率與透過率得到明顯提高，因此本發明可以將穿膜肽介導的肉毒毒素包裹制備成脂質體，方便用于經皮給藥系統。作為優選方案，以上所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，所述的外用制劑為溶液劑、軟膏劑、凝膠劑、乳劑、霜劑、氣霧劑或貼劑。作為優選方案，以上所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，穿膜肽與肉毒毒素形成的組合物，外用制劑中含有肉毒毒素5単位到3000単位，外用制劑中穿膜肽的重量百分含量為0.01% 40%。作為優選方案，以上所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物在制備治療眉間皺紋、鼻唇線、魚尾紋、嘴角紋或抬頭紋醫學或美容病癥中的應用。有益效果:本發明提供的組合物和現有技術相比具有以下優點:
本發明通過大量實驗篩選，優選出最佳的氨基酸序列與肉毒毒素進行組合，另外本發明還通過大量實驗將穿膜肽與肉毒毒素通過基因重組方式獲得融合蛋白質，通過經皮擴散實驗研究表明，本發明提供的基于穿膜肽介導下的肉毒毒素轉運速率與透過率明顯高于現有技術的肉毒毒素外用給藥制劑，具有很好的應用前景。
具體實施例方式下面結合具體實施例進ー步闡明本發明，應理解這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，在閱讀了本發明之后，本領域技術人員對本發明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。實施例1 R8 (8聚精氨酸)介導的肉毒毒素凝膠劑的制備
取I g卡波姆940，加蒸餾水適量，攪拌均勻后放置充分溶脹，得卡波姆凝膠溶液，然后取10單位的A型肉毒毒素,加入2 mL PBS緩沖液中，得到A型肉毒毒素溶液,然后采用固相合成法合成穿膜肽R8 (8聚精氨酸)，取I g R8 (8聚精氨酸)穿膜肽，溶解于2 mL PBS緩沖液中，得R8 (8聚精氨酸)穿膜肽溶液。將5 g丙ニ醇、10 gこ醇加入至上述卡波姆凝膠中，邊加邊攪拌，以三こ醇胺調pH至6.(T7.0，再以蒸餾水加至約90 g吋，將A型肉毒毒素PBS溶液和R8穿膜肽PBS溶液加入至凝膠中，充分攪拌混勻后，以蒸餾水加至100 g，即得A型肉毒毒素凝膠劑。實施例2 Tat_PTD49_57與肉毒毒素融合蛋白的制備
表達和純化含有Tat-PTD49_57蛋白轉導結構域(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)與A型肉毒毒素的融合蛋白質。采用PCR方法擴增出穿膜肽與A型肉毒毒素的基因片段，采用overlap法連接后將擴增產物和大腸桿菌表達質粒pET_22b (Novagen, c0.Ltd.，USA)用限制性內切酶EcoR I以及Xho I雙酶切后連接，并轉化至大腸桿菌DH5 a(Novagen, c0.Ltd.，USA)中，用氨芐青霉素篩選陽性克隆，抽提經測序鑒定正確的重組質粒，轉化至大腸桿菌BL21中，利用氨芐青霉素抗性篩選出構建成功的轉化子，在37°C經IPTG誘導4小時后，收獲融合蛋白并使用Ni親和層析柱進行分離純化，最終獲得純度高于98%的Tat與A型肉毒毒素的融合蛋白。將此融合蛋白加入凍干保護劑后凍干得到凍干粉，用于經皮給藥系統。
實施例3 Tat_PTD49_57與肉毒毒素融合蛋白氣霧劑的制備
按實施例2所述方法，合成穿膜肽Tat-PTD49_57，然后與C型肉毒毒素形成融合蛋白。取30單位的穿膜肽與C型肉毒毒素融合蛋白，加入20 mL PBS緩沖液中，得融合蛋白溶液，灌裝，即得Tat-PTD49_57與肉毒毒素融合蛋白氣霧劑。實施例4穿膜肽R16 (16聚精氨酸)與肉毒毒素融合蛋白貼劑的制備
按實施例2所述方法，采用固相合成法合成穿膜肽R16，將R16與D型肉毒毒素重組表達獲得融合蛋白，取10單位的R16與D型肉毒毒素融合蛋白，加入2 mL PBS緩沖液中，得融合蛋白溶液。取PVA，PVP，CMC-Na充分溶脹過夜，加入適量甘油與月桂氮酮，水浴溶解，得貼劑基質，將R16與D型肉毒毒素融合蛋白溶液加入貼劑基質中，攪拌溶解，形成透明的粘稠膠液，涂布于背襯層上，自然晾干至表面固化，得到D型肉毒毒素貼劑。實施例5 R8 (8聚精氨酸)與肉毒毒素融合蛋白脂質體的制備
按實施例2所述方法，合成穿膜肽R8與A型肉毒毒素融合蛋白，取10單位的R8與A肉毒毒素融合蛋白，加入2 mL PBS緩沖液中，得融合蛋白溶液。將磷脂與膽固醇混勻后，加無水こ醇溶解得到脂質溶液，蒸發，制成脂質薄膜。將脂質薄膜與水溶液水合，震蕩，制成脂質分散水溶液，將脂質分散水溶液經過超聲、乳化、過濾，調節PH至6.8，與R8與A型肉毒毒素融合蛋白溶液混合孵育，濾膜過濾，得到R8與A型肉毒毒素融合蛋白脂質體。實施例6 R8 (8聚精氨酸)與肉毒毒素融合蛋白脂質體凝膠制劑的制備將實施例1中的卡波姆凝膠溶液與實施例5制備得到的R8與C型肉毒毒素融合蛋白脂質體混合，緩慢攪拌均勻，制成R8 (8聚精氨酸)與肉毒毒素融合蛋白脂質體凝膠制劑。實施例7 穿膜肽介導的肉毒毒素的經皮擴散研究
1.實驗動物
ICR小鼠，體重18 22g，雌雄各半，由南京醫科大學實驗動物中心提供，合格證編號:0011898 ;實驗動物生產許可證號:SCXK (蘇)2008-0004。2.實驗分組
小鼠隨即分組，每組8只，分別為生理鹽水組，空白基質組，A型肉毒毒素溶液組(10U)，實施例1制備得到的R8與A型肉毒毒素組合物組(10U),實施例5制備得到的R8與A型肉毒毒素融合蛋白組(10U)，實施例2制備得到的Tat-PTD49_57與A肉毒毒素融合蛋白組。3.實驗內容
剪去小鼠腹部鼠毛，面積為6 cm X 6 cm，將藥物涂抹于去毛表面，開始計吋，8 h后麻醉處死，剝離腹部去毛皮膚，去除皮下組織和脂肪，生理鹽水沖洗干凈，獲得完整的小鼠腹部皮膚。剪取有效擴散面積以內的皮膚稱重，剪碎，勻漿后離心(5000 rpm)，用生理鹽水反復沖洗沉淀后離心，將上清 液合井。以ELISA方法分別測定各組動物皮膚組織上清液中A型肉毒毒素含量。 4.實驗結果
權利要求
1.一種用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，其特征在于，所述穿膜肽通過與肉毒毒素組合的形式存在或者穿膜肽通過與肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在。
2.根據權利要求1所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，其特征在干，穿膜肽通過與肉毒毒素組合的形式存在時，所述的穿膜肽的氨基酸序列為精氨酸的直鏈聚合物Rn，其中n = 3 16。
3.根據權利要求1所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，其特征在于，穿膜肽通過與肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在時，所述的穿膜肽的序列為精氨酸的直鏈聚合物Rn，其中n = 3 16。
4.根據權利要求1所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，其特征在于，穿膜肽通過與肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在時，所述的穿膜肽的序列為具有HIV-1轉錄激活因子Tat蛋白轉導結構域Tat_PTD49_57序列片段。
5.根據權利要求1所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，其特征在于，通過基因重組的方式獲得穿膜肽與肉毒毒素的融合蛋白，具體方法為:采用PCR方法擴增出穿膜肽與A型肉毒毒素的基因片段，采用overlap法連接后將擴增產物和大腸桿菌表達質粒pET-22b用限制性內切酶EcoR I以及Xho I雙酶切后連接，并轉化至大腸桿菌DH5a中，用氨芐青霉素篩選 陽性克隆，抽提經測序鑒定正確的重組質粒，轉化至大腸桿菌BL21中，利用氨芐青霉素抗性篩選出構建成功的轉化子，在37°C經IPTG誘導4小時后，收獲融合蛋白并使用Ni親和層析柱進行分離純化，獲得穿膜肽與A型肉毒毒素的融合蛋白。
6.根據權利要求1至4任一項所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，其特征在于，所述的肉毒毒素未A、B、C、D、E、F或G型肉毒毒素。
7.根據權利要求1所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，其特征在于，將穿膜肽與肉毒毒素的組合物或者穿膜肽與肉毒毒素形成的融合蛋白采用天然或合成的磷脂包裹制備成脂質體。
8.根據權利要求1至4任一項所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，其特征在于，所述的外用制劑為溶液劑、軟膏劑、凝膠劑、乳劑、霜劑、氣霧劑或貼劑。
9.根據權利要求2所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，其特征在于，穿膜肽與肉毒毒素形成的組合物，外用制劑中含有肉毒毒素5単位到3000単位，外用制劑中穿膜肽的重量百分含量為0.01% 40%。
10.權利要求1至4任一項所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物在制備治療眉間皺紋、鼻唇線、魚尾紋、嘴角紋或抬頭紋醫學或美容病癥中的應用。
全文摘要
本發明公開了用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物及其制備方法和應用，所述穿膜肽通過與肉毒毒素組合的形式存在或者穿膜肽通過與肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在。本發明通過大量實驗篩選，優選出最佳的氨基酸序列與肉毒毒素進行組合，另外本發明還通過大量實驗將穿膜肽與肉毒毒素通過基因重組方式獲得融合蛋白質，通過經皮擴散實驗研究表明，本發明提供的基于穿膜肽介導下的肉毒毒素轉運速率與透過率明顯高于現有技術的肉毒毒素外用給藥制劑，具有很好的應用前景。
文檔編號A61K47/48GK103083651SQ20131002166
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月22日 優先權日2013年1月22日
發明者劉睿, 吳皓, 程建明, 卞慧敏, 王令充 申請人:南京中醫藥大學