用于預防和/或治療癌癥的腫瘤抗原bfa5的制作方法

專利名稱：用于預防和/或治療癌癥的腫瘤抗原bfa5的制作方法
用于預防和/或治療癌癥的腫瘤抗原BFA5本申請為2004年4月15日提交的申請號為200480016064.5、發明名稱為“用于預防和/或治療癌癥的腫瘤抗原BFA5”的申請的分案申請。相關申請本申請要求保護2003年4月15日遞交的美國臨時申請號60/462，945的優先權。發明領域本發明涉及一種編碼多肽的核酸以及該核酸和/或多肽在預防和/或治療癌癥方面的用途。本發明特別涉及用于癌癥免疫治療的供編碼腫瘤抗原的外源基因插入和表達的改良載體。
背景技術：
在過去幾年中，借助高密度芯片、SEREX、免疫組化(IHC))、RT-PCR、原位雜交(ISH)和激光捕獲顯微鏡幾種技術(Rosenberg, Immunity, 1999 ；Sgroi 等，1999, Schena等，1995，OfTringa等，2000)，基于原發腫瘤和正常細胞表達譜的分子識別取得了長足進展，導致了帶有腫瘤相關抗原(TAA)的癌癥疫苗開發的劇增。TAA是由腫瘤細胞表達或過度表達的抗原，可能具有一種或數種腫瘤特異性，例如，CEA抗原表達于直腸癌、乳腺癌和肺癌。Sgroi等(1999)結合激光捕獲顯微切割技術和cDNA芯片技術鑒別了幾種差異性表達于浸潤和轉移的肉瘤細胞的基因。數種導入系統如DNA或病毒，可用于人類癌癥的治療性疫苗，能誘導免疫反應并打破對TAA的耐受。通過插入編碼T細胞協同刺激分子轉基因，如B7.1基因或細胞因子基因，如Y-干擾素(IFN-Y)，白細胞介素-2 (IL-2)或GM-集落刺激因子(GM-CSF)轉基因，可提高腫瘤細胞的免疫原性。TAA和細胞因子或協同刺激分子的共表達也顯示了在開發有效的治療性疫苗方面的作用(Hodge等，95，Bronte等，1995，Chamberlain 等，1 996)。在本領域存在有對刺激免疫反應以預防或治療癌癥的有效試劑和方法的需求，本發明提供了這樣的試劑和方法，這些試劑和方法克服了許多人們在治療癌癥的努力中遇到的困難。發明概述本發明提供了一個用于病人以預防和/或治療癌癥的免疫原性靶。特別的是該免疫原性靶為腫瘤抗原(“TA”)和/或血管生成相關抗原(“AA”)。在一個實施方案中，該免疫原性靶由SEQ ID NO:5編碼或有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些實施方案中，TA和/或AA通過質粒或其他導入載體，如重組病毒，以核酸的形式用于病人。TA和/或AA也可和其他的腫瘤抗原(如SEQ ID NO: 1-4)和/或協同刺激分子及佐劑聯合給予。附圖簡述

圖1.BFA4cDNA 序列圖2.BFA4氨基酸序列圖3.BCYl核苷酸㈧和氨基酸⑶序列圖4.BFA5cDNA 序列
圖5.BFA5氨基酸序列發明詳述本發明提供了可用于癌癥預防和治療的試劑和方法。本申請中所有引用的參考資料均通過弓I用結合到本文中。在一個實施方案中，本發明涉及到誘導或加強針對一種或多種的腫瘤抗原(“TA”)的免疫反應來預防和/或治療癌癥。在某些實施方案中，一種或多種TA可聯合給予。在優選的實施方案中，免疫反應由給予編碼腫瘤抗原的核酸載體后引起或由給予肽或多肽形式的腫瘤抗原本身引起。如這里所用 ，“抗原”是一種能在一個被給予了該抗原的宿主體內誘生免疫反應的分子，如一種多肽或它的一部分。免疫反應包括產生與該抗原上至少一種抗原決定簇結合的抗體和/或產生針對表達有該抗原的某一抗原決定簇的細胞的細胞免疫反應。這種反應也可是原有免疫反應的加強，例如誘導更多抗體的產生，或有更高親合力的抗體的產生，或誘導更有效的細胞免疫反應(如增高T細胞數量或增強T細胞的抗腫瘤作用)。能夠誘生免疫反應的抗原又可稱為具免疫性或稱作免疫原。在本發明的描述中，TA可被稱為“免疫原性靶”。TA包括了腫瘤相關抗原(TAA)和腫瘤特異性抗原(TSA)，癌性細胞是其來源。TAA是在腫瘤細胞表面的表達高于正常細胞的抗原，或正常細胞只在胚胎期才表達的抗原；TSA是腫瘤細胞特有而正常細胞不表達的抗原。TA還進一步包括了 TAA或TSA、它們的抗原性片段以及保留了它們的抗原性的修飾后的變異體。根據TA的表達模式、功能及基因來源將其分為典型的5類:癌-睪丸抗原(即MAGE, NY-ES-1);黑色素細胞分化抗原(即MelanA/MART-Ι，酪氨酸酶，gplOO);突變抗原(即MUM-1’ p53，CDK-4);過度表達的“自身”抗原(即HER-2/neu, p53);病毒抗原(即HPV,EBV)。為了應用本發明，合適的TA指任何一種能夠在其表達的宿主體內誘導和增強抗腫瘤免疫的 TA。合適的 TA 包括有:例如，gapl00(Cox 等，Science, 264:716-719 (1994))、MART-1/Me I an A (Kawakami 等，J.Exp.Med.，180:347-352 (1994)))、gp75(TRP_l) (Wang等，J.Exp.Med., 186:1131-1140 (1996))、酪氨酸酶(Wolfel 等，EU7-.J.1namufzo1.,24:759-764(1994) ；W0 200175117 ;W0 200175016 ;W0200175007))、NY-ESO-l (TO 98/14464 ；WO 99/18206)、黑色素瘤蛋白聚糖(Hellstrom 等，J.1mmunol.，130:1467-1472 (1983))、MAGE 家族抗原(S卩，MAGE_1、2、3、4、6、12、51 ；Van der Bruggen 等，Science,254:1643-1647(1991);美國專利 6, 235, 525 ；CN 1319611)、BAGE 家族抗原(Boel 等，Imnauszity, 2:167-175 (1995))、GAGE 家族抗原(即，GAGE_1、2 ;Van den Eynde 等，J.Exp.Med., 182:689-698(1995);美國專利 6，013，765)、RAGE 家族抗原(即，RAGE-1 ;Gaugler 等，Inaozunogenetics,44:323-330(1996);美國專利 5,939,526)、N-乙酸氛基葡萄糖轉移酶V (Guilloux 等，J.Exp.Med.，183:1173-1183 (1996))、pl5 (Robbins 等，J.1mnzuno1.154:5944-5950(1995))、β-聯蛋白(Robbins 等，J.Exp.Med.，183:1185-1192 (1996))、MUM-KCoulie 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 92:7976-7980 (1995))、細胞周期依賴的蛋白激酶 _4(CDK4) (Wolfel 等，Science，269:1281-1284 (1995))、p21_ras (Fossum 等，7.Cancer56:40-45(1994))、BCR-abl (Bocchia 等，Blood,85:2680-2684(1995))、p53 (Theobald等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 92:11993-11997 (1995))、pl85HER2/neu (erb-Bl ；Fisk 等，J.Exp.Med., 181:2109-2117 (1995))、表皮生長因子受體(EGFR) (Harris 等，BreastCancerRes.Treat, 29:1-2(1994))、癌胚抗原(CEA)(Kwong 等，J.Natl.Cancer I7nst.,85:982-990(1995)美國專利 5，756，103 ;5，274，087 ;5，571，710 ;6，071，716 ;5，698，530 ;6, 045, 802 ；EP 263933 ；EP 346710 ;和 EP 784483);癌相關突變粘蛋白(即，MUC-1 geneproducts Jerome 等，J.1nznauriol.9 151:1654-1662(1993)) ;EBV 基因產物 EBNA(即，EBNA-1 ；Rickinson 等，Cancer Surveys, 13:53-80 (1992));人乳頭狀瘤病毒蛋白 E7,E6 (Ressing 等，J.1nimunol9 154:5934-5943(1995));前列腺特異性抗原(PSA ;Xue 等,The Prostate, 30:73-78 (1997));前列腺特異性膜抗原(PSMA ;IsraeIi,等，Cancer Res.,54:1807-1811(1994));獨特型抗原決定簇或抗原，如免疫球蛋白獨特型或T細胞受體獨特型(Chen 等，J.1mmunol.，153:4775-4787(1994)) ;KSA(美國專利 5，348，887)、驅動蛋白-2 (Dietz，等 Biochem Biophys ResCommun 2000 Sep 7 ；275(3):731-8)、HIP-55，TGFβ-l 抗凋亡因子(Toomey，等Br J Biomed Sci 2001 ；58(3):177-83)、腫瘤蛋白 D52 (BryneJ.A.，等，Genomics, 35:523-532 (1996))、HlFT、NY-BR-1 (W001/47959)、NY-BR-62、NY-BR-75、NY-BR-85、NY-BR-87、NY-BR-96(Scanlan, M.Serologic and BioinfonnaticApproaches to theldentification of Human Tumor Antigens, in Cancer Tzacci71es2000，Cancer Research Institute, New York，NY)、BFA4(SEQ ID NOS.:1 和 2)、BCYl(SEQID NOS.:3和4)和BFA5(SEQ ID NOS.:5和6)，包括這些抗原的“野生型”(即由染色體編碼的，自然發生的)、修飾型和突變型以及它們的其他片段和衍生物。這些靶抗原中的任何一個均可單獨給予或相互聯合以共免疫的形式給予。在一定情況下，用TA和其他抗原共免疫可能會使病人受益，例如與血管生成相關抗原(“AA”)聯用。AA是一種與血管的誘生和/或繼續生長的細胞有關的免疫分子(即肽或多肽)。例如，AA可以表達在內皮細胞(“EC”)上，內皮細胞是血管的基本結構成份。治療腫瘤時，腫瘤內部或附近的供血血管上最好有AA存在，用AA免疫病人誘導出抗AA的免疫反應，這樣，腫瘤內部或附近的血管生成過程將會被阻止或抑制。AA包括血管內皮細胞生長因子(B卩，VEGF ；Bernardini,等J.Urol.,2001,166(4):1275-9 ;Starnes，等 J.Thorac.Cardiovasc.Surg.,2001,122(3):518-23 ;Dias，等Blood, 2002,99:2179-2184)、VEG`F 受體(即，VEGF-R, flk-l/KDR ；Starnes,等 J.Thorac.Cardiooasc.Surg.，2001，122(3):518-23)、EPH 受體(即，EPHA2 ;Gerety，等 1999，Cell,4:403-414)、表皮生長因子受體(即，EGFR ;Ciardeillo，等 Clin.CancerRes.,2001,7(10):2958-70)、喊性成纖維細胞生長因子(即，bFGF ;Davidson,等 Clin.Exp.Metastasis 2000，18(6):501-7 ;Poon，等 AmJ.Surg.，2001，182(3):298-304)、血小板源細胞生長因子(即，PDGF-B)、血小板源內皮生長因子(PD-ECGF ；Hong,等 J.Mol.Med.,2001,8 (2): 141-8)、轉化生長因子(即，TGF-a.;Hong，等 J.Mol.Med.，2001，8(2):141-8)、內皮因子(Balza,等 Int.J.Cancer,2OOl,94:579-585)、Id 蛋白(Benezra, R.Trends Cardiovasc.Med.,2001,11(6):237-41)、蛋白酶，如 uPA、uPAR 和基質金屬蛋白酶(MMP-2, MMP-9 ;Djonov，等J.Pathol.，2001，195(2):147-55)、一氧化氮合酶(Am.J.0phtllallllol.,20019 132(4):551-6)、氨妝酶(Rouslhati, E.Nature Cancer, 2:84-90, 2002)、凝血酶致敏蛋白(即,TSP-1, TSP-2 ；Alvarez,等 Gynecol.0ncol.,2001,82(2):273-8 ；Seki,等 Int.J.0ncol.，2001,19(2):305-10)、k-ras (Zhang，等 Cancer Res.，2001，61 (16):6050-4)、Wnt (Zhang,等 Cancer Res.，2001，61 (16):6050-4)、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs ;Drug Resist.Updat.2000，3 (2):83-88)、微管(Timar,等 2001.Path.0ncol.Res.，7 (2):85-94)、熱休克蛋白(即，HSP90 (Timar, supra))、肝素結合因子(即，heparinase ； Gohji,等 Int.J.Cancer, 2001,95 (5):295-301)、合成酶(即，ATP合酶，胸苷二磷酸合酶)、膠原蛋白受體、整聯蛋白(即auj33、aup5、alpl、a2pl、a5pl)、表面蛋白聚糖NG2，AAC2-l(SEQ ID N0.:1)或AAC2-2(SEQ ID N0.:2)，包括這些抗原的“野生型”(即由染色體編碼的，自然發生的)、修飾型和突變型以及它們的其他片段和衍生物。這些靶抗原中的任何一個都適用于本發明，可單獨給予或相互聯合給予或與其他試劑聯合給予。在某些實施方案中，用編碼免疫原性靶的核酸分子，該核酸分子含編碼一種或多種免疫原性靶或它們的片段或衍生物的核苷酸序列，例如ATCC(美國典型培養物保藏中心)保藏中DNA插件含有的核苷酸序列。術語“核酸序列”或“核酸分子”指一段DNA或RNA序列，該術語涵蓋任何已知的DNA和RNA的堿基類似物形成的分子，但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基-胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基-甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異-戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基-鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧唆、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露酰Q核苷、5'-甲氧基羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-Ν6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸甲基酯、尿嘧啶-5-乙醇酸、oxybutoxosine、假尿喃卩定、Q核苷、2-硫胞喃卩定、5-甲基_2_硫尿喃卩定、2_硫尿喃卩定、4_硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶 、N-尿嘧啶-5-乙醇酸甲基酯、尿嘧啶-5-乙醇酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶和2，6- 二氨基嘌呤等。分離出的核酸分子指:(I)從來源細胞中提取總DNA時，至少與其天然存在在一起的50%的蛋白質、脂類、碳水化合物或其他物質相分離；(2)不再與自然條件下相連的多核苷酸的全部或部分連接；(3)被操作性連接到自然條件下不相連的多核苷酸上；和/或(4)作為較大多核苷酸序列的一部分自然條件下不存在。本發明中分離的核酸分子最好基本不含其他核酸分子和其他自然環境中存在的污染物，這些污染物會干擾其在多肽產生或治療、診斷、預防和研究中的用途。當術語“自然發生的”、“天然的”和“天然存在的”在這里用于指生物物質，如核酸分子、多肽、宿主細胞和類似的其他東西時，是指該物質是自然而沒有經人為操作的。類似，“非自然發生的”或“非天然的”表示該物質不是自然存在而是經過了人為結構修飾或人工合成的。兩個或更多核酸或多肽分子的同一性由對比其序列來決定。正如在本領域所熟知，“同一性”意味著核酸或多肽序列相似的程度，由匹配比較構成序列的基本單位(即核苷酸或氨基酸殘基)確定。同一性通過一種特殊的數學模型或計算機程序(即算法(algorithm))設計的帶空位比對以測定兩個或更多序列的較小者之間的相同匹配的百分Ito核酸分子之間的同一性也可由相關序列與該核酸序列或分尚到的核酸分子的雜交的能力來確定。在確定這樣的序列時，術語“高度嚴格條件”和“中度嚴格條件”是指允許序列互補的核酸雜交，而避免錯配雜交的過程。用于雜交和洗滌的“高度嚴格條件”的例子有:0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉、65-68 °C孵育或0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉和50% 甲酸胺、42°C孵育(見，例如，Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) ;Anderson 等，Nucleic AcidHybridisation:A Practical Approach Ch.4 (IRL Press Limited))。術語“中度嚴格條件”是指與“高度嚴格條件”相比，較大程度的DNA雙螺旋堿基錯配可能發生的條件。中度嚴格條件的例子是0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉50-65 °C孵育或0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉和20%甲酰胺于37-50°C孵育。根據例子，0.015M鈉離子在50°C孵育的中度嚴格條件下，將有21%的錯配發生。雜交時，為了降低非特異反應和/或雜交背景，雜交和洗滌緩沖液中可包含其他試劑，例如0.1%牛血清白蛋白、0.1%聚乙烯吡喀烷酮、0.1 %亞錫焦磷酸鈉、0.1 %十二烷基硫酸鈉、NaDodSO4 (SDS)、聚蔗糖、Denhardt ’溶液超聲處理過的鮭魚精DNA(或其他非互補DNA)和硫酸葡聚糖，也可用其他合適的試劑。改變這些添加物的濃度和類別不會對雜交條件的嚴格性有太大影響。雜交實驗通常在PH6.8-7.4的條件下進行，然而在通常的離子強度條件下，雜交率幾乎不受PH的影響。在本發明的某些實施方案中，載體被用于轉運編碼多肽的核酸序列進入細胞中。載體為任何用于將核酸序列導入宿主細胞的分子。在某些情況下，使用表達載體，表達載體為含有能夠指導和/或控制被導入的核酸序列的表達的核苷酸序列且適合于轉化宿主細胞的核酸分子。表達包括但不限于轉錄、翻譯和有內含子存在時的剪接的過程。典型的表達載體含有一個或多個操作性連接到編碼多肽的外源核酸序列的側翼序列。側翼序列可以是，例如同源的(即與宿主細胞來自同一種和/或株)、異源的(即與宿主細胞不同種、株)、雜源的(即一個以上來源的側翼序列的結合)或合成的。側翼序列最好具有影響編碼序列的復制、轉錄和/或翻譯的能力且被操作性連接到編碼序列上。正如這里所用，術語“操作性連接”指多核苷酸片段以功能關系連接到一起。例如，一個啟動子或一個增強子如能影響編碼序列的轉錄，則其為操作性連接到編碼序列上。然而，只要能正常發揮功能，側翼序列并無必要與編碼序列相鄰。如此，例如不翻譯但轉錄的干預序列可存在于啟動序列與編碼序列之間，啟動序列仍被認為是操作性連接到編碼序列。同理，一個增強序列可以位于編碼序列的上游或下游而影響該序列的轉錄。在某些實施方案中，優選側翼序列是在靶細胞中驅動基因高水平表達的轉錄調節序列，該轉錄調節區域可包含，例如，啟動子、增強子、沉默子、抑制子或它們的聯合。該轉錄調節區域可以是組成性的、組織特異性的、細胞特異性的(即可在一種組織和細胞中較其他組織和細胞中驅動高水平轉錄的區)、或可調節的(即對與化合物的作用作出反應)。轉錄調節區可來源于任何原核或真核生物，任何脊椎或無脊椎生物，或任何植物，只要該側翼序列能在細胞內通過引起核酸的轉錄而發揮功能。各種不同的轉錄調節區均可在本發明的實施中使用。合適的轉錄調節區包括，如CMV啟動子(即CMV即早啟動子)；來自真核基因的啟動子(如雌激素誘導的雞卵清蛋白基因，干擾素基因，糖皮質激素誘導的酪氨酸氨基轉移酶基因和胸苷激酶基因)；腺病毒主要早期和晚期基因啟動子；SV40早期啟動區(BernoistandChambon 1981,1981, NATURE 290:304-10);包含于 Rous 肉瘤病毒(RSV)3，長端重復序列(LTR)的啟動子(Yamamoto，等，1980，Cell22:787-97);單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)啟動子(Wagner.，1981，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.78:1444-45);金屬硫蛋白基因的調節序列(Brinster, et al., 1982, Nature 296:39-42);原核表達載體如β_內酉先胺酶啟動子(Villa-Kamaroff 等，1978.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,75:3727-31) jtac啟動子(Deboer 等，1983.Rorc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.80:21-25)。組織和 / 或細胞特異的轉錄控制區其中包括，如，只在胰腺腺泡細胞內激活的彈性蛋白酶I基因控制區段(Swift等，1984Cell 38:639-46 ;0rnitz 等，1986, Cold Spring Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409 (1986)MacDonald，1987，Hepatology7:425-515);在胰腺 β 細胞中激活的胰島素基因控制區(Hanahan，1985，Nature 315:115-22);在淋巴細胞中激活的免疫球蛋白基因控制區(Grosschcdl 等，1984, Cell38:647-58 ;Adames 等，1985，Nature318:533-38 !Alexander 等，1987，Mol.Cell.Biol.，7:1436-44);在睪丸、乳腺、淋巴細胞和肥大細胞中的鼠乳腺瘤病毒控制區(Leder et.al.，1986，Cell45 =485-95);肝中的白蛋白基因控制區(Pinkert等，1987, Genes and Devel.1:268-76));肝中的甲胎蛋白控制區(Krumlauf 等，1985，Mol.Cell.Biol.，5:1639-48 ；Hammer 等，1987，Science235:53-58)；肝中的α-1-抗胰蛋白酶基 因控制區(Kelsey等，1987,Genes and Devel.1:161-71);髓樣細胞中的 β_球蛋白基因控制區(Mogram等，1985,Nature 315:338-40 ;Kollias 等，1986,Cell 46:89-94);大腦少突神經膠質細胞中的髓鞘堿性蛋白基因控制區(Readhead等，1987,Cell 48:703-12);骨骼肌細胞中的肌球蛋白輕鏈_2基因控制區(Sani，1985 Nature314:283-86);下丘腦中的促性腺釋放激素基因控制區(Mason等，1986, Science 234:1372-78)和黑色素瘤細胞中的酪氨酸酶啟動子(Hart, 1.Semin Oncol 1996 Feb ；23(1):154-8 ;Siders,等 CancerGene Ther 1998 Sep-Oct ；5 (5):281-91)。也可用誘導型啟動子,即在有某些化合物存在或在有光、熱、放射、四環素存在，或熱休克蛋白存在時被激活的啟動子(見例，W000/10612)。其他合適的啟動子為本領域已知。如上所述，增強子也可以是合適的側翼序列。增強子為DNA順式作用元件，通常長度為10-300bp，作用于啟動子以增強轉錄。典型的增強子無方向和位置依賴性，在受其控制的編碼核酸序列的5’和3’端都有發現。已知有幾個來源于哺乳動物基因的增強子序列(即，球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)。同樣，SV40增強子，巨細胞病毒早期啟動子增強子，多形瘤增強子和腺病毒增強子也有增強真核細胞啟動子序列的作用。雖然增強子可以拼接入載體的編碼序列的5’和3’端，但典型的還是位于啟動子的5’端。其他本領域已知的合適增強子，應該也適用于本發明。在制備本發明試劑的同時，細胞可能需要被轉染或轉化。轉染指外來或外源基因被細胞吸收。當外源基因被導入細胞膜，該細胞即被轉染。本領域有許多轉染技術為人們所熟知(如，Graham 等，1973, Virology 52:456 ;Sambrook 等，Molecular Cloning, AIaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratories,1989) and Chu 等，1981, Genel3:197)。利用這些技術能將一個和更多的DNA片段導入合適的宿主細胞。在某些實施方案中，以轉染導致被轉染的細胞發生轉化為優選。當細胞的特征發生改變時即細胞發生了轉化，被轉化意味著細胞被修飾而含有了新的核酸。轉染后，被轉染進入細胞的核酸可以物理的方式整合進細胞染色體而與細胞核酸重組為一體，也可作為一種游離的元件暫時存在于細胞中不被復制或作為質粒獨立地復制。當轉染進去的核酸隨細胞的分裂而復制時，即該細胞發生了穩定轉化。本發明進一步提供了多肽形式的分離的免疫原性靶。一個多肽被認為是分離的應具備:(1)從來源細胞中分離時，至少已與其天然存在在一起的50%的多核苷酸、脂類、碳水化合物或其他物質相分離；(2)不再與自然條件下相連的多肽的全部或部分相連接(共價或非共價相互作用)；(3)被操作性連接到自然條件下不相連的多肽上(通過共價或非共價相互作用)；(4)自然條件下不存在。分離的多肽最好基本不含其他污染多肽或其他自然環境中存在的污染物，這些污染物會干擾其在多肽產生或治療、診斷、預防和研究中的用途。免疫原性靶多肽可以是成熟的多肽，如這里所定義，其氨基端可以有也可以無甲硫氨酸殘基，這取決于它們的制備方法。另外涉及相關多肽如片段、變異體(等位，拼接)、直向同源物、同源物和衍生物，例如至少具有免疫原性靶的一種特征或功能(即活性或抗原性)的上述物質。還涉及肽，指一系列至少與其來源多肽的某部分序列具序列相關性的連續的氨基酸殘基。在優選實施方案中，肽含有約5-10個氨基酸、10-15個氨基酸、15-20個氨基酸、20-30個氨基酸或30-50個氨基酸。在更優選的實施方案中，例如，肽含9-12個氨基酸，正好適合于提呈給MHC I類分子。核酸或多肽片段在其氨基端(有或無前導序列)和/或羧基端包含一個序列截斷(即，核酸或多肽)。片段也可以包括變異體(等位的，拼接的)、直向同源物、同源物和其他與母序列相比有一個或多個的氨基酸插入或取代或內在缺失的變異體。在優選的實施方案中，截斷和/或缺失含約10個氨基酸、20個氨基酸、30個氨基酸、40個氨基酸、50個氨基酸或更多。由此產生的多肽片段將含約10個氨基酸、25個氨基酸、30個氨基酸、40個氨基酸、50個氨基酸、70個氨基酸或更多。這樣的多肽片段的氨基端可選擇性地含有一個甲硫氨酸殘基。不言而喻，這樣的片段應該能被用于，例如，產生與免疫原性靶多肽應答的抗體或細胞免疫。變異體是指與原有序列相比有一個或多個序列發生了取代、缺失和/或加入的序列。變異體可以是自然發生的或人為操控的。這樣的變異體可以從相應的核酸分子制備而得。在優選實施方案中，變異體有1-3、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-40、1-50或多于50的氨基酸發生了取代、插入、添加和/或缺失。一個等位變異體為一個生物或一個生物群體的染色體上占據同一基因座的基因的幾種可能自然發生的不同表型之一。一個拼接變異體是指由原始轉錄物經拼接形成的幾個RNA轉錄物產生的多肽之 一。直向同源物指來自不同的種屬的同樣的核酸和多肽序列，例如，鼠和人的一個相同的免疫原性靶多肽可被認為相互直系同源。一個衍生序列是指從母代序列衍生而來、其序列發生有取代、添加、缺失和化學修飾的序列。變異體也可包括融合蛋白，融合蛋白指一種或多種的第一序列(如肽)與至少另一個序列(如外源肽)在氨基或羧基端融合在一起。“相似性”是一個與同一性有關的概念，但相似性指對相關性的衡量，相關性包括了相同匹配和保守取代匹配兩者。如果兩個多肽序列，例如，有10/20相同氨基酸，其余均為非保守取代，則同一性和相似性均為50%。同一個例子，如果多了 5個位點上的保守性取代，則同一性的百分比仍為50%，相似性百分比為75% (15/20)。這樣，在有保守性取代的情況下，兩個多肽間相似性的百分比將比這兩個多肽間的同一性的百分比高。取代可以是保守的，也可是非保守的，或它們的任何組合。對多肽序列的保守氨基酸修飾(和對編碼序列的相應修飾)可產生功能和化學特征與母體多肽相似的多肽。例如，“保守氨基酸取代”可涉及一個天然氨基酸被一個非天然氨基酸取代，但其對該位點的氨基酸殘基的大小、極性、電荷、疏水性和親水性幾乎沒有影響或完全沒有影響，特別是不會引起免疫原性的降低。合適的保守氨基酸取代見表I。表I
權利要求
1.一種表達載體，含有SEQ ID N0:5或圖4中所不的核酸序列；一段核酸序列,編碼SEQID NO:6或圖5中所示的氨基酸序列；或其片段。
2.權利要求1的表達載體，其中載體為質粒或病毒載體。
3.權利要求2的表達載體,其中的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、皰疫病毒和腺相關病毒。
4.權利要求3的表達載體，其中病毒載體是選自牛痘、NYVAC、禽痘、金絲雀痘、ALVAC,ALVAC (2)、鳥痘和TROVAC的痘病毒。
5.權利要求4的表達載體，其中病毒載體是選自階￥八(:41^4(:和41^4(:(2)的痘病毒。
6.權利要求1的表達載體,進一步含有至少一個附加的腫瘤相關抗原。
7.權利要求6的表達載體,其中載體是質粒或病毒載體。
8.權利要求7的表達載體,其中的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、皰疫病毒和腺相關病毒。
9.權利要求8的表達載體，其中病毒載體是選自牛痘、NYVAC、禽痘、金絲雀痘、ALVAC,ALVAC (2)、鳥痘和TROVAC的痘病毒。
10.權利要求9的表達載體，其中病毒載體是選自階￥八(:41^4(:和41^4(:(2)的痘病毒。
11.權利要求1的表達載體，進一步含有至少一段編碼血管生成相關抗原的核酸序列。
12.權利要求11的表達載體，其中載體是質粒或病毒載體。
13.權利要求12的表達載體,其中的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、皰疫病毒和腺相關病毒。
14.權利要求13的表達載體，其中病毒載體是選自牛痘、NYVAC、禽痘、金絲雀痘、ALVAC, ALVAC (2)、鳥痘和 TROVAC 的痘病毒。
15.權利要求14的表達載體，其中病毒載體是選自NYVAC、ALVAC和ALVAC(2)的痘病毒。
16.權利要求6的表達載體，進一步含有至少一段編碼血管生成相關抗原的核酸序列。
17.權利要求16的表達載體,其中載體是質粒或病毒載體。
18.權利要求17的表達載體,其中的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、皰疫病毒和腺相關病毒。
19.權利要求17的表達載體，其中病毒載體是選自牛痘、NYVAC、禽痘、金絲雀痘、ALVAC, ALVAC (2)、鳥痘和 TROVAC 的痘病毒。
20.權利要求18的表達載體，其中病毒載體是選自NYVAC、ALVAC和ALVAC(2)的痘病毒。
21.一種表達載體,選自權利要求1的表達載體、權利要求6的表達載體、權利要求11的表達載體和權利要求16的表達載體；進一步含有編碼協同刺激分子的核酸序列。
22.權利要求22的表達載體，其中載體是質粒或病毒載體。
23.權利要求23的表達載體,其中的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、皰疫病毒和腺相關病毒。
24.權利要求24的表 達載體，其中病毒載體是選自牛痘、NYVAC、禽痘、金絲雀痘、ALVAC, ALVAC (2)、鳥痘和 TROVAC 的痘病毒。
25.權利要求18的表達載體，其中病毒載體是選自NYVAC、ALVAC和ALVAC(2)的痘病毒。
26.一種組合物，所述組合物在藥學上可接受的載體之中含有表達載體，所述表達載體含有SEQ ID NO:5或圖4中所示的核酸序列；編碼SEQ ID NO:6或圖5中所示的氨基酸序列的核酸序列；或其片段。
27.權利要求26的組合物，其中載體是質粒或病毒載體。
28.權利要求27的組合物，其中的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒和腺相關病毒。
29.權利要求28的組合物，其中病毒載體是選自牛痘、NYVAC、禽痘、金絲雀痘、ALVAC,ALVAC (2)、鳥痘和TROVAC的痘病毒。
30.權利要求29的組合物，其中病毒載體是選自NYVAC、ALVAC和ALVAC(2)的痘病毒。
31.一種預防或治療癌癥的方法，包括給予宿主含有SEQ ID NO: 5或圖4中所示的核酸序列的表達載體；編碼SEQ ID N0:6或圖5中所示的氨基酸序列的核酸；或其片段。
32.權利要求31的方法，其中載體是質粒或病毒載體。
33.權利要求32的方法，其中的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒和腺相關病毒。
34.權利要求 33的方法，其中病毒載體是選自牛痘、NYVAC、禽痘、金絲雀痘、ALVAC、ALVAC (2)、鳥痘和TROVAC的痘病毒。
35.權利要求34的方法，其中病毒載體是選自NYVAC、ALVAC和ALVAC(2)的痘病毒。
36.一種分離的肽，得自表X或XI所示的BFA5。
37.一種用腫瘤抗原BFA5免疫宿主的方法，包括給予病人表X或XI所示的肽，單獨給予或與其他藥聯合給予，聯合給予時各組分同時給予或各自分開給予。
38.一種分離的肽，得自表X或XI所示的BFA5。
39.一種用腫瘤抗原BFA5免疫宿主的方法，包括給予病人表X或XI所示的肽，單獨給予或與其他藥聯合給予，聯合給予時各組分同時給予或各自分開給予。
40.權利要求6的表達載體，其中外加的腫瘤相關抗原由選自下述序列的核酸序列編碼:SEQ ID NO:1核酸序列；SEQ ID NO: 3核酸序列；圖1中所示的核酸序列；圖3A中所示的核酸序列；編碼SEQ ID NO:2氨基酸序列的核酸序列；編碼SEQ ID NO:4氨基酸序列的核酸序列；編碼圖2中所示的氨基酸序列的核酸序列；編碼圖3B中所示的氨基酸序列的核酸序列；在嚴格條件下與前述任何序列雜交的核酸序列；前述任何核酸序列的片段；前述任何核酸序列的衍生物。
41.權利要求40的表達載體,其中的病毒載體選自痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、皰疫病毒和腺相關病毒。
42.權利要求41的表達載體，其中病毒載體是選自牛痘、NYVAC、禽痘、金絲雀痘、ALVAC, ALVAC (2)、鳥痘和 TROVAC 的痘病毒。
43.權利要求42的表達載體，其中病毒載體是選自NYVAC、ALVAC和ALVAC(2)的痘病毒。
44.一種表達載體,所述表達載體選自權利要求40的表達載體、權利要求41的表達載體、權利要求42的表達載體和權利要求42的表達載體；進一步含有編碼協同刺激分子的核酸序列。
45.權利要求44或21的表達載體，其中協同刺激分子是人B7.1或其衍生物。
46.一種組合物，所述組合物在藥學上可接受的載體中包含權利要求40的表達載體。
47.一種組合物，所述組合物在藥學上可接受的載體中包含權利要求41的表達載體。
48.一種組合物，所述組合物在藥學上可接受的載體中包含權利要求42的表達載體。
49.一種組合物，所述組合物在藥學上可接受的載體中包含權利要求43的表達載體。
50.一種組合物，所述組合物在藥學上可接受的載體中包含權利要求44的表達載體。
51.一種組合物，所述組合物在藥學上可接受的載體中包含權利要求45的表達載體。
52.一種預防或治療癌癥的方法，所述方法包括給予宿主權利要求46的組合物。
53.一種預防或治療癌癥的方法，所述方法包括給予宿主權利要求47的組合物。
54.一種預防或治療癌癥的方法，所述方法包括給予宿主權利要求48的組合物。
55.一種預防或治療癌癥的方法，所述方法包括給予宿主權利要求49的組合物。
56.一種預防或治療癌癥的方法，所述方法包括給予宿主權利要求50的組合物。
57.一種預防或治療癌癥的方法，所述方法包括給予宿主權利要求51的組合物。
58.一種分離的DNA分子，含有SEQ ID NO:5的核酸序列和至少一種SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的核酸序列。
59.一種表達載體，含有權利要求58的分離的DNA分子。
60.一種分離的DNA分子，含有編碼SEQ ID NO: 6氨基酸序列和至少一種SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4氨基酸序列的核酸序列。
61.—種表達載體,含有權利要求60的分離的DNA分子。
62.一種分離的DNA分子，含有SEQ ID NO:5的核酸序列和至少一種SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的核酸序列；能在嚴格條件下與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5雜交的核酸序列；SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5的核酸序列片段；任何SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5的核酸序列的衍生物。
63.一種抗體，能與SEQ ID NO: 6的氨基酸序列或SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的片段結口 ο
全文摘要
本發明涉及編碼多肽的核酸以及該核酸或多肽在預防和/或治療癌癥上的用途。本發明特別涉及用于癌癥免疫治療的供編碼腫瘤抗原的外源基因插入和表達的改良載體。
文檔編號A61K38/17GK103184234SQ201310012279
公開日2013年7月3日 申請日期2004年4月15日 優先權日2003年4月15日
發明者N.貝林斯泰因, S.加利錢, C.羅維特, M.帕林頓, A.佩迪察克, L.拉德文伊, D.辛－桑胡 申請人:圣諾菲·帕斯圖爾有限公司