專利名稱：免疫球蛋白級分及其方法
技術領域：
本發明涉及用作食品添加劑的含有IgA的組合物的制備。更具體地，本發明涉及制備富集IgA的乳制品提取物組合物的方法以及這樣的組合物。
背景技術：
根據以前在本領域作的工作理解本發明。然而，以下的討論并非承認或認可任何引用的材料在本申請的優先權日之前在澳大利亞被公開、使用或是作為公知常識的一部分。免疫球蛋白A(IgA)是在人的分泌物(包括乳汁)中主要的免疫球蛋白，其為機體提供抵抗病原體的保護，其結合到引起疾病的病毒、細菌、真菌及它們的毒素。IgA為嬰兒提供抵抗上述病原體的必需保護。當口服時IgA抗體是有效的，這是因為其抵抗腸內酶的降解，因此使得其理想地作為營養品(nutraceuticals)或食品補充劑。IgA可與益生菌聯用以抑制或降低由病原體引起的副作用。應用包括將IgA作為營養品成分以靶向病原體，所述病原體引起人粘膜表面例如鼻、眼、耳、肺、乳房部和陰道的感染。此外，含有IgA的產品適于腸和口部健康應用。由于通常存 在于牛奶中的IgA水平低，以商業規模提高IgA產量的現有方法是通過免疫方案以提高牛奶中的水平。典型地，牛奶包含比率為約1: 8的IgA 和 IgG0目前在全世界以實際上相同的方式使用實質上相同的方法生產用于食品消費的含有IgA的組合物。最常見的生產方法被稱為超免疫法，借助此法給大量的牛施用致免疫物質(例如病毒)以產生超免疫應答。作為超免疫應答的結果，由賦予免疫性的牛產生的牛奶含有增加量的IgA，也稱為“超免疫奶”。然后使用標準的膜技術濃縮所述超免疫奶以產生含有約5% w/w IgA的乳產品提取物，所述提取物可用作食品補充劑，例如嬰兒配方奶。該生產超免疫奶的方法的固有問題在于，免疫法方案通常需最多達三個月在牛內產生超免疫應答，并且還需一個月收獲足夠數量的超免疫奶以生產商業數量的含有IgA的乳產品提取物。另外，與本發明的方法相比，此方法還是昂貴的。由于可變的糖基化，IgA具有在約4.5-6.5范圍內的酸性等電點或pl，通常認為其不能以具有商業價值的量吸附到陽離子交換樹脂上。本發明的方法令人驚奇地使得可以通過調節裝載和洗脫條件，通過陽離子交換色譜從乳產品(例如脫脂乳)中分級IgA。這樣的方法以前還未以商業規模實現。此外，本發明的方法還可包括在純化乳產品的其它組分(例如乳鐵傳遞蛋白、乳過氧化物酶或生長因子)的現有方法中，作為其一部分。此方法的一個實例是其中乳產品與陽離子交換樹脂接觸，隨著流動相離子強度的增加，通過依次洗脫，首先洗脫富集IgA的級分，隨后是貧IgA的乳過氧化物酶級分，然后是乳鐵傳遞蛋白級分。
發明內容
本發明涉及制備富集IgA的乳產品提取物組合物的方法，其不需要超免疫牛并因此避免了與此相關的時間和成本。因此，本發明的目的在于提供富集IgA的乳產品提取物組合物以及其方法，所述方法可以以商業規模使用，其克服了現有技術中的至少一些缺點。術語“富集IgA的”意為在洗脫的乳產品提取物中IgA: IgG的比率與在分級之前的乳產品中的IgA: IgG的比率相比增加。根據本發明的一個方面，提供了制備富集IgA的乳產品提取物組合物的方法，所述組合物包含從乳產品中提取的IgA和IgG，其中IgA與IgG的相對含量與乳產品中IgA與IgG的相對含量相比升高，所述方法包括:提供:乳產品源；陽離子交換樹脂；和流動相；使乳產品與陽離子交換樹脂接觸，使得IgA與IgG相比優先吸附在陽離子交換樹月旨上;用流動相洗脫所述陽離子交換樹脂；以及收集洗脫的富集IgA的級分。對本領域的技術人員而言，顯而易見的是:在富集IgA的乳產品提取物組合物的制備中，所述乳產品不必局限于全牛奶，而是其它乳產品也可用作原料。在本發明的另一方面中，提供一種方法，其中所述乳產品選自全乳、脫脂乳、乳清和初乳。生產富集IgA的乳產品提取物組合物的特定條件可以變化，并仍產生富集IgA的級分。因此，在本發明一個優選的方面中，提供一種方法，其中采用含有0.05-0.4MNaCl (0.29-2.34% w/v)或等同離子強度、優選 0.08-0.35MNaCl (0.47-2.05% w/v))、更優選約0.17M NaCl (1% w/v)或等同離子強度的流動相進行洗脫。在替代方案中，可以使用其它合適的等同離子強度的流動相溶液。在本發明的另一方面中，流動相的pH為4.5-9，優選5.5-7.5，最優選pH約6.5。在本發明的另一方面中，在所述接觸步驟期間，所述乳產品吸附于陽離子交換柱的流量可為6-90升每升樹脂每小時(h)(線性流速60-900cm/h)。優選地，使用的流量為6-70升每升樹脂每小時(h)(線性流速60-700cm/h)，更優選為6-40升每升樹脂每小時(h)(線性流速60-400cm/h)。在這些流量下，已發現對于IgA的最佳分級,與陽離子交換樹脂接觸的乳產品的量為約16-300柱(床)體積，優選16-200柱體積，更優選16-40柱體積。在本發明的另一方面，在洗脫富集IgA的級分之前，用低離子強度的緩沖液(< 0.008M的鹽或其等同物)或水清洗陽離子交換樹脂，以除去殘留在柱中的乳產品。此外，在本發明中可使用不同類型的陽離子交換樹脂，其中優選Sepharose陽離子交換樹脂珠，例如SP Sepharose Big Beads。進一步優選的是粒徑范圍為45-300 μ m的樹脂珠。在本發明的另一方面中，提供一種方法，其中陽離子交換樹脂包括Sepharose珠，優選在45-300 μ m的粒徑范圍內。本發明的方法 可作為連續方法或作為分批方法使用，優選連續方法。隨后可處理洗脫的富集IgA的級分以降低其中的鹽含量。脫脂乳含有約1-2.5%的IgG w/w和0.05-0.1 %的IgA w/w,牛血清含有20%的IgG w/w和0.4%的IgA w/w。發明人發現，采用本發明的方法獲得的乳產品提取物濃縮物(洗脫物)令人驚奇地含有比預期更低水平的IgG w/w，其中IgA: IgG的比率通常在I: 2的級別上，這等同于IgA濃縮了八至十六倍。使用ELISA(酶聯免疫吸附法)試劑盒進行IgA和IgG的定量。對于那些想要在食品物質中提供增加的IgA水平或作為營養品的人來說，IgA: IgG比率的增加具有重要的意義。之前未知在陽離子交換色譜洗脫物中IgA的存在和IgA與IgG的相對量(比率)。因此，本發明的另一方面提供一種方法，其中所得的富集IgA的乳產品提取物組合物包含至少1: 8的IgA: IgG比率，優選1: 4，更優選至少1: 2。可進一步處理富集IgA的乳產品提取物組合物，以減少存在的非IgA蛋白質的量。這可通過膜過濾、柱色譜、透析或其它已知的方法實現。對于標準化的食品物質或營養品的生產而言，這些無關蛋白質的去除可以認為是重要的。在本發明的另一方面中，提供富集IgA的乳產品提取物組合物，其中IgA: IgG的比率至少為1: 8，優選為1: 4，更優選為至少1: 2。根據本發明的另一方面，提供通過本發明的方法得到的富集IgA的乳產品提取物組合物。此外，本發明的乳產品提取物可被用作食品物質或營養品，優選作為嬰兒食品物質或營養品。本發明的結果尤其令人驚奇，因為認為免疫球蛋白屬于具有酸性等電點的一類蛋白質，因此不大可能保留在陽離子樹脂上，或以與IgG相比優先結合IgA的方式保留在陽離子樹脂上。應當理解，本文描述的本發明不應當限于公開特征的具體實施例。
圖2A-2C-洗脫劑的鹽濃度和流量對IgA洗脫的影響。圖3A-3E-與陽離子交換樹脂接觸的乳產品體積的影響。圖4A-4C-與陽離子交換樹脂接觸的脫脂乳產品體積的影響。圖5A-5D-流動相pH對洗脫的IgA組成的影響。圖6A-6C-來自乳清蛋白濃縮物(WPC)的IgA純化。圖7A-7E-分離富集IgA的級分、乳鐵傳遞蛋白和乳過氧化物酶的方法；流動相離子強度對不同級分中IgA的影響。
具體實施例方式以下是對制備本發明的富集IgA的級分的詳細描述。
IgA的合適來源可包括乳產品，例如來自哺乳動物例如人、牛、綿羊、山羊、母豬等的全乳、脫脂乳、乳清或初乳。在使乳產品與陽離子交換樹脂接觸以使IgA吸附時，乳產品的PH優選約為6.5，盡管對于本發明不必調節乳產品的pH。用于使乳產品與陽離子交換樹脂接觸的流量可在大的范圍內變化，例如從6-90升每升樹脂每小時(線性流速60-900cm/h)，優選6_70升每升樹脂每小時(線性流速60-700cm/h),更優選約6_40升每升樹脂每小時(線性流速60-400cm/h)。通過用于工業過程的成本有效性確定下限，從而在非常低的流量下，運行此方法的成本超過了回報。高流量適于IgA的純化，前提是與樹脂接觸的乳產品的總量是有限的。當大大超過樹脂體積的乳產品體積適于純化其它乳產品例如乳過氧化物酶和乳鐵傳遞蛋白時，如在澳大利亞專利n0.613688中所描述的，本發明人已發現乳產品體積相對于樹脂體積在1000級別上的柱體積(升乳產品每升樹脂)不適合通過本發明的方法進行IgA的純化。發明人發現，乳產品體積相對于樹脂體積超過約400的柱體積，導致很少的IgA結合到樹脂，并且相對于起始原料中的IgG，回收的IgA不會富集。根據本發明，在脫脂乳的情況下，優選的上限為約300柱體積，優選約200柱體積，最優選約34柱體積。隨著乳產品相對于樹脂的比率增加，結合的IgA的數量和洗脫的IgA的純度逐漸降低。至于流量，下限通過商業因素而非與柱相關的因素設定。如果裝載的乳產品的體積下降大幅低于16柱體積，則達到清洗和洗脫時間超過可純化足夠的IgA以使得此方法經濟上可行的點。在將乳產品裝載到陽離子交換樹脂的步驟之后，且在用流動相洗脫IgA之前，可通過用水或離子強度小于例如0.0086M氯化鈉的緩沖液清洗柱來除去陽離子交換柱內的未結合的乳產品。在洗脫吸附的IgA時，使用由緩沖溶液組成的流動相，所述緩沖溶液具有0.086-0.4M的氯化鈉、氯化鉀或等同的低離子強度。不限制在流動相中使用的鹽的類型。隨著離子強度增加超過0.4，IgA的純度降低，這是因為非IgA蛋白質開始洗脫，因此其它蛋白質稀釋了 IgA。優選地 ，使用等同于或小于0.35M氯化鈉的離子強度。流動相可具有寬范圍的pH，例如4.5-9.0，優選5.5-7.5，最優選約6.5。在上限和下限處，蛋白質穩定性和蛋白質與陽離子交換樹脂結合的能力均受影響。5.5-7.5的pH提供最高的IgA純度，同時不降低產率。在本發明中，適于吸附IgA的陽離子交換樹脂的類型可包括例如為Sepharose陽離子交換樹脂珠的樹脂。例如，分別含有磺丙基官能團和羧甲基基團的SP Sepharose BigBeads和CM Sepharose珠(GEHealthcare的產品)是合適的。陽離子交換樹脂珠的粒徑優選在45-300 μ m的范圍內。根據本發明，在45-165 μ m范圍內和在100-300 μ m范圍內的SP Sepharose珠都適合用于IgA的吸附和純化。可對富集IgA的乳產品提取物組合物進行的進一步處理之一是通過例如透析或超濾進行脫鹽。可對富集IgA的乳產品提取物組合物進行的另一種處理是除去非IgA蛋白。可通過進一步的色譜法(例如免疫吸附或體積排阻)除去非IgA蛋白。本發明的富集IgA的乳產品提取物組合物可用作食品物質或營養品，優選用作嬰兒食品物質或營養品。可在分離中進行本發明的方法以制備富集IgA的乳產品提取物組合物，或可以引入本發明的方法作為完整的分級方法的一部分，在所述完整的分級方法中，分級其它所需的乳產品提取物。制備富集IgA的級分和貧IgA級分的方法本發明一個優選的方法是用大于45 μ M(理想地為90-300 μ Μ)的SP (磺丙基)瓊脂糖凝膠裝填IOcm高的柱。以Ilml/分鐘(線性流速331cm/h或0.55柱體積(CV)/分鐘)，向柱中加入乳產品(理想地為脫脂乳)流直到上柱的乳的體積為裝填到柱中的樹脂體積的134.6倍。以2.5CV的低離子強度(< 0.05% (0.0086M)NaCl或等同物)的緩沖液或3.5ml/分鐘(線性流速147cm/h或0.25CV/分鐘)的水去除保留在柱中的乳10分鐘。通過以3.5ml/分鐘(線性流速102cm/h或0.175CV/分鐘)流過陽離子溶液20分鐘，用
3.5CV的含有等于1% (0.171M) NaCl的鈉離子的pH 6.5的緩沖液，將富集IgA的級分從柱中洗脫。排出棄去最初的3分鐘(0.5CV)，收集其后的20分鐘(3.5CV)作為富集IgA的級分(包括3分鐘
與下一緩沖液應用時間的重疊，即穿透時間)。通過以3.5ml/分鐘(線性流速102cm/h或0.175CV/分鐘)流過陽離子溶液20分鐘，用3.5CV的含有等同于8.75% (1.5M)NaCl的鈉離子的緩沖液，將剩余的蛋白質(貧IgA級分)從柱中洗脫。排出棄去最初的3分鐘(0.5CV)，收集其后的20分鐘(3.5CV)作為貧IgA級分(包括3分鐘
與下一緩沖液應用時間的重疊，即穿透時間)。通過超濾膜或等同物過濾回收的蛋白質級分以脫鹽。對本領域的技術人員而言，很清楚可將此IgA分級方法放大用于商業用途。制備三種級分(富集IgA的級分、貧IgA的乳過氧化物酶和乳鐵傳遞蛋白)的方法本發明進一步優選的方法是用大于45 μ M(理想地為90-300 μ Μ)的SP (磺丙基)瓊脂糖凝膠裝填IOcm高的柱。以Ilml/ 分鐘(線性流速331cm/h或0.55CV/分鐘)向柱中加入乳產品(優選地為脫脂乳)流直到上柱的乳的體積為裝填到柱中的樹脂體積的134.6倍。用2.5CV的低離子強度(< 0.008M的NaCl或等同)的緩沖液或水以3.5ml/分鐘(線性流速147cm/h或0.25CV/分鐘)去除保留在柱中的乳10分鐘。通過以3.5ml/分鐘(線性流速102cm/h或0.175CV/分鐘)流過陽離子溶液20分鐘，用3.5CV的含有相當于I %(0.171M)NaCl的鈉離子的pH 6.5的緩沖液，將富集IgA的級分從柱洗脫。排出棄去最初的3分鐘(0.5CV)，收集其后的20分鐘(3.5CV)作為富集IgA的級分(包括3分鐘
與下一緩沖液應用時間的重疊，即穿透時間)。通過以3.5ml/分鐘(線性流速102cm/h或
0.175CV/分鐘)流過陽離子溶液20分鐘，用3.5CV的含有相當于2.5% w/v (0.43M)的NaCl的鈉離子(盡管其它陽離子也將是適合的)的緩沖液，將貧IgA的乳過氧化物酶級分從柱中洗脫。排出棄去最初的3分鐘(0.5CV)，收集其后的20分鐘(3.5CV)作為貧IgA的乳過氧化物酶級分(包括3分鐘
與下一緩沖液應用時間的重疊，即穿透時間)。通過以
3.5ml/分鐘(線性流速102cm/h或0.175CV/分鐘)流過陽離子溶液20分鐘，用3.5CV的含有相當于8.75% (1.5M)NaCl的鈉離子的緩沖液，將乳鐵傳遞蛋白級分從柱中洗脫。排出棄去最初的3分鐘(0.5CV)，收集其后的20分鐘(3.5CV)作為乳鐵傳遞蛋白級分(包括3分鐘
與下一緩沖液應用時間的重疊，即穿透時間)。通過超濾膜或等同物過濾回收的蛋白質級分以脫鹽。對本領域的技術人員而言，應當清楚可將此IgA分級方法放大用于商業用途。以下通過參考實施例，對本發明進行描述。
實施例1:由脫脂乳制備富集IgA的級分在一個根據本發明優選的方法中，在連續過程中以22升每升樹脂每小時的流量將脫脂乳裝載于每個床體積為29.7升的多個SPSepharose Big Beads陽離子交換樹脂柱中，總共134.6柱體積。然后以低離子強度緩沖液(水)清洗柱,并用由0.3M NaCl組成的PH6.5的流動相洗脫。收集洗脫的富含IgA的級分并透析以降低鹽含量。通過ELISA分析洗脫級分的免疫球蛋白含量，發現含有4.7% w/w的IgA，并且IgA: IgG的比率為約I: 2(表I)。然后可將分級的富集IgA的乳產品提取物組合物凍干并儲存在15°C的穩定狀態下。表1:通過ELISA分析的各種動物產品中IgA: IgG的相對量
權利要求
1.種制備富集IgA的牛乳產品提取物組合物的方法，所述方法包括: 提供: 選自全乳、脫脂乳和乳清的乳產品源； 包括Sepharose珠的陽離子交換樹脂；和 含有0.05-0.35M即0.29-2.05% w/v NaCl或等同離子強度的流動相； 使16-300柱體積的所述乳產品與所述陽離子交換樹脂接觸； 用所述流動相從所述陽離子交換樹脂洗脫富集IgA的級分；和 收集洗脫的富集IgA的級分， 其中所述組合物中IgA與IgG的相對含量為至少1: 4。
2.據權利要求1的方法，其中與所述陽離子交換樹脂接觸的所述乳產品的量是16-40柱體積。
3.據權利要求1或2的方法,其中所述Sepharose珠在45-300μ m的粒徑范圍內。
4.據權利要求1的方法，其中用含有0.17M即I % w/v的NaCl或等同離子強度的流動相進行洗脫。
5.據權利要求1或2的方法，其中在洗脫富集IgA的級分之前，以低離子強度即< 0.008M的鹽或其等同物的緩沖液或水清洗所述陽離子交換樹脂以除去保留在柱中的未結合乳產品。
6.據權利要求1或2的方法，其中用pH在5.5-7.5范圍內的流動相進行洗脫。
7.據權利要求1或2的方法，其中在所述乳產品與所述樹脂接觸的步驟期間，所述陽離子交換樹脂經受6-90升每升樹脂每小時的流量。
8.據權利要求7的方法，其中所述接觸流量為6-70升每升樹脂每小時。
9.據權利要求7的方法，其中所述接觸流量為6-40升每升樹脂每小時。
10.據權利要求1或2的方法，其中所述方法為連續方法或分批方法。
11.據權利要求1或2的方法，其中所述方法為連續方法。
12.據權利要求1或2的方法，由其得到的富集IgA的乳產品提取物組合物包含至少1: 2 的 IgA:1gG 比率。
13.據權利要求1或2的方法，由其得到的富集IgA的乳產品提取物組合物包含至少10% w/w 的 IgA 含量。
14.據權利要求13的方法，由其得到的富集IgA的乳產品提取物組合物包含至少20% w/w 的 IgA 含量。
15.據權利要求1或2的方法，其中進一步處理富集IgA的乳產品提取物組合物，以減少存在的非IgA蛋白質和/或鹽的量。
16.種通過權利要求1的方法獲得的來自全乳、脫脂乳或乳清的富集IgA的牛乳產品提取物組合物，其中IgA與IgG的比率為至少1: 4，并且IgA含量為至少10%。
17.利要求16的富集IgA的牛乳產品提取物組合物，其中IgA與IgG的比率為至少I: 2。
18.利要求16的富集IgA的牛乳產品提取物組合物，其中IgA含量為至少20%w/w。
19.利要求16至18中任一項的富集IgA的乳產品提取物組合物用于制備食品物質或營養品的用途。
20.據權利要求19的用途，其中所述食品物質或營養品為嬰兒食品物質或營養品。
21.利要求16至18中任一項的富集IgA的乳產品提取物組合物在制備用于治療或預防由病毒、細菌、真菌及它們的毒素引起的疾病的藥物中的用途。
22.利要求16至18中任一項的富集IgA的乳產品提取物組合物用于制備靶向病原體的營養品成分的用途，所述病原體引起人粘膜表面的感染。
23.利要求16至18中任一項的富集IgA的乳產品提取物組合物用于制備靶向病原體的營養品成分的用途，所述病原 體引起鼻、眼、耳、肺、乳房和陰道的感染。
全文摘要
本發明涉及用作食品添加劑的含有IgA的組合物的制備。更具體地，本發明涉及制備富集IgA的乳制品提取物組合物的方法以及這樣的組合物。
文檔編號A61P31/10GK103087188SQ20131000939
公開日2013年5月8日 申請日期2006年5月10日 優先權日2005年5月10日
發明者安德魯·布朗, 彼得·霍布曼, 理查德·佩因, 米歇爾·羅尼 申請人:墨累古爾本合作有限公司