用于治療變態反應的核酸的制作方法

用于治療變態反應的核酸的制作方法
【專利摘要】本發明提供用于治療變態反應的DNA疫苗。所述疫苗包含一種或多種變應原性表位、優選衍生所述表位的變應原性蛋白質的完整蛋白質序列的編碼序列，所述編碼序列與溶酶體相關膜蛋白(LAMP)的腔內域和LAMP的靶向序列框內融合。所述疫苗使得能遞呈正確構型的三維表位供產生免疫應答。所述疫苗可為多價分子，并且/或者可作為含有兩種或更多種DNA構建體的多價疫苗的一部分提供。
【專利說明】用于治療變態反應的核酸
[0001] 相關專利申請的交叉引用
[0002] 本專利申請依賴于2011年6月14提交的美國臨時專利申請No. 61/496, 866的公 開內容并且要求該臨時專利申請的權益，特此將該臨時專利申請的整個公開內容以引用的 方式并入本文。 【背景技術】 【技術領域】
[0003]
[0004] 本發明涉及分子生物學和醫學領域。更具體地講，本發明涉及用作DNA疫苗的核 酸以及將其用于治療遭受變態反應或易受變態反應影響的受試者的方法。
[0005] 相關領域的論沐
[0006] 變態反應是表征為產生對抗變應原（或引起變態反應的分子）的IgE抗體的超敏 反應性疾病。變態反應影響超過25%的人口。變態反應可通過許多途徑（包括呼吸道、皮 膚接觸、攝食、昆蟲叮咬或藥物注入）進入人體。
[0007] 變態反應疾病管理包括診斷和治療。變態反應學家使用多種技術，如皮膚點刺測 試、基于放射變應原吸附的技術、ELISA或激發測試來證明變應原特異性IgE以及來鑒定變 應原來源而診斷變態反應。變態反應的治療最通常分為兩類：回避和施與抗組胺劑。第三 種替代方法即變態反應免疫療法，其要求患者每周接受由小量攻擊性變應原組成的注射劑 以幫助免疫系統重新訓練（reeducate)其對變應原的應答。
[0008] 變應原融合蛋白的使用和產生是本領域所熟知的。例如，美國專利No. 7, 566, 456 教導了具有IgE和IgG結合域以及編碼變應原的融合蛋白。另外，WO 97/07218教導了供 在變態反應免疫療法中使用的變應原-抗CD32融合蛋白。然而，這兩篇文獻均沒有教導它 們各自的融合蛋白如何通過抗原遞呈而與T細胞相互作用來誘導或改變Thl應答。此外， 在引導含抗CD32的疫苗至樹突細胞到實現Thl細胞的正誘導之間沒有理論聯系。這兩篇 文獻均教導了一種組合物，該組合物在治療上引入一種變應原，使得該變應原可作為變應 原融合蛋白存在于血清中。
[0009] 已經由Toda等人（2002)確定，可將變應原的T細胞表位（在本例中是位于氨基 酸247-258處的Cry J2表位）附接至融合蛋白并且可用于進行變態反應特異性免疫療法。 Toda等人（2002)描述的特異性組合物是DNA疫苗的使用，該DNA疫苗編碼與II類相關恒 定鏈肽（CLIP)附接的Cry J2的主要⑶4 T細胞表位（位于氨基酸247-258)。CLIP含有 溶酶體/內體運輸序列并且含有結合至MHC II的肽結合槽的域。Toda等人（2002)顯示， 用Cry J2肽/CLIP DNA疫苗免疫導致使小鼠啟動主要的Thl應答，該應答表征為較高的 IFN-γ和IgG2a產生。然而，Toda等人沒有教導可用于進行變態反應特異性免疫療法的變 應原的整個蛋白質編碼序列的細胞內靶向。
[0010] 美國專利No. 6, 982, 326和美國專利No. 6, 090, 386描述了編碼日本柳杉 (Cryptomeria japonica)主要花粉變應原 Cry Jl、Cry J2、Jun s I 和 Jun V I 的核酸序 列以及其片段或肽。該發明還提供了在用編碼Cry Jl、Cry J2、Jun s I和Jun v I或其至 少一種片段、以及Cry Jl、Cry J2、Jun s I或Jun V I的片段或者其至少一種片段的核酸 序列轉化的宿主細胞中產生的純化的Cry Jl、Cry J2、Jun s I和Jun V I以及其至少一種 片段，以及合成制備的Cry Jl、Cry J2、Jun s I或Jun V I的片段。Cry Jl、Cry J2、Jun s I和Jun V I以及其片段被公開可用于診斷、治療和預防日本柳杉花粉癥。該發明還提供 Cry Jl和Cry J2的分離的肽。在該發明范圍內的肽包含Cry Jl或Cry J2的至少一個T 細胞表位，或者優選至少兩個T細胞表位。該發明還涉及經修飾的肽，該肽具有與對應的天 然存在的變應原或其部分相似的或增強的治療特性但具有減少的副作用。還提供了治療或 診斷個體中對日本柳杉花粉敏感的方法以及包含一種或多種該發明的肽的治療組合物和 多重肽制劑（multipeptide formulation)。該發明沒有教導如何將表位或變應原合并進具 有免疫刺激特性的DNA疫苗中。
[0011] 美國專利No. 7, 547, 440和美國專利No. 7, 112, 329通過用涵蓋日本扁柏（hinoki) 花粉變應原一級結構的重疊肽對建立自遭受日本扁柏花粉變態反應的患者的T細胞系進 行刺激，鑒定了日本扁柏花粉變應原分子上的T細胞表位位點。該肽可用于針對患有春天 樹木花粉癥的患者（包括與日本扁柏花粉有交叉反應性的日本扁柏花粉癥患者）的基于肽 的免疫療法。該肽還可用于診斷春天樹木花粉癥。該發明局限于診斷學和表位的多肽遞送。
[0012] DNA疫苗已發展為傳統的全細胞或全病毒疫苗的替代形式。一般而言，DNA疫苗 是經工程改造的核酸，其包含編碼一種或多種表位的序列。將該核酸遞送至細胞，通常是抗 原遞呈細胞（APC)，使該核酸表達，所表達的蛋白質上存在的表位在內體/溶酶體區室中加 工，并最終遞呈在細胞的表面上。授予August等人的美國專利No. 5, 633, 234公開并表征 了溶酶體相關膜蛋白（LAMP)的內體/溶酶體靶向序列。該專利鑒定了該蛋白質C端區域 中的關鍵殘基，該關鍵殘基對該蛋白質靶向至內體/溶酶體區室是必要的。該專利公開了， 抗原肽與C端LAMP靶向序列融合可為免疫應答的產生提供增強的表位加工和遞呈。
[0013] 此外，授予Harris等人的美國專利申請公開No. 2004/0157307公開了 LAMP腔內 域（lumenal domain)作為"運輸域"來引導由DNA疫苗表達的嵌合蛋白穿過一個或多個細 胞區室/細胞器如穿過溶酶體囊泡途徑的用途。該嵌合蛋白包括LAMP多肽的腔內域、包含 此前從抗原蛋白質鑒定和選擇的肽表位序列的抗原域、跨膜域和內體/溶酶體靶向序列。
[0014] 已提出將DNA疫苗作為變應性疾病的治療方法（Raz等人，1996 ;Hartl等人， 2004 ;Hsu等人，1996 ;Crameri 2007 ;Weiss等人，2006)。基本原理是，由DNA疫苗編碼的變 應原蛋白質將優先激活變應原特異性Thl細胞應答，伴隨著由APC、自然殺傷細胞（NK)和T 細胞產生干擾素，而不是激活特征性的Th2型應答，如IL-4、IL-5和IL-13的分泌，以及由 B淋巴細胞形成IgE和在晚期反應中嗜酸性粒細胞的成熟和募集。然而，Thl和Th2T細胞 表型的差異性誘導的根本機制看起來涉及大量的因素，例如疫苗制劑的細菌DNA的獨特性 質（如未甲基化的和CpG DNA殘基）、由先天免疫引起的細胞因子環境和變應原的細胞運輸 特性（Chen等人，2001 ;Kaech等人，2002)。尚沒有發明或方法成功地解決通過遞送編碼變 應原的核酸所進行的變態反應治療的不確定性。因而，至今尚未實現這樣一種變態反應治 療方法。此外，施用DNA疫苗用于治療變應性疾病已導致變應原肽分泌進細胞外環境，從而 有可能導致通過激活IgE而意外地誘導變應性應答。
【發明內容】

[0015] 本發明提供編碼變應原性蛋白質、變應原性多肽和變應原性肽的核酸（本文也稱 為"構建體"）。該核酸設計用于遞送至免疫細胞以及在那些細胞中產生變應原性蛋白質、 多肽和肽。所編碼的蛋白質、多肽和肽具有靶向序列，用于將該蛋白質靶向至MHC-II區室 供一種或多種表位的加工和展不，從而導致對所述表位的免疫應答。一般而言，該核酸包含 以下域，所述域與所編碼的蛋白質的各個域相關：信號序列域；細胞器內穩定化域；變應原 域；跨膜域；和胞質溶酶體/內體靶向域。
[0016] 在編碼的蛋白質的語境中，提供信號序列來將所編碼的蛋白質引導至內質網或溶 酶體。細胞器內穩定化域是設計為耐受蛋白水解的并且設計用于保護蛋白質的其余部分 (尤其是變應原域）免于在加工供細胞進行表位遞呈之前被降解的序列。在示例性的實施 例中，細胞器內穩定化域是LAMP-I的腔內域。變應原域包含一種或多種變應原性表位的序 列，所述變應原性表位可用來在所述表位在其中遞呈的動物中引起免疫應答。通常，變應原 域包含一種或多種變應原蛋白質，但在一些實施例中，可使用變應原性蛋白質的免疫原性 多肽或肽片段。在下文論述的示例性實施例中，表位是植物變應原的表位。在本發明的編 碼的蛋白質中，變應原域不包括信號肽，例如作為變應原蛋白質的一部分天然存在的信號 肽。變應原域可包含單種變應原性蛋白質、多肽或肽，或者可包含兩種或更多種變應原性蛋 白質、多肽或肽。若存在兩種或更多種變應原，則每種變應原可來自相同的物種/來源或者 一種或多種可來自一種或多種不同的來源。若存在兩種或更多種變應原，則它們可協同表 達以在所表達的蛋白質中提供相等拷貝數的每種編碼區。跨膜域可以是適于引導蛋白質插 入膜和穿過膜運輸的任何序列。許多這類序列是本領域已知的或者可容易地設計。溶酶體 /內體靶向域可以是能夠將肽引導至溶酶體或內體的任何序列。這類序列是本領域已知的 并且在本文中通過LAMP-I的胞質尾部序列示例。
[0017] 如上文所提及的，在優選的實施例中，該核酸包含變應原域，該變應原域包括變應 原性蛋白質的整個變應原性編碼序列，但缺少變應原的信號序列的編碼序列。在一些實施 例中，本發明的核酸不包含整個變應原性編碼序列，而是僅包含足夠量的該編碼序列而使 得所編碼的多肽在表達時能夠折疊而實現該多肽上存在的至少一個表位的天然三維結構。 如在包含整個變應原編碼序列的構建體中，若存在短于整個編碼序列，則該核酸構建體還 缺少變應原性多肽或肽的天然存在的信號肽的編碼序列。
[0018] 在優選的實施例中，核酸構建體在變應原域中包含多個變應原性蛋白質、多肽和/ 或肽的編碼序列。存在的每個變應原可來自相同來源，每者來自不同來源，或它們的任何組 合。
[0019] 本發明的核酸，以及因而所編碼的蛋白質、多肽和肽可用于治療遭受變態反應或 潛在發展變態反應的受試者，尤其是動物受試者的方法中。一般而言，根據本發明的治療方 法包括將本發明的核酸以足以將所述核酸遞送至免疫系統的一種或多種免疫細胞，并且優 選遞送至一種或多種抗原遞呈細胞（APC)的量施用給受試者。一旦遞送，所述核酸就表達， 所編碼的蛋白質在細胞內進行加工，并且表位展示在細胞的表面上。該治療方法可認為是 使用核酸和蛋白質來提供治療性或預防性免疫應答的方法。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1是根據本發明的一個實施例的核酸的示意圖，其中在變應原域中提供包含單 個表位的單個抗原。
[0021] 圖2示出了根據本發明的核酸的載體圖譜，其中變應原域包含在人LAMP N-端序 列（SS和ISOD)和人LAMP C-端序列（TM和TG)之間插入的CryJ2變應原（來自日本柳杉 的變應原），但沒有信號序列。
[0022] 圖3為根據本發明的一個替代實施例的核酸的示意圖，其中在變應原域中提供單 一變應原的多個表位序列。
[0023] 圖4為根據本發明的一個替代實施例的核酸的示意圖，其中在變應原域中提供多 個不同的變應原序列。
[0024] 圖5示出了根據本發明的核酸的載體圖譜，其中變應原域包含變應原CryJl (來 自日本柳杉的變應原）和變應原CryJ2(來自日本柳杉的變應原）的變應原序列（無信號 肽）。
[0025] 圖6A示出了在變應原域中包括三個花生變應原（AraHl、AraH2和AraH3,都缺少 信號序列）的核酸的載體圖譜。
[0026] 圖6B示出了由圖6A的核酸編碼的蛋白質的示意圖。
[0027] 圖7示出了根據本發明的核酸的載體圖譜，繪出了缺少CryJl變應原序列的天然 存在的信號序列。該特定構建體用于下文詳細描述的實驗中以顯示移除變應原序列的天然 信號序列的重要性。
[0028] 圖8示出了不被本發明涵蓋的核酸構建體的載體圖譜，其中CryJ2變應原在質粒 骨架上編碼，但是缺少SS、IOS、TM和TG域。該構建體在下文詳細描述的實驗中用作比較對 照。
[0029] 圖9示出了蛋白質印跡，其繪出了根據本發明的構建體在293細胞中的表達。分 圖A示出了當用抗CryJ2抗體測定時，根據本發明的構建體中的CryJl-CryJ2組合變應原 (見圖5)和單獨的CryJ2變應原（見圖2)的表達。分圖B示出了當用抗CryJl抗體測定 時，CryJl-CryJ2組合變應原和CryJl變應原（缺少其天然的信號序列；見圖7)的表達。分 圖B還顯示，在其中未移除CryJl變應原的天然信號序列的構建體（載體圖譜未示出）中 CryJl變應原的表達是不可檢測的。
[0030] 圖10示出了線圖，該圖繪出了根據本發明的核酸構建體與包含變應原序列的其 他構建體相比的效力。分圖A顯示，與包含與CryJ2編碼序列融合的質粒骨架的構建體（見 圖8)相比，由于施用本發明的CryJ2-LAMP構建體（見圖2)而見到IgGl產量和檢測值的 顯著增加。分圖B顯示，與包含與CryJ2編碼序列融合的質粒骨架的構建體（根據分圖A) 相比，由于施用本發明的CryJ2-LAMP構建體（根據分圖A)而見到IgG2a產量和檢測值的 顯著增加。
[0031] 圖11繪出了條形圖，該圖示出了 CryJ2-LAMP構建體在小鼠中的劑量效應。分圖A 繪出了與單獨注射載體DNA相比，在以10 μ g至100 μ g范圍的多種量注射DNA疫苗后21天 和28天時的IgG2a檢測值。分圖B繪出了與單獨注射載體DNA相比，在以IOyg至IOOyg 范圍的多種量注射DNA疫苗后21天和28天時的IgGl檢測值。
[0032] 圖12繪出了條形圖，該圖示出了與單獨的載體相比，用本發明的CryJ2-LAMP構建 體處理的小鼠脾臟培養物中IL-4和IFN-γ的誘導效果。分圖A示出了 IL-4的效果。分 圖B示出了 IFN-γ的效果。
[0033] 圖13繪出了線圖，該圖顯示了用CryJ2-LAMP DNA疫苗免疫先前致敏的小鼠的效 力。分圖A示出了隨時間推移的IgGl滴度。分圖B示出了隨時間推移的IgG2a滴度。
[0034] 圖14繪出了條形圖，該圖示出了小鼠脾細胞培養物中IFN-g(分圖A)和IL_4(分 圖B)的誘導。
[0035] 圖15繪出了條形圖，該圖示出了免疫的小鼠中循環CryJ2蛋白的定量。
[0036] 圖16繪出了豚鼠數據的條形圖，該圖示出了用CryJ2-LAMP構建體免疫且用重組 CryJ2攻擊的豚鼠的IgGl檢測值（分圖A)和IgG2檢測值（分圖B)。
[0037] 圖17繪出了條形圖，該圖示出了在85天毒理學GLP安全性研宄期間用 CryJ2-LAMP DNA疫苗免疫的新西蘭白兔中的抗CryJ2應答。
[0038] 圖18繪出了蛋白質印跡，其示出了來自根據本發明的構建體的花生變應原H1、H2 和H3的共表達。 【具體實施方式】
[0039] 現在將詳細參考本發明的各個示例性實施例。應當理解，下面對示例性實施例的 論述無意于限制本發明，而是在本文中廣義地公開。相反，提供下面的論述以使讀者對本發 明的某些方面和特征有更詳細地理解。除非另外指明，否則本發明的實踐采用本領域技術 人員技術范圍內的常規分子生物學、微生物學和重組DNA技術。這類技術充分解釋于這些 領域中的普通技術人員已知的文獻中，因而不需要在本文中詳細描述。同樣，關于醫學治療 的本發明實踐遵循本領域已知的標準方案，并且那些方案不需要在本文中詳細描述。
[0040] 在詳細描述本發明的實施例之前，應當理解本文所用的術語僅是為了描述特定實 施例的目的，而無意于限制。另外，若提供了值的范圍，則應該理解，除非上下文另有明確規 定，否則也具體公開了該范圍上限和下限之間的每個居間的值，至下限的十分之一個單位。 任何聲明的值之間的每個較小的范圍或聲明的范圍中的每個居間的值以及該聲明的范圍 中的任何其他聲明的或居間的值涵蓋于本發明內。這些較小的范圍的上限和下限可獨立地 包括或排除在該范圍內，并且其中限值中的一者、二者包括在該較小范圍中或者限值中的 二者均不包括在該較小范圍中的每個范圍也涵蓋于本發明內，所聲明范圍中的任何具體排 除的限值除外。若所聲明的范圍包括限值中的一者或二者，則排除了那些包括的限值中的 一者或二者的范圍也包括在本發明中。因而應當理解，若給出了值的范圍，則該范圍內的每 個值，以及落入該范圍內的每個范圍也被固有地敘述，并且不對每個值以及每個可能的值 的范圍進行具體敘述不是忽略那些值和范圍，而是方便讀者以及為了本公開簡潔起見。
[0041] 除非另外限定，否則本文所用的所有技術和科學術語具有與所述術語所屬領域的 普通技術人員通常所理解的含義相同的含義。盡管與本文所述的材料和方法類似或等同的 任何方法和材料均可用于實踐或測試本發明，但現在描述優選的方法和材料。本文提及的 所有出版物以引用的方式并入本文以結合所述出版物引用的方法和/或材料公開和描述 方法和/或材料。當本公開與任何并入的出版物沖突時以本公開為準。
[0042] 如本文和所附權利要求中所用，單數形式"一個"、"一種"和"該"包括多個指代物， 除非上下文另有明確規定。因而，例如，提及"變應原"包括多個這種變應原，并且提及"該 樣品"包括提及一個或多個樣品以及其本領域技術人員已知的等同物，等等。此外，使用可 用等同術語描述的術語包括使用那些等同術語。因而，例如，使用術語"受試者"應該理解 為包括術語"動物"、"人"和本領域用于指經受醫學治療者的其他術語。
[0043] 如本文所用，術語"包含"旨在意指構建體、組合物和方法包括所述的元素和/或 步驟，但不排除其他元素和/或步驟。"基本上由…組成"在用于限定構建體、組合物和方法 時，意指排除任何對所述構建體、組合物和方法具有重要意義的其他元素和步驟。因而，基 本上由本文所限定的元素組成的組合物將不排除來自分離和純化方法的痕量污染物和藥 學上可接受的載體，如磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等等。"由…組成"意指排除衡量元素之外的 其他成分以及施用本發明組合物的基本方法步驟。由這些過渡術語每一者限定的實施例在 本發明的范圍內。
[0044] "嵌合DNA"是較大DNA分子中可鑒定的DNA區段，該DNA區段在天然條件下不與 該較大分子相關聯存在。因而，當嵌合DNA編碼蛋白質區段時，該區段編碼序列的旁側將為 在任何天然存在的基因組中不處于該編碼序列旁側的DNA。在旁側DNA編碼多肽序列的情 形中，所編碼的蛋白質稱為"嵌合蛋白"（即具有非天然存在的融合在一起的氨基酸序列的 蛋白質）。等位變異或天然存在的突變事件不會產生本文所定義的嵌合DNA或嵌合蛋白。
[0045] 如本文所用，術語"多核苷酸"和"核酸分子"可互換使用來指任何長度的核苷酸聚 合形式。多核苷酸可含有脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它們的類似物。核苷酸可具 有任何三維結構，并且可執行任何已知的或未知的功能。術語"多核苷酸"包括例如單鏈、 雙鏈和三螺旋分子、基因或基因片段、外顯子、內含子、mRNA、tRNA、rRNA、核糖酶、反義分子、 cDNA、重組多核苷酸、支鏈多核苷酸、適體、質粒、載體、分離的任何序列的DNA、分離的任何 序列的RNA、核酸探針和引物。核酸分子還可包含經修飾的核酸分子（如包含經修飾的堿 基、糖和/或核苷酸間連接）。
[0046] 如本文所用，術語"肽"是指兩個或更多個亞單元氨基酸、氨基酸類似物或模擬肽 的化合物。亞單元可通過肽鍵或通過其他鍵（如，作為酯、醚等）連接。術語"肽"在本文 中一般用來指肽（即2至約20個殘基的多聚氨基酸）、多肽（即約20個殘基至約100個殘 基的肽）和蛋白質（即具有約100個或更多個殘基的肽）。
[0047] 如本文所用，術語"氨基酸"是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘 氨酸以及D或L光學異構體二者，以及氨基酸類似物和模擬肽。如果肽鏈短的話，三個或更 多個氨基酸的肽通常稱為寡肽。雖然術語"蛋白質"涵蓋術語"多肽"，但"多肽"可以為短 于全長的蛋白質。
[0048] 術語"變應原"是指任何天然存在的蛋白質或蛋白質的混合物，所述蛋白質或蛋白 質的混合物已據報道在它們重復暴露于個體時誘導變應性反應，即IgE介導的反應。變應 原是能夠引起變應性反應的任何化合物、物質或材料。變應原通常理解為一亞類抗原，該亞 類抗原為能夠引起免疫應答的化合物、物質或材料。為了實施本發明，變應原可尤其選自天 然的或原本的變應原、經修飾的天然變應原、合成的變應原、重組變應原、類變應原以及它 們的混合物或組合。特別要關注的是能夠引起IgE介導的速發型超敏反應的變應原。
[0049] 天然存在的變應原的例子包括花粉變應原（如樹、雜草、藥草和青草花粉變應 原）、螨蟲變應原（來自例如屋塵螨類和倉儲螨類）、昆蟲變應原（如吸入物、唾液和毒液起 源的變應原）、來自例如動物（如狗、貓、馬、大鼠、小鼠等）的唾液、毛發和皮肩的動物變應 原、真菌變應原和食物變應原。變應原可以是以下形式：變應原提取物、純化的變應原、經修 飾的變應原或重組變應原或重組突變體變應原、超過30個氨基酸的變應原片段或它們的 任何組合。
[0050] 就它們的化學或生物化學性質而言，變應原可代表天然的或重組的蛋白質或肽、 天然的或重組的蛋白質或肽的片段或截短形式、融合蛋白、合成的化合物（化學變應原）、 模擬變應原的合成化合物、或通過化學或物理方法變更的變應原如通過熱變性修飾的變應 原。
[0051] 可通過若干測試將變應原歸類為主要變應原。如果至少25%的患者顯示出強 的IgE結合（3分）并且至少50%的患者顯示出中等結合（2分），則變應原通常歸類 為主要變應原，其中所述結合通過CRIE(交叉放射免疫電泳（Crossed Radio Immune Electrophoresis))測定（CRIE強結合，即一天后X射線膠片上可見的IgE結合；CRIE中等 結合，即3天后出現的結合；CRIE弱結合，S卩10天后出現的結合）。至少10 %的患者為強 IgE結合將變應原歸類為中等變應原，不到10 %的患者為明顯地特異性結合將變應原歸類 為次要變應原。其他方法也可用于測定IgE結合，例如IgE印跡法。
[0052] "表位"是一結構，通常由短的肽序列或寡糖構成，其被免疫系統的組分特異性識 別或特異性結合。T細胞表位已總體顯示為線性寡肽。如果兩個表位可被相同抗體特異性 結合，則它們彼此對應。如果兩個表位二者均能夠結合相同的B細胞受體或結合相同的T 細胞受體，并且一種抗體與其表位的結合基本上防止另一表位的結合（如少于約30%、優 選少于約20%并且更優選少于約10%、5%、1 %或約0. 1 %的其他表位結合），則兩個表位 彼此對應。
[0053] 如本文所用，如果兩條核酸編碼序列或它們的互補序列編碼相同的氨基酸序列， 則這兩條核酸編碼序列彼此"對應"。
[0054] 如本文所用，與另一序列具有某一百分比（至少約50%、至少約60%、至少約 70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99% )的"序列同一*性" 的多核苷酸或多核苷酸區域（或者多肽或多肽區域）意指，當手動或使用本領域常規的軟 件程序進行最佳比對時，在比較的兩條序列中該百分比的堿基（或氨基酸）是相同的。
[0055] 當在所限定長度的DNA序列上至少約50 %、至少約60 %、至少約70 %、至少約 75 %、并且優選至少約80 %、并且最優選至少約90或95 %的核苷酸匹配時，兩條核苷酸序 列是"基本上同源的"或"基本上相似的"。類似地，當在所限定長度的多肽序列上多肽的至 少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約66%、至少約70%、至少約75%、并且優選至 少約80%、并且最優選至少約90或95%或98%的氨基酸殘基匹配時，兩條多肽序列是"基 本上同源的"或"基本上相似的"。基本上同源的序列可使用序列數據庫（sequence data bank)中可用的標準軟件通過比較序列來鑒定。基本上同源的核酸序列也可在DNA雜交實 驗中在例如嚴格條件下鑒定，所述嚴格條件是針對特定系統定義的。定義適當的雜交條件 在本領域技術內。例如，嚴格條件可以是：以5xSSC和50%甲酰胺下于42°C下雜交，并以 0. IxSSC和0. 1 %十二烷基硫酸鈉于60°C下洗滌。
[0056] 還可提供結構域序列的"經保守修飾的變體"。關于特定的核酸序列，術語"經保 守修飾的變體"是指編碼相同的或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者若核酸不編 碼氨基酸序列，則是指基本上相同的序列。具體地講，簡并密碼子置換可通過生成其中一個 或多個選定的（或全部）密碼子的第三個位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基置換的序 列來實現（Batzer 等人，1991，Nucleic Acid Res.(《核酸研宄》）19:5081 ;Ohtsuka 等人， 1985, J. Biol. Chem.(《生物化學雜志》）260:2605-2608 ;Rossolini 等人，1994, Mol. Cell. Probes (《分子和細胞探針》）8:91-98)。
[0057] 術語野生型蛋白質的"生物活性片段"、"生物活性形式"、"生物活性等同物"和"功 能衍生物"意指使用適于檢測活性的測定法測量時所具有的生物活性與野生型蛋白質的生 物活性至少基本上相同（如不顯著不同）的物質。例如，包含運輸域的生物活性片段是可 共定位至與包含該運輸域的全長多肽相同的區室的片段。
[0058] 當已將外源或異源核酸引入細胞內時該細胞已被該核酸"轉化"、"轉導"或"轉 染"。轉化DNA可以或不可以與構成細胞基因組的染色體DNA整合（共價連接）。在例如 原核生物、酵母和哺乳動物細胞中，轉化DNA可維持在附加型元件如質粒上。在真核細胞 中，穩定轉化的細胞是其中轉化DNA已整合進染色體中使得其被子代細胞通過染色體復制 而遺傳的細胞。該穩定性通過真核細胞建立由一群含有該轉化DNA的子代細胞組成的細胞 系或克隆的能力來證明。"克隆"是通過有絲分裂衍生自單個細胞或共同祖先的一群細胞。 "細胞系"是能夠體外穩定生長許多代（如至少約10代）的原代細胞的克隆。
[0059] "復制子"是充當體內DNA復制的自主單位的任何遺傳元件（如質粒、染色體、病 毒）。
[0060] 如本文所用，"病毒載體"是指包含待體內、離體或體外遞送進宿主細胞中的多核 苷酸的病毒或病毒顆粒。病毒載體的例子包括但不限于腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉 錄病毒載體等。在基因轉移由腺病毒載體介導的方面，載體構建體是指包含腺病毒基因組 或其部分和選定的與腺病毒衣殼蛋白相關聯的非腺病毒基因的多核苷酸。
[0061] 如本文所用，"核酸遞送載體"是可將所關注的多核苷酸運送進細胞中的核酸分 子。優選地，這種載體包含與表達控制序列有效連接的編碼序列。然而，所關注的多核苷酸 序列不一定包含編碼序列。例如，在一個方面，所關注的多核苷酸序列是結合靶分子的適 體。在另一方面，所關注的序列是調控序列的互補序列，其結合調控序列以抑制該調控序列 的調控。在又一個方面，所關注的序列本身是調控序列（例如，用于滴定出細胞中的調控因 子）。
[0062] 如本文所用，"核酸遞送媒介物"定義為可將插入的多核苷酸攜帶進宿主細胞并且 與如上所述核酸遞送載體相伴出現的任何分子或分子群組或大分子（例如基因或基因片 段、反義分子、核糖酶、適體等）。
[0063] 如本文所用，"核酸遞送"或"核酸轉移"是指將外源多核苷酸（例如轉基因）引入 進宿主細胞中，而無論用于該引入的方法如何。所引入的多核苷酸可穩定地或暫時地維持 在宿主細胞中。穩定的維持通常要求所引入的多核苷酸或者含有與宿主細胞相容的復制起 點或者整合進宿主細胞的復制子如染色體外復制子（如質粒）或核或線粒體染色體中。
[0064] 如本文所用，"表達"是指多核苷酸轉錄成mRNA和/或翻譯成肽、多肽或蛋白質的 過程。如果多核苷酸源自基因組DNA，則表達可包括轉錄自基因組DNA的mRNA的剪接。
[0065] 如本文所用，"在轉錄控制下"或"有效連接"是指多核苷酸序列的表達（如轉錄或 翻譯），該表達由表達控制元件和編碼序列的適當毗鄰控制。在一個方面，當表達控制序列 控制和調節DNA序列的轉錄時，則該DNA序列"有效連接"至該表達控制序列。
[0066] 如本文所用，"編碼序列"是當置于適當表達控制序列的控制下時轉錄并翻譯成多 肽的序列。編碼序列的邊界由5'（氨基）端處的起始密碼子和3'（羧基）端處的翻譯終止 密碼子確定。編碼序列可包括但不限于原核序列、來自真核mRNA的cDNA、來自真核（如哺 乳動物）DNA的基因組DNA序列以及甚至合成的DNA序列。多聚腺苷酸化信號和轉錄終止 序列將通常位于編碼序列的3'。
[0067] 如本文所用，"遺傳修飾"是指對細胞的正常核苷酸序列的任何添加或缺失或中 斷。可實現APC的遺傳修飾的任何方法均處于本發明的精神和范圍內。本領域認識到的方 法包括病毒介導的基因轉移、脂質體介導的轉移、轉化、轉染和轉導，例如病毒介導的基因 轉移如基于DNA病毒（如腺病毒、腺相關病毒和皰瘆病毒）的載體以及基于逆轉錄病毒的 載體的使用。
[0068] 如本文所用，"溶酶體/內體區室"是指含有膜中的LAMP分子、在抗原加工中起作 用的水解酶和用于抗原識別和遞呈的MHC II類分子的膜結合酸性囊泡。
[0069] 該區室充當通過包括內吞作用、吞噬作用和胞飲作用在內的多種機制中的任一種 從細胞表面內化的外來物質以及通過專門的自溶現象遞送至該區室的細胞內物質的降解 位點（參見例如de Duve，Eur. J. Biochem.(《歐洲生物化學雜志》）137:391，1983)。本文 所用的術語"內體"涵蓋溶酶體。
[0070] 如本文所用，"溶酶體相關的細胞器"是指包含溶菌酶的任何細胞器并且包括但不 限于MIIC、CUV、黑素體、分泌粒、裂解性顆粒、血小板致密顆粒、嗜堿顆粒、伯貝克顆粒、吞噬 溶酶體、分泌溶酶體等。優選地，這樣一種細胞器缺少甘露糖6-磷酸受體并且包含LAMP，但 是可能會或可能不會包含MHC II類分子。關于綜述，參見例如Blott和Griffiths, Nature Reviews，Molecular Cell Biology (《自然綜述，分子細胞生物學》），2002 ;Dell'Angelica 等人，The FASEB Journal(《FASEB 雜志》）14:1265-1278, 2000。
[0071 ]如本文所用，"LAMP 多肽"是指 LAMP-1、LAMP-2、CD63/LAMP-3、DC-LAMP 或任何溶 酶體相關膜蛋白或同源物、直系同源物、變體（如等位變體）和經修飾的形式（如包含一個 或多個天然存在的或工程改造的突變）。在一個方面，LAMP多肽是哺乳動物溶酶體相關膜 蛋白，例如人或小鼠溶酶體相關膜蛋白。更一般地說，"溶酶體膜蛋白"是指包含存在于內體 /溶酶體區室或溶酶體相關細胞器的膜中的域并且還包含腔內域的任何蛋白質。
[0072] 如本文所用，"靶向"表示將本發明的嵌合蛋白引導至優選的位點，如發生抗原加 工和與MHC II結合的細胞器或區室的多肽序列。照此，"靶向域"是指遞送至細胞區室/細 胞器所需的一系列氨基酸。優選地，靶向域是結合至接頭蛋白或AP蛋白（例如AP1、AP2或 AP3蛋白）的序列。示例性的靶向域序列在例如Dell' Angelica, 2000中描述。
[0073] 如本文所用，體內核酸遞送、核酸轉移、核酸療法等是指將包含外源多核苷酸的載 體直接引入進生物體（如人或非人哺乳動物）的體內，由此將該外源多核苷酸體內引入進 這種生物體的細胞中。
[0074] 如本文所用，術語原位是指一種類型的體內核酸遞送，其中使該核酸與靶細胞鄰 近（例如，不系統性地施用該核酸）。例如，原位遞送方法包括但不限于在位點處直接注入 核酸（例如，注入進組織，如腫瘤或心臟肌肉中）、通過開放的術野使核酸與細胞或組織接 觸、或者使用醫學進入裝置如導管將核酸遞送至位點。
[0075] 如本文所用，術語"分離的"和"純化的"有時互換使用來指與各成分（細胞及其他 成分）分離，其中在自然界中多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段通常與所述成分相 關。例如，對于多核苷酸，分離的多核苷酸是與5'和3'序列分離的多核苷酸，在染色體中 該多核苷酸通常與該5'和3'序列相關聯。如對本領域技術人員顯而易見的是，非天然存 在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段不需要"分離"來使其與其天然存在的對應 物相區分。此外，術語"分離的"和"純化的"不意味著完全分離和完全純化。這些術語用 于表示從一些或所有天然與多核苷酸等相關存在的其他物質部分純化和完全純化。因而， 這些術語可意指從一種天然相關的物質分離或純化（例如，DNA從RNA分離或純化）、從同 一大類分子的其他物質分離或純化（例如，與樣品中的所有蛋白質相比，特定蛋白質顯示 出20%的純度）或任何組合。分離和純化可意指約1%至約100% (包括100% )的任何 水平。照此，"分離的"或"純化的"細胞群體基本上不含自然界中與之相關聯的細胞和材 料。所謂基本上不含雜質的或基本上純化的APC意指細胞群體的至少50%是APC，優選至 少70%、更優選至少80%、并且甚至更優選至少90%不含自然界中與之相關聯的非APC細 胞。當然，本領域的技術人員將認識到，所有具體的值，包括值的分數，均涵蓋在這些范圍內 而無需在本文中列出每個特定的值。為了簡潔起見未具體公開各值；然而，讀者應該理解， 每個具體的值固有地被本發明公開和涵蓋。
[0076] 如本文所用，"靶細胞"或"受體細胞"是指單獨的細胞或期望為或已經成為外源核 酸分子、多核苷酸和/或蛋白質的接受者的細胞。該術語還旨在包括單個細胞的子代，并且 由于天然的、偶然的或有意的突變，該子代可不一定與初始的親本細胞完全相同（在形態 上或在基因組或總DNA互補上）。靶細胞可與其他細胞接觸（例如，如在組織中）或者可在 生物體的體內循環。
[0077] 本文所用的術語"抗原遞呈細胞"或"APC"意指在其表面上遞呈與主要組織相容 性復合體分子或其部分、或者，一種或多種非典型的MHC分子或其部分相關聯的抗原的任 何細胞。合適的APC的例子在下文中詳細地進行了論述并且包括但不限于全細胞如巨噬細 胞、樹突細胞、B細胞、雜交APC和foster抗原遞呈細胞。
[0078] 如本文所用，"經工程改造的抗原遞呈細胞"是指在其表面上具有非天然的分子部 分的抗原遞呈細胞。例如，這樣一種細胞在其表面上可能天然不具有共刺激分子或者在其 表面上可能除了天然的共刺激分子外還具有額外的人工共刺激分子，或者可在其表面上表 達非天然的II類分子。
[0079] 如本文所用，術語"免疫效應細胞"是指能夠結合抗原并且介導免疫應答的細胞。 這些細胞包括但不限于T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞 (CTL)，例如CTL系、CTL克隆，以及來自腫瘤、炎癥或其他浸潤物的CTL。
[0080] 如本文所用，術語"受試者"和"患者"可互換使用來指本發明所針對的動物。術 語動物應該理解為包括人和非人動物；若兩者之間的區別是所需的，則使用術語人和/或 非人動物。在實施例中，受試者或患者是脊椎動物，優選哺乳動物，更優選人。哺乳動物包 括但不限于鼠類、猿猴、人、農場動物（如牛、綿羊、豬）、運動動物（如馬）和寵物（如犬和 貓）。
[0081 ] 臨床變態反應癥狀對本領域技術人員是已知的，并且不需要在本文中給出詳盡的 清單。非限制性的例子包括鼻炎、結膜炎、哮喘、蕁麻瘆、濕瘆，其包括皮膚、眼、鼻、上呼吸道 和下呼吸道中的反應，其中共同癥狀是例如眼和鼻發紅和瘙癢、瘙癢和流鼻涕、咳嗽、氣喘、 呼吸短促、瘙癢和組織腫脹。
[0082] "免疫性體內測試"的例子是皮膚點刺測試（SPT)、結膜激發測試（CPT)、用變應原 進行支氣管攻擊（BCA)和其中對一種或多種變態反應癥狀進行監測的各種臨床測試。參見 例如Haugaard等人，J Allergy Clin Immunol (《變態反應臨床免疫學雜志》），第91卷，第 3 期，第 709-722 頁，1993 年 3 月。
[0083] 如本文所用，術語"藥學上可接受的載體"涵蓋任何本領域已知的標準藥用載 體，例如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水和乳液，例如油/水或水/油乳液，以及各種類型的潤濕 劑。該組合物還可包括穩定劑和防腐劑。關于載體、穩定劑和佐劑的例子，參見Martin Remington's Pharm. Sei.(《雷明頓氏藥物科學》），第15版（伊斯頓市的馬克出版公司 (Mack PubL Co. , Easton)(1975))〇
[0084] 如本文所用，"治療有效量"在本文中用于意指足以預防、校正異常的生理反應和/ 或使之正常化的量。在一個方面，"治療有效量"是足以使臨床重要的病理學特征（例如腫 瘤體的尺寸、抗體產量、細胞因子產量、發燒或白細胞計數或組胺水平）減少至少約30%、 更優選減少至少50%、最優選減少至少90%的量。
[0085] "抗體"是結合特異性表位的任何免疫球蛋白，包括抗體及其片段。該術語涵蓋多 克隆抗體、單克隆抗體和嵌合抗體（如雙特異性抗體）。"抗體結合位點"是抗體分子的由 重鏈和輕鏈可變區和高變區構成的結構部分，該部分特異性結合抗原。示例性的抗體分子 是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子，以及免疫球蛋白分子含有互補 位的那些部分，包括Fab部分、Fab'部分、F(ab'） 2部分和F(V)部分，這些部分優選用于本 文所述的治療方法。
[0086] 術語" 口腔粘膜施用"是指一種施用途徑，其中將劑型置于舌下或口腔別的地方以 讓活性成分與患者的口腔或咽的粘膜形成接觸以便獲得該活性成分的局部或系統效果。口 腔粘膜施用途徑的例子是舌下施用。術語"舌下施用"是指其中將劑型置于舌底部以便獲 得活性成分的局部或系統效果的施用途徑。如本文所用，術語"真皮內遞送"意指將疫苗遞 送至皮膚中的真皮。然而，疫苗將不必僅位于真皮中。真皮是人皮膚中位置在距表面約1. 〇 與約2. Omm之間的皮膚中的層，但個體之間以及身體的不同部分中存在一定量的變化。通 常，通過深入皮膚表面下1.5_可預計到達真皮。真皮的位置在表面的角質層和表皮與下 面的皮下層之間。取決于遞送模式，疫苗可最終僅僅或主要位于真皮層內，或者其可最終分 布在表皮或真皮內。
[0087] 如本文所用，變態反應免疫療法、變態反應治療的語境中的術語"預防"或者描述 針對變態反應患者所設計的干預的其他術語意指在所有患者的至少20%中防止IgE應答。 術語"預防"不意味著在所有患者中完全防止發展IgE介導的疾病，并且這樣一個定義不 在本發明通過減少變態反應癥狀的機制來治療變態反應的范圍內，并且與該術語在本領域 中的使用不一致。變態反應免疫療法領域的技術人員眾所周知的是，變態反應治療不會在 100%患者中100%有效，并因而"預防"的絕對定義在本發明上下文中不適用。本發明設想 了本領域認可的預防的概念。
[0088] 本發明提供多聚核酸、多聚氨基酸以及治療需要所述多聚核酸和多聚氨基酸的受 試者的方法。從廣義上講，該多聚核酸可以認為是用于細胞內產生變應原性序列（多聚氨 基酸）的核酸（如DNA、RNA)疫苗，該變應原性序列在施用該多聚核酸的受試者的體內引發 保護性免疫應答。該多聚核酸在施用時，優先經由MHC-II途徑引起細胞介導的免疫應答以 及通過激活變應原特異性的1型輔助性T細胞（Thl)細胞應答（伴隨由APC、NK細胞和T 細胞產生干擾素）而不是Th2型應答引起IgG抗體的產生，Th2型應答涉及IgE抗體、粒細 胞（如嗜酸性粒細胞）和其他物質的產生。在一定程度上，MHC-II和MHC-I應答二者均可 產生。然而，本發明提供了一種應答，其主要或者基本上是MHC-II應答。優選地，該核酸不 編碼抗生素抗性基因。
[0089] 本發明至少部分地基于這樣的認識：某些結構（并因而功能）元件的組合可為核 酸疫苗和所編碼的變應原提供有利的特性，從而使得變態反應治療方法滿足本領域尚未得 到滿足的需求。在本發明的多個實施例（旨在將這些實施例理解為作為獨立的實施例單獨 存在以及理解為組合了獨立實施例的兩種或更多種特征的實施例）中，該組合包括使用溶 酶體運輸域來將變應原氨基酸序列引導至具有MHC II蛋白的溶酶體。這樣做使得對變應 原序列主要發生IgG應答而不是IgE應答。另外，獨立的實施例或者實施例的組合提供構 建體，該構建體含有一定長度的核酸序列，該長度足以編碼可提供表位的天然存在的三維 結構的氨基酸序列。在優選的實施例中，核酸序列提供/編碼全長變應原編碼序列，但是其 缺少與該變應原序列相關聯的任何天然存在的信號肽序列。在其它實施例中，該核酸序列 編碼變應原的至少一個變應原性區域，而不是全長變應原蛋白質（并且還缺少信號序列， 如果該信號序列天然存在的話）。盡管本領域認識到可產生對抗表位的一級序列的免疫應 答，但是本發明認識到，用于產生針對所編碼的表位的MHC-II免疫應答的核酸疫苗優選使 用這樣的核酸構建體：其編碼足夠的序列數據以至少在將變應原性序列遞送至溶酶體進行 加工時，在包含變應原性表位的區域中產生正確的三維肽結構。雖然不限于任何特定的分 子理論，據信將進行正確的三維折疊的蛋白質、多肽或肽遞送至內體可改善變應原性表位 的加工和遞呈以供免疫應答。
[0090] 作為可單獨地或作為實施例的組合的一部分實施的實施例的另一個例子，提供了 從單個構建體表達多種變應原。至今，尚未表明可有效地制備和使用防范變應原的核酸疫 苗。本發明不僅提供對抗變應原的有效核酸疫苗，而且還提供同時對抗多種變應原的有效 核酸疫苗。變應原可以是來自相同來源（如單種植物）的變應原，或者可以是來自兩種或 更多種來源（如樹、花、食物等）的變應原。如上所述，可以使用全長變應原序列（缺少變 應原的任何天然相關的信號序列），或者可以使用變應原性部分。在包含多種變應原序列的 構建體中，可以使用全長或截短的變應原序列的任何混合物。另外，就其他實施例而言，優 選的是移除每條變應原序列的天然存在的信號序列（即每條變應原序列的天然存在的信 號序列不存在于構建體中）。
[0091] 盡管已發現將信號序列用于變應原域內的獨立變應原性序列對核酸構建體的功 能是有害的，但已經發現，在該核酸疫苗構建體內使用信號序列區或域是一重要的特征。照 此，在實施例中，核酸疫苗在信號序列域內包括至少一條信號序列以將所編碼的肽引導至 膜并穿過膜。盡管信號序列的氨基酸序列在構建體與構建體之間可有所不同，并且可以選 擇任何已知的信號序列，但已經發現在優選的實施例中，信號序列是存在的并且與變應原 序列的編碼序列在框內提供。單條信號序列的使用足以將整個編碼的嵌合蛋白引導至膜并 穿過膜。照此，信號序列用于每條變應原序列是不必要的，并且事實上，已發現對變應原表 位在免疫細胞表面的正確定位、加工和表達是有害的。
[0092] 此外，在具體的實施例中以及在實施例的組合中，已經發現，在多肽從胞質向內體 轉移的過程中，包括在內體中在多肽切割成用于在細胞表面遞呈的單元之前的時候，變應 原序列的螯合或物理保護在提供有用的根據本發明的核酸疫苗方面可能是重要的因素。照 此，一般而言，本發明包括包含細胞器內穩定化域（IOSD)以保護變應原序列的構建體。
[0093] 本發明的核酸包含至少以下域：信號序列域；細胞器內穩定化域；變應原域（其可 包含單種變應原或兩種或更多種變應原，各包含一個或多個變應原性表位）；跨膜域；和胞 質溶酶體/內體靶向域。各個域存在于單個嵌合的或經工程改造的核酸上。各個域可用本 領域已知且廣泛實踐的技術以任何線性順序組合。在優選的實施例中，對各域進行組合和 布置使得它們構成編碼嵌合蛋白的單個開放閱讀框，該開放閱讀框與足以表達該嵌合蛋白 的轉錄元件有效連接。該核酸因而可以是表達載體，例如質粒、噬菌粒、病毒載體等。優選 地，該核酸包含適于在哺乳動物細胞如人細胞中表達的轉錄元件。這種表達載體元件和表 達載體是本領域已知并廣泛使用的，如美國專利申請公開No. 2004/0157307所示例的，將 該專利申請公開以引用的方式并入本文。用于產生根據本發明的核酸構建體的質粒骨架的 非限制性例子在本文有時候稱為"ρΙΤΙ"質粒，其序列以SEQ ID NO: 1提供。
[0094] 本發明的核酸的三種示例性構型分別在圖1、3和4中以示意圖繪出。圖1示出了 域的順序布置方式，其中在所編碼的嵌合蛋白中包括包含單個表位的單種變應原。圖3示 出了域的順序布置方式，其中單種變應原的多個不同表位包括在所編碼的嵌合蛋白的變應 原域內。這兩個表位被布置成使得它們處于同一閱讀框中并因而二者均作為嵌合蛋白的一 部分產生。本領域的技術人員將立刻認識到，可使用標準的分子生物學技術在同一閱讀框 中在表位域內提供三個或更多個表位。圖4示出了域的順序布置方式，其中兩種不同的變 應原存在于變應原域中。當然，技術人員將認識到各變應原序列可含有一個或多個變應原 性表位。根據本發明核酸的實施例的這三個示意圖，讀者將立刻認識到，來自任何數目的來 源并且含有任何數目的表位的任何數目的變應原可包括在變應原域內，并且使用標準的分 子生物學技術連接在框內。
[0095] 圖2繪出了根據本發明的一個實施例的核酸的載體圖譜（"pITI-CRY J2-LAMP" ； 在本文中有時候也稱為"CRYJ2-LAMP"），其與圖1中以示意圖繪出的本發明實施例大致相 關。該載體或遞送媒介物包括具有PUC復制起點和用于所編碼的蛋白質產生的各種轉錄和 表達元件的質粒骨架。更具體地講，其包括PlTI骨架的序列（SEQ ID NO: 1)。應該注意， 根據本發明的優選實施例，該核酸構建體不包括抗生素抗性基因。該核酸還包含所編碼的 蛋白質的序列，該序列包含人LAMP蛋白的N端區，該N端區包括信號序列和細胞器內穩定 化域。該核酸還提供所編碼的蛋白質的序列，該序列包含與LAMP蛋白的N端區框內融合的 CryJ2變應原序列（缺少其信號序列）。該核酸還包括編碼人LAMP蛋白的C端區的一部 分的序列，該部分包括跨膜區和靶向區。CRY J2-LAMP嵌合蛋白序列的編碼區作為SEQ ID NO:2提供。CRY J2-LAMP嵌合蛋白的氨基酸序列作為SEQ ID NO:3提供。
[0096] 在示例性的實施例中，本發明還涉及用于日本柳杉的其他變應原（包括CryJl變 應原）的遞送和表達的核酸構建體。使用相同的質粒骨架，已經產生了 ρΙΤΙ-CRYJl-LAMP構 建體。該嵌合蛋白可引發MHC II型免疫應答。pITI-CRYJl-LAMP構建體的編碼區作為SEQ ID N0:4給出。CRY Jl-LAMP嵌合蛋白的氨基酸序列作為SEQ ID N0:5提供。
[0097] 如圖3和4中所示，變應原域可包括具有多個變應原性表位的變應原，或者可包括 多種變應原（各具有一個或多個變應原性表位）。圖5繪出了核酸構建體的一個特定示例 性實施例的載體圖譜，其中變應原域包括兩條變應原性序列。在該示例性實施例中，變應原 域含有日本柳杉的CryJl和CryJ2變應原（各缺少其天然的信號序列），該變應原與LAMP 信號序列域和細胞器內穩定化域框內融合并且在N末端融合。CryJl-CryJ2序列還在C末 端與LAMP跨膜域和靶向域融合。該嵌合蛋白的編碼區的全部核苷酸序列以SEQ ID N0:6給 出。所編碼的嵌合蛋白的全部氨基酸序列以SEQ ID N0:7給出，其中：殘基1-27代表該嵌 合蛋白的信號序列；殘基28-380代表細胞器內穩定化域（取自人LAMP的序列）；殘基381 和382代表連接物；殘基383-735代表CryJl的編碼區（無其信號序列）；殘基736-741代 表連接區；殘基742-1232代表CryJ2變應原的編碼區；殘基1233-1234代表連接區；殘基 1235-1258代表跨膜和靶向域；并且殘基1259-1270代表額外的C端殘基。
[0098] 本發明的核酸構建體在可協同產生的變應原數目方面基本上是無限的。照此，兩 種、三種、四種、五種、六種、十種、二十種或更多種不同的變應原（來自相同來源或不同來 源的混合物）可包括在本發明的核酸構建體中。圖6A給出了根據本發明實施例的另一示例 性核酸的載體圖譜。該載體或遞送媒介物包括具有PUC復制起點和用于所編碼的蛋白質產 生的各種轉錄和表達元件的質粒骨架。骨架可以是但不一定是SEQ ID NO: 1的pITI骨架。 該核酸還包含所編碼的蛋白質的序列，該序列包含人LAMP蛋白的N端區，該N端區包括信 號序列域和細胞器內穩定化域。該核酸還提供所編碼的嵌合蛋白的序列，該序列包含花生 變應原多聚蛋白AraHl/AraH2/AraH3。該核酸還包括編碼人LAMP蛋白的C端區的一部分的 序列，該部分包括跨膜區和靶向區。該嵌合蛋白的編碼區的核苷酸序列以SEQ ID N0:8提 供。由圖6A的載體編碼的嵌合蛋白在圖6B中以示意圖給出（并且以SEQ ID N0:9給出）。
[0099] 存在于本發明的核酸中的域在下文中就所編碼的嵌合蛋白提供的功能進行了更 詳細的描述。應當理解，本發明的實踐不依賴于或受限于任何特定的核酸或蛋白質序列，而 是，其為給構建體提供優點和特性的各元件和各域的組合。還應當理解，當在所編碼的蛋白 質的物理和功能特性的語境下論述時，描述是關于核酸構建體的各域，并且反之亦然。其足 以告知本領域技術人員所述核酸或蛋白質的物理和功能特性。利用計算機和遺傳密碼的簡 并性來獲得編碼已知蛋白質序列的所有可能的核酸分子以及來獲得由核酸編碼的蛋白質 是簡單的事情。因而，提及特定蛋白質序列的物理或功能特性就立刻給技術人員公開了與 該物理或功能特性相關的所有可能的核酸序列，反之亦然。
[0100] 對兩種或更多種核酸分子或序列進行設計和組合以獲得編碼根據本發明的嵌合 蛋白的序列也完全處于本領域技術人員的技術范圍內。同樣，選擇和組合轉錄和翻譯控制 元件來根據需要體內或體外表達編碼序列和嵌合蛋白也完全在技術人員的能力范圍內。因 此，這些通常使用的技術不需要在本文中詳細論述來使得能實踐本發明。
[0101] 本發明的核酸包含信號序列域。信號序列域含有信號序列，該信號序列用于編碼 的嵌合蛋白插入進限定外部環境與內部環境之間的邊界的生物膜中。信號序列還引導蛋白 質從外部環境向內部環境的轉移。信號序列的一般結構是本領域所熟知的，因為有特定信 號序列的許多例子。實踐者可根據針對落入本發明范圍內的每個實施例的各種選擇參數隨 意選擇任何適當的信號序列。在示例性的實施例中，信號序列是將嵌合蛋白引導至內質網 的信號序列。此刻值得注意的是，信號序列域僅僅是嵌合蛋白含有信號序列的部分。照此， 在將變應原序列包括在構建體中之前，存在于變應原域中的變應原的天然存在的信號序列 已被移除。已經發現的是，移除這些單獨的信號序列可改善構建體在體內的總體性能。
[0102] 本發明的核酸包含細胞器內穩定化域（IOSD)。該IOSD包含編碼氨基酸序列的序 列，該氨基酸序列經由化學鍵與變應原域中的一條或多條序列結合并且在嵌合蛋白到達內 體/溶酶體區室中之前保護那些序列免于降解（如蛋白水解）。本質上，可將IOSD設想為變 應原域序列的保護帽，防護那些序列，尤其是變應原性表位序列，以免受蛋白水解酶、低PH 和其他蛋白質去穩定化物質和條件的影響。IOSD可以是許多已知的或經工程改造的序列的 任一者，包括但不限于LAMP多肽腔內域和巨涎蛋白/⑶68蛋白，巨涎蛋白（macrosialin)/ CD68蛋白為在巨噬細胞和巨噬細胞樣細胞中作為晚內體蛋白表達的高度糖基化的跨膜蛋 白。IOSD的關鍵特征是IOSD與變應原域結合并保護其免于蛋白水解直至MHC II類分子從 不變肽釋放的能力。以該方式，變應原性表位的三維結構得以保持直至活性的MHC II類分 子可供相互作用。在優選的實施例中，IOSD包含溶酶體蛋白的全部或部分序列。在一些實 施例中，IOSD是除了 LAMP多肽腔內域之外的蛋白質或多肽，例如但不限于巨涎蛋白/CD68。
[0103] 本發明的核酸構建體包含變應原域。變應原域包含編碼包含一個或多個變應原性 表位的變應原蛋白、多肽或肽的一條或多條序列。變應原域不包括來自存在的變應原的信 號序列。許多蛋白質性變應原是本領域已知的，并且變應原和/或變應原性表位中的任一 者或組合可根據本發明使用。若使用短于全長的變應原性序列，則優選地，將全長變應原蛋 白的一個或多個表位于它們在該變應原性蛋白內的天然位置背景中提供。更具體地講，本 發明提供改良的核酸疫苗，其中該疫苗編碼嵌合蛋白，該嵌合蛋白保留或基本保留它們的 三維結構直至MHC II類分子能夠結合該嵌合蛋白上的表位。以該方式，與將短肽遞送至 MHC II類分子相比，可引發改善的免疫應答，所述短肽通常將缺少適當的三維結構。因此， 優選的是變應原域編碼包括一個或更多個表位（如果最初存在于變應原蛋白質上的話）的 相對較長的氨基酸序列。
[0104] 變應原域可包括兩種或更多種變應原，各含有一個或更多個變應原性表位。眾所 周知的是某些變應原性蛋白質含有兩個或更多個表位。因為本發明的優選實施例使用變應 原性蛋白質的整個變應原性編碼區（即缺少信號序列的編碼區）或其實質部分，所以某些 變應原域將包括處于其天然存在的關系的兩個或更多個表位。或者，兩個或更多個已知的 表位可融合進一個編碼區。再一次，在示例性的實施例中，兩種或更多種變應原性蛋白質或 其變應原性區域存在于變應原域中。若對兩個或更多個表位進行工程改造而存在于單個表 位域中，則所述表位可來自同一抗原蛋白。或者，它們可來自同一物種的兩種不同蛋白質。 再一次，它們可來自兩種不同物種的同一蛋白質。此外，它們可來自兩種或更多種不同物種 的兩種或更多種不同蛋白質。本質上，本發明設想了來自相同或不同物種的相同或不同蛋 白質的表位的任何組合。同樣，各變應原和表位的順序可以可想象的任何方式變動。來自 多個物種的變應原性蛋白質和/或變應原性肽的混合使得能產生穩健的核酸疫苗，該疫苗 基于多種變應原可為針對單種來源的生物體（如，特定物種的樹）的變態反應提供治療，以 及基于多種變應原可為針對多種來源的生物體（如，在一年的同一季節期間釋放孢子的多 種植物）的變態反應提供治療。由單種核酸疫苗對抗多種變應原的能力迄今尚未證明。
[0105] 本發明的核酸構建體還包含跨膜域。跨膜域是蛋白質的眾所周知的且得到充分表 征的物理和功能元件，其部分存在于生物膜的兩側上。本質上，跨膜域是性質通常是疏水性 或親脂性并且用于將蛋白質錨定在生物膜處的氨基酸的線性序列。一般來講，這類序列長 度為20-25個殘基。本領域的技術人員非常清楚這類序列并且可容易獲得或工程改造合適 的跨膜序列以用于本發明。
[0106] 除了上面論述的元件，本發明的核酸還包含靶向域。靶向域是編碼氨基酸序列的 序列，該氨基酸序列用于將所編碼的嵌合蛋白靶向至內體/溶酶體區室。雖然不如此受 限于其身份，但在優選的實施例中，靶向域包含LAMP多肽的C端胞質靶向序列、DC-LAMP、 LAMP2、LAMP-3、UMP II、ENDOLYN 或巨涎蛋白 /CD68。
[0107] 在實施例中，本發明的核酸在變應原域中包含SEQ ID NO: 2 (即缺少其信號序列的 Cry J2核苷酸序列）的序列或編碼SEQ ID N0:3(即缺少其信號序列的Cry J2蛋白質序 列）的另一序列作為變應原域的一部分。SEQ ID NO: 2由編碼Cry J2的整個蛋白質編碼序 列的核苷酸組成，其信號序列除外（即SEQ ID NO:2)，Cry J2為存在于日本柳杉花粉中的 一種果膠酸裂解酶蛋白。本領域眾所周知Cry J2與存在雪松花粉的區域中的季節性和持 續性變態反應相關。Cry J2特異性的IgE通常存在于接近雪松林的區域中的變態反應患 者中。應該注意，在作為本發明公開內容的一部分提供的序列表中，對每種變應原的信號序 列（如果存在的話）進行了注解。應當理解，在本發明構建體的背景下，這些信號序列不存 在。
[0108] 在其它實施例中，核酸包含SEQ ID N0:4(即Cry Jl核苷酸序列，缺少其信號序 列）的序列或編碼SEQ ID N0:5(即Cry J2蛋白質序列，缺少其信號序列）的另一序列。 在其他實施例中，核酸包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4二者的序列或分別編碼SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:5的其他序列。在實施例中，核酸包含一種或多種本文所公開的其他 序列，例如編碼任何以下變應原的那些：CryJ3(CryJ3.8;日本柳杉；SEQIDN0 :10;信號 序列為殘基 1-26)、CJP-4(日本柳杉；SEQ ID NO: 11)、CJP-6(日本柳杉；SEQ ID NO: 12)、 CJP-8(日本柳杉；SEQ ID N0:13 ;信號序列為殘基1-35)、CPA63(日本柳杉；SEQ ID N0:14 ; 信號序列為殘基1-20)、CJP38(日本柳杉；SEQ ID NO: 15;信號序列為殘基1-28)、Cha 〇 1(日本扁柏（(：.〇1^11此）視0 10勵:16;信號序列為殘基1-21)、扣113 1(阿斯赫刺柏 (J·ashei);SEQIDN0:17;信號序列為殘基l-21)、Junvl(北美圓柏（J·virginiana) : SEQIDN0:18;信號序列為殘基l-21)、Cupal(亞利桑那赫克薩拉（H.arizonica) ;SEQ IDN0:19;信號序列為殘基l-21)、Junol(酸刺柏αoxycedrus) ;SEQIDN0:20;信號序 列為殘基l_21)、Cup s 1(地中海柏木（C. sempervirens) ;SEQ ID N0:21;信號序列為殘基 1-21)、Cha 〇 2(日本扁柏；SEQ ID NO:22 ;信號序列為殘基1-22)、Jun a 2(阿斯赫刺柏； SEQ ID NO:23;信號序列為殘基1-22)、Cup a 2(亞利桑那赫克薩拉；SEQ ID NO:24)、Jun a 3(阿斯赫刺柏；SEQ ID N0:25 ;信號序列為殘基1-16)、Jun r 3(杜松（J.rigida) ;SEQ ID NO:26;信號序列為殘基1-26)、Cup s 3(地中海柏木；SEQ ID NO:27;信號序列為殘基 l-26)、Cup a 3(亞利桑那赫克薩拉；SEQ ID N0:28)、Ch4A(加州山松（P.monticola) ;SEQ IDN0:29;信號序列為殘基l-25)、Ch4-l(花旗松（P.menziesii) ;SEQIDN0:30;信號序列 為殘基 1-26)、PT-I (火炬松（P. taeda) ;SEQ ID N0:31)和 LTP (歐洲云杉（P. abies) ;SEQ ID NO: 32;信號序列為殘基1-25)。未參考SEQ ID NO列出的核酸和氨基酸序列也可公開獲 得。根據核酸序列，僅通過計算機程序實施就能獲得根據本發明的蛋白質序列。當然，這些 蛋白質序列的在生物化學上同源的序列也為這些實施例所涵蓋。例如，與所公開的序列顯 示出30%或更高的同一性，例如40%或更高、50%或更高、75%或更高、90%或更高、95% 或更高、98%或更高或者99%或更高的同一性的序列為這些實施例所涵蓋。應當理解，該概 念不僅適用于本文所公開的變應原的特定序列，而且還適用于本文提供的所有蛋白質和核 酸序列。另外，如上所述，所公開的范圍內的每個值應該理解為被本公開具體地涵蓋。
[0109] 在本發明的特定例子中，提供了在變應原域中包含SEQ ID NO:2或編碼SEQ ID NO: 3的另一序列的DNA疫苗。當將這樣一種疫苗施用給存在相當的日本柳杉變態反應跡 象的患者時，該疫苗導致從頭合成包含變應原Cry J2(在SEQ ID NO: 3中給出）的融合或 嵌合（這兩個術語在本文中可互換使用）蛋白。由于該嵌合蛋白上存在的域的組合，該蛋 白質被從內質網引導進內吞溶酶體途徑中，從而導致在MHC囊泡中將該融合蛋白加工成表 位，一些表位與MHC II類分子結合，從而導致增強的體液免疫應答。
[0110] 在本發明的另一個例子中，提供了在變應原域內包含SEQ ID N0:4的序列或編碼 SEQ ID N0:5的另一序列的DNA疫苗。當將這樣一種疫苗施用給存在相當的日本柳杉變態 反應跡象的患者時，該疫苗導致從頭合成包含變應原Cry Jl (在SEQ ID NO:4的序列中給 出）的融合或嵌合（這兩個術語在本文中可互換使用）蛋白。由于該嵌合蛋白上存在的域 的組合，該蛋白質被從內質網引導進內吞溶酶體途徑中，從而導致在MHC囊泡中將該融合 蛋白加工成表位，一些表位與MHC II類分子結合，從而導致增強的體液免疫應答。
[0111] 在本發明的另一個例子中，提供了在變應原域中包含SEQ ID NO: 6的DNA疫苗。當 將這樣一種疫苗施用給存在相當的日本柳杉變態反應跡象的患者時，該疫苗導致從頭合成 包含變應原CryJl和Cry J2(SEQ ID NO: 7)的融合或嵌合（這兩個術語在本文中可互換使 用）蛋白。由于該嵌合蛋白上存在的域的組合，該蛋白質被從內質網引導進內吞溶酶體途 徑中，從而導致在MHC囊泡中將該融合蛋白加工成表位，一些表位與MHC II類分子結合，從 而導致增強的體液免疫應答。
[0112] 在本發明的另一個例子中，在變應原域中提供了編碼Jun a 1的整個蛋白質編碼 序列的核酸，Jun a 1為屬于阿斯赫刺柏屬的果膠酸裂解酶。Jun a 1展示出與Cry Jl具 有高度序列同一性并且保留與Cry Jl相似的酶活性且在已知的表位中具有高度相似性。
[0113] 眾所周知其他多肽與Cry Jl具有交叉反應性并且該交叉反應性是由于共享與果 膠酸裂解酶家族多肽的酶活性相關的表位。該家族包括日本扁柏的主要變應原（日本扁 柏（Ch ο 1))，并且包括來自以下的變應原：阿斯赫刺柏（Jun a 1)、北美圓柏（Jun V 1)、 亞利桑那柏木（Cuppressus arizonica) (Cup a 1)、酸刺柏（Jun ο 1)和地中海柏木（Cups 1)。在文獻中已經觀察到，變態反應患者中存在對來自雪松科（柏木屬（Cupressus))的花 粉的強交叉反應性。下面的表I描繪了示出相關蛋白質之間的交叉反應性水平的表。雖然 就Cry Jl和Cry J2詳細地描述了本發明，但應當理解除了 Cry Jl和Cry J2序列或者作 為Cry Jl和Cry J2序列的替代形式，還可使用本文中并且尤其是表I中公開的一種或多 種變應原。
[0114] 表I :日本柳杉與其他奪應原的奪叉反應件
[0115]
【權利要求】
1. 一種分離的或純化的核酸，所述核酸依次包含： 編碼信號序列的序列； 編碼細胞器內穩定化域的序列； 編碼變應原域的序列，其中所述變應原域包含至少一種變應原，所述變應原不包括所 述變應原的天然存在的信號序列； 編碼跨膜域的序列；和 編碼內體/溶酶體靶向域的序列。
2. 根據權利要求1所述的核酸，其中所述細胞器內穩定化域包含編碼溶酶體相關膜蛋 白（LAMP)的序列。
3. 根據權利要求1所述的核酸，其中所述細胞器內穩定化域包含編碼LAMP多肽、 DC-LAMP、LAMP2、LAMP-3、UMP II 或 ENDOLYN 的序列。
4. 根據權利要求1所述的核酸，其中所述編碼變應原域的序列包含編碼兩種或更多種 變應原性表位的序列。
5. 根據權利要求1所述的核酸，其中所述編碼變應原域的序列包含編碼兩種或更多種 變應原的序列。
6. 根據權利要求5所述的核酸，其中所述變應原來自兩種或更多種不同的物種。
7. 根據權利要求1所述的核酸，其中所述變應原是Cry Jl，Cry J2、Cry J3、CJP-4、 CJP_6、CJP_8、CPA63、Cha 〇 1、Jun a l、Jun V l、Cup a 1、Jun 〇 l、Cup s l、Cha 〇 2、 Jun a 2、Cup a 2、Jun a 3、Jun r 3、Cup s 3、Cup a 3、Ch4A、Ch4_l、PT-1 或 LTP 變應原 或其具有至少一個變應原性表位的部分。
8. 根據權利要求1所述的核酸，其為在宿主中誘導免疫應答的DNA疫苗。
9. 根據權利要求1所述的核酸，其中所述變應原域包含編碼兩種或更多種變應原的序 列，所述變應原每一者來自相同物種。
10. 根據權利要求1所述的核酸，其中所述變應原域包含編碼兩種或更多種變應原的 序列，所述變應原每一者來自不同的物種。
11. 一種在受試者中減輕、消除或預防變態反應的方法，所述方法包括以足以減輕或消 除變應原性表位特異性的IgE應答產生的量給所述受試者施用根據權利要求1所述的DNA 疫苗。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中所述方法預防所述變態反應。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中所述方法減輕、消除或預防至少一種臨床變態 反應癥狀。
14. 根據權利要求13所述的方法，其中所述方法預防至少一種臨床變態反應癥狀。
【文檔編號】A61K38/00GK104519896SQ201280075163
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2012年6月15日 優先權日:2012年6月15日
【發明者】威廉·赫爾, 特瑞·海蘭 申請人:免疫治療有限公司