用于光動力療法的新型光免疫偶聯物的制作方法
【專利摘要】一種化合物，包括：·光敏劑，其共價結合于·選自下組的蛋白抗體或其衍生物或其片段、合成肽，如scFv、模擬表位·其結合于CD抗原、細胞因子受體、白介素受體、激素受體、生長因子受體，尤其是ErbB家族的酪氨酸激酶生長因子受體，其中·所述光敏劑與蛋白的結合通過O6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶(hAGTm)，其為經修飾的人DNA修復蛋白。
【專利說明】用于光動力療法的新型光免疫偶聯物 發明領域
[0001] 光動力療法（PDT)是一種非常有前景的微創癌癥治療手段。引入改良的光敏劑以 及臨床應用方案后，已有數個經FDA批準的PDT藥物可用，而其他的（藥物）則處于臨床前 和臨床開發1的多個階段中。無害光線直接激活后，光敏藥物可變得具有細胞毒性而發揮 其作用；或在非直接激活后，在原位啟動產生毒性自由基或活性氧（R0S)從而發揮其作用。 這些過程能造成細胞的破壞，并最終通過凋亡或壞死 2誘導細胞的死亡。細胞破壞的部位 取決于光敏劑的種類、溫育周期以及遞送方式。疏水性光敏劑常常破壞細胞膜，而陽離子光 敏劑則在膜囊泡（如線粒體）中積聚并導致局部的破壞 3。
[0002] PDT的一個最大挑戰在于其缺乏靶向特異性。在由光照激活后，光敏劑在破壞腫瘤 組織的同時也破壞健康組織，這會造成長期的皮膚光敏 4。為了提高PDT的特異性，將光敏 劑偶聯于腫瘤特異性單克隆抗體或單鏈抗體片段（scFv)，從而產生了能夠直接將光敏劑遞 送到腫瘤組織的所謂光免疫偶聯物。這個方法稱作光免疫療法（PIT) 5。標準的偶聯反應并 不適用于光敏劑和抗體的偶聯，因為尚無一個可靠的方式來確定抗體-光敏劑的偶聯能以 最佳的化學計量比 6產生。此外，光敏劑的化學性質（例如，疏水性，以及帶電基團的數量 和排列）能夠改變抗體的藥代動力學性質以及生物分布，并最終導致非特異性結合以及內 化行為。隨機的偶聯也可引發光敏劑激發態的自淬滅，從而降低光動力活性 5。因此，需要 更可控的偶聯反應來克服這些限制。
[0003] PDT的一個主要缺陷在于經激活的光敏劑的非選擇性效應，其常常同時破壞健康 細胞和腫瘤細胞。利用抗體的靶向療法徹底改變了癌癥治療，數個結合于腫瘤細胞抗原的 抗體已經造成了轟動的效應。將額外的效應分子（例如，放射性核素、藥物或毒素） 7共價 連接于治療性抗體能增強其效果，因為這能實現選擇性遞送，并降低通常與小分子藥物8相 關的全身性毒性反應。相同的理論也適用于光敏劑。效應分子通常利用半胱氨酸殘基上的 還原巰基或賴氨酸側鏈的氨基基團與抗體相連。然而，這兩種方法都會產出異質性的產物， 包括在不同位點連接效應分子的偶鏈抗體混合物，以及連接各抗體的效應分子數量各異， 從而導致摩爾比是一范圍，以及極為不同的藥代動力學、效力以及安全性特征。
[0004] 通過純化含有2、4、8個一甲基奧瑞他汀E(MMAE)偶聯分子的三種抗體部分， Hamblett和其同事9研究了異質性抗體藥偶聯物的毒性、藥代動力學性質以及治療效率。含 有8個MMAE基團的部分較其他部分而言耐受性較差，清除較快，并顯示出最低的效率。這 提示了抗體藥偶聯物的關鍵設計參數是連接于抗體的藥物分子數量。然而，即使攜帶相同 數量藥物分子的純化抗體依然會構成復雜的混合物，因為具有許多不同的結合位點。例如， 通常一個抗體中約有40個賴氨酸殘基，這可能導致大于一百萬個不同的偶聯抗體種類。相 似地，半胱氨酸殘基有1-8個，通常會生成約100個不同的偶聯變體。每一個抗體藥偶聯物 通常都會顯現出獨特的、不可預測的藥代動力學特征 9。
[0005] 發明概述
[0006] 光敏性藥物暴露在無害光線下所引起的毒性效應能夠殺滅癌細胞，但這也會對周 圍健康細胞造成巨大損傷。通過將光敏性藥物偶聯于特異性結合腫瘤相關細胞表面抗原的 抗體和抗體片段，能使光動力療法的特異性有所提高。然而，標準偶聯反應所產生的異質性 產物卻削弱了其靶向特異性和（作用）譜特性。
[0007] 在本發明中，利用結合于表皮生長因子（EGFR)的抗體片段（scFv-425)作為模型 來研究采用SNAP-標簽融合作為改良的偶聯方法。scFv-425-SNAP-標簽融合蛋白能夠特異 性結合光敏劑，例如經節基鳥噪呤（〇6-benzylguanine)修飾的二氫卩卜吩e6(chlorin e6)， 從而生成特異性遞送至EGFR+癌細胞并引起顯著的腫瘤細胞特異性細胞毒的異質性產物。 (本文）討論了我們的研究結果對光動力療法發展的影響。
[0008] 本發明提供了一種化合物，其包括：共價結合于結合結構的光敏劑，所述結合結 構選自下組：抗體或其衍生物或其片段、合成肽（如scFv)、模擬表位（其結合結構結合 于CD抗原）、細胞因子受體、白介素受體、激素受體、生長因子受體、尤其是ErbB家族的酪 氨酸激酶生長因子受體，其中，所述光敏劑通過經修飾的人類DNA修復蛋白06-烷基鳥嘌 呤-DNA-烷基轉移酶（hAGTm)而結合于內化受體結合蛋白。
[0009] 在本發明的一個實施例中，表皮生長因子受體結合蛋白是scFv抗體片段，尤其是 如SEQ ID NO. : 1所示的scFv抗體片段，編碼其的多核苷酸序列如SEQ ID N0. :2所示。 [0010] 在本發明的另一實施例中，本發明化合物包括或具有氨基酸序列SEQ ID N0. :3， 編碼其的多核苷酸序列如SEQ ID NO. :4所示。
[0011] 在本發明的又一實施例中，本發明化合物中光敏劑偶聯于06-烷基鳥嘌呤-DNA烷 基轉移酶的活性位點。
[0012] 在本發明的化合物中，所示的光敏劑選自下組：嚇啉、葉綠素以及具有光敏能力的 染料。
[0013] 本發明的主題還在于一不含光敏劑的化合物。所示化合物包括選自下組的結合 蛋白：抗體或其衍生物、或其片段、合成多肽（如scFv)、模擬表位（其結合蛋白結合于CD 抗原）、細胞因子受體、白介素受體、激素受體、生長因子受體，尤其是ErbB家族的酪氨酸 激酶生長因子受體，其通過經修飾的人類DNA修復蛋白06-烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉移酶 (hAGTm)偶聯于內化受體結合蛋白。
[0014] 特別地，所述結合蛋白是scFv抗體片段，尤其是如SEQ ID N0. :1和/或SEQ ID NO. :3所述的scFv抗體片段。該化合物可由SEQ ID NO. :2和/或SEQ ID NO. :4所示的多 核苷酸編碼。具體的實施例即結合于ErbB家族的酪氨酸激酶生長因子受體。
[0015] 所述化合物的具體實施例即由核苷酸序列如SEQ ID N0. :5所示的多核苷酸編碼。
[0016] 本發明的另一主題在于制備本發明化合物的方法，包括步驟：將06-鳥嘌呤-DNA 烷基轉移酶（hAGTm)與選自下組的結合蛋白融合：抗體或其衍生物或其片段、合成肽如 scFv、模擬表位，其結合蛋白結合于CD抗原、細胞因子受體、白介素受體、激素受體、生長因 子受體，尤其是ErbB家族的酪氨酸激酶生長因子受體。具體地，將scFv-425 DNA序列插 入真核細胞表達載體PMS-SNAP中經SiFI和Notl消化的位點，從而提供N末端結合配體 (scFv-425)和C末端SNAP-標簽序列。
[0017] 具體地，還將His6標簽與蛋白相融合。融合蛋白可在人體細胞中表達，尤其是胚腎 細胞系中，例如HEK-293T細胞（ATCC:CRL-11268)，并利用該標簽的親和樹脂（例如，Ni-NTA 修飾樹脂）進行純化。
[0018] 本發明的另一主題是下式所示的卟啉衍生物
[0019]
【權利要求】
1. 一種化合物，包括： ?光敏劑，其共價結合于 ?選自下組的蛋白 抗體或其衍生物或其片段、合成肽，如SCFv、模擬表位 ?其結合于CD抗原、細胞因子受體、白介素受體、激素受體、生長因子受體，尤其是ErbB 家族的酪氨酸激酶生長因子受體，其中 ?所述光敏劑與蛋白的結合通過 06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶（hAGTm)，其為經修飾的人DNA修復蛋白。
2. 如權利要求1所述的化合物，特異性靶向于內化和疾病特異性細胞表面受體。
3. 如權利要求1或2所述的化合物，其特征在于，所述酪氨酸激酶生長因子受體結合 蛋白是scFv抗體片段，尤其是如SEQ ID N0. :1所示的scFv抗體片段，其由SEQ ID N0. :2 所示的多核苷酸序列編碼。
4. 如權利要求1-3所述的化合物，氨基酸序列如SEQ ID N0. :3所示，其由SEQ ID NO. :4所示的多核苷酸序列編碼。
5. 如權利要求1-4所述的化合物，其特征在于，所述的光敏劑偶聯于06-烷基鳥嘌 呤-DNA烷基轉移酶的活性位點。
6. 如權利要求1-4所述的化合物，其特征在于，光敏劑選自下組：嚇啉、葉綠素和染料。
7. -種化合物，包括 選自下組的結合蛋白：抗體或其衍生物或其片段、合成肽，如scFv、模擬表位，其結合 于CD抗原、細胞因子受體、白介素受體、激素受體、生長因子受體，尤其是ErbB家族的酪氨 酸激酶生長因子受體，并共價結合于稱為06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶（hAGTm)的經修 飾的人DNA修復蛋白。
8. 如權利要求7所述的化合物，其特征在于，所述的結合蛋白是scFv抗體片段，尤其是 SEQ ID NO. : 1和/或SEQ ID N0. :3所示的scFv抗體片段。
9. 權利要求7所述化合物的編碼多核苷酸序列，尤其包括SEQ ID N0. : 2和/或SEQ ID NO. :4.
10. 權利要求1所述化合物的編碼多核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID NO. :5所示。
11. 制備權利要求7所述化合物的方法，包括步驟：將06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉移酶 (hAGTm)與選自下組的蛋白融合：抗體或其衍生物或其片段、合成肽，如scFv、模擬表位，結 合蛋白結合于CD抗原、細胞因子受體、白介素受體、激素受體、生長因子受體，尤其是ErbB 家族的酪氨酸激酶生長因子受體。
12. 如權利要求11所述的方法，其特征在于，將scfv-425 DNA序列插入真核表達載體 pMS-SNAP中經Sifl和Notl消化的位點，從而提供N-末端結合配體（scFv-425)和C-末端 SNAP-標簽序列。
13. 如權利要求11或12所述的方法，其特征在于，在人胚腎細胞系，尤其是HEK-293T 細胞（ATCC:CRL-11268)中表達 scFv-425-SNAP 融合蛋白。
14. 如權利要求11-13中任一所述的方法，其特征在于，采用親和層析，尤其是Ni-NTA 親和層析自無細胞上清液中純化所述scFv-425-SNAP融合蛋白。
15. 如下式所示的卟啉衍生物
并與權利要求7所述的化合物偶聯。
16. 制備權利要求15所述化合物的方法，其特征在于，η卜啉光敏劑，如二氫η卜吩e6的羧 基至少部分與活化的酯反應，或通過偶聯劑，然后與06-芐基鳥嘌呤、02-芐基胞嘧啶或輔 酶A(C 〇A)反應。
17. 如權利要求16所述的方法，其特征在于，06-芐基鳥嘌呤、02-芐基胞嘧啶或輔酶 A(C〇A)偶聯于連接分子，例如PEG-24-NH2和/或通過琥珀酰亞胺，如NHS或偶聯劑形成所 述活化的酯，所述偶聯劑選自下組：碳化二亞胺，如EDC、EDAC和DCC。
18. -種藥物，其含有權利要求1-8中至少一項所述的化合物，和藥學上可接受的佐 齊U，以便改進光免疫療法相關的藥學效應或可能賦予這種效應。
19. 權利要求1-8中至少一項所述的化合物的用途，用于通過光免疫療法治療癌癥。
【文檔編號】A61K47/48GK104203286SQ201280071458
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2012年3月21日 優先權日:2012年3月21日
【發明者】S·巴思, M·K·圖爾, A·哈辛 申請人:德國弗勞恩霍夫協會債權安格萬特學術研究所, 亞琛工業大學