調節免疫反應的組合物和方法

調節免疫反應的組合物和方法【專利摘要】本發明涉及刺激MHCI介導的免疫反應的組合物和方法，其包含在樹突狀細胞中刺激MHCI內溶酶體交叉呈遞。刺激MHCI內溶酶體交叉呈遞可包含在樹突狀細胞中過度表達CD74和/或將抗原靶向所述MHCI內溶酶體交叉呈遞路徑。還提供了包含抗原或其片段和CD74內溶酶體靶向序列的融合蛋白質。【專利說明】調節免疫反應的組合物和方法【
技術領域：
】[0001]本發明涉及免疫調節領域，具體地說，涉及調節MHCI介導的免疫反應的組合物和方法。【
背景技術：
】[0002]在初次免疫反應期間，樹突狀細胞為啟動適應性免疫反應的主要抗原呈遞細胞(APC)。樹突狀細胞吸收含有抗原蛋白質的死細胞和細胞殘渣并加工這些外源衍生的抗原以用于呈遞在MHCI上。這一過程稱為MHCI交叉呈遞。這一過程為對抗病毒、腫瘤、自抗原和同種異體移植物的CD8+T細胞介導的反應所必需。[0003]CD74是樹突狀細胞內部工作的細胞機構的重要部分用于調節哺乳動物初次免疫反應。樹突狀細胞具有能夠使其感應并接著響應外來威脅的專用途徑。到目前為止，尚無人能夠拼湊出使主要組織相容性I類(MHCI)能夠發現并‘碰撞’外來侵入物引起免疫系統對病原體的必要呈遞和識別的線路。【
發明內容】[0004]本發明的一個目標是提供調節免疫反應的組合物和方法。根據本發明的一個方面，提供了一種刺激MHCI介導的免疫反應的方法，其包含在樹突狀細胞中刺激MHCI內溶酶體交叉呈遞。刺激MHCI內溶酶體交叉呈遞可包含在樹突狀細胞中過度表達⑶74和/或將抗原靶向MHCI內溶酶體交叉呈遞路徑。[0005]根據本發明的另一方面，提供了一種融合蛋白質，其包含抗原或其片段和CD74內溶酶體靶向序列。還提供了表達所述融合蛋白質的核酸分子、載體和細胞。[0006]根據本發明的另一方面，提供了一種隔室，其用于⑶74依賴性MHCI交叉呈遞路徑。這種隔室可能是內溶酶體。[0007]根據本發明的另一方面，提供了一種組織蛋白酶裂解肽和所述肽的多聯體，其用于刺激初次免疫反應。【專利附圖】【附圖說明】[0008]圖1.CC174+小鼠產生較弱的抗病毒初次免疫反應。(a)在經低效價VSV(感染50%組織培養細胞單層或小鼠的2X15劑量)感染后6天分離的Cd74+/+、Cd74^和Tapl+小鼠的脾臟中產生VSVNP(52-59)特異性(H_2Kb_VSVNP)CD8+T細胞，接著用VSVNP(52-59)刺激5天。象限中的數字指示每次通過的細胞百分比。(b)在如a中獲得的細胞中H-2Kb-VSVNP(52-59)特異性CD8+T細胞頻率(η=3種小鼠/基因型)。(c)在如a中VSV感染和體外加強之后產生的CTL的標準51Cr釋放分析。*P〈0.05(史都登氏t檢驗)。數據代表至少3次單獨實驗(平均值土s.d.)。[0009]圖2.CC174+小鼠在誘發初次免疫反應方面的缺陷在于其抗原呈遞細胞且與CD4+T細胞無關。(a)從用VSV(感染50%組織培養細胞單層或小鼠的IX15劑量)注射且在體外用VSVNP(52-59)加強的嵌合體(η=3)獲得的脾臟中產生VSVNP(52-59)特異性CD8+細胞。(b)在如a中體外加強之后產生的CTL的細胞毒性分析。目標細胞在指示時經VSVNP(52-59)脈沖處理或保持未標記作為非特異性殺傷的對照。(c)在如a中VSV感染和體外加強之后通過靜脈內注射抗⑶4(+Ab)耗盡⑶4+細胞的Cd74+/+—Cd74^和CC174+—Cd74+/+嵌合體(η=3)的脾臟中產生對H_2Kb_VSVNP(52-59)具有特異性的CD8+T細胞。(d)在如c中體外加強之后產生的CTL的如b中的細胞毒性分析。*P〈0.05(史都登氏t檢驗)。數據代表3次實驗(a)、至少3次實驗(b)、2次實驗(c)或3次實驗(d;平均值和s.d.)ο[0010]圖3.CC174+DC不能體內交叉呈遞細胞相關的抗原來激活抗原特異性⑶8+T細胞。(a)方案:將經OVA蛋白或OVA(257-264)脈沖處理的0(174+或Cd74+/+BMDC與純化的CFSE標記的⑶8+0T-1T細胞一起注射到BALB/c背景的Ragl+小鼠中(左側);3天后，評估H-2KbCD8+T細胞的增殖(勾畫的區域，右側)。(b)來自a中接受體小鼠(η=3)的脾臟的增殖中的(黑色)和非增殖中的(灰色)OT-1T細胞。加括號線上方的數字指示CFSE_(分裂)細胞百分比。數據代表2次實驗。[0011]圖4.交叉呈遞和交叉激活在CC174+DC中是有缺陷的。(a)在37°C(深灰色陰影曲線)或4°C(淺灰色線)下與OVA—起孵育后通過流式細胞術評估BMDC對OVA-AlexaFluor488的攝取。(b)通過流式細胞術所測量，在與(+0VA)或不與(-0VA)可溶性OVA—起孵育的情況下脾臟DC上H-2Kb-0VA(257-264)復合體的形成以及背景(灰色線；底部)上方的總H-2Kb(陰影曲線)。(c)通過流式細胞術所評估，與單獨培養基(-0VA)、單獨OVA(+0VA)或OVA和干擾素-Y(0VA+IFN-Y)一起孵育的BMDC上CD80和CD40的表達。(d)通過化學發光分析所測量，在細胞信號傳導分子單獨GM-CSF(頂部)或GM-CSF外加TNF(中部)或干擾素-Y(底部)存在下與各種濃度的可溶性OVA(橫軸)一起孵育的脾臟衍生的DC對B3ZT細胞的活化。(e)如光學合并的圖像所呈現，在有(底部)或沒有(頂部)TNF情況下與OVA—起孵育、接著與H-2Kb-0VA(257-264)抗體(紅色)和抗LAMP-1(綠色)一起共染色的成熟、脾臟衍生的DC的ICM。比例尺，5μm。(f)如歸一化的個別像素相對于總像素所呈現，在TNF(頂部)存在下H-2Kb-0VA(257-264)與LAMP-Γ晚期內體的共定位的定量分析以及在有和沒有TNF處理(底部)情況下0(174+^0(174+和Tapl+DC(>20個/品系)的熒光。*P〈0.05(史都登氏t檢驗)。數據代表2次(a-f)實驗(誤差線(f)，s.d.)或是來自代表具有類似結果的3次單獨實驗的I次實驗(d式三份樣品的平均值土s.d.)。[0012]圖5.通過用氯奎處理來抑制DC中MHCI類的⑶74介導的運輸。(a)通過流式細胞術所測量，保持未經處理(-CQ)或用氯奎處理(+CQ)且與單獨培養基(藍色)或可溶性OVA(紅色；頂部)或OVA肽(紅色；底部)一起孵育的BMDC上的H_2Kb-0VA(257-264)復合體的形成。(b)保持未經處理或與氯奎一起處理的BMDC上的總H-2Kb(綠色)；藍色，背景。(c)如a中處理的BMDC上的表面H-2Kb-0VA(257-264)復合體，如歸一化的平均熒光強度(MFI)所呈現，其中100%是在未經處理的BMDC上發現的H-2Kb-0VA(257-264)復合體的量。(d)如光學合并的圖像所呈現，保持未經處理的或用氯奎處理、接著與抗H-2Kb(紅色)和抗⑶74(綠色)一起共染色的成熟BMDC的ICM。比例尺，5μm。(e)如歸一化的像素相對于總像素所呈現，d中的H-2Kb與⑶74的共定位的定量。(f)由經全長(+FL)⑶74或缺乏內溶酶體運輸基元(+Λ2-17)的截短型⑶74重組且與可溶性OVA蛋白或OVA(257-264)一起孵育的CC174+BMDC誘導的CFSE標記的OT-1細胞的增殖。勾畫出的區域中的數字指示相對于設定為100%的Cd74+/+對照(最左側)的增殖中的OT-1細胞(⑶8+CFSE_)百分比。數據代表2次實驗(誤差線(c、e)，s.d.)。[0013]圖6.⑶74控制DC中MHCI類的ER到內溶酶體運輸。(a)用抗H_2Kb(綠色)夕卜加抗⑶74(紅色；頂部)或抗LAMP-1(紅色；底部)染色的成熟脾臟DC的ICM。比例尺，5μm。(b)如個別像素/總像素所呈現，LAMP-1+隔室(50個DC/小鼠品系)中MHCI類的定量。(c)使用抗1-A-1-E(1-Ab;左側泳道)、抗⑶74(中間泳道)或抗H_2Kb(右側泳道)的[35S]蛋氨酸標記的Cd74+/+、CC174+、Tapl+和β2-微球蛋白缺陷型￠2111+)BMDC的免疫沉淀(IP)。箭頭指示41kDa(頂部)和31kDa(底部)CD74條帶。(d)來自使用抗I_Ab、抗H-2Kb(構象依賴性)、H-2Kb細胞質域的抗體(e-VIII;構象非依賴性)或轉鐵蛋白受體(TFR)的抗體的Cd74+/+DC的溶解產物的蛋白的免疫沉淀，隨后使用抗CD74進行免疫印跡分析。最右側(WCL)，全細胞溶解產物(對照)的免疫印跡分析。(e)來自使用抗CD74的DC的溶解產物的蛋白的免疫沉淀，隨后不消化(_)或使用EndoH(+)消化并使用抗MHCI類進行免疫印跡分析。(f)來自保持未經處理或用氯奎或EndoH處理的細胞的溶解產物的蛋白的免疫沉淀(使用抗MHCI類)，隨后使用抗CD74進行免疫印跡分析。條帶強度使用Odyssey軟件定量。泳道下方的數字指示歸一化到未經CQ處理的樣品的條帶強度。(g)通過流式細胞術隨時間推移所評估和如與對照DC在4°C下比較在37°C下孵育的DC的平均熒光強度的降低百分比所呈現，經抗H-2Kb標記的DC中的MHCI類的內化。*P〈0.05(史都登氏t檢驗)。數據代表2次實驗(a)、2次實驗(b;平均值土s.d.)、5次實驗(c)、3次實驗(d)、3次實驗(e)、2次實驗(e)或2次實驗(f;誤差線，s.d.)。[0014]圖7.嵌合小鼠的外周分析。[0015]圖8.CC174+小鼠不能體內交叉呈遞細胞相關的抗原來產生有效的初次免疫反應。[0016]圖9.Cd74^DC定位于脾臟。【具體實施方式】[0017]本發明是基于以下發現:由⑶74起到的將MHCI受體連接于免疫細胞內含有入侵病原體的隔室的引導作用。這種復雜的線路允許免疫細胞識別身體中的病原體并發出病原體存在于身體中的信號，并且警告專門的T免疫戰士細胞，所述細胞通過以下方式響應:分裂，并攻擊感染的細胞，由此破壞病原體。具體來說，本發明是基于以下發現:CD74介導MHCI從樹突狀細胞的內質網運輸到內溶酶體隔室以用于裝載外源性肽，且因此⑶74在內溶酶體樹突狀細胞交叉呈遞以用于激活MHCI介導的CTL反應方面具有關鍵功能。因此，本發明提供了調節MHCI介導的免疫反應的方法。[0018]在某些實施例中，提供了調節⑶74依賴性MHCI內溶酶體樹突狀細胞交叉呈遞的化合物和方法。在某些實施例中，提供了一種刺激免疫反應(如MHCI介導的CTL反應)的方法，其通過增強⑶74依賴性MHCI樹突狀細胞交叉呈遞進行。⑶74依賴性MHCI交叉呈遞路徑可通過例如增加樹突狀細胞中CD74的表達來增強。因此，在某些實施例中，提供了增強CD74表達的化合物和方法。[0019]表達載體可用于在細胞中表達本發明的CD74蛋白。所屬領域的技術人員將清楚可用于構筑表達載體的適當表達載體。所屬領域的技術人員還將清楚所述載體可直接投與個體。或者，來自個體的細胞可離體經編碼本發明多肽的聚核苷酸(DNA或RNA)工程改造，且經工程改造的細胞接著被提供給個體。所述方法在此項技術中是熟知。[0020]另外，鼠CD74的氨基酸序列為此項技術中已知(參見，例如NCBI蛋白質數據庫登錄號P04441.3)且闡述于下文中:[0021]lmddqrdlisnheqlpilgnrprepercsrgalytgvsvlvalllagqattayflyqqqgr[0022]611dkltitsqnlqleslrmklpksakpvsqmrmatpllmrpmsmdnmllgpvknvtkygnm[0023]121tqdhvmhlltrsgpleypqlkgtfpenlkhlknsmdgvnwkifeswmkqwllfemsknsl[0024]181eekkpteappkvltkcqeevshipavypgafrpkcdengnylplqchgstgycwcvfpng[0025]241tevphtksrgrhncsepldmedlssglgvtrqelgqvtl[0026]人CD74的各種同工型的氨基酸序列也是此項技術中已知的(參見，例如基因庫登錄號AAH18726.1；AAH24272.1；EAW61729.1；EAW61730.1和EAW61731.1)。[0027]因此，在本發明的某些實施例中，提供了表達CD74的聚核苷酸和表達載體以及使用所述聚核苷酸和表達載體來表達CD74或其活性片段的方法。在某些實施例中，本發明的聚核苷酸和表達載體在體內用于基因工程細胞，包括(但不限于)樹突狀細胞。在某些其它實施例中，本發明的聚核苷酸和表達載體離體用于基因工程細胞，包括(但不限于)樹突狀細胞，且這些經基因工程改造的細胞可接著投與個體。因此，在某些實施例中，提供了已經基因工程改造以過度表達CD74的樹突狀細胞。聚核苷酸、表達載體和細胞可與醫藥學上可接受的稀釋劑或載劑一起作為醫藥組合物投與。[0028]如上所述，有證據表明，內溶酶體是用于在樹突狀細胞中交叉呈遞的主要隔室。在本發明的某些實施例中，提供了樹突狀細胞的內溶酶體。在某些實施例中，提供了用于呈遞到在樹突狀細胞的內溶酶體隔室中產生的MHCI的肽。這些肽可為從抗原和其片段加工、特異性靶向樹突狀細胞的內溶酶體的肽。[0029]使抗原和其片段靶向樹突狀細胞的內溶酶體隔室可增強MHCI抗原的激活。因此，在本發明的某些實施例中，提供了使包括抗原和其片段的分子靶向樹突狀細胞的內溶酶體的化合物和方法。舉例來說，CD74的內體靶向信號可用于將抗原或其片段投送到樹突狀細胞中的MHCI抗原加工路徑。在本發明的某些實施例中，提供了融合蛋白質，其包含所關注的抗原或其片段和CD74內體靶向信號。在某些實施例中，靶向信號包含NCBI蛋白質數據庫登錄號P04441中闡述的序列的氨基酸2到17(序列:ddqrdlisnheqlpil)。[0030]本發明還提供了表達所述融合蛋白質的聚核苷酸、表達載體和細胞(包括樹突狀細胞)。如上所述，所屬領域的技術人員將清楚適當表達載體。表達所述融合蛋白質的聚核苷酸和表達載體可在體內用于基因工程細胞(包括(但不限于)樹突狀細胞)，或可離體用于基因工程細胞(包括(但不限于)樹突狀細胞)且這些經基因工程改造的細胞可接著投與患者。融合蛋白質、聚核苷酸、表達載體和細胞可與醫藥學上可接受的稀釋劑或載劑一起作為醫藥組合物投與。[0031]MHCI交叉呈遞的增強可引起免疫反應的增強。具體來說，⑶74依賴性MHCI內溶酶體樹突狀細胞交叉呈遞的增強可引起對MHCI介導的CTL反應的刺激。因此，在本發明的某些實施例中，提供了一種通過增強MHCI內溶酶體交叉呈遞來刺激MHCI介導的CTL反應的方法。如上所述，MHCI交叉呈遞的增強可經由在樹突狀細胞中過度表達⑶74和/或將抗原或其片段靶向MHCI抗原加工路徑進行。這些方法可與其它免疫刺激方法(如投與免疫刺激化合物，包括(但不限于)細胞因子)組合以進一步刺激免疫反應。所屬領域的技術人員將清楚適于與本發明的化合物和方法一起使用的其它免疫刺激方法和化合物。[0032]所屬領域的技術人員將易于了解，刺激CTL反應可適用于預防和/或治療許多疾病和/或病狀。舉例來說，刺激CTL反應可適用于預防和/或治療由細胞內病原體(包括(但不限于)細菌、瘧原蟲和病毒)引起的疾病和/或治療癌癥。因此，在本發明的某些實施例中，提供了預防和/或治療由細胞內病原體引起的疾病的方法，其通過刺激MHCI交叉呈遞路徑進行。在其它實施例中，提供了治療癌癥的方法，其通過刺激MHCI交叉呈遞路徑進行。[0033]在某些實施例中，提供了預防和/或治療病毒性感染(包括(但不限于)HIV感染)的方法。在某些實施例中，提供了預防和/或治療細菌感染(如分枝桿菌感染，包括(但不限于)結核分枝桿菌(M.tuberculosis)感染)的方法。在某些實施例中，提供了預防和/或治療瘧原蟲感染(包括(但不限于)預防和/或治療瘧疾)的方法。[0034]增強MHCI抗原的激活的化合物和方法可適用于改進疫苗的免疫原性和功效。因此，本發明的化合物可用作佐劑和/或疫苗。舉例來說，表達⑶74的聚核苷酸、表達載體和/或樹突狀細胞可用于刺激免疫反應。另外，靶向MHCI交叉呈遞路徑的融合蛋白質(和表達所述融合蛋白質的聚核苷酸和/或表達載體)可用于疫苗。因此，在某些實施例中，提供了靶向MHCI交叉呈遞路徑的疫苗。[0035]在某些實施例中，提供了用于刺激疫苗中初次免疫反應的組織蛋白酶裂解肽和這些肽的多聯體。在某些實施例中，組織蛋白酶為組織蛋白酶S。[0036]在某些實施例中，提供了用于改進疫苗性能的化合物和方法。在某些實施例中，提供了用于改進癌癥疫苗性能的化合物和方法。在某些實施例中，提供了用于改進對抗病毒(包括(但不限于)HIV)的疫苗的性能的化合物和方法。在某些實施例中，提供了用于改進對抗細菌(如分支桿菌，包括(但不限于)結核分枝桿菌)的疫苗的性能的化合物和方法。在某些實施例中，提供了用于改進對抗瘧原蟲(包括(但不限于)惡性瘧原蟲(PlasmodiumfaIciparum))的疫苗的性能的化合物和方法。[0037]對CD74作用的理解也可開始闡明在未來會沖擊個人化醫學選擇的個體之間的免疫反應差異。因此，在某些實施例中，提供了基于個體的⑶74依賴性MHCI交叉呈遞路徑開發個人化疫苗途徑的方法。[0038]MHCI交叉呈遞的抑制可引起對免疫反應的抑制。舉例來說，⑶74表達的缺陷可引起MHCI交叉呈遞減少，所述減少又可減少MHCI介導的免疫反應，包括MHCI介導的CTL反應。因此，在本發明的某些實施例中，提供了抑制MHCI交叉呈遞且由此抑制MHCI介導的免疫反應的方法，其通過在樹突狀細胞中抑制CD74的表達和/或活性進行。所述方法可適用于治療自體免疫疾病和/或預防/抑制移植物排斥。抑制CD74的表達和/或活性的化合物可包括例如反義化合物和/或中和抗體。[0039]已表明MHCI信號傳導可影響Toll樣受體(TLR)先天性炎癥反應。具體來說，已發現組成性表達的膜MHCI減弱TLR觸發的先天性炎癥反應。(自然免疫學(NatureImmunology)13:551-559)。因此，在本發明的某些實施例中，提供了通過改變MHCI信號傳導來改變先天性免疫反應的方法。[0040]可在體內動物模型中測試本發明的化合物對免疫反應的影響。舉例來說，可在體內通過重組RAG-/-免疫缺陷小鼠中的抗原呈遞細胞和T細胞來評估免疫反應。因此,在本發明的某些實施例中，提供了在RAG-/-免疫缺陷小鼠中篩選免疫調節劑和/或佐劑的方法，其包含用樹突狀細胞和⑶8+T細胞重組小鼠且分析小鼠中的免疫反應。候選免疫調節劑可直接投與重組后的小鼠和/或樹突狀細胞和/或T細胞(隨后注射到RAG-/-小鼠中)。[0041]⑶74缺陷小鼠和/或樹突狀細胞也可用于開發靶向MHCI交叉呈遞路徑的疫苗。舉例來說，所述小鼠和細胞可適用于鑒別由MHCI交叉呈遞的肽，且因此可適用于刺激初次免疫反應。為了獲得對本文中所述的本發明的更好了解，闡述以下實例。應了解，這些實例打算描述本發明的說明性實施例且并不打算以任何方式限制本發明的范圍。[0042]實例:⑶74依賴性MHCI類內溶酶體交叉呈遞路徑.[0043]免疫反應由交叉呈遞外源性抗原的樹突狀細胞(DC)啟動并激活。伴侶分子CD74(不變鏈)被認為在主要組織相容性復合體(MHC)II類的情形下專門促進DC激活。然而，此處展示了DC中的CD74依賴性MHCI類交叉呈遞路徑，其在對病毒蛋白質相關抗原和細胞相關抗原產生MHCI類限制性、溶細胞性T淋巴細胞(CTL)反應方面具有重要的作用。⑶74與DC的內質網中的MHCI類締合且介導MHCI類向內溶酶體隔室運輸以用于裝載外源性肽。推斷出，CD74在用于激活MHCI類介導的CTL反應的內溶酶體DC交叉呈遞中具有先前未被發現的生理功能。[0044]在初次免疫反應期間，樹突狀細胞(DC)為主要的抗原呈遞細胞，其主要經由交叉呈遞并交叉激活T細胞來啟動適應性免疫反應。這涉及細胞外抗原攝取、細胞相關的抗原片段的消化和主要組織相容性復合體(MHC)I類和MHCII類分子上蛋白水解肽產物的呈遞1O對于MHCI類，已描述了兩種可闡明這一過程如何發生的主要路徑:有說服力地展示在體外起作用的胞質路徑2_5和展示在體內對某些抗原具有主要作用的液泡路徑6Λ交叉呈遞的‘吞噬-ER’(內質網介導的吞噬作用)模型已被視為主要交叉呈遞路徑9。隨后的數據質疑所述結論'促成這一爭論的一個因素似乎是對數據的過度詮釋，所述數據將細胞內蛋白質指定為確定的特定細胞器標記，其常常并非唯一的而是僅僅在動態細胞器生物發生和分配期間經歷富集。另外，可從不同形式外源性抗原的研究和在長期DC細胞株的研究相對于剛分離的DC的研究中推斷出不同結論。[0045]在液泡路徑中，組織蛋白酶S已被鑒別為會產生裝載在易于接受肽的MHCI類分子上的抗原肽的蛋白酶n。另外，膜和胞質SNARE蛋白質(其在細胞內膜融合期間控制供體和接受體的系栓和對接事件)似乎也在交叉呈遞事件中具有基礎性作用12。然而，交叉激活隔室中MHCI類的來源、其轉運機制和肽裝載部位仍然是活性研究領域8，13。[0046]已展示了再循環MHCI類進入內體的自發性內化14’15。已公開的結果支持其中MHCI類從質膜再循環到內溶酶體裝載隔室的模型通過識別可見于MHCI類細胞質尾域的酪氨酸內化信號來促進8’13。因此，從質膜再循環的MHCI類分子是用于裝載注定參與交叉呈遞的外源性抗原的MHCI類的一個來源8，13。同樣地，也已提出MHCI類從內質網(ER)轉運到內吞隔室。這可通過涉及吞噬體和ER的融合的機制發生9。替代性和潛在補充假設是伴侶分子⑶74(不變鏈)(已知與ER中的MHCII類締合，由此防止肽的過早結合且通過分選CD74細胞質尾域中存在的信號來介導向內吞路徑的運輸U6)可結合MHCI類且將MHCI類的一部分傳遞到液泡-內吞隔室以在交叉呈遞中起作用17’18。這一機制將巧合地將易于接受肽的MHCI類與外源性抗原和MHCII類分子置放于相同隔室(或相似隔室)19，MIIC隔室，促進抗原肽裝載并結合到MHCI類分子上。這一路徑將MHCI類轉運與液泡路徑關聯，因為⑶74未必將參與MHCI類外源性呈遞的胞質投送2°’21。[0047]已在人細胞株中展示了MHCI類與⑶74的相互作用和其在同一隔室中巧合的定位17_19。盡管基于較舊的范例推斷出，MHCI類-⑶74相互作用可能并不控制MHCI類在生理條件下轉運到內體的命運22，但其它對比研究已展示經轉染以表達⑶74的細胞具有由不同等位基因編碼的MHCI類的遠為更高的表面表達，這表明MHCI類-⑶74可能具有功能重要性23。此處研究了MHCI類與⑶74體內相互作用的免疫學相關性，且描述了⑶74在通過DC交叉呈遞外源性抗原和后續交叉激活中的明確并關鍵的作用。[0048]結果[0049]⑶74為初次抗病毒反應所需[0050]DC可被直接感染且可因此使用通過MHCI類的經典呈遞來活化未處理⑶8+T細胞。然而，在經病毒以低效價感染期間，DC的直接感染較不可能，且DC交叉呈遞是造成⑶8+T細胞反應產生的占主導地位的路徑8’24。為了解決⑶74在交叉呈遞以產生初次抗病毒免疫反應中的作用，用低劑量水泡性口炎病毒(VSV)感染野生型(Cd74+/+)小鼠和CD74缺乏￠(174+)小鼠。我們類似地感染缺乏轉運蛋白TAP的小鼠(Tapl+小鼠)作為陰性對照，所述小鼠的MHCI類的裝配和細胞內轉運受損，且由此因不當胸腺選擇而缺乏CD8+T細胞25(圖1和圖7a)。在這個感染中，對VSV的初次和記憶⑶8+T細胞反應可在不存在⑶4+T細胞的情況下產生26’27。以這種方式，CD74在交叉呈遞中的作用可在不考慮其在CD4+T細胞反應中的作用的情況下評估。評估在VSV感染之后響應于MHCI類(H-2Kb)上呈遞的免疫顯性表位VSV核蛋白氨基酸52-59(VSVNP(52-59))產生的⑶8+T細胞的頻率。0(174+小鼠與Cd74+/+小鼠相比產生抗原特異性⑶8+T細胞的能力顯著較低(5.0%對19.0%;圖la、b)。這引起細胞毒性T淋巴細胞(CTL)殺傷能力較小的免疫反應(圖1c)。[0051]構筑骨髓嵌合體以進一步排除T細胞在VSV感染模型中幫助交叉激活的作用的可能性26’27。另外，嵌合體用于證實在產生免疫反應方面的缺陷是否取決于造血細胞衍生的DC交叉呈遞抗原并激活T細胞的能力。為此，具有Cd74+/+骨髓(Cd74+/+—Cd74+/+)或CC174+骨髓(CC174+—Cd74+/+)的Cd74+/+小鼠和重組的CC174+小鼠用Cd74+/+骨髓(Cd74+/+—Cd74+)或Cd74+骨髓(Cd74+—Cd74+)重組。在Cd74+/+—Cd74+/+和0(174+—Cd74+/+小鼠的外周中已發現正常量的⑶8+T細胞和⑶4+T細胞。然而，在CC174+—CC174+和Cd74+/+—Cd74v_小鼠中發現較少的CD4+T細胞和稍微較多的CD8+T細胞(圖7b、c)。這指示了在接受體CC174+小鼠中的陽性選擇因CC174+胸腺上皮細胞中MHCII類的較低豐度而受損。[0052]為了檢查抗病毒反應，嵌合小鼠用低效價VSV感染且通過四聚體分析和CTL殺傷性分析評估VSVNP(52-59)特異性CD8+T細胞產生(圖2)。CD4+T細胞數目低的Cd74+/+—Cd74+小鼠能夠與野生型Cd74+/+—Cd74+/+嵌合體類似地產生VSVNP(52-59)特異性⑶8+T細胞(1.1%對1.2%;圖2a)，這引起具有類似殺傷能力的免疫反應(16.8%對1.9%;圖2b)。然而，CC174+—Cd74+/+小鼠盡管具有正常CD4+T細胞，但在產生VSVNP(52-59)特異性⑶8+T細胞方面極度受損(0.2%;圖2a)，這引起較低的CTL殺傷反應(18.0%對4.5%;圖2b)。這表明VSV特異性CTL反應的產生與⑶4+T細胞數目無關。值得注意的是，需要表達⑶74的骨髓衍生的抗原呈遞細胞且其允許CC174+小鼠產生與Cd74+/+小鼠的抗病毒免疫反應類似的穩固的抗病毒免疫反應。[0053]⑶4+細胞的耗盡對抗VSV反應沒有影響[0054]接著，排除了以下可能性:由CC174+小鼠中功能失常的陽性選擇產生的Cd74+/+—Cd74^嵌合體中的剩余CD4+T細胞促進其抗病毒免疫反應的效率。在感染過程期間，Cd74+/+—Cd74^嵌合體通過對其注射CD4的GKl.5抗體(抗CD4)而耗盡CD4+細胞。盡管⑶4+細胞相對于背景幾乎是完全不可檢測的，但耗盡⑶4+細胞的Cd74+/+—Cd74v-嵌合體與0(174+—Cd74+/+嵌合體相比產生顯著較多的對VSVNP(52-59)具有特異性的CD8+T細胞(13.5%對4.1%;圖2c)，這引起溶解活性較大的免疫反應(14.0%對4.9%;圖2(1)。這些數據合起來證實Cd74+/+—CC174+與CC174+—Cd74+/+嵌合體相比展出更強的抗VSV反應。這不依賴于⑶4+T細胞，而是代之以歸因于CC174+小鼠經充分能夠激活抗病毒⑶8+T細胞反應的野生型DC的重建。[0055]細胞相關的抗原的交叉激活是⑶74依賴性的[0056]為了研究CD74在對細胞相關的抗原的初次免疫反應中的作用，使用經卵白蛋白(OVA)脈沖處理的經致死性輻射的DC或經OVA脈沖處理的具有與宿主不匹配的MHCI類的DC作為細胞相關的抗原的來源以活化Cd74+/+小鼠、耗盡CD4+細胞的Cd74+/+小鼠和CC174+小鼠以及重組的小鼠嵌合體中的CTL。用細胞相關的OVA攻擊的具有野生型免疫系統的小鼠能夠誘導源自于OT-1轉基因小鼠的CD8+T細胞的增殖(圖8)或活化會有效殺傷OVA氨基酸257-264(0VA(257-264)脈沖處理的目標細胞的內源性CTL(數據未示出)。然而，在細胞相關的OVA的相同攻擊的情況下，造血系統缺乏CD74的小鼠更不能刺激OT-1CD8+T細胞的增殖且產生會促成較低殺傷能力的較少內源性CTL(圖8和數據未示出)。[0057]⑶74依賴性交叉激活不依賴于⑶4+T細胞[0058]為了特別集中于DC交叉激活缺陷并排除外來因素(包括對CD4+T細胞輔助的需求)的促成作用，將CC174+和Cd74+/+DC與OVA蛋白或OVA(257-264)肽一起孵育，并將那些細胞與經細胞溶質染料CFSE標記的純化的OT-1⑶8+T細胞一起注射到BALB/c背景的T細胞缺乏的重組-活化基因I缺乏(Ragl+)小鼠中。評估DC交叉激活OT-1T細胞的能力(圖3a)。當與OVA蛋白一起孵育時，CC174+DC與Cd74+/+DC相比誘導遠為更少的OT-1增殖(18%對48%;圖3b)。然而，當DC經OVA(257-264)肽脈沖處理時，作為直接呈遞的陽性對照，Cd74^DC在活化CD8+0T-1T細胞方面與Cd74+/+DC—樣有能力(59.5%對60.0%;圖3b)。[0059]為了解決⑶74在DC從注射部位到脾臟的運動性和歸巢28方面的可能的混淆作用，評估在靜脈注射之后CFSE標記的DC的定位29(圖3b和圖9)。靜脈內注射到Ragl+小鼠中的Cd74+/+和CC174+DC等同地定位于脾臟。因此，CC174+DC誘導T細胞增殖的能力較低并不歸因于DC遷移的差異，而是歸因于加工和呈遞抗原的能力較小。推斷出CD74在通過MHCI類交叉呈遞細胞相關的抗原方面和在體內CD8+T細胞激活方面具有關鍵作用，且這與⑶4+T細胞輔助或⑶74介導的DC運動性無關。[0060]⑶74缺乏的DC具有受損的交叉激活能力[0061]評估來自各種小鼠品系的脾臟衍生的DC體外交叉呈遞H_2Kb限制性卵白蛋白表位OVA(257-264)的能力。DC在有或者沒有細胞因子的情況下與可溶性OVA—起孵育，并且或者用對H-2Kb-0VA(257-264)復合體具有特異性的抗體對細胞進行染色，或者將細胞與B3Z(—種T細胞雜交瘤，其在識別H-2Kb與OVA(257-264)締合之后被活化)一起培養3°。Cd74+/+和CC174+DC具有類似的內化OVA的能力且具有類似的MHCI類的總表面表達(圖4a、b)。然而，在與OVA—起孵育之后，CC174+DC與Cd74+/+DC相比具有低得多的H-2Kb-0VA(257-264)復合體豐度(圖4b)。已顯示DC的交叉激活能力通過誘導共刺激和MHC分子上調且減少內吞作用的炎性介體增強31’32。這產生較大的對T細胞激活的能力，但減小DC捕獲并呈遞可溶性抗原的能力。為了在涉及共刺激的類似體內條件的情況下評估T細胞活化，將OVA脈沖處理的DC在有和沒有細胞因子的情況下與B3ZT細胞一起孵育。在腫瘤壞死因子(TNF)和干擾素-Y存在下，Cd74+/+和CC174+DC具有等同的上調共刺激分子CD80、CD86和CD40的能力(圖4c和數據未示出)，但Cd74+DC與Cd74+/+DC相比活化B3ZT細胞的能力遠為較小(圖4d)。正如所料，細胞在細胞因子存在下與源自于Tapl+小鼠的OVA脈沖處理的DC—起孵育后，未檢測到T細胞活化。這些數據支持⑶74在T細胞交叉激活中具有作用且并不影響共刺激分子的表達的結論。[0062]⑶74介導內溶酶體MHCI類裝載[0063]為了更好地在分子層面了解交叉呈遞和激活缺陷的機制，使用比較性免疫熒光共聚焦顯微術(ICM)來評估在有和沒有TNF的情況下Cd74+/+和CC174+DC中OVA(257-264)裝載的MHCI類的細胞內定位、運輸和分布。細胞與OVA蛋白一起孵育，且用H-2Kb-0VA(257-264)的抗體和晚期內體標記LAMP-1的抗體細胞內染色細胞。當未將TNF加入培養物時，與LAMP-1的共定位在針對H-2Kb-0VA(257-264)復合體染色的許多Cd74+/+脾臟DC中是可檢測的(圖4e、f)。在Cd74+和Tap1+DC中鑒別出一些H_2Kb-0VA(257-264)復合體；然而，與晚期內體的共定位是最少的(圖4e、f)japl+DC中不存在裝載的MHCI類與TAP在交叉呈遞中的作用(一種之前已假定的機制)一致24’33。在用TNF處理之后，Cd74+/+DC具有顯著較多的H-2Kb-0VA(257-264)復合體與LAMP-1(圖4e、f)而非與ER標記GRP78或高爾基體標記giantin(數據未示出)的共定位。相比之下,在CC174+DC中的晚期內體隔室中觀察到很少的H-2Kb-0VA(257-264)復合體，這指示晚期內體中H_2Kb-0VA(257-264)復合體的形成較少(圖4f)。ICM數據的比較指示了在存在TNF的情況下，源自于CC174+的DC與Cd74+/+DC相比具有顯著較少的OVA(257-264)裝載到晚期內體中的H_2Kb上(62%對32%;圖4f)。這些數據表明在DC中，存在為交叉呈遞外源性抗原所需的⑶74依賴性MHCI類抗原加工路徑。[0064]CD74將MHCI類從ER引導到內溶酶體[0065]⑶74缺陷在晚期內體隔室中產生較少的H-2Kb_0VA(257-264)復合體的發現表明CD74將MHCI類從ER靶向內溶酶體路徑。在那里，CD74據推測降解，且MHCI類裝載外源性抗原肽。為了更詳細地檢查這一點，內體的酸化經由使用氯奎阻斷，且評估⑶74介導的MHCI類交叉呈遞路徑。已發現，用氯奎處理的骨髓衍生的DC(BMDC)具有與未經處理的對照的MHCI類表面表達等同的MHCI類表面表達，且在經OVA(257-264)肽脈沖處理時展示H-2Kb-0VA(257-264);然而，在與可溶性OVA—起孵育時，經氯奎處理的DC與未經處理的DC相比具有少得多的表面H-2Kb-0VA(257-264)(圖5a_c)。ICM分析展示BMDC在用氯奎處理之后具有更多的H-2Kb與⑶74的共定位(圖5d、e)。這指示了用氯奎處理產生更多的內溶酶體MHCI類分子，其據推測通過以與針對MHCII類路徑所報道34類似的方式阻斷內溶酶體中MHCI類與⑶74的解離并通過抑制再循環MHCI類的降解進行。最后結果是MHCI類較少裝載外源性抗原且隨后表面H-2Kb-0VA(257-264)較少。為了證實⑶74將MHCI類引導到內溶酶體隔室的發現并明確地展示⑶74介導的MHCI類運輸，⑶74缺乏的BMDC經全長⑶74或缺乏胞質運輸域的⑶74的表達載體轉染，且評估其呈遞OVA蛋白或OVA(257-264)肽(將略過對加工的需求的陽性對照)的能力。CC174+DC的交叉激活能力受損且與Cd74+/+DC相比誘導少得多的OT-1T細胞增殖(圖5f)。正如所料，交叉激活能力恢復η個經全長⑶74重組的CC174+DC，且DC能夠以與野生型DC的能力類似的能力誘導OT-1T細胞增殖。然而，當我們將缺乏內體運輸基元的⑶74再引入CC174+DC時，交叉激活能力繼續受損(圖5f)，這展示出在不存在CD74的情況下，引導到內溶酶體的MHCI類較少且OT-1T細胞的交叉激活較少。合起來，這些數據展示⑶74影響MHCI類運輸到其中發生外源性抗原有效呈遞的交叉激活隔室。[0066]⑶74和MHCI類分子在DC中形成復合體[0067]在分子層面研究作為將MHCI類靶向交叉激活隔室的先決條件的CD74與MHCI類在DC中的相互作用。將來源于Cd74+/+和CC174+小鼠脾臟的DC分離以用于通過ICM分析。DC用抗H-2Kb和抗CD74染色，且發現H_2Kb分子分布在細胞表面處和細胞質(其中其主要定位于泡樣隔室)中。CD74分子與這些細胞內隔室顯著共定位于Cd74+/+DC中(圖6a)。然而，我們觀察到H-2Kb與⑶74較少共定位于Tapl+DC中，這推測上歸因于H_2Kb的限制性總體可利用性(圖6a)。[0068]為了鑒別其中這些分子共定位的隔室，用抗H_2Kb和抗LAMP-1染色脾臟DC(以檢測晚期內體)。相當大比例的晚期內體在Cd74+/+DC中含有H-2Kb(圖6a)，這證實了實質性量的MHCI類分子存在于內吞隔室中8，21。相比之下，僅一小部分H-2Kb與晚期內體共定位于CC174+DC中(圖6a)。這一結果由ICM圖像的定量證實，這表明顯著與在Cd74+/+DC中相t匕，在CC174+DC中顯著更少的MHCI類分子靶向內溶酶體隔室(73%對47%;圖6b)。共定位在Tapl+DC甚至更不明顯中，可能歸因于在不存在TAP的情況下H_2Kb分子對內溶酶體的靶向受損。這些數據表明實質性部分的MHCI類分子與CD74相互作用，促進其(可能從ER)轉運到DC的內溶酶體隔室。[0069]DC中MHCI類與⑶74之間的直接分子相互作用的證實將進一步強化這是DC中迄今尚未描述的抗原呈遞路徑的論據。為了證實這一點，從各種基因敲除和野生型小鼠獲得BMDC且用35S標記細胞，接著使共免疫沉淀的復合體結合到MHCI類(H_2Kb)、MHCII類(1-Ab)或CD74，且基于這些復合體中的蛋白質的表觀分子量對其進行鑒別。MHCII類的抗體免疫沉淀Cd74+/+DC中CD74的豐富的41千道爾頓(kilodalton)(4IkDa)和31kDa同工型(圖6c)。抗H-2Kb也沉淀那些相同的⑶74同工型(圖6c)，這表明在任一時刻，⑶74與DC中總MHCI類分子池的一部分結合。用介于41kDa和31kDa之間的分子大小檢測的兩種重要蛋白質可能是MHCI類裝載或轉運復合體的組分。其大小與在MHCII類裝載中充當伴侶分子的H-2DM或H-2D0的大小一致，但其身份尚未最終確定。⑶74的41kDa和31kDa形式在CC174+DC中不存在(圖6c)，這指示其的確是已展示與MHCI類和MHCII類分子一起免疫沉淀的所報道的CD74同工型17_19’23。另外，在Tapl+DC中，41kDa和3IkDaCD74同工型與H-2Kb—起免疫沉淀(圖6c)，這表明CD74與MHCI類的結合并不依賴于TAP的肽轉運蛋白功能。最后，⑶74同工型與來自β2-微球蛋白缺陷型DC的MHCI類一起沉淀(圖6c)，這表明⑶74能夠結合締合折疊β2-微球蛋白的MHCI類復合體和無β2-微球蛋白的MHCI類復合體。[0070]接著使用免疫印跡分析來證實與MHCI類分子結合的⑶74同工型的身份。使蛋白質經抗I_Ab、抗H-2Kb和由外顯子8編碼的MHCI類分子的區域的抗體以及與不相關的轉鐵蛋白受體的抗體免疫沉淀，隨后用抗CD74進行免疫印跡分析(圖6d)。正如所料，CD74與MHCII類(1-Ab)締合，但不與不相關的蛋白質轉鐵蛋白受體締合(圖6d)。CD74被決定性地鑒別為與MHCI類締合(圖6d)，這證實這種相互作用在用于這一免疫沉淀程序的條件下是可檢測并穩定的。[0071]MHCI類-⑶74復合體在前高爾基體隔室中形成[0072]接著，為了明確地展示MHCI類與⑶74之間相互作用的動力學和來源，使用生物化學手段來進一步推演其中發生這種相互作用的細胞內隔室。分泌路徑中的蛋白質在其從ER運輸穿過高爾基體隔室時獲得對內切糖苷酶(EndoH)的抗性，且其在所述高爾基體隔室中經歷甘露糖苷酶II裂解35。已被普遍接受的是，對EndoH的敏感性充當蛋白質定位于ER或者ER與順面高爾基體之間的‘過渡元件’中的指示。來自Cd74+/+BMDC的⑶74結合的MHCI類經抗⑶74或抗MHCI類免疫沉淀，且用EndoH處理免疫沉淀物，接著用抗MHCI類或抗⑶74進行免疫印跡分析以將MHCI類-⑶74復合體對EndoH的敏感性可視化。我們發現，與⑶74締合的MHCI類對EndoH敏感(圖6e、f)。另外，在用氯奎處理之后，EndoH抗性CD74與MHCI類的締合略微較多，如由較高條帶強度所展示(圖6f)。總體而言，這些數據表明，⑶74與MHCI類的相互作用起源于ER，其中⑶74結合MHCI類分子的‘不成熟’部分且自此處啟動向內溶酶體隔室的運輸，從而介導交叉呈遞、T細胞激活和初次免疫反應8，13。[0073]⑶74不影響MHCI類的內化[0074]最后，為了確定結合⑶74的MHCI類的來源，我們研究了⑶74介導的MHCI類從質膜的運輸的作用。為了確定⑶74是否在表面受體再循環中起作用，監測Cd74+/+和CC174+DC中的MHCI類內化。BMDC用抗H_2Kb染色且使用流式細胞術以監測隨時間推移的內化。Cd74+/+和CC174+DC具有極其相似的MHCI類內化動力學(圖6g)。這指示了⑶74并不與MHCI類在細胞表面處相互作用以引起內化到細胞內隔室中以實現交叉呈遞。這種被致意的已公開研究展示出MHCI類分子的細胞質域中的基于酪氨酸的基元對于再循環MHCI類分子從質膜內化到內溶酶體交叉激活隔室中至關重要8，13且因此展示出⑶74依賴性MHCI類運輸的獨特和不同的路徑。[0075]討論[0076]外源性肽由MHCII類分子呈遞相對于胞質肽由MHCI類分子展示的二分法已被修訂6’8’36’37。MHCI類交叉呈遞不僅展示出這種劃分的模糊性而且展示出對于特定細胞類型(如DC)來說，這種現象在體內產生初次免疫反應中起到重要作用8。另外，MHCII類分子上內源性衍生的肽的呈遞展示出MHCI類和II類路徑可能交叉且其可能共用相同的抗原裝載隔室38。盡管⑶74被經典公認為通過MHCII類呈遞中的主要伴侶分子，但⑶74和MHCI類也已展示出互相作用17’18’39’4°。然而，⑶74對MHCI類介導的免疫反應的生理學貢獻尚未被研究，且對MHCI類-⑶74相互作用的鑒別基本上被貶損為生物學好奇心。此處，已展示⑶74實質上有助于DC中的MHCI類交叉呈遞路徑。這些研究已鑒別出⑶74依賴性交叉激活在產生對病毒和細胞相關的抗原的反應中的重要作用。[0077]為了評估經由DC交叉呈遞產生的⑶4+T細胞非依賴性CTL反應，使用以低劑量VSV感染的模型。低病毒劑量模擬其中大部分DC將推測上幸免于感染且其它感染的細胞將充當抗原肽供體的生理學情形，這允許直接或內源性呈遞對交叉呈遞的描述。缺乏⑶74的小鼠在其尤其對交叉激活可能相較于通過DC直接激活占主導地位的低病毒劑量產生MHCI類限制性CTL反應的能力方面顯著受損的觀察結果支持了以下結論:MHCI類交叉呈遞是抗病毒⑶8+T細胞介導的免疫性在體內生理條件下產生的主要機制8’41。我們也證實了別人的工作且展示出對病毒(如VSV)的CTL反應是⑶4+T細胞非依賴性的26’27且因此不依賴于MHCII類-⑶74復合體的功能。[0078]骨髓嵌合體的產生使得研究野生型宿主背景的CC174+骨髓細胞衍生的DC的活性成為可能。那些研究得出結論，CD74的激活缺陷是屬于DC來源且指示出所述缺陷是在DC交叉呈遞層面下。另外，⑶74依賴性交叉激活被鑒別為重要的MHCI類抗原呈遞路徑，因為不存在CD74產生超過50%更少的抗VSVCTL0另外，通過小鼠嵌合體獲得的發現支持了以下觀察結果:CD74缺陷與較低豐度的CD4+T細胞無關地損害對VSV產生的初次免疫反應26，42。這是根據其它已公開的數據，展示出在一些情況下，⑶4+T細胞為二次CTL群體擴增而非初次群體擴增所需43。CDS+CTL通過B7分子共刺激以及T細胞抗原受體的刺激可在沒有T細胞輔助的情況下足以誘發CD8+CTL26。或者，完全有可能的是，存在兩種不同譜系的CDS+CTL前體，由此CD4+T細胞非依賴性群體提供了對各種病毒的主要的反應，這引起在不存在CD4+T細胞的情況下無CTL功能損失42。[0079]已發現，⑶74缺乏其內體靶向信號的形式的表達未能補充DC交叉呈遞并激活T細胞。然而，用含有功能內體靶向信號的野生型⑶74分子重組恢復了交叉激活，這支持了MHCI類是通過⑶74從ER轉運到內溶酶體的機制的提議。另外，完全缺乏⑶4+T細胞的Ragl+小鼠中CC174+DC對CD8+T細胞的缺陷活化明確地展示出，DC交叉激活功能的缺陷是歸因于不存在CD74。在我們的研究中，CD74在體內DC歸巢和運動性中似乎并不具有作用，但介導用于DC對⑶8+T細胞的⑶74依賴性MHCI類交叉激活的生理學上重要路徑。[0080]我們的研究還提供了在生理條件下DC中MHCI類分子與⑶74之間的締合的證明。其還表明在MHCI類-CD74復合體在內溶酶體中解離之后，內溶酶體隔室中可接著發生MHCI類重鏈與β2_微球蛋白和抗原肽的重裝配44。在此情況下，直接展示了MHCI類-⑶74復合體仍然在被鑒別為晚期內體的泡樣隔室中裝配。另外，已確立的是，CD74影響內溶酶體中MHCI類的存在，這證實了以下已公開的觀察結果:MHCI類-⑶74相互作用引起MHCI類分子的子集對內溶酶體路徑的靶向17。[0081]先前已描述的MHCI類細胞質尾域中的酪氨酸內化信號8’13’45將再循環MHCI類靶向到交叉激活隔室中。與這一機制形成對比，⑶74與MHCI類分子之間的穩定相互作用未必發生在質膜處以引導再循環MHCI類，因為DC中不存在CD74似乎并不影響MHCI類的內化。我們的結果支持了以下模型=MHCI類通過細胞質域中的酪氨酸內化信號所引導而從質膜再循環以及MHCI類經由結合到CD74伴侶分子從ER運輸兩者促成內溶酶體路徑中的易于接受肽的MHCI類池。因此，以與通過MHCII類分子所用的類似的方式，MHCI類-⑶74復合體在ER中形成且可以在其運送到交叉激活隔室時遮蔽肽結合的構象形式保持。實際上，兩項獨立研究已展示CD74肽(包括來源于核MHCII類締合的⑶74肽CLIP的較小肽(MRMATPLLM)、結合在MHCII類結合溝槽中的⑶74的部分)可從MHCI類分子洗脫46’47。因此，這種肽是CLIP的MHCI類等效物的強有力的候選物。這種CLIP衍生的肽可防止類似于MHCII類情形的過早肽結合46’48。在這種模型中，在消化并去除CD74之后，MHCI類可為裝載高親和力的組織蛋白酶S衍生的外源性肽11且前進到細胞表面，其中其可有效地將⑶8+T細胞前體激活成變得活化。[0082]總而言之，此處我們的結果和其它已公開數據8’49強調了內溶酶體作為DC中交叉呈遞的主要隔室的重要性，且此處我們的研究已正式確定了MHCI類-⑶74相互作用關于MHCI類分子的細胞內投送和DC的交叉激活功能的結構和功能相關性。我們的觀察結果已定義了先前未知的免疫反應激活路徑；未來的研究將完全闡明這一過程。我們的結果具有相當大的臨床相關性，且表明將疫苗候選物靶向DC的內溶酶體將增強對MHCI類和MHCII類抗原兩者的激活且由此改進疫苗的免疫原性和功效。[0083]方法[0084]小鼠.Cd74+/+(H-2Kb)小鼠是來自查爾斯河實驗室(CharlesRiver)。β2_微球蛋白缺陷型BZnr^TaplvOT-1OUKb)和Ragl+(H_2Kd)小鼠是來自杰克遜實驗室(JacksonLaboratory)。Cd74+(H_2Kb)小鼠是來自D.馬西斯(D.Mathis)的禮物。對于嵌合小鼠，供體骨髓用抗Thy-1(MRC0X-7;艾碧康公司(Abcam))耗盡成熟T細胞且被注射(IX17個細胞)到經亞致死輻射的接受體(1，200拉德)中。外周T細胞子集在用抗⑶8(53-6.7；碧迪法明更公司(BDPharmingen))和抗⑶4(GK1.5,碧迪法明更公司)染色之后通過流式細胞術分析。為了耗盡CD4+細胞，在免疫接種之前和T細胞評估之前48小時，用10yg抗Q)4(GK1.5)注射小鼠5°。所有研究均遵循由英屬哥倫比亞大學(UniversityofBritishColumbia)的動物護理委員會(AnimalCareCommittee)和加拿大動物保護協會(CanadianCouncilonAnimalCare)設定的指南。[0085]病毒感染.腹膜內注射VSV(以感染50%組織培養細胞單層的IXlO5到2X15的劑量)。在感染后6天，脾細胞用抗CD8(53-6.7)和H-2Kb-VSVNP(52-59)或H_2Kb-0VA(257-264)iTAg四聚體(免疫組學貝克曼庫爾特公司(immunomics-BeckmanCoulter)染色并用FACSCalibur(碧迪公司(BectonDickinson))和FlowJo軟件分析。脾細胞與ΙμΜOVA(257-264)(SIINFEKL)或VSVNP(52-59)(RGYVYQGL)一起進一步培養5天，隨后如上所述進行四聚體染色。如所述進行細胞毒性分析8。[0086]攝取分析.如所述產生BMDC8。將細胞在4°C下或在37°C下與OVA-AlexaFluor488(30μg/ml;英杰公司(Invitrogen))—起孵育30分鐘。OVA攝取通過流式細胞術分析。[0087]交叉呈遞分析.如所述產生BMDC8或用⑶Ilc+磁性珠粒(美天旎生物技術公司(MiltenyiB1tech))分離脾臟DC。DC與OVA(沃辛頓公司(Worthington))和在指示時與100μM氯奎一起孵育15小時。DC用FeBlock(法明更公司(PharMingen))，接著用抗H-2Kb(AF.6-88.5)、抗CD80(16-10A1)、抗CD86(GLl)、抗CD40(3/23)(均來自碧迪法明更公司)或抗H-2Kb-0VA(257-264)(25.Dl.16;來自J.耶德爾(J.Yewdell)的禮物)染色，并通過流式細胞術分析。針對交叉激活分析，將DC與OVA、GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；15ng/ml;西格瑪公司(Sigma))和TNF(10ng/ml)或干擾素I(安迪公司(R&DSystems))一起孵育。如所述評估B3ZT細胞(來自N.夏斯特里(N.Shastri)的禮物)的活化8。[0088]針對體內研究，將Cd74+/+和Cd74+BMDC與OVA或OVA(257-264)(各自10mg/ml)一起孵育2小時，且靜脈內注射到Ragl+BALB/c小鼠中(IX17個細胞)。24小時后，OT-1T細胞用2.5μMCFSE(羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯；分子探針公司(MolecularProbes)標記且靜脈內注射到小鼠中(5X106個細胞)。OT-1T細胞在脾臟中的增殖在3天后通過流式細胞術以CFSE稀釋度形式評估。為了證實定位到脾臟，將CFSE標記的DC靜脈內注射到Ragl+BALB/c小鼠中。2小時后，用流式細胞術評估脾臟中CFSE+細胞的存在。[0089]共聚焦顯微術.如所述將脾臟衍生的DC分離，固定且使其可滲透8。針對交叉呈遞的分析，將DC在存在或不存在TNF(10ng/ml)的情況下與0VA(5mg/ml)—起孵育10小時。當需要時，將DC在加工之前用50μM氯奎處理72小時34。細胞用抗H-2Kb(AF.6-88.5)、抗CD74(In-l;菲茨杰拉德公司(Fitzgerald))、抗LAMP-1(N19;圣克魯斯生物技術公司(SantaCruzB1technology))或抗H_2Kb-0VA(257-264)(25.Dl.16)染色。將AlexaFluor488結合的或AlexaFluor568結合的兔抗小鼠(A-11029、A_11031;分子探針公司)、AlexaFluor488結合的或AlexaFluor568結合的兔抗山羊(A-11078、A-11079;分子探針公司)或AlexaFluor488結合的山羊抗小鼠(A-11001;分子探針公司)用作二次抗體。用Nikon-Cl、TE2000-UICM和EZ-C1軟件獲得圖像。數據使用ImageJ.1、Openlab和AdobePhotoshop分析。個別顏色的熒光強度以總熒光強度百分比形式呈現。[0090]增殖分析.將來源于C3H/He小鼠(H_2Kk)的BMDC與0VA(10mg/ml)—起孵育15小時且腹膜內注射到小鼠中(5X16個細胞)。如上所述標記并靜脈內注射OT-1T細胞。OT-1T細胞的增殖在3天后通過流式細胞術以CFSE稀釋度形式評估。[0091]轉染.不成熟的BMDC經由使用Amaxa小鼠樹突狀細胞核轉染試劑盒(AmaxaMouseDendriticCellNucleofectorkit)用含有全長小鼠⑶74(p31同工型)或缺乏氨基酸2-17的⑶74的pBabe載體(來自1.沙哈爾(1.Shachar)的禮物)轉染。在電穿孔后I天，將DC與0VA(20mg/ml)或OVA(257-264)(IμΜ)一起孵育8小時，接著與CFSE標記的OT-1⑶8+Τ細胞一起孵育3天。CFSE稀釋度通過流式細胞術評估。[0092]免疫沉淀.將BMDC在無蛋氨酸且無半胱氨酸的培養基中孵育I小時，接著經[35S]蛋氨酸GOOyCi/ml)脈沖處理30分鐘，接著溶解在含有蛋白酶抑制劑‘混合液’(羅氏公司(Roche))和PMSF(苯甲磺酰氟；40μg/ml)的0.5%(體積/體積)NonidetP-40緩沖液(120mMNaCl、4mMMgCl2和20mMTris-HCl，pH7.6)中。當指示時，將DC與100μM氯奎一起孵育過夜，隨后溶解。細胞溶解產物通過與正常家兔血清和蛋白質A-瓊脂糖凝膠(法瑪西亞公司(Pharmacia))—起孵育過夜來進行預澄清。將識別完全折疊的MHCI類的抗H-2Kb(AF6.88.5;碧迪法明更公司)、識別所有MHCI類的由外顯子8編碼的序列的抗體(來自D.威廉姆斯(D.Williams)和B.巴博爾(B.Barber))、抗1-A-1-E(M5/114.15.2;碧迪公司)、抗CD74(In-l;菲茨杰拉德公司)和轉鐵蛋白受體的抗體(H68.4;英杰公司)用于免疫沉淀。樣品通過10%-12%SDS-PAGE分離。將凝膠固定，用Amplify(安瑪西亞生物科學公司(AmershamB1sciences))增強,干燥且曝光到KodakXMR自動射線照相膜上。或者，將樣品轉移到硝化纖維素膜上且使用抗CD74(In-1;菲茨杰拉德公司)或抗MHCI類(KH95;圣克魯斯生物技術公司)通過免疫印跡法分析。樣品根據制造商的方案(新英格蘭生物實驗室(NewEnglandB1labs))用內切糖苷酶Hf消化。全細胞溶解產物作為陽性對照通過免疫印跡法分析。將小鼠免疫球蛋白G的驢抗體(926-32212;里-克爾生物科學公司(L1-CorB1sciences))和小鼠大鼠免疫球蛋白G的山羊抗體(A21096;英杰公司)用作二次抗體。印跡使用Odyssey紅外成象可視化。[0093]MHCI類內化.BMDC用FeBlock(碧迪法明更公司)染色，接著在0°C下用生物素化的抗H-2Kb(AF6-88.5;碧迪法明更公司)標記30分鐘。將樣品在37°C或(TC下孵育。在適當時間，將DC固定于2%(體積/體積)多聚甲醛中且用鏈霉親和素-藻紅蛋白標記，接著通過流式細胞術檢查。數據用Flowjo軟件分析以計算內化的MHCI類的量。[0094]統計分析.史都登氏t檢驗(Student’st_test)用于比較群體之間的差異。當P值小于0.05(兩尾)時，將差異視為在統計學上顯著。[0095]參考文獻[0096]1.瓜利亞爾迪L.E.(Guagliardi,L.E.)等人參與抗原加工和呈遞的分子在早期細胞內吞隔室中的共定位(Co-localizat1nofmoleculesinvolvedinantigenprocessingandpresentat1ninanearlyendocyticcompartment).自然(Nature)343,133-139(1990)。[0097]2.科瓦切維奇-班科夫斯基M(Kovacsovics_Bankowski，Μ.)和洛克K.L.(Rock,K.L.)MHCI類分子上呈遞的外源性抗原的吞曬體到細胞溶質路徑(Aphagosome-to-cytosolpathwayforexogenousantigenspresentedonMHCclassImolecules).科學(Science)267，243-246(1995)。[0098]3.阿克曼A.L.(Ackerman,A.L.),齊里齊斯C.(Kyritsis,C.),坦佩R.(Tampe,R.)和克雷斯韋爾P.(Cresswell,P.)樹突狀細胞中的早期吞噬體形成足以用于外源性抗原交叉呈遞的細胞隔室(Earlyphagosomesindendriticcellsformacellularcompartmentsufficientforcrosspresentat1nofexogenousantigens).美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)100,12889-12894(2003)。[0099]4.蓋爾蒙普雷P(Guermonprez,P.)等人ER-吞噬體融合定義樹突狀細胞中的MHCI類交叉呈遞隔室(ER-phagosomefus1ndefinesanMHCclassIcross-presentat1ncompartmentindendriticcells).自然425，397-402(2003)。[0100]5.霍德M.(Houde,Μ.)等人吞噬體為抗原交叉呈遞的感受態細胞器(Phagosomesarecompetentorganellesforantigencross-presentat1n).自然425，402-406(2003)。[0101]6.普法伊費爾J.D.(Pfeifer，J.D.)等人細菌抗原針對I類MHC呈遞到T細胞的吞嗤力口工(PhagocyticprocessingofbacterialantigensforclassIMHCpresentat1ntoTcells).自然361，359-362(1993)。[0102]7.桑R.(Song,R.)和哈德林C.V.(Harding,C.V.)蛋白酶體、用于抗原呈遞的轉運蛋白(TAP)和β2-微球蛋白在經由替代性I類MHC加工路徑加工細菌或微粒抗原中的作用(Rolesofproteasomes,transporterforantigenpresentat1n(TAP)，andβ2-microglobulinintheprocessingofbacterialorparticulateantigensviaanalternateclassIMHCprocessingpathway).免疫學雜志(J.1mmunol.)156，4182-4190(1996)。[0103]8.利齊G.(Lizee,G.)等人通過主要組織相容性復合體I類細胞質域控制樹突狀細胞交叉呈遞(Controlofdendriticcellcross-presentat1nbythemajorhistocompatibilitycomplexclassIcytoplasmicdomain).自然免疫學(Nat.Immunol.)4，1065-1073(2003)。[0104]9.加農E.(Gagnon,E.)等人內質網介導的吞噬作用是一種進入巨噬細胞的機制(Endoplasmicreticulum-mediatedphagocytosisisamechanismofentryintomacrophages).細胞(Cell)110，119—131(2002)?[0105]10.圖雷N.(Touret，N.)等人ER對吞嗷體形成的貢獻的定量和動態評估(Quantitativeanddynamicassessmentofthecontribut1noftheERtophagosomeformat1n).細胞123，157-170(2005)。[0106]11.沈L(Shen，L.)，西加爾LJ.(SigaljLJ.),伯斯M.(Boes，Μ.)和洛克K.L組織蛋白酶S在產生肽以用于體內TAP非依賴性MHCI類交叉呈遞中的重要作用(ImportantroleofcathepsinSingeneratingpeptidesforTAP—independentMHCclassIcrosspresentat1ninvivo).免疫(Immunity)21，155-165(2004)。[0107]12.西布利安1.(Cebrian,1.)等人Sec22b通過樹突狀細胞調節吞嗷體成熟和抗原交叉呈遞(Sec22bregulatesphagosomalmaturat1nandantigencrosspresentat1nbydendriticcells).細胞147，1355-1368(2011)。[0108]13.巴沙G.(Basha，G.)等人MHCI類內體和溶酶體運輸與樹突狀細胞中的外源性抗原裝載一致(MHCclassIendosomalandlysosomaltraffickingcoincideswithexogenousantigenloadingindendriticcells).公共科學圖書館?綜合(PLoSONE)3，e3247(2008)。[0109]14.丘1.(Chiu，1.)，戴維斯D.M.(Davis，D.Μ.)和施特羅明格J.L(Strominger,J.L.)自發內吞的MHC蛋白質的運輸(TraffickingofspontaneouslyendocytosedMHCproteins).美國國家科學院院刊96，13944-13949(1999)。[0110]15.里德P.A.(Reid,P.A.)和瓦特C.(Watts,C.)細胞表面MHC糖蛋白通過伯氨喹敏感性細胞內隔室的循環(Cyclingofcell-surfaceMHCglycoproteinsthroughprimaquine-sensitiveintracellularcompartments).自然346，655-657(1990)。[0111]16.巴克0.(Bakke，0.)和多貝爾施泰因B.(Dobberstein，B.)MHCII類締合的不變鏈含有內體隔室的分選信號(MHCclassΙΙ-associatedinvariantchaincontainsasortingsignalforendosomalcompartments).細胞63，707-716(1990)。[0112]17.杉田Μ.(Sugita,Μ.)和勃倫那M.B.(Brenner,Μ.B.)不變鏈與主要組織相容性復合體I類分子的締合引導向細胞內吞隔室的運輸(Associat1noftheinvariantchainwithmajorhistocompatibilitycomplexclassImoleculesdirectstraffickingtoendocyticcompartments).生物化學雜志(J.B1l.Chem.)270，1443-1448(1995)。[0113]18.維尼亞J.L.(Vigna,J.L.),史密斯K.D.(Smith,K.D.)和盧茨C.T.(Lutz,C.T.)不變鏈與MHCI類締合:優選HLAI類/β2-微球蛋白雜二聚體，特異性和MHC肽結合凹槽的影口向(Invariantchainassociat1nwithMHCclassI!preferenceforHLAclassI/β2-microglobulinheterodimers,specificity,andinfluenceoftheMHCpeptide-bindinggroove).免疫學雜志157，4503-4510(1996)。[0114]19.克萊默爾M.J.(Kleijmeer,M.J.)等人MHCI類分子在細胞內吞道中抗原裝載(AntigenloadingofMHCclassImoleculesintheendocytictract).運輸(Traffic)2，124-137(2001)。[0115]20.茲威基H.L.(Zwickey,H.L.)和波特Τ.Α.(Potter,T.A.)從非細胞溶質單核細胞增生李斯特菌分泌的抗原通過經典MHCI類加工路徑加工(AntigensecretedfromnoncytosolicListeriamonocytogenesisprocessedbytheclassicalMHCclassIprocessingpathway).免疫學雜志162，6341-6350(1999)。[0116]21.馬卡里P.A.(MacAry,P.A.)等人在⑶34衍生的人朗格罕氏細胞活化之后MHCI類分子從晚期內體動員到細胞表面(Mobilizat1nofMHCclassImoleculesfromlateendosomestothecellsurfacefollowingactivat1nofCD34_derivedhumanLangerhanscells).美國國家科學院院刊98，3982-3987(2001)。[0117]22.托爾內S.(Tourne,S.)等人IiTAPl雙突變小鼠中的主要組織相容性復合體分子的生物合成和T細胞的產生(B1synthesisofmajorhistocompatibilitycomplexmoleculesandgenerat1nofTcellsinIiTAPIdouble-mutantmice).美國國家科學院院刊93，1464-1469(1996)。[0118]23.雷伯A.J.(Reber,A.J.)，特恩奎斯特H.R.(TurnquistjH.R.)，托馬斯H.J.(Thomas,H.J.),盧茨C.T.和索海姆J.C.(Solheim,J.C.)不變鏈的表達可引起MHCI類分子的表面表達的等位基因依賴性增加(Express1nofinvariantchaincancauseanallele-dependentincreaseinthesurfaceexpress1nofMHCclassImolecules).免疫遺傳學(Immunogenetics)54，74-81(2002)。[0119]24.維塔利斯T.Z.(Vitalis,T.Z.)等人使用抗原加工機構的TAP組分作為分子佐劑(UsingtheTAPcomponentoftheantigen-processingmachineryasamolecularadjuvant).公共科學圖書館.病原體(PLoSPathog.)1，e36(2005)。[0120]25.范卡爾L.(vanKaer，L.)，艾什頓-里卡德P.G.(Ashton-Rickardt，P.G.)，普勒格H.L.(Ploegh,H.L.)和舍川S.(Tonegawa，S.)TAPl突變小鼠缺乏抗原呈遞、表面I類分子和CD4—8+T細胞(TAPlmutantmicearedeficientinantigenpresentat1n,surfaceclassImolecules,andCD4—8+Tcells).細胞71，1205-1214(1992)?[0121]26.麥克亞當A.J.(McAdam，A.J.)，法爾卡什E.A.(Farkash，E.A.)，格烏茲Β.Ε.(Gewurz,B.Ε.)和夏普A.H.(Sharpe,A.H.)B7共剌激是響應水泡性口炎病毒的宿主中抗體種類交換和CD8+細胞毒素T-淋巴細胞產生的關鍵(B7C0Stimulati0niscriticalforantibodyclassswitchingandCD8+cytotoxicT-1ymphocytegenerat1ninthehostresponsetovesicularstomatitisvirus).病毒學雜志(J.Virol.)74，203-208(2000)。[0122]27.馬爾佐A.L.(Marzo,A.L.)等人在不存在⑶4T細胞情況下的完全功能記憶CD8T細胞(Fullyfunct1nalmemoryCD8TcellsintheabsenceofCD4Tcells).免疫學雜志173，969-975(2004)。[0123]28.福爾-安德烈G.(Faure-Andre,G.)等人⑶74MHCII類締合的不變鏈對樹突狀細胞遷移的調節(Regulat1nofdendriticcellmigrat1nbyCD74，theMHCclassΙΙ-associatedinvariantchain).科學322，1705-1710(2008)?[0124]29.本韋努蒂F.(Benvenuti,F.)等人T細胞激活需要成熟樹突狀細胞表達Racl和Rac2(RequirementofRaclandRac2express1nbymaturedendriticcellsforTcellpriming).科學305，1150-1153(2004)?[0125]30.夏斯特里N.(ShastrijN.)和岡扎來茲F.(Gonzalez，F.)內源性產生并呈遞卵白蛋白妝/Kb復合體到T細胞(Endogenousgenerat1nandpresentat1noftheovalbuminpeptide/KbcomplextoTcells).免疫學雜志150，2724-2736(1993)?[0126]31.薩盧斯托F.(Sallusto，F.)，賽拉M.(Celia,Μ.),丹尼利C.(Danieli,C.)和蘭扎韋基亞A.(Lanzavecchia,A.)樹突狀細胞使用巨胞飲和甘露糖受體將巨分子集中在主要組織相容性復合體II類隔室中:通過細胞因子和細菌產物下調(DendriticcellsusemacropinocytosisandthemannosereceptortoconcentratemacromoleculesinthemajorhistocompatibilitycomplexclassIIcompartment:downregulat1nbycytokinesandbacterialproducts).實驗醫學雜志(J.Exp.Med.)182，389-400(1995)?[0127]32.布羅薩爾P.(Brossart,P.)和貝文M.J.(Bevan，M.J.)通過樹突狀細胞呈遞主要組織相容性復合體I類分子上的外源性蛋白質抗原:通過細胞因子呈遞和調節的路徑(Presentat1nofexogenousproteinantigensonmajorhistocompatibilitycomplexclassImoleculesbydendriticcells:pathwayofpresentat1nandregulat1nbycytokines).血液(Blood)90，1594-1599(1997)。[0128]33.梅爾袓吉N.(Merzougui，N.)，克拉策R.(Kratzer，R.)，薩韋亞努L.(Saveanu,L.)和范恩德特P.(vanEndertjP.)用于交叉呈遞吞嗷的抗原的蛋白酶體依賴性、TAP非依賴性路徑(Aproteasome-dependent，TAP-1ndependentpathwayforcross-presentat1nofphagocytosedantigen).歐洲分子生物學學會報道(ΕΜΒ0Rep.)12，1257-64do1:10.1038/embor.2011.203(2011)。[0129]34.小羅斯G.E.(Loss,G.E.Jr.)和桑特A.J.(Sant,A.J.)不變鏈將MHCII類分子保留在細胞內吞路徑中(InvariantchainretainsMHCclassIImoleculesintheendocyticpathway).免疫學雜志150，3187-3197(1993)。[0130]35.科恩菲爾德R.(KornfeId,R.)和科恩菲爾德S.(KornfeId,S.)天冬酰胺連接的寡糖的組裝(Assemblyofasparagine-linkedoligosaccharides).生物化學年鑒(Annu.Rev.B1chem.)54，631-66410.1146/annurev.b1.54.070185.003215(1985)。[0131]36.洛克K.L.，甘博S.(Gamble，S.)和羅思坦L.(Rothstein，L.)用I類主要組織相容性復合體分子呈遞外源性抗原(Presentat1nofexogenousantigenwithclassImajorhistocompatibilitycomplexmolecules).科學249，918-921(1990)。[0132]37.范利斯M.(vanLithjM.),范漢姆M.(vanHam,M.)和里費斯J.(Neefjes，J.)MHCI類重鏈/HLA-DO復合體在質膜處的穩定表達(Stableexpress1nofMHCclassIheavychain/HLA-DOcomplexesattheplasmamembrane).歐洲免疫學雜志(Eur.J.1mmunol.)33，1145-1151(2003)。[0133]38.努澈恩J.G.(Nuchtern，J.G.)，比蒂森W.E.(Biddison,W.E.)和克勞斯納R.D.(Klausner，R.D.)II類MHC分子可使用內源性抗原呈遞路徑(ClassIIMHCmoleculescanusetheendogenouspathwayofantigenpresentat1n).自然343，74-7610.1038/343074a0(1990)。[0134]39.塞蘭德羅V.(CerundolojV.),埃利奧特T.(Ell1ttjT.),埃爾文J.(Elvin,J.),巴斯廷J.(Bastin,J.)和唐森德A.(Townsend,A.)人不變鏈與H_2DbI類分子的締合(Associat1nofthehumaninvariantchainwithH_2DbclassImolecules).歐洲免疫學雜志22，2243-2248(1992)。[0135]40.波伊斯S.J.(Powis,S.J.)CLIP區介導的不變鏈與MHCI類分子的相互作用(CLIP-reg1nmediatedinteract1nofInvariantchainwithMHCclassImolecules).歐洲生物化學學會聯盟通訊(FEBSLett)580，3112-3116(2006)。[0136]41.西加爾L.J.和洛克K.L.骨髓衍生的抗原呈遞細胞為響應于病毒的細胞毒素T淋巴細胞的產生和使用與抗原呈遞的抗原呈遞(TAP)依賴性和非依賴性路徑相關的轉運蛋白所需(Bonemarrow-derivedantigen-presentingcellsarerequiredforthegenerat1nofcytotoxicTlymphocyteresponsestovirusesandusetransporterassociatedwithantigenpresentat1n(TAP)-dependentand-1ndependentpathwaysofantigenpresentat1n).實驗醫學雜志192，1143-1150(2000)。[0137]42.布勒R.M.(Buller,R.Μ.),霍姆斯K.L.(Holmes,K.L.),胡金A.(Hugin,A.),弗雷德里克森T.N.(Frederickson,T.N.)和莫爾斯H.C.(Morse,H.C.),II1.在不存在CD4輔助細胞情況下體內細胞毒素T細胞反應的誘導(II1.1nduct1nofcytotoxicT-cellresponsesinvivointheabsenceofCD4helpercells).自然328，77-7910.1038/328077a0(1987)。[0138]43.詹森Ε.M.(Janssen,E.M.)等人⑶4+T細胞為⑶8+Τ淋巴細胞的二次擴增和記憶所需(CD4+Tcellsarerequiredforsecondaryexpans1nandmemoryinCD8+Tlymphocytes).自然421，852-856(2003)。[0139]44.麥克霍爾德R.P.(MachoId,R.P.)和普勒格H.L.用游離重鏈特異性單克隆抗體探測的I類主要組織相容性復合體(MHC)分子的組裝和降解中的中間物(Intermediatesintheassemblyanddegradat1nofclassImajorhistocompatibilitycomplex(MHC)moleculesprobedwithfreeheavychain-specificmonoclonalantibodies).實驗醫學雜志184,2251-2259(1996)。[0140]45.賴尼克A.T.(Reinicke,A.T.),奧米路西克K.D.(Omilusik,K.D.),巴沙G.和杰弗里斯W.A.(Jefferies,ff.A.)樹突狀細胞交叉激活是對單核細胞增生李斯特菌的免疫反應必需的(Dendriticcellcross-primingisessentialforimmuneresponsestoListeriamonocytogenes).公共科學圖書館.綜合4，e721010.1371/journal,pone.0007210(2009)。[0141]46.勒基C.J.(Luckey，C.J.)等人在蛋白酶體抑制劑存在下人I類MHC等位基因表達的差異和其締合的妝(Differencesintheexpress1nofhumanclassIMHCallelesandtheirassociatedpeptidesinthepresenceofproteasomeinhibitors).免疫學雜志167，1212-1221(2001)。[0142]47.克魯格T.(Kruger,T.)等人從原發性腎細胞癌學到的課程:用于免疫療法的新穎腫瘤抗原和HLA配體(Lessonstobelearnedfromprimaryrenalcellcarcinomas:noveltumorantigensandHLAligandsforimmunotherapy).癌癥免疫學免疫療法(CancerImmunol.1mmunother.)54,826-836(2005)。[0143]48.布施R.(Busch，R.)，克盧捷1.(Cloutier,1.),塞卡利R.P.(Sekaly,R.P.)和哈默林G.J.(Hammerling,G.J.)不變鏈保護II類組織相容性抗原免于結合內質網中的完整多月太(InvariantchainprotectsclassIIhistocompatibilityantigensfrombindingintactpolypeptidesintheendoplasmicreticulum).歐洲分子生物學雜志(EMBOJ.)15，418-428(1996)。[0144]49.賽維納A.(Savina,A.)等人N0X2控制吞噬體pH值以在通過樹突狀細胞交叉呈遞期間調節抗原加工(N0X2controlsphagosomalpHtoregulateantigenprocessingduringcrosspresentat1nbydendriticcells).細胞126，205-218(2006)。[0145]50.拉西德A.(Rashid,A.)，小奧金克洛斯H.(Auchincloss，H.Jr.)和莎倫J.(Sharon,J.)用于延長小鼠中皮膚同種異體移植存活并抑制同種抗體產生的GKl.5和嵌合大鼠/小鼠GKl.5抗CD4抗體的比較(ComparisonofGKl.5andchimericrat/mouseGKl.5anti_CD4antibodiesforprolongat1nofskinallograftsurvivalandsuppress1nofalloantibodyproduct1ninmice).免疫學雜志148，1382-1388(1992)。【權利要求】1.一種刺激MHCI介導的免疫反應的方法，其包含在樹突狀細胞中刺激MHCI內溶酶體交叉呈遞。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述刺激MHCI內溶酶體交叉呈遞包含在樹突狀細胞中過度表達⑶74。3.根據權利要求1所述的方法，其中所述刺激MHCI內溶酶體交叉呈遞包含將抗原靶向所述MHCI內溶酶體交叉呈遞路徑。4.一種融合蛋白質，其包含抗原或其片段和CD74內溶酶體革巴向序列。5.一種隔室，其用于⑶74依賴性MHCI交叉呈遞路徑。6.根據權利要求5所述的隔室，其中所述隔室是內溶酶體。7.—種組織蛋白酶裂解肽和所述肽的多聯體，其用于刺激初次免疫反應。【文檔編號】A61K38/01GK104350070SQ201280071256【公開日】2015年2月11日申請日期:2012年7月31日優先權日:2012年1月27日【發明者】威爾弗雷德·杰弗里斯,根茨·芭莎,凱拉·奧米盧西克,阿納·查維斯·斯特恩布克申請人:生物防護科技公司