利用免疫球蛋白片段的位點特異性glp-2綴合物的制作方法

利用免疫球蛋白片段的位點特異性glp-2綴合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及胰高血糖素-樣肽-2(GLP-2)綴合物，其包括經非肽基聚合物共價連接的天然GLP-2或其衍生物和免疫球蛋白Fc片段，其中天然GLP-2或其衍生物具有在其C-末端引入的巰基基團，并且非肽基聚合物的一端連接至GLP-2的氨基酸殘基而不是其N-末端氨基基團；用于制備GLP-2綴合物的方法；包括其的藥學組合物；和通過使用其用于治療或預防腸道疾病、腸道損傷或胃病的方法。因為本發明的GLP-2綴合物具有針對GLP-2受體顯著增加的結合親和力，所以其顯示延長的體內半衰期和改進的體內持久性和穩定性。
【專利說明】利用免疫球蛋白片段的位點特異性GLP-2綴合物

【技術領域】
[0001] 本發明涉及胰高血糖素-樣肽_2 (GLP-2)綴合物，其中在其C-末端具有引入的巰 基基團的GLP-2或其衍生物通過非肽基聚合物共價連接至免疫球蛋白Fc片段，其中非肽基 聚合物和免疫球蛋白Fc片段位點-特異性地連接至GLP-2或其衍生物的氨基酸殘基而不 是其N-末端氨基基團；用于制備GLP-2綴合物的方法；包括其的藥學組合物；和通過使用 其治療或預防腸道疾病、腸道損傷或胃病的方法。

【背景技術】
[0002] 胰高血糖素-樣肽-2 (GLP-2)是33個氨基酸的肽激素，其在養分攝取時由腸道 內分泌L細胞產生。GPL-2刺激小腸和大腸中的粘膜生長（DG Burrin等，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 279(6) :G1249-1256, 2000)并且抑制腸道細胞和隱窩細胞 的細胞凋亡（Bernardo Yusta 等，Gastrpenterology 137(3) :986_996,2009)。此外，GLP-2 增強小腸中養分的吸收（PALLE BJ等，Gastrpenterology 120 :806-815,2001)并且降低腸 道通透性（Cameron HL等，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 284(6) :G905_12， 2003)。另外，GLP-2 抑制胃排空和胃酸分泌（Meier JJ 等，Gastrpenterology 130(1): 44_54,2006)，同時增加腸道血液流速（Bremholm L 等，Scand J Gastroenterol. 44(3): 314_9,2009)和松弛腸道平滑肌（Amato A 等，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296(3) :G678-84, 2009)。
[0003] 因為GLP-2能夠吸收和保持能量并且激活腸道細胞的功能，已經在腸道疾病和損 傷的各種體內模型中顯示高的治療潛能。作為調節養分吸收的激素，GLP-2具有很大的希 望用于治療短腸綜合癥（SBS)的療法。SBS由先天的原因或后天的原因，比如外科手術去 除腸造成，并且導致由于小腸吸收面積下降而引起的營養不足。已經報道GLP-2改善具有 SBS的大鼠模型的消化道中養分攝取和吸收（Ljungmann K等，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281(3) :G779-85,2001)。
[0004] 此外，克羅恩病是慢性炎癥腸道疾病，其可在消化道從口至肛門范圍的任何區域 產生。至今不知道克羅恩病的原因，但是認為是由于身體對消化道中正常存在的細菌細胞 過度的炎癥反應以及環境和遺傳原因引起的。已知GLP-2可防止或減輕當由于化療或遺 傳原因發展粘膜炎、結腸炎或炎癥腸道疾病時粘膜上皮細胞的傷害（Qiang Xiao等，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.278(4) :R1057_R1063,2000)。
[0005] 化學療法誘導的腹瀉（CID)是限制抗癌劑劑量的因素之一并且是抗癌化學療 法的最常見副作用。大約10%的患者具有晚期癌癥。大約80%的具有晚期癌癥接受 5-FU(5-氟尿啼陡，Adrucil)/伊立替康（Camptosar)單個/組合療法的患者經歷CID并且 他們的大約30%顯示3至5級的嚴重腹瀉癥狀。另外，如果粘膜炎或嗜中性細胞減少癥在 具有的CID患者中同時發生，有死亡的危險。在CID誘導的大鼠模型中，GLP-2顯示減輕由 5-FU誘導的腸重量、絨毛高度和隱窩深度減小的影響，從而表明其用于CID治療的治療潛 能（A.Tavakkolizadeh 等，J Surg Res.91(l) :77_82,2000)。
[0006] 盡管該高的治療潛能，GLP-2仍具有開發成為商用藥物的局限性。肽比如GLP-2可 由于低穩定性而容易轉化，容易被體內蛋白酶降解并且喪失活性，并且由于它們相對小的 尺寸而容易通過腎清除。所以，為了維持肽藥物的最佳血液濃度和滴度，需要更頻繁施用肽 藥物。但是，大部分肽藥物以各種類型的注射施用，并且需要頻繁的注射以維持肽藥物的血 液濃度，其造成患者的嚴重疼痛。在這點上，已經進行許多嘗試以解決這些問題，其中之一 已經開發了增加肽藥物的膜通透性的方法，其使得肽藥物通過口服或鼻途徑遞送至身體。 但是該方法與其注射相比具有低肽藥物遞送效率的局限性，并且因此仍難以保持足夠的用 于治療用途的肽藥物的生物活性。
[0007] 尤其，GLP-2具有非常短的體內半衰期（7分鐘或更短），原因在于其被二肽基肽 酶-IV (DPP IV)失活，所述二肽基肽酶-IV在GLP-2的2位（Ala)和3位（Asp)氨基酸之 間切割（Bolette H.等，The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism. 85(8): 2884-2888, 2000)。已經嘗試通過氨基酸替代增加 GLP-2的體內半衰期。
[0008] 目前，NPS藥物公司（美國）正在開發GLP-2類似物"Teduglutide"，作為用于克羅 恩病、SBS和胃腸道疾病的治療劑，其中在天然GLP-2的2位氨基酸（Ala)被天冬酰胺（Asp) 替代。通過在2位氨基酸的替代Teduglutide抵抗DPPIV的切割，其反過來增加穩定性和效 力。但是，因為對DPPIV切割的抵抗力的增加不足以延長Teduglutide的體內半衰期。因此， Teduglutide也需要通過注射每天施用一次，其對患者仍是大的負擔（W0 2005/067368)。
[0009] Zealand Pharma(丹麥）目前正通過替代在天然 GLP-2 的 3、8、16、24、28、31、 32和33位的一個或多個氨基酸來開發GLP-2類似物。這些替代不僅僅增強肽的穩定性 和效力，而且也允許通過根據替代的位置使得小腸中相對于結腸中的生長促進活性更高 而選擇性治療癥狀或反之亦然。另外，Zealand Pharma正在開發作為GLP-2類似物的 Elsiglutide (ZP1846)，其靶向胃腸道（GI)-粘膜炎和CID，并且Elsiglutide正在進行I期 臨床試驗。但是，上述類似物也不具有足夠的體內半衰期，并且因此其需要通過每天注射一 次施用（W0 2006/117565)。
[0010] 聚乙二醇（PEG)非特異性結合靶肽的特異性位點或不同位點并且增加其分子量， 從而預防靶肽的腎清除和水解，而不產生任何副作用。例如，美國專利號4, 179, 337描述了 用PEG連接降鈣素，以增強降鈣素的體內半衰期和膜通透性的方法。W0 2006/076471描述 了通過連接PEG用于增加已經用作充血性心力衰竭的治療劑的B-型利鈉肽（BNP)體內半 衰期的方法。另外，美國專利號6, 924, 264公開了通過用其賴氨酸殘基連接PEG增加艾塞 那肽-4 (exendin-4)體內半衰期的方法。盡管這些方法可通過增加待與其連接的PEG的分 子量延長肽藥物的體內半衰期，但是有許多問題，在于隨著PEG的分子量增加，肽藥物的滴 度下降并且PEG與肽藥物的反應性也降低，導致產率下降。
[0011] W0 02/46227描述了制備GLP-1、艾塞那肽-4(exendin-4)或其類似物與人血清白 蛋白或免疫球蛋白Fc區的融合蛋白的方法。美國專利號6, 756, 480也描述了制備甲狀旁 腺激素（PTH)或其類似物與免疫球蛋白Fc區的融合蛋白的方法。這些方法可克服聚乙二 醇化的問題比如低產率和非特異性，但是增加藥物肽體內半衰期的作用不如預期的顯著， 并且有時其滴度也仍然低。為了使增加藥物肽體內半衰期的作用最大化，可使用各種肽接 頭，但是有誘導免疫應答的風險。此外，如果使用具有二硫鍵的肽藥物比如BNP，則錯折疊的 可能性很大。最后，如果使用包括非天然存在的氨基酸的肽藥物，則不可能通過遺傳重組產 生其融合蛋白。
[0012] 在之前的研究中，本發明人已經開發了制備具有延長的體內半衰期的GLP-2綴合 物的方法，其中GLP-2綴合物通過經非肽基聚合物共價連接GLP-2或其衍生物至免疫球蛋 白Fc片段制備。在該方法中，GLP-2衍生物，比如β -羥基-咪唑并-丙酰基GLP-2,其中 GLP-2的Ν-末端氨基用羥基替代；脫-氨基-組氨酰GLP-2,其中其Ν-末端氨基缺失；和 咪唑并-乙酰-GLP-2,其中第一個組氨酸的α碳和與其連接的Ν-末端氨基缺失，顯示對 DPPIV切割增加的抗性同時保持它們生物活性并且因此GLP-2綴合物的體內半衰期顯著增 加。
[0013] 但是，在免疫球蛋白Fc片段位點-特異性地連接至這些GLP-2衍生物的賴氨酸殘 基的情況下，因此獲得的GLP-2綴合物顯示對GLP-2受體顯著降低的結合親和力并且因此 具有體內效力和其持久性將下降的問題。
[0014] 就此研究可增加血液中GLP-2體內半衰期和最大化體內效力持久性的方法而言， 本發明人已經通過共價連接將在其C-末端引入巰基基團的GLP-2衍生物綴合至非肽基聚 合物和免疫球蛋白Fc片段而開發了 GLP-2綴合物，并且發現GLP-2綴合物展示對GLP-2受 體增加的結合親和力和顯著增加的體內效力持久性。尤其，已經發現當非肽基聚合物和免 疫球蛋白Fc片段位點-特異性地連接至被引入其中第一個組氨酸的α -碳和與其連接的 Ν-末端氨基缺失的咪唑并-乙酰-GLP-2的C-末端的半胱氨酸殘基時，導致對DPPIV抗性 的增加，咪唑并-乙酰-GLP-2綴合物的體外效力顯著增加。


【發明內容】

[0015] 技術問題
[0016] 因此，本發明的目標是提供具有增強的體內治療效力和穩定性的GLP-2綴合物。
[0017] 本發明的另一目標是提供制備GLP-2綴合物的方法。
[0018] 本發明的仍另一目標是提供藥學組合物，其包括GLP-2綴合物作為活性成分，用 于預防或治療腸道疾病、腸道損傷或胃病。
[0019] 技術方案
[0020] 在一個方面，本發明提供胰高血糖素-樣肽_2 (GLP-2)綴合物，其包括經非肽基聚 合物共價連接的天然GLP-2或其衍生物和免疫球蛋白Fc片段，其中所述天然GLP-2或其衍 生物具有在其C-末端引入的巰基基團，并且非肽基聚合物的一端連接至GLP-2的氨基酸殘 基而不是其N-末端氨基基團。
[0021] 在另一方面，本發明提供制備根據本發明的GLP-2綴合物的方法，包括：
[0022] 1)共價連接在兩個末端具有活性基團的非肽基聚合物至GLP-2或其衍生物的氨 基或巰基基團，所述活性基團選自醛（aldehyde)、馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺衍生物，其中所 述GLP-2或其衍生物具有在其C-末端引入的巰基基團；
[0023] 2)從步驟（1)的反應混合物分離復合物，其中非肽基聚合物共價連接至GLP-2或 其衍生物的氨基或巰基基團；
[0024] 3)共價連接復合物中非肽基聚合物的另一末端至免疫球蛋白Fc片段；和
[0025] 4)從步驟3)的反應混合物分離GLP-2綴合物，其中非肽基聚合物的兩個末端分別 連接至免疫球蛋白Fc片段和GLP-2或其衍生物。
[0026] 在仍另一方面，本發明提供藥學組合物，其包括根據本發明的GLP-2綴合物作為 活性成分，用于預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷和胃病的一種或多種疾病。
[0027] 在仍又另一方面中，本發明提供用于預防或治療一種或多種選自腸道疾病、腸道 損傷和胃病的疾病的方法，包括施用本發明的GLP-2綴合物至需要其的患者。
[0028] 本發明的優勢效果
[0029] 本發明的GLP-2綴合物具有對GLP-2受體顯著高的結合親和力，從而顯示持久的 體內治療效力和延長的體內半衰期。所以，本發明的GLP-2綴合物可有效用于以顯著低的 施用頻率治療或預防腸道疾病、腸道損傷或胃病。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1顯示通過使用Source Phe柱純化的CGLP-2 (A2G，34C) -10K PEG-免疫球蛋白 Fc綴合物的純化圖譜。
[0031] 圖2顯示通過使用Source 15Q柱純化的CGLP-2 (A2G，34C) -10K PEG-免疫球蛋白 Fc綴合物的純化圖譜。
[0032] 圖3顯示通過使用Source ISO柱純化的CGLP-2 (A2G，34C) -10K PEG-免疫球蛋白 Fc綴合物的純化圖譜。
[0033] 圖4顯示用于分析CAGLP-2(A2G，34C)-10K PEG-免疫球蛋白Fc綴合物純度的反 相HPLC的結果。
[0034] 圖5顯示測量對GLP-2衍生物和天然GLP-2的GLP-2受體的結合親和力的體外結 果。
[0035] 實施方式
[0036] 在本發明的一個方面，本發明提供胰高血糖素-樣肽-2 (GLP-2)綴合物，其包括通 過非肽基聚合物共價連接的GLP-2或其衍生物和免疫球蛋白Fc片段，其中GLP-2或其衍生 物具有引入其C-末端的巰基基團，并且非肽基聚合物共價連接至GLP-2或其衍生物的氨基 酸殘基而不是其N-末端氨基基團。
[0037] 如本文所使用，術語"胰高血糖素-樣肽-2 (GLP-2) "指由小腸分泌的激素，通常 促進胰島素的生物合成和分泌，抑制胰高血糖素的分泌，并且促進細胞中的葡萄糖吸收。 GLP-2具有通過結合GLP-2受體治療或預防腸道疾病、腸道損傷或胃病的功能。GLP-2由33 個氨基酸組成，天然GLP-2的氨基酸序列如下：
[0038] GLP-2(l-33)
[0039] HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQ ID NO :1)
[0040] 本發明的GLP-2包括GLP-2的天然形式，其激動劑、衍生物、片段或變體等等。
[0041] 如本文所使用，術語"GLP-2激動劑"指可結合GLP-2受體的物質而無論其與GLP-2 的結構相似性，并且誘導如天然GLP-2相同或類似的生理學活性。
[0042] 如本文所使用，術語"GLP-2片段"指一個或多個氨基酸添加至或從天然GLP-2的 N-末端或C-末端缺失的肽，其中添加的氨基酸可以是非天然存在的氨基酸（例如D-氨基 酸）。
[0043] 在優選的實施方式中，本發明的GLP-2包括巰基基團引入其C-末端的GLP-2，其中 巰基基團可通過添加半胱氨酸殘基至GLP-2的C-末端引入，但不限于此。
[0044] 如本文所使用，術語"GLP-2變體"指具有一個或多個氨基酸與天然GLP-2的不同 的肽。對于此，可產生用非天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸替代。
[0045] 如本文所使用，術語"61^-2衍生物"指與天然61^_2相比具有至少80%氨基酸 序列同源性的肽，并且指其中部分氨基酸殘基可以是化學取代的（例如α-甲基化、α-羥 化）、缺失（例如脫氨基），或修飾（例如Ν-甲基化）的肽。優選地，本發明的GLP-2衍生 物可通過天然GLP-2的Ν-末端的替代、缺失或修飾而制備，并且其可選自具有GLP-2功能 的肽、片段和其變體。
[0046] 更優選地，本發明的GLP-2衍生物可選自：
[0047] 咪唑并-乙酰-GLP-2 (CA-GLP2)，其中在天然GLP-2的Ν-末端處第一組氨酸殘基 的α -碳和與其連接的Ν-末端氨基缺失；
[0048] 脫-氨基-組氨酰GLP-2 (DA-GLP2)，其中天然GLP-2的Ν-末端氨基缺失；
[0049] β -羥基-咪唑并-丙酰基GLP-2 (0H-GLP-2)，其中天然GLP-2的Ν-末端氨基用 羥基基團替代；
[0050] 二甲基組氨酰GLP-2 (DM-GLP-2)，其中天然GLP-2的Ν-末端氨基被修飾為二甲基 基團；和
[0051] β -羧基-咪唑并-丙酰基GLP-2 (CX-GLP2)，其中天然GLP-2的Ν-末端氨基用羧 基基團替代。
[0052] 甚至更優選地，GLP-2衍生物可以是CA-GLP-2,其中天然GLP-2的Ν-末端第一個 氨基酸，組氨酸的α -碳和與其連接的Ν-末端氨基缺失。
[0053] 在優選的實施方式中，本發明的GLP-2或其衍生物可以是這樣的的肽，其中半胱 氨酸殘基被引入至天然GLP-2的C-末端，其Ν-末端的α-碳和與其連接的氨基缺失，并且 任選地，第二個氨基酸，丙氨酸被甘氨酸替代。
[0054] 根據本發明的天然GLP-2和GLP-2衍生物可使用固相合成方法或重組技術合成。
[0055] 如本文所使用，術語"非肽基聚合物"指生物相容性聚合物，其包括通過任何共價 鍵而不是肽鍵彼此連接的至少兩個重復單元。適于本發明的非肽基聚合物可選自聚乙二 醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙 烯基乙醚、生物可降解聚合物如聚乳酸（PLA)和聚乳酸-乙醇酸（PLGA)、脂質聚合物、幾丁 質、透明質酸和其組合，并且優選的是聚乙二醇。另外，本發明的非肽基聚合物的范圍包括 本領域熟知的或可由本領域技術人員容易制備的上述列舉聚合物的衍生物。
[0056] 在通過常規的框內（in-frame)融合方法制備的融合蛋白中使用的肽接頭的缺點 是它們可容易被蛋白水解酶切割，并且因此由于載體的使用，其難以實現生理活性多肽體 內半衰期的顯著增加。但是，本發明采用對這種蛋白水解酶具有抗性的聚合物，并且因此生 理活性多肽的體內半衰期可保持與載體的體內半衰期類似。
[0057] 所以，任何非肽基聚合物可用于本發明而沒有限制，只要其是具有對蛋白水解酶 抗性的聚合物。適于本發明的非肽基聚合物的分子量范圍從1至l〇〇kDa，并且優選地在1 至20kDa的范圍。而且，連接至免疫球蛋白Fc片段的本發明的非肽基聚合物可由一種類型 的聚合物或不同類型聚合物的組合組成。
[0058] 本發明的非肽基聚合物具有末端活性基團，所述末端活性基團可在其兩個末端結 合免疫球蛋白Fc片段和肽藥物。在非肽基聚合物的兩個末端的末端活性基團優選地選自 活性醛基、丙醛基、丁醛基、馬來酰亞胺基團和琥珀酰亞胺衍生物。琥珀酰亞胺衍生物的例 子可以是琥珀酰亞胺基丙酸酯、羥基琥珀酰亞胺基、琥珀酰亞胺基羧甲基和琥珀酰亞胺基 碳酸酯。在非肽基聚合物的兩個末端的末端活性基團可以彼此相同或可以不同。例如，非 肽聚合物可在其一個末端具有馬來酰亞胺基團，和在其另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。 在兩個末端具有羥基基團的聚乙二醇（PEG)用作非肽基聚合物的情況下，羥基基團可通過 常規的化學反應被活化成各種活性基團。另外，商業上可得的具有修飾活性基團的PEG可 用于制備本發明的GLP-2綴合物。
[0059] 尤其，當采用在一端具有具有醛基并且在另一端具有馬來酰亞胺基團的非肽基聚 合物時，可能使非特異性反應最小化并且有效地誘導GLP-2或其衍生物和免疫球蛋白Fc片 段結合至非肽基聚合物的每個末端。經還原烷基化通過醛鍵產生的終產物比通過酰胺鍵產 生的更穩定。在低pH水平下醛基選擇性結合N-末端，但是在高pH水平，比如pH9. 0,其結 合賴氨酸殘基以形成共價鍵。
[0060] 在優選的實施方式中，本發明的非肽基聚合物可在一端具有馬來酰亞胺基團并且 在另一末端具有醛基，更優選地其可以是在一端具有馬來酰亞胺基團和在另一末端具有醛 基的聚乙二醇。
[0061] 在本發明中，免疫球蛋白（Ig)Fc片段適于用作藥物載體，因為其是體內生物可降 解的。而且，Fc片段對于具有肽藥物的復合物的制備、純化和產率是有益的，因為其相對于 整個免疫球蛋白分子具有小的分子量。此外，因為去除了由于抗體之間氨基酸序列的不同 而顯示高的非同質性的Fab區域，Fc片段具有大大增加的物質同質性和誘導血清抗原性的 低可能性。
[0062] 術語"載體"如本文所使用，指連接至藥物的物質。典型地，包括連接至載體的藥 物的復合物大大降低了藥物的生理學活性。但是，就本發明的目標而言，本發明中采用載體 以便使連接至載體的感興趣藥物的生理學活性的下降最小化，并且降低載體的免疫原性， 從而增強藥物的體內穩定性。為了實現這些目標，本發明采用通過非肽聚合物修飾的Fc片 段作為載體。
[0063] 如本文所使用，術語"免疫球蛋白G(IgG) "共同指通過選擇性針對抗原作用參與 身體保護免疫性的蛋白質。免疫球蛋白由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈構成。輕鏈和 重鏈包括可變區和恒定區。基于它們恒定區的氨基酸序列的差異，有五種不同類型的重鏈： γ、μ、α、δ和ε型，和重鏈包括下列子類：γ 1、γ 2、Y 3、Y 4、α 1和α 2。而且，基于 它們恒定區氨基酸序列的差異，有兩種類型的輕鏈：κ和λ型（Coleman等，Fundamental Immunology,第二版，1989, 55-73)。根據重鏈恒定區的特征，免疫球蛋白分為五種同種型： IgG、IgA、IgD、IgE 和 IgM。IgG 分成 IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4 亞類。
[0064] 已知免疫球蛋白產生數種結構不同的片段，其包括Fab、F(ab'）、F(ab'）2、Fv、 SCFv、Fd和Fc。免疫球蛋白片段中，Fab包含輕鏈和重鏈的可變區，輕鏈的恒定區和重鏈的 第一恒定區（CH1)，并且具有單個抗原-結合位點。就在重鏈CH1結構域的C-末端（羧基 末端）包含一個或多個半胱氨酸殘基的鉸鏈區而言，F(ab'）片段與Fab片段不同。通過在 F(ab'）片段的鉸鏈區的半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵，F(ab'）2片段作為一對F(ab'）片 段產生。Fv是僅僅包含重鏈可變區和輕鏈可變區的最小抗體片段。scfv (單鏈Fv)片段包 括通過肽接頭彼此連接的重鏈可變區和輕鏈可變區并且因此存在于單條多肽鏈中。而且， Fd片段僅僅包括重鏈的可變區和CH1結構域。
[0065] 如本文所使用，術語"免疫球蛋白Fc片段"在免疫球蛋白（Ig)分子用木瓜蛋白酶 消化時產生，并且是除輕鏈的可變區（')和恒定區（CJ以及重鏈的可變區（VH)和恒定區 1(CH1)之外的免疫球蛋白分子的區域。Fc片段可進一步包括在重鏈恒定區的鉸鏈區。而 且，Fc片段可基本上與天然形式相同，或可以是包含部分或完整重鏈恒定區KCJ)和/或 輕鏈恒定區1(Q1)的延長的Fc片段，只要其具有改進的作用。另外，Fc片段可以是在C h2 和/或Ch3的相對長部分的氨基酸序列具有缺失的片段。優選的Fc片段是IgG或IgM-衍 生的Fc片段。IgG-衍生的Fc片段是更優選的，并且IgG2Fc和IgG4Fc片段是特別優選的。 [0066] 根據本發明修飾的Fc片段可以是從IgG、IgA、IgD、IgE和IgM衍生的Fc片段的組 合或混合。術語"組合"意思是這樣的二聚體或多聚體多肽，其中相同起源的單鏈Fc片段被 連接至不同起源的單鏈Fc片段以形成二聚體或多聚體。術語"混合"意思是這樣的多肽， 其中不同起源的兩個或更多個結構域存在于單鏈Fc片段中。例如，混合可由選自IgGIFc， IgG2Fc，IgG3Fc和IgG4Fc中包含的CH1、CH2、CH3和CH4結構域的一個至四個結構域構成。 [0067] 根據本發明修飾的Fc片段可源自人或其他動物，包括母牛、山羊、豬、小鼠、兔子、 倉鼠、大鼠和豚鼠，并且優選人。人-衍生的Fc片段比非人衍生的Fc片段是優選的，所述 非人衍生的Fc片段可作為人體中的抗原起作用并且造成不期望的免疫應答，如產生針對 該抗原的新抗體。
[0068] 根據本發明修飾的Fc片段包括天然氨基酸序列和其序列突變體（變體）。"氨基酸 序列突變體"意思是由于天然氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基的缺失、插入、非保守或 保守替代或其組合而具有不同的序列。蛋白質和肽中通常不改變蛋白質或肽的活性的氨基 酸交換是本領域已知的（H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York， 1979)。最常見發生的交換是 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Se;r、Ala/Gly、Ala/Th;r、Se;r/ Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和Asp/Gly，在兩個方向上。另外，Fc片段，如果期望，可通過磷酸化、硫酸化、丙烯酸酯化、 糖基化、甲基化、法呢酰化、乙酰化、酰胺化等等修飾。
[0069] 氨基酸變體可以是具有與天然蛋白質相同的生物活性的功能等價物，或，如果期 望，可通過改變天然形式的性質而制造。例如，變體可具有增加的抵抗熱、pH等的結構穩定 性，或增加的溶解度改變和其天然氨基酸序列的修飾。例如，在IgG Fc片段中，已知對于結 合重要的氨基酸殘基，在214至238、297至299、318至322或327至331位，可用作用于修 飾的適當的靶標。另外，其他各種衍生物是可能的，包括這樣的衍生物，其中缺失能夠形成 二硫鍵區域，或在天然Fc形式的N-末端的某些氨基酸殘基消失或向其添加甲硫氨酸殘基。 此外，為了去除效應器功能，缺失可發生在補體-結合位點，比如Clq-結合位點和ADCC位 點。國際專利出版號W097/34631和W096/32478等公開了制備此類免疫球蛋白Fc片段序 列衍生物的技術。
[0070] 根據本發明修飾的Fc片段可獲自從人和其他動物分離的天然形式，或可通過重 組技術獲自轉化的動物細胞或微生物。
[0071] 根據本發明修飾的Fc片段可以是具有天然糖鏈的形式，與天然形式相比糖鏈增 力口，或與天然形式相比糖鏈減少，或可以是去糖基化的形式。糖基化Fc片段由于其比無糖 基化形式更強的補體-依賴性細胞毒性（CDC)活性而具有誘導免疫應答的高風險。因此， 就本目標而目，無糖基化或去糖基化Fc片段是優選的。
[0072] 如本文所使用，術語"去糖基化Fc片段"指其中糖部分被人工去除的Fc片段，而 術語"無糖基化Fc片段"意思是通過原核生物，優選地大腸桿菌，以非糖基化形式產生的Fc 片段。Fc片段的糖鏈的增加、減少或去除可通過本領域常見的方法來實現，如化學方法、酶 學方法和使用微生物的基因工程方法。
[0073] 重組體Fc片段由于與其天然形式的三維結構不同而具有增加的酶敏感性。而 且，當與天然IgG相比時，無糖基化IgG對蛋白水解酶（胃蛋白酶、糜蛋白酶）高度敏感 (Morrison 等，J. Immunology 143 :2595-2601，1989)。重組 Fc 片段對 FcRn 具有與通過木 瓜蛋白酶處理產生的天然Fc相同的結合親和力，但是天然Fc片段的血清半衰期比重組Fc 片段的長2至3倍（Eur. J. Immunology 29 :2819-2825,1999)。在根據本發明修飾的Fc片 段中，酶切割位點由非肽聚合物保護。該保護防止Fc片段對水解酶的高度敏感性并且具有 降低的體內半衰期。
[0074] 本發明中使用的GLP-2可在不同位點連接至非肽基聚合物。當GLP-2連接至對于 肽的生理學活性重要的N-末端之外的位點時，活性巰基基團可被引入至天然GLP-2的氨基 酸序列中待修飾的氨基酸殘基并且然后可在GLP-2的巰基基團和非肽基聚合物的馬來酰 亞胺基團或醛基之間形成共價鍵。
[0075] 當使用非肽基聚合物的醛基時，其可與在N-末端或賴氨酸殘基的氨基基團反應。 此時，修飾形式的GLP-2可用于選擇性增加反應產率。例如，可能僅僅保持一個氨基，其能 夠通過保護GLP-2的N-末端與在期望位點的非肽基聚合物反應，用其他氨基酸替代賴氨酸 殘基，并且將氨基引入其C-末端，從而增加聚乙二醇化和偶聯反應的產率。保護N-末端的 方法可包括二甲基化、甲基化、脫氨基、乙酰化等，但不限于此。
[0076] 在本發明優選的實施方式中，為了誘導在GLP-2的C-末端氨基酸殘基的選擇性聚 乙二醇化，半胱氨酸殘基被引入GLP-2衍生物的C-末端，并且然后具有馬來酰亞胺基團的 PEG連接至GLP-2的C-末端半胱氨酸殘基。尤其，已發現GLP-2綴合物，其中免疫球蛋白 Fc片段被位點-特異性地連接至咪唑并-乙酰-GLP-2 (CA-GLP-2)的C-末端--其第一個 組氨酸的α碳和與其連接的N-末端氨基缺失，與其中免疫球蛋白Fc片段連接至原始賴氨 酸殘基的長持久性GLP-2衍生物相比，顯示了對GLP-2受體提高的結合親和力（見圖5)。
[0077] 在另一實施方式中，本發明提供制備GLP-2綴合物的方法，包括下述步驟：
[0078] 1)共價連接在其兩個末端具有活性基團的非肽基聚合物至天然GLP-2或其衍生 物的氨基或巰基基團，其中活性基團選自醛、馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺衍生物，并且其中巰 基基團被引入GLP-2或其衍生物的C-末端；
[0079] 2)從步驟1)的反應混合物分離包括非肽基聚合物和GLP-2或其衍生物的復合物， 其中非肽基聚合物共價連接至GLP-2或其衍生物的氨基酸殘基而不是N-末端氨基基團；和
[0080] 3)共價連接免疫球蛋白Fc片段至步驟2)中分離的復合物的非肽基聚合物的另 一末端，從而產生GLP-2綴合物，其包括免疫球蛋白Fc區、非肽基聚合物和GLP-2或其衍 生物，其中非肽基聚合物的一端共價連接至免疫球蛋白Fc片段而其另一末端共價連接至 GLP-2或其衍生物。
[0081] 如本文所使用，術語"復合物"指彼此共價連接的非肽基聚合物和GLP-2衍生物之 間的中間產物。隨后，沒有連接至GLP-2衍生物的非肽基聚合物的另一末端連接至免疫球 蛋白Fc片段。
[0082] 步驟（1)是將GLP-2或其衍生物共價連接至非肽基聚合物的一端。優選地，GLP-2 或其衍生物可以是具有SEQ ID N0:1的氨基酸序列的天然GLP-2或具有引入GLP-2或其衍 生物的C-末端的巰基基團的其N-末端衍生物。優選地，GLP-2衍生物可以是CA-GLP-2、 DA-GLP2、0H-GLP2、DM-GLP-2,或 CX-CLP-2。更優選地，GLP-2 衍生物可以是 CA-GLP-2,其中 半胱氨酸殘基被引入其C-末端。
[0083] 在步驟1)中，在非肽基聚合物的兩個末端的活性基團可以相同或不同。優選地， 非肽基聚合物的一端可具有馬來酰亞胺基團而其另一末端可具有醛基。
[0084] 此外，步驟1)中的非肽基聚合物共價連接至GLP-2或其衍生物的氨基酸殘基而不 是其N-末端，優選地引入GLP-2或其衍生物的C-末端的半胱氨酸殘基的巰基基團。為了 選擇性位點特異性地連接非肽基聚合物至GLP-2或其衍生物的巰基基團，步驟1)中GLP-2 或其衍生物和非肽基聚合物之間的反應可在pH 2至4,優選地pH 3下進行。此時，該反應 中GLP-2或其衍生物與非肽基聚合物的摩爾比可在1:2至1:10的范圍，但不限于此。
[0085] 如果必要，步驟1)的反應可在存在還原劑的情況下進行，這取決于非肽基聚合物 的兩個末端的活性基團的類型。適于反應的還原劑可包括氰基硼氫化鈉（NaCNBH 3)、硼氫化 鈉、硼酸二甲胺或硼酸吡啶。
[0086] 步驟2)是從步驟1)的反應混合物分離GLP-2-非肽基聚合物的復合物，其中 GLP-2或其衍生物被共價連接至非肽基聚合物的一端。考慮靶蛋白的物理性質，如純度、分 子量和凈電荷，可通過適當選擇本領域已知的用于蛋白質純化和分離的常規方法進行步驟 2的分離。例如，可使用各種常規的方法--包括尺寸排阻色譜和離子交換色譜，并且如果 必要，它們可被組合用于增加純化的靶產物的產率。
[0087] 步驟3)進行步驟2)中分離的復合物（GLP-2-非肽基聚合物）和免疫球蛋白Fc 片段之間的反應，從而共價連接免疫球蛋白Fc片段至復合物包括的非肽基聚合物的另一 末端。
[0088] 步驟3)中，GLP-2-非肽基聚合物的復合物和免疫球蛋白Fc片之間的反應段可在 pH 5.0至8.0,優選地在pH 6.0下進行。此時，在該反應中GLP-2-非肽基聚合物的復合物 與免疫球蛋白Fc片段的摩爾比的范圍可從1:2至1:10,優選地1:4至1:8。
[0089] 如果必要，步驟3)的反應可在存在還原劑的情況下進行，這取決于非肽基聚合物 的兩個末端的活性基團的類型。適于反應的還原劑可包括氰基硼氫化鈉（NaCNBH3)、硼氫化 鈉、硼酸二甲胺或硼酸吡啶。
[0090] 在優選的實施方式中，用于制備根據本發明的GLP-2綴合物的方法包括下述步 驟：
[0091] 1)共價連接在一個末端具有馬來酰亞胺基團和在另一末端具有醛基的非肽基聚 合物至天然GLP-2或其衍生物的巰基基團，并且其中巰基基團被引入其C-末端；
[0092] 2)從步驟1)的反應混合物分離包括非肽基聚合物和GLP-2或其衍生物的復合物， 其中非肽基聚合物共價連接至GLP-2或其衍生物的巰基基團；和
[0093] 3)共價連接免疫球蛋白Fc片段至步驟2)中分離的復合物的非肽基聚合物的另一 末端，從而產生包括免疫球蛋白Fc區、非肽基聚合物和GLP-2或其衍生物的GLP-2綴合物， 其中非肽基聚合物的一端共價連接至免疫球蛋白Fc片段而其另一末端共價連接至GLP-2 或其衍生物。
[0094] 在仍另一方面中，本發明提供包括GLP-2綴合物作為活性成分的藥學組合物。
[0095] 本發明的藥學組合物可用于預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷和胃病的一種或 多種疾病。具體而言，本發明的藥學組合物可用于預防或治療的疾病包括但不限于包括SBS 的GI疾病、炎性腸炎（IBD)、克羅恩病、結腸炎、胰腺炎、回腸炎、炎性腸梗塞、癌癥化療和/ 或放療引起的粘膜炎、全腸胃外營養或局部缺血引起的胃萎縮、骨缺損、兒科胃腸道（GI) 紊亂--包括誘導新生兒壞死性腸炎的腸道衰竭，等等。
[0096] 如本文所使用，術語"預防（prevention) "或"預防（preventing) "旨在包括通過 施用本發明的藥學組合物阻止或延遲上述提到的疾病如腸道疾病、腸道損傷和胃病疾病的 發生或進展的所有動作。
[0097] 在該背景下，術語"治療（treatment) "或"治療（treating) "包括通過施用本發 明的藥學組合物改進或有利改變上述提到的疾病如腸道疾病、腸道損傷和胃病疾病的癥狀 的所有動作。
[0098] 本發明的藥學組合物包括作為活性成分的根據本發明的持久性GLP-2綴合物，其 具有延長的體內半衰期和改進的體內效力和穩定性，并且因此其可明顯減少藥物的施用劑 量并且展示改進的藥物依從性，而無血糖水平的波動。所以，本發明的藥學組合物可有效用 于預防和治療腸道疾病、腸道損傷或胃病。
[0099] 本發明的藥學組合物此外可包括藥學上可接受的載體。對于口服施用，藥學上可 接受的載體可包括粘合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩定劑、懸浮劑、著色 劑和香料。對于可注射的施用，藥學上可接受的載體可包括緩沖劑、防腐劑、鎮痛劑、增溶 齊IJ、等滲劑和穩定劑。為了局部施用，藥學上可接受的載體可包括堿、賦形劑、潤滑劑和防腐 劑。
[0100] 本發明的藥學組合物可與前述藥學上可接受的載體組合配制成各種劑型。例如， 為了口服施用，藥學組合物可配制成片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸液、糖漿劑或圓片。為了注射 施用，藥學組合物可配制成作為單劑量劑型或單位劑型的安瓿，如多劑量容器。藥學組合物 也可配制成溶液、懸液、片劑、丸劑、膠囊和長效制劑。
[0101] 另一方面，適于本發明的藥學組合物的載體、賦形劑和稀釋劑可包括乳糖、右旋 糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠橡膠、藻酸鹽、明膠、 磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、 羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。另外，本發明的藥學組合物可進一步包括填充 齊?、抗凝結劑、潤滑劑、保濕劑、香料和抗菌劑。
[0102] 本發明的藥學組合物可經任何一種常見途徑施用，只要其能夠達到期望的組織。 考慮施用的各種模式，包括腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內和直腸 內，但不限于此。
[0103] 但是，因為在口服施用時肽被消化，所以用于口服施用的藥學組合物的有效成分 應被包被或配制用于保護在胃中免于降解。優選地，本發明的藥學組合物可以可注射的形 式施用。另外，本發明的藥學組合物可使用能夠將有效成分運輸至靶細胞的某些裝置施用。
[0104] 本發明的藥學組合物的施用頻率和劑量可通過數個相關的因素確定，包括待治療 疾病的類型、施用途徑、患者年齡、性別、體重和疾病的嚴重性，以及作為有效成分的藥物類 型。但是，劑量可根據施用途徑、疾病的嚴重性，和患者的性別、體重和年齡而增加或下降， 并且因此不限制本發明的范圍。顯示卓越的體內持續性和滴度，本發明的藥學組合物可顯 著降低施用頻率。因為本發明的藥學組合物具有卓越的體內持久性和穩定性，具有延長的 體內半衰期，其可顯著降低藥物的施用頻率和劑量。
[0105] 根據仍進一步方面，本發明提供預防或治療腸道疾病、腸道損傷或胃病的方法，包 括以治療有效量施用長效GLP-2綴合物至需要其的對象。
[0106] 如本文所使用，術語"施用（administration) "或"施用（administering) "指以 適當的方式將有效成分引入患者。只要其允許有效成分到達靶組織，可采用任何施用。施 用途徑的例子包括腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內和直腸內施用， 但不限于此。但是，因為在口服施用時肽被消化，所以用于口服施用的組合物的有效成分應 包被或配制用于保護在胃中免于降解。優選地，有效成分可配制成注射液。另外，長效綴合 物可在將有效成分傳遞至靶細胞的任何設備的幫助下施用。
[0107] 待治療的對象的例子包括人、無尾猴、母牛、馬、綿羊、豬、小雞、火雞、鵪鶉、貓、狗、 小鼠、大鼠、兔子和豚鼠，但不限于此。優選的對象是哺乳動物，尤其是人。
[0108] 如在有效成分的背景下所使用，術語"治療有效量"指以為了適用于醫學治療合理 的獲益/風險比足夠用于預防或治療疾病，即，腸道疾病、腸道損傷或胃病的量。
[0109] 本發明的長效GLP-2綴合物顯示延長的體內半衰期和改進的體內持久性和穩定 性。因此，本發明的長效GLP-2綴合物可以顯著低的劑量施用并且展示藥物依從性的改善， 而不影響血糖水平。因此，本發明的長效GLP-2綴合物可有效用于預防或治療腸道疾病、腸 道損傷或胃病。

【具體實施方式】
[0110] 通過下列實施例進一步描述本發明。但是，應理解這些實施例僅僅用于具體闡釋 本發明，而不是理解它們用于以任何形式限制本發明。
[0111] 實施例1 :瞇啤并-乙酰-GLP-2的聚乙二醇化
[0112] 咪唑并-乙酰 GLP-2(CA-GLP-2, A2G，34C，American P印tide，美國）與 10K MAL-PEG-ALD PEG (在每個末端具有馬來酰亞胺和醛基的雜雙官能PEG，NOF Inc.，Japan) 反應，以便使CA-GLP-2的第34位半胱氨酸殘基（Cys34)聚化。這里乙二醇，CA-GLP-2與 PEG的摩爾比是1:3,并且反應在室溫下進行3小時，肽濃度是3. 5mg/mL。此外，反應在50mM Tris-HCl緩沖液中在存在20mM氰基硼氫化鈉（SCB)作為還原劑的情況下進行。在反應結 束之后，在下列條件下通過色譜使用SOURCE S柱（LRC25, Pall Corporation)純化所得產 物，單-聚乙二醇化CA-GLP-2-PEG復合物。
[0113] 柱子：SOURCE S(LRC25, Pall Corporation)
[0114] 流速：4. Oml/min
[0115] 梯度：洗脫液 B 0%-40%，240min(A :20mM 檸檬酸，pH 2· 0+45% 乙醇，B :A+1M KC1)
[0116] 實施例2 :瞇啤并-乙酰-GLP-2 (A2G, 34C) -PEG-免疫球蛋白Fc綴合物的制各
[0117] 上面純化的單-聚乙二醇化CA-GLP-2 (A2G，34C)復合物與免疫球蛋白（IgG)Fc片 段（韓國專利號10-725315)以1:6的摩爾比混合，隨后它們在4°C下反應20小時，其中肽濃 度為20mg/ml。此時，反應在lOOmM鉀磷酸緩沖液（pH 6. 0)中在存在20mM SCB作為還原劑 的情況下進行。在反應結束之后，反應混合物使用Source Phe柱（XK16，GE Healthcare), SOURCE 15Q 柱（LRC25, Pall Corporation)和 SOURCE IS0(HR16, GE Healthcare)柱在下 列條件下進行三-步色譜。
[0118] 柱：SOURCE Phe (XK16, GE Healthcare)
[0119] 流速：2. Oml/min
[0120] 梯度：洗脫液 B 100% - 0% (A :20mM Tris，pH 8· 0 ;Β :Α+2· 6M NaCl)
[0121] 柱：SOURCE 15Q(LRC25, Pall Corporation)
[0122] 流速：5. Oml/min
[0123] 梯度：洗脫液 B 0 - 30%，120min(A :20mM Tris-HCl，pH 8. 0, B :A+1M NaCl)
[0124] 柱：SOURCE ISO (HR16, GE Healthcare)
[0125] 流速：2. Oml/min
[0126] 梯度：洗脫液 B 100%-0%，100min(A :20mM Tris-HCl，pH 8. 0, B :A+1. 1M硫酸 銨）
[0127] SOURCE Phe柱、SOURCE 15Q柱和SOURCE ISO柱的每個純化圖譜分別顯示在1、2 和3中。作為反相HPLC分析的結果，CA-GLP-2(A2G，34C)-10KPEG-F c綴合物被純化，純 度為94. 2% (圖4)，并且其產率是12. 5%。
[0128] 實施例3 :CA-GLP-2 (A2G, 34C) -10K PEG-Fc綴合物對GLP-2夸體的體外結合親和 力的測量
[0129] 為了測量實施例2中制備的CA-GLP-2(A2G，34C)-10KPEG-Fc綴合物（下文， "GLP-2綴合物"）的效力，如下使用測量體外細胞活性的方法。在該方法中，使用轉化中國 倉鼠卵巢（CH0)細胞系，CH0/hGLP-2R，以表達編碼人GLP-2受體的基因。
[0130] CH0/hGLP-2R細胞一周次培養2至3次，并且以1X105個細胞/孔的濃度接種 在96-孔板上，隨后培養24小時。因此培養的CH0/hGLP-2R細胞分別用以下進行處理： 天然GLP-2以1000至0· 002nM的濃度；天然GLP-2的長效制劑（GLP-2-PEG-Fc綴合物， LAPS-GLP-2)以10000至0. 02nM的濃度；經賴氨酸特異性綴合的GLP-2衍生物的長效制劑 (LAPS-DA-GLP-2，LAPS-CA-GLP-2，LAPS-0H-GLP-2)以 10000 至 0· 02nM 的濃度；和經 C-末端 半胱氨酸特異性綴合的GLP-2衍生物的長效制劑（LAPS-CA-GLP-2(A2G，34C))以10000至 0. 02nM的濃度。通過使用cAMP測試試劑盒（MD，USA)，在用每種化合物處理的CH0/hGLP-2R 細胞中測量作為用于信號轉導的第二信使的cAMP的細胞內水平，并且通過VICTOR LIGHT 光度計（PerkinElmer Life Sciences)測定突光酶素活性。還測量每種化合物的EC5(I值。
[0131] 如在圖5中顯示，經賴氨酸特異性綴合的GLP-2衍生物的長效制劑 (LAPS-DA-GLP-2, LAPS-CA-GLP-2, LAPS-0H-GLP-2)顯示比天然 GLP-2 的長效制劑 (LAPS-GLP-2)更低的體外活性（2. 6-7. 5%對8. 6% )。相反，經C-末端半胱氨酸特異性 綴合的GLP-2衍生物的長效制劑（LAPS-CA-GLP-2(A2G，34C))顯示比天然GLP-2長效制劑 (LAPS-GLP-2)更高的體外活性（與天然GLP-2相比9. 9% )。
[0132] 這些結果已經確認GLP-2綴合物--其中非肽基聚合物的一端共價連接至GLP-2 衍生物的C-末端而其另一末端共價連接至免疫球蛋白Fc片段--與之前的GLP-2綴合物 相比顯示對GLP-2受體增強的結合親和力，從而延長體內半衰期并且提高體內持久性和穩 定性。
[0133] 給出本說明書中使用的具體術語僅僅描述具體的實施方式并且不旨在限制本發 明。本說明書中使用的單數形式包括復數形式，除非它們明確表示相反的意思。本說明書 中使用的"包括"或"具有"的意思旨在使具體的性質、區域、整數、步驟、操作、要素和/或 組分具體化，而不旨在排除存在或添加其他的性質、區域、整數、步驟、操作、要素和/或組。
[0134] 工業適用性
[0135] 本發明的GLP-2綴合物具有對GLP-2受體顯著高的結合親和力，從而顯示持久的 體內治療效力和延長的體內半衰期。因此，本發明的GLP-2綴合物可有效用于以顯著低的 施用頻率治療或預防腸道疾病、腸道損傷或胃病。
【權利要求】
1. 胰高血糖素-樣肽-2(GLP-2)綴合物，其包括經非肽基聚合物共價連接的天然 GLP-2或其衍生物和免疫球蛋白Fc片段，其中所述天然GLP-2或其衍生物具有在其C-末 端引入的巰基基團，和所述非肽基聚合物的一端連接至所述GLP-2的氨基酸殘基而不是其 N-末端氨基基團。
2. 根據權利要求1所述的GLP-2綴合物，其中所述GLP-2或其衍生物的所述巰基基團 通過使半胱氨酸結合至其C-末端引入。
3. 根據權利要求1所述的GLP-2綴合物，其中所述GLP-2的衍生物通過天然GLP-2的 N-末端氨基的替代、缺失或修飾而制備并且具有結合GLP-2受體的功能。
4. 根據權利要求3所述的GLP-2綴合物，其中所述GLP-2的衍生物選自：通過去除作 為所述天然GLP-2的所述N-末端的第一個氨基酸的組氨酸的α -碳和與其結合的N-末端 氨基而制備的GLP-2衍生物；通過缺失所述天然GLP-2的Ν-末端氨基而制備的GLP-2衍生 物；通過用羥基基團替代所述天然GLP-2的Ν-末端氨基而制備的GLP-2衍生物；通過用二 甲基基團修飾所述天然GLP-2的Ν-末端氨基而制備的GLP-2衍生物；和通過用羧基基團替 代所述天然GLP-2的Ν-末端氨基而制備的GLP-2衍生物。
5. 根據權利要求1所述的GLP-2綴合物，其中所述非肽基聚合物的一端共價連接至所 述免疫球蛋白Fc片段而其另一末端共價連接至所述GLP-2或其衍生物的所述氨基或巰基 基團。
6. 根據權利要求5所述的GLP-2綴合物，其中所述非肽基聚合物共價連接至所述 GLP-2或其衍生物的所述巰基基團。
7. 根據權利要求1所述的GLP-2綴合物，其中所述非肽基聚合物選自聚乙二醇、聚丙二 醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、 生物可降解聚合物、脂質聚合物、幾丁質、透明質酸和其組合。
8. 根據權利要求1所述的GLP-2綴合物，其中所述非肽基聚合物在其兩個末端具有活 性基團，其選自醛基、丙醛基、丁醛基、馬來酰亞胺基團和琥珀酰亞胺衍生物。
9. 根據權利要求8所述的GLP-2綴合物，其中所述琥珀酰亞胺衍生物選自琥珀酰亞胺 基丙酸酯、琥珀酰亞胺基羧甲基、羥琥珀酰亞胺基和琥珀酰亞胺基碳酸酯。
10. 根據權利要求8所述的GLP-2綴合物，其中所述非肽基聚合物在一個末端具有馬來 酰亞胺基團和在另一末端具有醛基。
11. 根據權利要求1所述的GLP-2綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是非糖基化的。
12. 根據權利要求1所述的GLP-2綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段由選自CH1、 CH2、CH3和CH4結構域的1至4個結構域構成。
13. 根據權利要求12所述的GLP-2綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段進一步包括鉸 鏈區。
14. 根據權利要求1所述的GLP-2綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段衍生自IgG、 IgA、IgD、IgE 或 IgM。
15. 根據權利要求14所述的GLP-2綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段的每個結構域 是源自選自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的不同免疫球蛋白的結構域的混合。
16. 根據權利要求14所述的GLP-2綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是由包括源自 相同免疫球蛋白的結構域的糖基化免疫球蛋白組成的二聚體或多聚體。
17. 根據權利要求14所述的GLP-2綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是IgG4Fc片 段。
18. 根據權利要求17所述的GLP-2綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是人非糖基化 的IgG4Fc片段。
19. 制備根據權利要求1至18任一項所述的GLP-2綴合物的方法，包括： 1) 共價連接在兩個末端具有活性基團的非肽基聚合物至GLP-2或其衍生物的氨基或 巰基基團，所述活性基團選自醛、馬來酰亞胺和琥珀酰亞胺衍生物，其中所述GLP-2或其衍 生物具有在其C-末端引入的巰基基團； 2) 從步驟（1)的反應混合物分離復合物，其中所述非肽基聚合物共價連接至所述 GLP-2或其衍生物的所述氨基或巰基基團； 3) 共價連接所述復合物中所述非肽基聚合物的另一末端至免疫球蛋白Fc片段；和 4) 從步驟3)的反應混合物分離GLP-2綴合物，其中所述非肽基聚合物的兩個末端分別 連接至所述免疫球蛋白Fc片段和GLP-2或其衍生物。
20. 根據權利要求19所述的方法，其中步驟（1)中的所述非肽基聚合物共價連接至所 述GLP-2或其衍生物的C-末端巰基基團。
21. 根據權利要求19所述的方法，其中步驟（1)中的所述GLP-2或其衍生物和非肽基 聚合物以1:2至1:10的摩爾比在pH 2至4的條件下反應。
22. 藥學組合物，其包括根據權利要求1至18任一項所述的GLP-2綴合物作為活性成 分，用于預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷和胃病的一種或多種疾病。
23. 預防或治療選自腸道疾病、腸道損傷和胃病的一種或多種疾病的方法，包括施用權 利要求1至18任一項所述的GLP-2綴合物至需要其的患者。
【文檔編號】A61K47/30GK104144697SQ201280071002
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2012年12月28日 優先權日:2011年12月30日
【發明者】金承洙, 林世榮, 鄭圣燁, 權世昌 申請人:韓美科學株式會社