輕鏈橋連的雙特異性抗體的制作方法
【專利摘要】本發明描述了用于臨床治療的具有免疫激活性質的新形式單體雙特異性融合蛋白。雙特異性融合蛋白包括對感興趣的第一靶標具有特異性的第一靶向結構域；衍生自免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的恒定區的橋連結構域，該免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白；和對感興趣的第二靶標具有特異性的第二靶向結構域。雙特異性融合蛋白還可以包括融合到橋連結構域的N-端或C-端的接頭。第一靶向結構域融合到橋連結構域并且第二靶向結構域融合到橋連結構域或接頭上。接頭可以包括GGGGS序列。感興趣的第一靶標可以是CD20、Her2/neu或EpCAM，并且第二靶向結構域是T-淋巴細胞激活結構域。
【專利說明】輕鏈橋連的雙特異性抗體
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年12月27日提交的臨時申請系列號61/580，491的優先權，其公開通過引用全文納入本文。
【技術領域】
[0003]本發明涉及雙特異性或多重特異性生物分子，諸如雙特異性抗體的制備方法及其產物。
[0004]發明背景
[0005]結合具有不同功能的生物分子可能產生具有需要或改良性質的新分子。例如，在多特異性抗體，包括雙特異性抗體和雙特異性腫瘤祀向T-淋巴細胞銜接子(engager)中的最新進展已經證明與單克隆抗腫瘤治療相比，具有免疫激活性質的多重特異性分子經常在腫瘤治療中遞送增強的功效。
[0006]例如，雙特異性抗體(BsAb)可以由來自不同抗體的兩種不同結合結構域(即，可變區)的片段組成。兩種不同的結合結構域可以結合兩種不同類型的抗原。這些分子可以在臨床治療中有所應用，諸如腫瘤免疫治療。對于這類應用，BsAbs可以被設計成同時結合細胞毒性細胞(使用受體如0)3 (Kurby immunology (Kurby免疫學).San Francisco:ff.H.Freeman.1SBN1-492-0211-4))和靶標如癌細胞(例如，癌細胞上的抗原)。
[0007]雙特異性和多重特異性蛋白的構建包括多個蛋白結構域的融合。然而，這樣的融合可能由于融合伙伴不同的生物和/或生理性質而造成融合伙伴之間的不相容。另外，生理限制，包括腎過濾或循環途徑的滲透性，也可能挑戰醫學上可用的多重特異性腫瘤靶向分子的設計。
【發明內容】
[0008]本發明的實施方式涉及用于生物醫學應用如臨床治療的具有免疫激活性質的新形式雙特異性或多重特異性融合蛋白。這些蛋白包括通過橋連結構域連接的兩個特異性結合結構域(靶向結構域)，橋連結構域可以包括一個或兩個任選的接頭。橋連結構域可以衍生自抗體的免疫球蛋白結構域，使得融合蛋白中的不同伙伴是相容的并且可以保留需要的生物性質。可以用作橋的免疫球蛋白結構域可包括輕鏈恒定區或重鏈恒定區。這樣的融合蛋白可以被稱為輕鏈橋連的抗體或重鏈橋連的抗體。
[0009]例如，本發明的實施方式所述的雙特異性融合蛋白可以包括抗腫瘤生物標記，諸如CD20(Hybridoma.19832 ;17)、Her2/neu(Am J Clin Pathol 2003 120(suppl I) ;S53)或EpCAM(J.1mmunol.1992 148⑵；590)，作為細胞靶向或生物分子靶向結構域的單鏈連接的Fv片段(ScFv)，作為橋的輕鏈恒定結構域，任選的接頭(其可以省去)，和作為T-淋巴細胞激活結構域的抗-CD3 ScFv0這樣的輕鏈橋連的雙特異性免疫激活劑同時顯示出對腫瘤表達的細胞靶標和T-淋巴細胞的結合特異性。結合兩個靶標特異性地誘導對腫瘤靶標的T-淋巴細胞-介導的細胞毒作用。
[0010]除了上述的抗腫瘤ScFv示例以外，也可使用其他細胞-靶向結構域。這類其他分子可以具有對其他細胞靶標的特異性結合能力。除了 T-淋巴細胞激活結構域以外，其他細胞靶向結構域的示例可以包括具有所需特異性的ScFv或毒素多肽、酶、激素、細胞因子、信號分子。此外，本發明的實施方式所述的融合蛋白可以在原核或真核細胞中表達。另外，ScFv的取向可以是輕鏈可變區連接到重鏈可變區上，或反之。這樣的雙特異性分子的應用包括藥物應用，諸如載特定生物標記細胞的消耗治療，諸如腫瘤治療。另外，這樣的分子可以在診斷應用中使用。
[0011]本發明的一個方面涉及雙特異性融合蛋白。本發明的一個實施方式所述的雙特異性融合蛋白可以包括對感興趣的第一靶標具有特異性的第一靶向結構域；衍生自免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的恒定區的橋連結構域，該免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白；和對感興趣的第二靶標具有特異性的第二靶向結構域。靶向結構域可以對靶標生物分子或細胞有特異性。
[0012]按照本發明的一些實施方式，雙特異性融合蛋白還可以包括與橋連結構域的N-端或C-端融合的接頭。第一靶向結構域融合到橋連結構域或接頭上而第二靶向結構域融合到橋連結構域或接頭上。接頭可以包括GGGGS序列。感興趣的第一靶標可以是⑶20、Her2/neu、EpCAM等,并且第二祀向結構域可以是T-淋巴細胞激活結構域,諸如抗-⑶3。
[0013]按照本發明的一些實施方式，雙特異性融合蛋白可以省去上述的接頭結構域，例如，其中對感興趣的第一靶標具有特異性的第一靶向結構域和對感興趣的第二靶標具有特異性的第二靶向結構域各直接融合到橋連結構域的兩個末端。
[0014]按照本發明的一些實施方式，雙特異性融合蛋白可以包括間插在第一靶向結構域和橋連結構域之間，以及橋連結構域和第二靶向結構域之間的一個或多個上述的接頭。即，第一靶向結構域和第二靶向結構域都與接頭單獨融合，這些接頭與橋連結構域的兩個末端融合。
[0015]在任意的上述實施方式中，第一靶向結構域可以包括對感興趣的第一靶標具有特異性的第一 ScFv，并且第二靶向結構域可以包括對感興趣的第二靶標具有特異性的第二ScFv0
[0016]在任意的上述實施方式中，第一 ScFv和第二 ScFv各自可以包括人免疫球蛋白序列。在上述實施方式中，第一 ScFv可以包括對第一抗原具有結合特異性的VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，并且第二 ScFv可以包括對第二抗原具有結合特異性的VH-接頭-VL或VL-接頭-VH。
[0017]在任意上述實施方式中，接頭可以包括一個或多個GGGGS(G4S)序列。例如，接頭可以包括I個G4S序列、2個G4S序列(重復)、3個G4S序列等。另外，接頭可以包括與G4S序列結合的其他氨基酸序列。例如，這類其他氨基酸序列可以包括鉸鏈序列(例如，CPPCP)。
[0018]從下面的詳述和所附權利要求書很容易了解本發明的其他方面和優點。
[0019]附圖簡要說明
[0020]圖1A和圖1B顯示了說明本發明的實施方式所述的各種雙特異性T-淋巴細胞激活劑的構建體的示意圖。
[0021 ] 圖2A和圖2B顯示了本發明的實施方式所述來自真核和原核表達系統的輕鏈橋連雙特異性T-淋巴細胞激活劑的表達和純化。圖2B顯示了考馬斯亮藍染色(組圖A)和由BL-21 (DE3)pLysS表達的可溶蛋白上針對帶His-標簽的LCBTA的Western印跡(組圖B)。兩個組圖中的泳道I和3是IPTG誘導前的提取物。兩個組圖中的泳道2和4是用IPTG誘導的提取物。泳道I和2表示Ka LCBTA-1的EpCAM靶向。泳道3和4表示Ka LCBTA-1的Her2/neu革巴向。
[0022]圖3A顯示選擇的腫瘤靶向單克隆抗體和輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細胞激活劑的尺寸排阻-高效液相色譜(SEC-HPLC)分析。圖3B顯示SEC-HPLC分析輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細胞激活劑的均勻性和它們的抗原結合活性以及產率的改善。
[0023]圖4A和4B顯示了本發明的實施方式所述的結合⑶20+拉吉(Raji)淋巴瘤細胞、Her2/neu+BT474乳腺癌細胞、EpCAM+HT29結直腸癌細胞(圖4A)和Jurkat淋巴瘤細胞的CD3(圖4B)的不同腫瘤靶向輕鏈橋連的雙特異性抗體的示例。
[0024]圖5顯示了本發明的實施方式所述的幾個雙特異性抗體的Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴激活劑的瞬時表達的比較。
[0025]圖6證明了 La LCBTA和Ka LCBTA的體外血清穩定性分析。
[0026]圖7顯示在單克隆抗體和本發明的實施方式所述腫瘤靶向雙特異性抗體(同時靶向EpCAM和Her2)的刺激之后外周血單核細胞(PBMC)的細胞因子分泌概況的示例。
[0027]圖8A顯示了本發明的實施方式所述Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細胞激活劑對⑶20+B-淋巴瘤(拉吉)的細胞毒性。圖SB顯示了本發明的實施方式所述Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細胞激活劑對Her2/neu7EpCAM+結直腸癌(HT29)的細胞毒性。圖8C顯示了本發明的實施方式所述Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細胞激活劑對Herf/neu+/EpCAM+胰腺癌(Capan-1)的細胞毒性。
[0028]圖9A顯示由本發明的實施方式所述靶向⑶20的Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細胞激活劑根除腫瘤的移植研究。圖9B顯示由本發明的實施方式所述靶向Her2/neU的Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細胞激活劑根除腫瘤的移植研究。圖9C顯示由本發明的實施方式所述靶向EpCAM的Ig輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細胞激活劑根除腫瘤的移植研究。
[0029]發明詳述
[0030]本發明的實施方式涉及用于生物醫學應用如臨床治療的具有免疫激活性質的新形式雙特異性或多重特異性融合蛋白。本發明的實施方式所述的單體雙特異性或多重特異性免疫激活分子可以指輕鏈橋連的雙特異性免疫激活劑(LCBTA)，或更具體地指免疫球蛋白橋連的雙特異性或多重特異性生物分子。本發明的實施方式所述的生物分子可以是雙特異性的或多重特異性的。然而，為清楚起見，下面的說明書將這些分子稱為“雙特異性”分子。應理解這樣提及“雙特異性”旨在包括“雙特異性”和“多重特異性”。
[0031]本發明的實施方式所述的雙特異性分子可以包括連接兩個靶向結構域的橋連結構域。本發明的實施方式所述的橋連結構域可以包括蛋白或肽，并且這兩個靶向結構域可以分別連接橋連結構域的N-端和C-端。本發明的實施方式所述的這兩個靶向結構域可以衍生自抗體的特異性結合結構域(即，可變區)。這兩個靶向結構域之一可以是T-淋巴細胞-激活結構域，而另一個靶向結構域可以對靶標分子或細胞，諸如腫瘤細胞、腫瘤抗原、病毒、細菌等有特異性。
[0032] 本發明的雙特異性分子的示例可以包括下式⑴和(VI)中所示的那些，其中TgD是靶向結構域，BD是橋連結構域，TAD是T-淋巴細胞激活結構域，并且LNK是接頭:
[0033]TgD -BD-TAD式(I)
[0034]TAD -BD- TgD式(II)
[0035]TgD - LNK -BD- TAD 式(III)
[0036]TAD -BD- LNK - TgD 式(IV)
[0037]TgD - LNK -BD- LNK - TAD 式(V)
[0038]TAD - LNK -BD- LNK - TgD 式(VI)
[0039]一些示例可以包括靶向結構域和橋連結構域之間的接頭。一些示例可以包括T-淋巴細胞-激活結構域和橋連結構域之間的接頭。一些示例可以包括靶向結構域和橋連結構域之間的接頭和T-淋巴細胞-激活結構域和橋連結構域之間的另一個接頭。
[0040]按照本發明的實施方式，靶向結構域(TD)(例如，腫瘤靶向結構域、抗原靶向結構域、生物分子靶向結構域等)可以衍生自抗體的可變區。抗體衍生的靶向結構域可以包括輕鏈可變區和重鏈可變區，其可以兩種構型(取向)存在:(1)輕鏈可變區在N-端而重鏈可變區在C-端，或(2)重鏈可變區在N-端而輕鏈可變區在C-端。
[0041]在靶向結構域(例如，腫瘤靶向結構域)中，重鏈可變區和輕鏈可變區可以與接頭連接，其可以包括任意合適的接頭，諸如短肽片段。例如，本發明的實施方式所述的接頭可以包括短肽，其通常包括小氨基酸殘基或親水氨基酸殘基(例如，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺等)。這樣的肽的一個示例是Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G4S)。其他示例可以在序列中包含這些氨基酸的變換，諸如GGGSG、GGSGG, GSGGG或SGGGG。其他示例可以包括含有G或S以外的氨基酸殘基的肽，諸如GGTGS、GTSPGG, GNGGGS等。本領域技術人員會理解許多常用的肽接頭可以用于本發明的實施方式中。
[0042]按照本發明的實施方式，這樣的短肽接頭可以包括重復單元以增加接頭長度。例如，一些接頭可以包括2個G4S-重復的接頭、3個G4S-重復的接頭、或4個G4S-重復的接頭。此外，一些“重復-樣”接頭可以包括不同肽序列的混合物，諸如G4S-GGSGG-G4S-SGGGG。
[0043]按照本發明的實施方式，橋連接頭可以包括肽片段，優選衍生自抗體的片段。在優選的實施方式中，橋連結構域可以衍生自重鏈、輕鏈，具體地重鏈或輕鏈中的恒定區。例如，本發明的實施方式所述的橋可以衍生自輕鏈，諸如kappa(K)鏈、lambda-2 ( λ -2)鏈、或lambda-5 ( λ-5)鏈(或替代輕鏈)。在一些實施方式中，橋可以包括衍生自輕鏈的區域或結構域，諸如kappa O )鏈、lambda-2(A _2)鏈,或lambda-5 ( λ -5)鏈的恒定區。相似地，橋連結構域可以衍生自重鏈或重鏈的區域(例如，恒定區)。本文使用的術語“衍生自”是指橋連結構域與輕鏈或重鏈的結構域(例如，恒定區)的全長序列具有基本的同源性(例如，≥50%，優選≥70%，更優選≥80%，最優選≥90% )。
[0044]另外，按照本發明的實施方式，橋連結構域可以是模擬輕鏈恒定區的K鏈、λ鏈、或λ-5 (或替代輕鏈)的突變體，或K鏈、λ鏈、或λ-5替代輕鏈的衍生物。本文使用的“突變體”是指保守性突變體或非保守性突變體。如本文所述，本發明的實施方式所述的突變體保留了用作橋連結構域的功能。本領域技術人員會理解保守性突變體包括用相似的氨基酸取代氨基酸并且通常會具有保持的生物活性或結構。保守性突變體可以包括1-50個氨基酸取代，優選1-30個氨基酸，更優選1-20個氨基酸，并且最優選1-10個氨基酸。非保守性突變體可能具有一個或多個氨基酸殘基，例如1-50個氨基酸，優選1-30個氨基酸，更優選1-20個氨基酸，并且最優選1-10個氨基酸的刪除、取代或插入。
[0045]按照本發明的一些實施方式，橋(或橋連結構域)可以與靶向結構域和T-淋巴細胞激活結構域直接連接。按照本發明的其他實施方式，可以在橋和靶向結構域或T-淋巴細胞激活結構域之間提供接頭。按照本發明的其他實施方式，可以在橋和靶向結構域之間提供一個接頭，并且在橋和T-淋巴細胞激活結構域之間提供第二個接頭。
[0046]橋連結構域和靶向結構域或T-淋巴細胞激活結構域之間的接頭可與上述的那些結構域內接頭相似。例如，橋連結構域和靶向結構域或T-淋巴細胞激活結構域之間的接頭可以包括G4S接頭或G4S-重復接頭(其可以是雙重復、三重復等)。另外，如上述，接頭可以包括其他氨基酸序列。
[0047]按照本發明的實施方式，T-淋巴細胞激活結構域可以用或不用間插結構域與橋連結構域的一個末端相連用于T-淋巴細胞激活。各種T-淋巴細胞激活分子為本領域已知，包括抗-CD3抗體(單克隆或多克隆)，或此類抗體的CD3-結合片段或配體或對4-1BB分子的抗體。例如，按照本發明的實施方式，T-淋巴細胞激活結構域可以包括針對CD3的單克隆抗體的可變區。在這樣的實施方式中，可以在兩個取向上使用可變區的重鏈和輕鏈:(I)輕鏈可變區位于N-端并且重鏈可變區位于C-端，或(2)重鏈可變區位于N-端并且輕鏈可變區位于C-端。
[0048]與靶向結構域的描述相似，接頭可連接T-淋巴細胞結合結構域的重鏈可變區和輕鏈可變區。例如，這樣的接頭可以包括任意合適的氨基酸序列，諸如G4S或雙、三或四G4S-重復的接頭。另外，接頭可以包括其他氨基酸序列。
[0049]本發明的雙特異性分子可以用于靶向細胞或分子，同時激活T-淋巴細胞應答。用下面的工作實施例來說明這些分子的一些生物用途。
[0050] 免疫球蛋白輕鏈橋連的雙特異性T-淋巴細胞激活劑的產生
[0051]在第一組示例中，抗-CD20、抗-Her2/neu或抗-EpCAM ScFv (可變區的單鏈片段)用作細胞靶向結構域(CtD)，并且選擇抗-⑶3 ScFv作為T-淋巴細胞激活結構域(TAD)。所選的CtD和TAD通過橋連接，例如其可能包括衍生自抗體輕鏈或重鏈的免疫球蛋白結構域。這類橋的示例可以包括選自人免疫球蛋白恒定區的那些。這類選自人免疫球蛋白恒定區的免疫球蛋白鏈橋的具體示例可能包括，但不限于以下所示的SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQID N0.3 和 SEQ ID N0.4:
[0052]?SEQIDN0.1:VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0053]-人免疫球蛋白κ恒定區
[0054]?SEQIDN0.2:GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEK TV APTECS
[0055]-人免疫球蛋白λ2恒定區
[0056]?SEQIDN0.3:VTHVFGSGTQLTVLSQPKATPSVTLFPPS SE ELQANKATLVCL Met NDFYPGILTVTffKADGTPIT QG VEMetTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWRSRRSYSCQVMetHEGSTVEKTVAPTECS
[0057]-人免疫球蛋白λ5恒定區
[0058]?SEQIDN0.4:TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSC
[0059]-人免疫球蛋白重鏈恒定區I(CHl)
[0060]按照本發明的一些實施方式，CtD的C-端可以與所選橋(例如，衍生自人免疫球蛋白恒定區的橋)的N-端融合。按照本發明的其他實施方式，CtD的C-端可以與所選的接頭序列的N-端融合，并且該接頭隨后與所選橋(例如，衍生自人免疫球蛋白恒定區的橋)的N-端融合。
[0061]在輕鏈橋的C-端，接頭可以任選地與該橋的C-端融合。按照本發明的實施方式，接頭可以包括任意合適的上述肽序列。例如，接頭可以包括一個或多個GGGGS序列(G4S)，含有或不含其他序列(例如，鉸鏈序列，CPPCP)。然后該構建體可以與TAD連接形成圖1所示的雙特異性分子。
[0062]如上述，本發明的一些實施方式可以在橋的N-端具有TAD，含有或不含間插接頭，并且在橋的C-端具有CtD，含有或不含間插接頭。此外，本領域技術人員會理解可以用針對其他靶標分子的其他特異性結合結構域取代CtD。
[0063]圖1所示的LCBTA是二價(雙特異性)分子，具有針對細胞靶標的一價特異性和針對T-淋巴細胞上的CD3分子的另一價特異性。該LCBTA可以在哺乳動物、真核或原核細胞中表達并純化，例如通過輕鏈特異性親和柱純化至均一(圖2)。SEC-HPLC(尺寸排阻HPLC)分析顯示大多數的經純化雙特異性分子是單體形式(圖3)。然而，ScFv的取向、結構域間接頭的長度、ScFv結構域與橋連結構域的相容性、和/或翻譯的效率可能影響雙特異性分子的翻譯和翻譯后加工，其可能導致多聚體形成的增加和/或改變的生物功能(I和J，圖 3,表 I)。
[0064]表1
[0065]
【權利要求】
1.一種雙特異性融合蛋白，所述蛋白包含: 對感興趣的第一靶標具有特異性的第一靶向結構域； 衍生自免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的恒定區的橋連結構域；和 對感興趣的第二靶標具有特異性的第二靶向結構域。
2.如權利要求1所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，還包含融合到所述橋連結構域的N-端或C-端的接頭。
3.如權利要求1或2所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述第一靶向結構域融合到所述橋連結構域或所述接頭上并且所述第二靶向結構域融合到所述橋連結構域或所述接頭上。
4.如權利要求1-3中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
5.如權利要求4所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述橋連結構域是K鏈，λ鏈，λ-5替代輕鏈，或模擬輕鏈恒定區的所述K鏈、所述λ鏈、所述λ-5替代輕鏈的突變體，或所述K鏈、所述λ鏈、所述λ-5替代輕鏈的衍生物。
6.如權利要求2-5中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述接頭包含GGGGS序列。
7.如權利要求1-6中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述第二靶向結構域是T-淋巴細胞激活結構域。
8.如權利要求1-7中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述感興趣的第一靶標是 CD20、Her2/neu 或 EpCAM。
9.如權利要求1-8中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述第一靶向結構域包含對所述感興趣的第一靶標具有特異性的第一 ScFv，并且所述第二靶向結構域包含對所述感興趣的第二靶標具有特異性的第二 ScFv。
10.如權利要求9所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述第一ScFv和所述第二ScFv各包含人序列。
11.如權利要求9或10所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述第一ScFv包含對第一抗原具有結合特異性的VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，并且所述第二 ScFv包含對第二抗原具有結合特異性的VH-接頭-VL或VL-接頭-VH。
12.如權利要求11所述的雙特異性融合蛋白，其特征在于，所述接頭包含GGGGS序列。
【文檔編號】A61K39/395GK104185642SQ201280064787
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2012年12月27日 優先權日:2011年12月27日
【發明者】徐悠深, 許壽山, 張銘一, 駱正凱 申請人:財團法人生物技術開發中心, Dcb-美國有限責任公司