用于治療由包膜病毒導致的疾病的方法和組合物的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：1251467閱讀：1772來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            用于治療由包膜病毒導致的疾病的方法和組合物的制作方法
            
【專利摘要】本發明涉及通過抑制包含在病毒包膜神經節甘酯中的唾液乳糖分子至CD169/唾液酸粘附素受體的結合來預防病毒進入表達CD169/唾液酸粘附素表面受體的細胞的方法和組合物。本發明還涉及基于負載目標抗原的樹突細胞的疫苗組合物，由此，與組合物一起提供的疫苗能夠預防病毒進入表達CD169/唾液酸粘附素的細胞內。此外，本發明涉及可被特別地傳遞至包膜病毒的診斷和治療組合物，其中，診斷/治療試劑被結合至CD169/唾液酸粘附素。
            
【專利說明】用于治療由包膜病毒導致的疾病的方法和組合物
            
  
            
【技術領域】
            
  [0001]本發明涉及通過抑制在病毒包膜神經節甘酯中的唾液乳糖分子至⑶169受體的結合來防止病毒進入表達CD169細胞表面受體的細胞中的方法。本發明還涉及這種結合的抑制劑，以及包含本發明抑制劑的藥物組合物，其制備方法和診斷應用。
            
  
            
【背景技術】
            
  [0002]樹突細胞(DC)捕捉黏膜中的病菌并隨后遷移至次級淋巴組織，它們在那里會獲得需要用以有效誘導適應性免疫反應的成熟表型。用于提取抗原呈遞的成熟DC(mDC)的潛在作用暗示了有效的抗原捕捉并傳遞至抗原呈遞通路內。內吞作用的下調被認為是DC成熟的特點，但是有越來越多的證據指明在炎性條件下，mDC捕捉、處理和呈遞抗原不完全依賴于在先的病菌暴露。參見Mellman I,等，Cell2001 ;106:255_258，Platt C，等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA2010 ； 107:4287-4292 和 Drutman S，等，J.1mmunol.2010 ；185:2140-2146。這種情況可能與慢性感染特別相關，例如由HIV-1所導致的感染，增加的腸腔細菌遷移會系統地刺激DC并促使持續性的抗病毒免疫反應。參見Brenchley J,等，Nat.Med.2006 ;12:1365-1371。
            
  [0003]反常的是，HIV-1捕捉至mDC內還通過在DC-T細胞突觸內傳染性病毒至T細胞的有效表達而表現出極大地增強了病毒在淋巴組織中的傳播，由此通過反式感染而促使發病和疾病發展。體外研究已經示出當HIV在低MOI下使用T細胞培養的時候，包含DC導致更加有效的T細胞感染。反式感染的機理已經成為某些辯論的主題。基于DC成熟而上調的病毒結合和吸收的HIV-lgpl20_獨立機制在本領域中已被在先確立。參見Izquierdo-UserosN, J.Virol.2007 ;81:7559-7570。此外，HIV-lGag eGFP表達熒光病毒樣顆粒(VLPHIV_Gag_eGFP)與mDC中的野生型HIV-1具有相同的運輸路徑，并由此分享通用的管控進入至mDC中的分子模式。參見 Izquierdo-Useros N,等，Blood2009 ;113:2732_2741。然而，HIV-1 通過其而被內在化并累積至mDC中的精確機理迄今為止是未知的。
            
  [0004]據此，通過DC發生的吸收HIV的機理的確定將允許用于防止所述吸收的有用工具的研發，由此降低⑶4+T細胞通過⑶的反式感染。
            
  [0005]發明概述
            
  [0006]在第一方面，本發明涉及唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑，用于治療或預防與通過包膜病毒導致的感染相關的疾病。
            
  [0007]在另一方面，本發明涉及組合物或試劑盒組件，包含負載抗原的抗原呈遞細胞和唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑。
            
  [0008]在又一方面，本發明涉及用于在試樣中檢測或分離包膜病毒的方法，包括:
            
  [0009](i)使所述試樣與唾液酸粘附素或其基本上保持結合唾液乳糖能力的功能等效變體接觸，和
            
  [0010](ii)檢測或分離結合至所述唾液酸粘附素或其功能等效變體的病毒。
            
  [0011]在又一方面，本發明涉及一種試劑盒組件，其包含固定的唾液酸粘附素或其基本上保持結合唾液乳糖能力的功能等效變體。
            
  [0012]在另一方面，本發明涉及包含固定的唾液酸粘附素或其基本上保持結合唾液乳糖能力的功能等效變體的軛合物，以及治療劑或診斷劑。
            
  [0013]在又一方面，本發明涉及用于將目標化合物傳遞至抗原呈遞細胞的體外方法，其包含使所述的抗原呈遞細胞與包含所述目標化合物的脂質微粒相接觸，其中所述的脂質微粒包含至少一個包含唾液乳糖片段的分子。
            
  
            
【專利附圖】
            

            
【附圖說明】
            
  [0014]圖1.神經節苷脂為用于由mDC調節的病毒捕捉所需要的。脂質中的神經節苷脂檢測從MT4衍生的HIVnm.3提取。㈧表示由UPLC/TOF ESI⑴分析獲得的三種不同的病毒分離體的相應于5.3和6.5min范圍的色譜的部分質譜(850至1550amu)。對于識別的每種目標化合物，其[M+H] +和[M+Na] +離子被指示出。每種化合物的保留時間緊挨著其縮寫而給出。所選擇的時間范圍相應于N十六酰(N-C16)類。(B)在5.56min獲得的GDl的精確質量離子簇。(C)具有電荷態為2的相應于通式C82H144N4039的精確質量離子簇。也觀察到 N-C22、N-C24 和 N-C24:1 類。(D)對比 VLPHIV_eag_e(；FP 和包含 Cer、GM3、GM2、GMl 或 PS 的不同的熒光LUVHIV_tKed的mDC捕捉。總共2xl05的DC在37°C下使用0.2ml的100 μ M的LUV或者75ng VLPHIV_Gag_eGFP Gag脈沖4h，使用PBS沖洗并通過FACS評估以獲得tRed或eGFP陽性細胞的百分比。數據顯示出五個獨立試驗的均值和SEM，包括至少六個供體的細胞。包含GM3的LUVHIV_tKed比Cer或0 LUVHIV_tEed具有顯著更大量的成熟DC捕捉(P〈0.0001,配對
            
  t檢驗)。包含GMl的LUVHIV_tKed比帶負電的PS-LUVHIV_tKed具有顯著更大量的成熟DC捕捉(P = 0.0081,配對 t 檢驗)。(E) 75ng 的 VLPHIV_Gag_eGFP Gag 和降低量(μ Μ)的包含 GM2 的LUVHIV_tIted之間的捕捉競爭。作為對照組，我們使用最大濃度的LUVHIV_tIted(100 μ Μ)，具有或不具有Cer。細胞在37°C下培養4小時，沖洗并通過FACS分析來確定eGFP-和tRed-陽性細胞的百分比。數據顯示三個獨立試驗的平均值和SEM，包括來自至少四個供體的細胞。在存在更大量的包含GM2的LUVHIV_tKed(P〈0.0001,配對t檢驗)時，mDC捕捉更少的VLPHIV_Gag_e(；FP。
            
  [0015]圖2.包含神經節苷脂的LUVHIV_tKed在mDC內作為VLP HIV_Gag_eGFP傳遞至相同的隔間。(A)在VLPHIV_eag‘FP或包含神經節苷脂的LUVHIV_tIted獨立挑戰4小時后具有不同捕捉圖形的mDC百分比。數據示出了 5個不同供體的大于100個細胞的平均值和SEM。(B)與包含神經節苷脂的LUVHIV_tKed共同定位的VLPHIV_eag_eeFP的量化百分比并且反之亦然，通過分析3個不同供體的mDC的至少10個囊泡獲得的。
            
  [0016]圖3.獨立于通過mDC的包含神經節苷脂的LUVHIV_tKed捕捉的液體次序。⑷包含或不包含Cer、GM3、GM2或GMl的LUVP0PC_tEed的mDC捕捉對比。總共2xl05的DC在37。。下使用100 μ M的LUV脈沖4h，使用PBS沖洗并通過FACS評估以獲得tRed陽性細胞的百分t匕。數據顯示出三個獨立試驗的均值和SEM，包括來自至少六個供體的細胞。包含GM3的LUVP0PC_tEed比Cer或LUVrarc_tIted具有顯著更大量的成熟DC捕捉(P值在圖形上，配對t檢驗)。(B)在包含神經節苷脂的LUVrorc_tKed挑戰4h后具有不同的脂質體捕捉的mDC百分比圖形。
            
  [0017]圖4.復合神經節苷脂的mDC捕捉圖形。(A)包含GM1、例如⑶lb、GTlb和GQlb的多聚唾液酸神經節苷；PS和Cer的不同的LUVHIV_tKed的mDC捕捉對比。總共2xl05的DC在37°C下使用100 μ M的LUV脈沖4小時，使用PBS沖洗并通過FACS評估以獲得tRed陽性細胞的百分比。數據顯示出兩個獨立試驗的均值和SEM，包括來自六個供體的細胞。包含GMl的LUVHIV_tKed比包含GQlb的LUVHIV_tKed具有顯著更大量的成熟DC捕捉(P〈0.0001，配對t檢驗)。在這些實驗中所采用的LUV中的神經節苷脂的示意圖鄰近本說明示出。(B)使用75ng的VLPHIV_eag_eeFP Gag和100 μ M不同的多聚唾液酸神經節苷LUVHIV_tKed脈沖的mDC之間的捕捉競爭。細胞在37°C下培養4小時，沖洗并通過FACS分析來確定eGFP和tRed陽性細胞的百分比。數據顯示出兩個獨立試驗的均值和SEM，包括來自六個供體的細胞。在存在包含GMl的LUVHIV_tKed時，與存在相同濃度的包含GQlb的LUVHIV_tKed相比，mDC捕捉更少的VLP肌ag_eGFP(P〈0.0001，配對 t 檢驗)。
            
  [0018]圖5.存在于神經節苷脂的病毒附著域的識別。(A)包含Cer、GMl或缺乏唾液酸的GMl (缺乏唾液酸基的GMl)的不同的LUVHIV_tKed的mDC捕捉對比。總共2xl05的DC在37°C下使用100 μ M的LUV脈沖4小時，使用PBS沖洗并通過FACS評估以獲得tRed陽性細胞的百分比。數據顯示出三個獨立試驗的均值和SEM，包括來自九個供體的細胞。包含GMl的LUVHIV_tKed比包含缺乏唾液酸基的GMl的LUVHIV_tKed具有顯著更大量的成熟DC捕捉(P〈0.0001，配對t檢驗)。⑶包含GM3的LUVHIV_tKed和利用神經氨酸酶處理以移除唾液酸或未處理的VLPHIV_eag_e(；FP的mDC捕捉對比。總共2xl05的DC在37°C下使用25 μ M的LUV和75ng利用產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)神經氨酸酶ON處理的或未處理的VLPHIV_eag_e(；FP Gag脈沖2小時，使用PBS沖洗并通過FACS評估以獲得tRed和eGFP陽性細胞的百分比。數據顯示出兩個獨立試驗的均值和SEM，包括來自五個供體的細胞。未處理顆粒比神經氨酸酶處理的顆粒具有顯著更大量的成熟DC捕捉(P值在圖形上，配對t檢驗)。(C)包含GalCer、GM4、GM3或GMl的不同的LUVHIV_tKed的mDC捕捉對比。總共2xl05的DC在37°C下使用100 μ M的LUV脈沖4小時，沖洗并通過FACS評估以獲得tRed陽性細胞的百分比。數據顯示出三個獨立試驗的均值和SEM，包括來自九個供體的細胞。包含GMl的LUVHIV_tKed比包含GalCer或GM4的LUVHIV_tKed具有顯著更大量的成熟DC捕捉(P〈0.0001,配對t檢驗)。對于這些試驗來說，存在于LUV中的分子的示意圖在底部說明中示出。(D)通過mDC來相對捕捉包含GM3的LUVHIV_tKed和VLPHIV_eag_eeFP的圖形表示，其使用1mM的可溶乳糖或者5至1mM的GM3碳水化合物極性端基預培養，標準化至通過模擬處理的mDC的LUV/VLP捕捉的水平(以100%設定)。基于利用GM3極性端基的處理，mDC捕捉少量的顆粒(P值在圖形上，配對t檢驗)。數據顯示出三個獨立試驗的均值和SEM，包括來自至少九個供體的細胞。
            
  [0019]圖6.神經節苷脂結構。在本研究中所使用的無唾液酸神經節苷脂、單唾液酸神經節苷脂、二唾液酸神經節苷脂、三唾液酸神經節苷脂和四神經節苷脂的2D模型。
            
  [0020]圖7.包含Texas Red的LUV的對比熒光。包含在圖形中所示分子的LUVHIV_tIted或LUVP0PC_tEed在608nm的最大發射熒光。㈧在圖1和2中使用的LUVHIV_tIted的對比，⑶在圖3中使用的LUVrarc_tIted的對比，(C)在圖4中使用的LUVHIV_tKed的對比，⑶在圖5中使用的LUVHIV_tEed的對比。數據顯示出至少兩個不同的LUV制備的獨立測量值的均值和SEM。
            
  [0021]圖8.在CHO細胞系中產生的VLP的捕捉。在CHO細胞系中產生的VLPHIV_eag‘FP的捕捉，其僅能夠合成神經節苷脂至GM3。總共2xl05的DC在37°C下使用75ng的蔗糖小球VLPHIV-Gag-eGFP Gag脈沖4小時，沖洗并通過FACS評估以獲得eGFP陽性細胞的百分比。數據顯示出兩個代表性試驗之一的平均值和SEM，包括來自三個供體的細胞。
            
  [0022]圖9.Raji B細胞中凝集素的轉染。由Raji細胞捕捉的VLPHIV_eag_eeFP通過所示的表達質粒被轉染，用于凝集素或模擬轉染。轉染的Raji細胞使用10 μ g/ml的指示mAbs預培養并暴露至VLP。數據顯示出兩個試驗的平均值和SEM，包括來自四個轉染的細胞。
            
  [0023]圖10.唾液乳糖的阻塞效應。通過Siglec-1表達質粒或模擬轉染被轉染的Raji細胞的VLPHIVm捕捉。細胞使用指示濃度的唾液乳糖或可溶乳糖預培養并暴露至VLP。數據示出三次平行轉染的平均值和SEM。
            
  [0024]圖11.在LPS mDCs中表達的Siglec-1捕捉包含不同神經節苷脂的囊泡，例如HIV-1病毒樣微粒，脂質體和外來體。通過使用降低濃度的a-SigleC-lmAb7D2在VLP暴露之前在37°C下預培養30分鐘的LPS mDCs捕捉VLPHIV_eag_eeFP。數據示出三個試驗的平均值和SEM，包括來自六個供體的細胞。
            
  [0025]圖12.通過 LPS mDCs 捕捉 VLPHIV_eag_eeFP，所述 LPS mDCs 使用或不使用 2 μ g/ml 的a -Siglec_lmAb7D2預培養，所述a -Siglec_lmAb7D2使用至少100倍摩爾過量的指示人類重組蛋白預先處理或不處理。值得注意的是，Siglec-14與Siglec-5在V設定域分享100%氨基酸同源性。數據示出三個試驗的平均值和SEM，包括來自九個供體的細胞。
            
  [0026]圖13.a -Siglec-1mAb7 - 239 的阻塞效應。(A)通過 LPS mDC 捕捉 VLPHIV_Gag_e(；FP，在VLP暴露之前，所述LPS mDC使用降低濃度的a-Siglec-lmAb7 - 239在37°C下預培養30分鐘。數據示出四個供體的平均值和SEM。(B)通過LPS mDC捕捉VLPHIV_eag_eeFP，在VLP暴露之前，所述LPS mDC使用10 μ g/ml的指示mAbs在37°C下預培養3小時。數據示出兩個實驗的平均值和SEM，包括來自七個供體的細胞。
            
  [0027]圖14.Siglec-1沉默阻止病毒捕捉和反式感染，而SIGLEC1的再次表達挽救其。Siglec-1的干涉。對CD14，HLA-DR，Siglec-1或VLP捕捉呈活性的LPS mDCs百分比緊隨模擬轉導或非目標轉導或兩個不同的Siglec-1特異的shRNAs。數據示出四個試驗的平均值和SEM，包括至少來自四個供體的細胞。
            
  [0028]發明詳述
            
  [0029]本發明清楚地確定了新的角色，用于在病毒或者囊泡的膜內唾液酸化神經節苷月旨，作為通過mDC進行特定捕捉的決定因素。這種捕捉取決于暴露的唾液乳糖片段，其在這里首次定義為新的病原體相關的分子模型。神經節苷脂是在所有的包膜病毒中存在的質膜磷脂的重要組分，其由受感染細胞的質膜發育出，可以通過所記載的機理而被捕捉至mDC內，除非它們不包括包含神經節苷脂的唾液乳糖。
            
  [0030]攜帶神經節苷脂的囊泡或病毒的有效捕捉提供了一種例如在本發明中揭示的模型，其中存在于mDC(及其他可能的細胞)細胞表面上的特定受體，例如CD169細胞表面受體，識別出病毒或囊泡膜上的唾液乳糖部分。囊泡的神經節苷脂的特定識別隨后將觸發被吸收至細胞內部分。相繼地，內在化材料可被回收至表面(作為HIV-1至T細胞的傳輸)或可被供給至抗原呈遞通路內。
            
  [0031]1.通用術語和表達的定義
            
  [0032]在這里所使用的術語“AIDS”指的是HIV感染的產生癥狀的階段，并且包括獲得性免疫缺陷綜合癥(俗稱AIDS)和“ARC”、或者AIDS相關綜合征。參見Adler M,等，Brit.Med.J.1987 ;294:1145-1147。AIDS的免疫學和臨床表現為現有技術已知的并且包括例如機會感染和由免疫缺陷導致的癌癥。
            
  [0033]本文使用的術語“抗體”指的是由一種或多種基本上通過全部或部分公認的免疫球蛋白基因來編碼的蛋白質構成的蛋白質，包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體及其抗原結合片段，例如F(ab’)jPFab片段，以及單鏈抗體。術語抗體包括任意種類已知的抗體，例如多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體、靈長類抗體、人類抗體和雙特異性抗體。
            
  [0034]本文使用的術語“抗HIV劑”、“HIV抑制劑”和“HIV抗病毒劑”指的是能夠抑制HIV在例如為哺乳動物細胞的細胞內的復制，或者有效治療、預防或推遲HIV感染或AIDS或疾病或產生其的條件或與之相關的發病或惡化的任意化合物及其藥學上可接受的鹽。根據本發明使用的合適的抗HIV試劑包括但不限于HIV蛋白酶抑制劑、HIV逆轉錄酶抑制劑、HIV進入抑制劑和HIV免疫原。
            
  [0035]本文所使用的術語抗體的“抗原結合區域”還包括結合至特定抗原的合成或基因工程多肽，例如由輕鏈可變區域構成的多肽，由重鏈和輕鏈可變區域構成的“Fv”片段，其中輕鏈和重鏈可變區域通過肽鍵而被連接的重組單鏈多肽分子(“scFv蛋白質”)，和由模仿高變區的氨基酸殘基構成的最小識別單元。
            
  [0036]本文使用的術語“抗原負載”指的是通過培養樹突細胞或祖細胞將抗原傳遞至樹突細胞的方法，其利用肽、多肽、脂肽、DNA(裸DNA或者在質粒運載體內的DNA)或RNA ;或者利用抗原表達重組細菌或病毒(例如牛痘、腺病毒或慢病毒)，從而使得其抗原表位在細胞表面上通過MHC而被負載和表達。
            
  [0037]本文使用的術語“抗原呈遞細胞(APC) ”指的是能夠通過MHC分子(MHC I類或MHCII類分子)處理和呈遞抗原的任何細胞。APC能夠通過MHC I類或MHC II類分子處理和呈遞抗原。特別地，抗原呈遞細胞包含樹突細胞、巨噬細胞、B細胞、上皮細胞、纖維原細胞、膠質細胞和可由本領域技術人員確定的其它細胞。優選地，APV為樹突細胞。
            
  [0038]本文使用的術語“抗逆轉錄病毒劑”包括任何已被證明能夠逆轉錄病毒的藥物、生物或細胞劑。
            
  [0039]術語“反義核酸”指的是與癌基因編碼的DNA和RNA的堿基序列互補的寡核苷酸。當在靶細胞中表達的時候，反義核酸特別地結合至它們的目標核酸并干預轉錄、RNA加工、轉運和/或翻譯。具有多肽的靶向雙鏈(ds)DNA導致三螺旋的形成；靶向RNA將導致雙螺旋形成。
            
  [0040]本文使用的術語“自體同源”指的是源自供體并隨后再引入至相同個體的任何材料。
            
  [0041]本文使用的術語“組合物”指的是包含至少兩個組分以及由不同組分的組合以任意量直接或間接地獲得的任何產物的物質組合物。本領域技術人員將觀察到組合物可被配制為單一的配方或者可被表示為每個組分的單獨配方，其可被組合以作為聯合制劑組合使用。組合物可以是試劑盒組件，其中每個組分被單獨地配制并包裝。
            
  [0042]本文使用的術語“包含”還揭示了根據專利實踐通常可接受的“由……構成”。
            
  [0043]本文使用的術語“軛合物”指的是兩種或多種共價連接的化合物以使得每種化合物的功能被保持為共軛的。
            
  [0044]本文所使用的術語“樹突細胞(DC) ”為抗原呈遞細胞，存在于體內、體夕卜、來自體內或在宿主或患者內，或者其可以源自造血干細胞或單核細胞。樹突細胞及其前體細胞可以從多種淋巴器官(例如脾臟、淋巴結)以及骨髓和周邊血液中分離。DC具有在多個方向遠離樹突細胞體延伸的薄層(層形足板)的特征形態。典型地，樹突細胞表達高水平的MHC和共刺激(例如B7-1和B7-2)分子。樹突細胞可以包括體外T細胞的抗原特異性分化，并且能夠在體外和在體內激發原始T細胞應答。術語“樹突細胞”包括分化的樹突細胞，無論是成熟的還是不成熟的樹突細胞。這些細胞可以通過特定細胞表面標記(例如CDllc、MHCII類以及至少低水平的⑶80和⑶86)的表達來表征。此外，樹突細胞可以通過它們刺激同種異體應答的能力以及混合淋巴細胞反應(MLR)來功能性地表征。表述“樹突細胞制備”指的是包含可在適用于所述細胞脈沖的介質中獲得自主體的樹突細胞的組合物。
            
  [0045]本文所使用的表述“與HIV感染相關的疾病”包括其中所述主體具有發展的AIDS的狀態以及其中受到HIV感染的受試者并未顯示出任意的疾病跡象或癥狀的狀態。由此，當施加至未出現臨床感染跡象的受試者的時候，本發明的組合物可以具有預防活性，因為它們可以預防該疾病的發生。所述組合物能夠預防或減緩健康CD4+T細胞在這樣的受試者中的感染和毀壞。其還指的是預防和減緩獲得性免疫缺陷病的癥狀的發生，例如極低的0)4+T細胞含量和通過例如分枝桿菌屬(Mycobacteria spp.)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystiscarinii)和卡氏肺隱球菌(Pneumocystis cryptococcus)的條件致病菌的重復感染。有益的或期望的臨床結果包括但不限于絕對的天然⑶4+T細胞量的增加(范圍10-3520)，⑶4+T細胞相對于總循環免疫細胞的百分比的增加(范圍1-50% )，和/或CD4+T細胞量相對于未受感染主體中的正常CD4+T細胞量的百分比的增加(范圍1-161%)。“治療”還指與所期望的存活相比，感染受試者的延長的存活，如果受試者并不接受任何的HIV靶向治療。
            
  [0046]本文使用的“雙鏈RNA”或“dsRNA”指的是由雙鏈組成的RNA分子。雙鏈分子包括由自身折回以形成雙鏈結構的單個RNA分子所組成的那些。例如，祖分子的莖環結構，單鏈miRNA 源自于祖分子，被稱為前體 miRNA (Bartel 等，2004.Cel 1116:281-297)，包含 dsRNA 分子。
            
  [0047]本文使用的表述“與由包膜病毒導致的感染相關的疾病”包括但不限于:
            
  [0048]I)由屬于絲狀病毒科的包膜病毒導致的疾病，包括但不限于由馬堡病毒導致的馬堡病毒病(馬堡出血熱或MHF)，以及由埃博拉病毒導致的埃博拉病毒病(埃博拉出血熱或EHF)，和
            
  [0049]2)由屬于逆轉錄病毒科的包膜病毒導致的疾病。由包膜病毒感染導致的其它疾病包括但不限于登革熱、登革出血熱(DHF)、黃熱病、登革熱、急性和慢性丙型肝炎、委內瑞拉出血熱、巴西出血熱、玻利維亞出血熱、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎、拉沙熱、漢坦病毒肺綜合征(HPS)、腦膜炎和流行性感冒。
            
  [0050]本文使用的術語“包膜病毒”指的是具有外膜或包膜的任何動物病毒，其為包含病毒蛋白質的脂質雙層，包圍病毒外殼。示例性的包膜病毒包括但不限于痘病毒科、肝脫氧核糖核酸病毒科、披膜病毒科、沙粒病毒科、黃病毒科、正粘病毒科、副黏液病毒科、布尼亞病毒科、彈狀病毒科、絲狀病毒科、冠狀病毒科、逆轉錄病毒科和博爾納病病毒科的病毒家族成員。
            
  [0051]本文使用的術語“表位”指的是能夠特定結合至免疫球蛋白或者能夠由主要組織相容性復合體(MHC)蛋白質(例如I類或II類)呈遞至T細胞受體的任何蛋白質決定簇。表位決定簇通常為適配在MHC分子溝槽內的5-30個氨基酸長的短肽，所述MHC分子將特定的氨基酸側基呈遞至T細胞受體，并且在所述溝槽內具有特定的其它殘基(例如由于所述溝槽的特定的電荷特征)，肽側基和T細胞受體。
            
  [0052]本文使用的術語“神經節苷脂”或“唾液酸神經節苷脂”指的是鞘糖脂，每分子包含數個單糖單元。包含在神經節苷脂或者神經節苷脂衍生物中的合適的單糖單元的例子為D-半乳糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、葡萄糖和N-乙酰神經氨酸。特別優選的神經節苷脂為鞘氨醇(2-氨基-4-十八烯-1，3-二醇，天蛾-4-錦葵色素-3-葡糖苷)的衍生物，特別地，其具有通過氧的方式而被結合至C-1的糖殘基和短鏈(特別是(:2-(:18)脂肪酸，其可以是飽和的或者不飽和的，通過C-2上的氮的方式而被結合。進一步給出的優選的神經節苷脂包含:
            
  [0053](i) N-酰基鞘氨醇(神經酰胺)，其具有通用結構:
            
  [0054]
            

            

            
 O
            

            
 —II—
            

            
   HN-C-R1
            
 R3~~-O——CH2—CH~-CH—CH=CH-Rj
            

            

            
  OH
            
  [0055]其中，R1為長鏈脂肪酸殘基，特別是C6-C3tl、更優選C8-C24脂肪酸殘基，R2為長鏈烷基殘基，特別是C6-C3tl、更優選C8-C24烷基殘基，并且R3為H，和
            
  [0056](ii)寡糖鏈，承載鏈接至神經酰胺的終端伯羥基的一個或多個N-乙酰神經氨酸(例如N-乙酰神經氨酸，NANA,唾液酸)。所述N-乙酰神經氨酸殘基或多個殘基可以通過唾液酸內任意可能的位置結合至寡糖，并結合至寡糖分子內任意可能的位置。在優選的實施方式中，N-乙酰神經氨酸通過唾液酸的位置2的羥基連接至寡糖(唾液酸結構的編號開始于羧酸鹽碳并繼續圍繞該鏈)。在另一優選的實施方式中，唾液酸通過形成寡糖一部分的半乳糖殘基的位置3或6的羥基被連接至寡糖。在優選的實施方式中，“N-乙酰神經氨酸”形成α 2，3-唾液酸化或者α 2，6_唾液酸化寡糖。
            
  [0057]本文使用的術語“HIV”包括HIV-1和HIV-2以及SIV。“HIV-1 ”是指I型人類免疫缺陷病毒。HIV-1包括但不限于細胞外病毒微粒以及與HIV-1感染細胞相關的HIV-1的形式。HIV-1病毒可以代表任意已知的主要亞型(A、B、C、D、E、F、G和H型)或者外圍亞型(O組)，包括實驗室毒株和主要隔離種群。“HIV-2”是指2型人類免疫缺陷病毒。HIV-2包括但不限于細胞外病毒微粒以及與HIV-2感染細胞相關的HIV-2的形式。術語“SIV”是指猿猴免疫缺損病毒，其為感染猴子、黑猩猩和其它非人類靈長目動物的HIV樣病毒。SIV包括但不限于細胞外病毒微粒和與SIV感染細胞相關的SIV的形式。
            
  [0058]本文使用的術語“HIV免疫原”指的是衍生自HIV的蛋白質或肽抗原，其能夠在主體中產生免疫應答。用于根據本發明的HIV免疫原可以選自任意的HIV隔離種群(例如任何原生的或培養的HIV-1、HIV-2或HIV-3隔離種群、株或分支)。
            
  [0059]本文使用的術語“HIV感染”指的是已被證實的HIV抗體、HIV抗原或HIV核酸在受試者中的存在，其通過使用本領域技術人員已知的HIV試驗(例如HIV EIA、蛋白質印記、PCR試驗)檢測病毒的存在而被證明。
            
  [0060]本文使用的術語“免疫原”指的是能夠單獨地或者與佐劑聯合誘導免疫應答的物質或材料(包括抗原)。正如將被理解的，通過疫苗產生的免疫應答可以是體液或細胞免疫應答。本文使用的術語“體液免疫應答”用于描述抵抗外來抗原的免疫應答，其由T細胞和它們的分泌產物介導。本文使用的術語“細胞免疫應答”用于描述抵抗外來抗原的免疫應答，其通過由B細胞產生的抗體介導。疫苗為全身或者局部施用。所述疫苗可以通過單獨施用的方式來施用，或者通過在先描述的用于施用本發明組合物的多次施用的方式來增加施用。本文使用的術語“預防”指的是減少病變細胞在動物內的產生。預防可以是完全的(例如在受試者內完全不存在病變細胞)。所述預防還可以是局部的，從而使得例如病變細胞在主體內的產生小于不通過本發明而發生的。預防還指降低臨床癥狀的易感性。
            
  [0061]本文使用的表述“唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑”指的是能夠抑制唾液酸粘附素和唾液乳糖或者包含唾液乳糖的任意其它化合物之間結合的任何分子或化合物。抑制劑能夠通過親和力特別地結合至唾液酸粘附素和唾液乳糖之一，所述親和力大于唾液酸粘附素和唾液乳糖之間結合的親和力。如在本發明中使用的，表述“特異性結合”指的是第一分子通過兩個分子的三維結構之間所存在的互補性而特別地結合至第二分子的能力，其對于非特異性結合具有本質上更高的親和力，從而使得所述第一和第二分子之間的結合優選在任何所述的分子與反應混合物中存在的其它分子相結合之前發生。應當理解在兩個分子結合時存在高親和力，當由所述的結合導致的復合物具有的解離常數(KD)小于1(Γ6Μ、小于1(Γ7Μ、小于1(Γ8Μ、小于1(Γ9Μ、小于1(Γ10Μ、小于1(ΓηΜ、小于1(Γ12Μ、小于ΙΟΙ、小于KT14M或小于KT15M的時候。
            
  [0062]本文使用的術語“干擾RNA”指的是通過結合并抑制mRNA加工、例如抑制mRNA翻譯或導致mRNA降解的分子通過特定的mRNA的破壞的選擇性的后轉錄基因沉默。合適的干擾RNA包括但不限于siRNA、shRNA,內源性miRNA和人工miRNA。例如，其包括在先定義為siRNA的序列，而無需考慮RNA的下游加工機理(即盡管siRNA被認為具有導致mRNA分解的體內加工的特定方法，在這里描述的側翼序列的內容中這樣的序列可被結合至載體內)。
            
  [0063]本文使用的術語“分離”指的是從它們被引入的介質部分地或者完全地移除病毒微粒。
            
  [0064]本文使用的術語“外源凝集素”指的是任何不同于抗體的并且能夠結合至碳水化合物或由碳水化合物改性的結構的蛋白質，包括糖蛋白和糖基化納米結構。
            
  [0065]本文使用的術語“脂質微泡”或“脂質體”指的是包含外脂質層的微泡，所述外脂質層可以是脂質單層或雙層。當外脂質層為脂質單層的時候，脂質體也稱為膠團。脂質體可以具有一個或多個脂質膜。本發明考慮也稱為單層的單層脂質體和稱為多層的多層脂質體。
            
  [0066]本文中可互換使用的術語“微RNA”或“miRNA”為內源性RNA，其中的某些已知用于以轉錄后水平調節蛋白質編碼基因的表達。內源性微RNA為天然存在于基因組中的小RNA,其能夠調制mRNA的高效應用。術語人工微RNA包括除了內源性微RNA之外的能夠調制mRNA的高效利用的任何類型的RNA序列。微RNA序列已在文獻中有所描述，例如Lim，等,Genes and Development, 17, p.991-1008(2003), Lim 等 Science299, 1540 (2003), Lee和 Ambros Science,294,862 (2001),Lau 等，Science294, 858-861 (2001)，Lagos-Quintana 等,Current B1logy, 12, 735-739 (2002), Lagos Quintana等，Science294, 853-857 (2001)，以及 Lagos-Quintana 等，RNA, 9，175-179 (2003)，其通過引用而被納入本發明中。多個微RNA還可被引入至前體分子中。此外，miRNA樣莖環結構可以作為載體而在細胞中表達用以傳遞人工miRNA和短干涉RNA(siRNA)，用于通過miRNA和/或RNAi路徑調制內源性基因的表達的目的。本文使用的術語“包含唾液乳糖部分的分子”指的是在其結構中包含結合至唾液酸片段的β -D-吡喃型半乳糖- (I — 4)-D-葡萄糖片段的任意分子。在優選實施方式中，所述β-D-吡喃型半乳糖-(I —4)-D-葡萄糖片段形成寡糖的一部分，其中吡喃型半乳糖-(I — 4)-D-葡萄糖片段可以形成鏈中末端的兩個單糖殘基或者可在兩側被連接至其它的單糖殘基。包含吡喃型半乳糖-(I — 4)-D-葡萄糖片段的寡糖可以包含至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多的單糖殘基。所述寡糖可以如此提供或者形成神經節苷脂的一部分。
            
  [0067]本文使用的術語“序列同一性％ ”通過在對比窗口比較兩個最優化排列的序列來確定，其中多肽或多核苷酸序列在對比窗口中的片段可以包含增加或刪減(例如間隙或突出)，與用于兩個序列最優化排列的參考序列(其并不包含增加或刪減)相比。該百分比通過確定位置數量來計算，在所述位置，在兩個序列中出現的相同的氨基酸殘基或核酸殘基會產生匹配位置的數量，令匹配位置的數量除以對比窗口內位置的總數并將該結果乘以100從而獲得序列同一性百分比。對齊序列的運算法則為本領域已知的。用于對比的序列的最優化排列可被實施，例如通過Smith-Waterman局部同源性算法、Needleman-Wunsch同源性比對算法、Pearson-Lipman相似性搜索方法、這些算法的計算機實施或者通過手工排列和視覺檢查。參見Smith T, Waterman M, Adv.Appl.Math.1981 ；2:482-489 ;Needleman S, Wunsch C, J.Mol.B1l.1970 ；48:443-453 ；Pearson ff, LipmanD, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA1988 ；85:2444-2448 ；Tatusova T, Madden T, FEMS Microb1l.Lett.1999 ;174:247-250 ;the GAP, BESTFIT, FASTA 和 TFASTA programs,WisconsinGenetics Software Package, Genetics Computer Group,Madison, WI, US ；Ausubel F,等.，Eds., “Short Protocols in Molecular B1logy”，第四版.(John Wiley 和Sons, Inc.，New York, NY, US, 1997)。
            
  [0068]在這里可互換使用的術語“藥學上可接受的載體”、“藥學上可接受的稀釋劑”、“藥學上可接受的賦形劑”或者“藥學上可接受的載體”指的是非毒性的固體、半固體或液體填料、稀釋劑、包封材料或任何常規類型的配方助劑。制藥學可接受的載體為所應用的劑量和濃度對于接受者基本上為非毒性的，并且可以與配方的其它成分相兼容。例如，用于包含多肽的制劑的載體將通常不會包括氧化劑和已知對多肽有毒的其他化合物。
            
  [0069]本文使用的術語“磷脂”指的是包含一個或多個磷酸基團的脂質。磷脂在性質上為兩親的；即每個分子由親水性部分和疏水性部分構成。在這里，術語“磷脂”包括藥學上可接受的鹽和這樣的化合物的酯類衍生物。磷脂可以根據磷酸甘油酯(或甘油磷脂)中乙醇的類型來分類，當它們攜帶甘油主鏈和鞘脂的時候，其中所述脂質包含鞘氨醇。兩個種類均存在于生物膜中。磷酸甘油酯為天然發現的最豐富的磷脂種類，并且包括但不限于磷脂酰膽堿(例如卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和心磷脂。每種類型的磷酸甘油酯的結構多樣性取決于脂肪酸酯基團的鏈長和飽和度的可變性。
            
  [0070]本文使用的術語“蛋白酶抑制劑”指的是HIV-1蛋白酶，使病毒多聚蛋白前體(例如病毒GAG和GAG Pol多聚蛋白)溶蛋白性裂解為在感染HIV-1中發現的單功能蛋白質所需要的酶。
            
  [0071]本文使用的術語“逆轉錄酶病毒”指的是屬于逆轉錄病毒家族的病毒，其特征在于RNA病毒可在宿主細胞中通過逆轉錄酶復制以由其RNA基因組產生DNA。
            
  [0072]本文使用的術語“逆轉錄酶抑制劑”指的是抑制HIV-1逆轉錄酶活性的任何化合物，所述酶會催化病毒基因組HIV-1RNA轉化為前病毒HIV-1DNA。
            
  [0073]術語“核酶”指的是RNA基酶，能夠靶向并裂解DNA中或者更典型地RNA中特定的堿基序列。
            
  [0074]本文使用的“shRNA”或“小發夾RNA” (還稱為莖環結構)為siRNA類型。在一種實施方式中，這些shRNA由短的、例如約19至約25個核苷酸、反義鏈，之后約5至約9個核苷酸的核苷酸環以及類似的有義鏈組成。可替換地，有義鏈可以位于核苷酸環結構之前并且反義鏈位于其后。
            
  [0075]本文使用的“siRNA”指的是形成雙鏈的核酸。
            
  [0076]RNA，其中雙鏈RNA具有降低或抑制基因或靶基因表達的能力，當siRNA作為靶基因sHl而存在于或表達于小細胞中的時候。雙鏈RNA、siRNA可以通過互補鏈而形成。在一種實施方式中，siRNA指的是可以形成雙鏈siRNA的核酸。siRNA的序列相當于全長度靶基因或其序列。典型地，siRNA為至少約15-50個核苷酸的長度(例如每個雙鏈siRNA的互補序列為約15-50個核苷酸的長度，并且雙鏈siRNA為約15-50個堿基對的長度，優選約19-30個堿基核苷酸，優選約20-25個核苷酸長度，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長度)。在這里可互換使用的術語“唾液酸粘附素”、“唾液酸結合Ig類外源凝集素1”、“唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素-1 (siglec-1) ”、⑶169指的是I類外源凝集素，其由17個免疫球蛋白(Ig)域組成，其結合至唾液酸以在高度保留的精氨酸殘基和唾液酸的羧基之間形成鹽橋。參見May A,等，Mol.Celll998 ;1:719_728。根據本發明使用的合適的唾液酸粘附素變體包括人唾液酸粘附素(描述于UniProt數據庫，登陸號Q9BZZ2)、豬唾液酸粘附素(描述于UniProt數據庫，登陸號A7LCJ3)和鼠唾液酸粘附素(描述于UniProt數據庫，登陸號Q62230)。
            
  [0077]本文使用的術語“唾液酸粘附素抑制劑”指的是導致唾液酸粘附素水平和/或活性降低的任意分子。抑制劑包括但不限于導致唾液酸粘附素蛋白質的量降低的分子，以及導致mRNA編碼的唾液酸粘附素的量降低的分子。
            
  [0078]本文使用的術語“唾液乳糖”指的是包含結合至唾液酸片段的乳糖片段(β -D-吡喃型半乳糖-(I —4)-D-葡萄糖)的分子。所述唾液酸可以在唾液酸中任何可能的位置結合至乳糖，并被結合至乳糖分子中任意可能的位置。在優選的實施方式中，所述唾液酸通過唾液酸的位置2上的羥基基團被連接至乳糖(唾液酸結構的編號開始于羧基碳并圍繞鏈延續)。在另一優選的實施方式中，唾液酸通過乳糖分子的位置3或6上的羥基基團連接至乳糖。在優選的實施方式中，“唾液乳糖”為α 2，3-唾液酸化乳糖或者α 2，6_唾液酸化乳糖。唾液乳糖可以是源自真核或原核的。優選地，唾液乳糖為源自真核的。真核或原核細胞可以是致病的或非致病的。
            
  [0079]本文使用的術語“受試者”是指包括所有已示出或者期望具有抗原呈遞細胞的動物。在特別的實施方式中，所述受試者為哺乳動物、人類或非人類靈長類動物、狗、貓、馬、牛、其它家畜或嚙齒類動物(例如小鼠、大鼠、豚鼠)。術語“受試者”和“個體”在這里可互換使用。
            
  [0080]本文使用的術語“治療”指的是任意種類的治療，其目的在于終止、預防、改進或降低對如在這里所述的臨床癥狀的易感性。在優選的實施方式中，術語治療指的是如在這里所定義的疾病或癥狀的預防性治療(即治療以降低臨床癥狀的易感性)。由此，“治療”和它們的等義術語指的是獲得所期望的藥理學或生理學效果，覆蓋哺乳動物、包括人類的任意的病理癥狀或疾病的治療。所述效果可以是預防性的，其完全地或者局部地預防其疾病或癥狀，和/或可以是治療性的，其局部或完全治愈疾病和/或反作用于疾病。也就是說，“治療”包括(I)防止疾病在主體中發生或復發，(2)抑制疾病，例如制止其發展，(3)停止或終止疾病或者至少是與之相關的癥狀，從而使得宿主不再遭受疾病或其癥狀，例如導致疾病或其癥狀的退化，例如通過恢復或者修復喪失的、丟失的或有缺陷的功能，或者刺激無效進行，或(4)減輕、緩解或改善疾病或與之相關的癥狀，其中，改善被用于廣泛含義，用以指代至少是參數量級上的降低，例如炎癥、疼痛或免疫缺陷。
            
  [0081 ] 本文使用的術語“疫苗”和“疫苗組合物”指的是包含根據本發明的合適形式的軛合物或組合物的制劑，其用于施用到脊椎動物并誘導保護性免疫應答。所述的軛合物或組合物為足以誘導免疫，從而預防或改善感染或降低感染的至少一種癥狀或增強本發明軛合物或組合物的另一種劑量的效力。
            
  [0082]本文使用的術語“陰道乳膏”指的是適用于陰道應用的半固體制劑。本領域已知的多種賦形劑或載體可用于該制劑中。所述賦形劑包含不會反作用于配方組分的天然產生的或源自合成的材料。本文使用的合適的載體包括但不限于純凈水、白凡士林、黏附聚合物、液體石蠟、聚山梨醇酯60、山梨醇硬脂酸酯硅、蠟、石油、膠狀物、聚乙二醇和多種其它材料，取決于所使用制劑的特定類型。
            
  [0083]本文使用的術語“表達載體”指的是由連接至載體上的轉錄調控序列的序列指導RNA或多肽表達的載體。所表達的序列將通常但不是必須與細胞是異源的。表達載體可以包含額外的元件，例如表達載體可以具有兩個復制系統，由此允許其保持在兩個有機體中，例如在用于表達的人類細胞中和用于克隆和擴增的原核宿主中。
            
  [0084]本文使用的術語“病毒進入抑制劑”指的是能夠干涉病毒進入至細胞中的任何化合物。
            
  [0085]本文使用的術語“病毒免疫原”指的是通過本發明的失活處理而獲得的全部HIV滅活的病毒粒子。
            
  [0086]2.使用唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑的本發明的治療方法
            
  [0087]本發明公開了 HIV-1膜中的神經節苷脂對于其通過成熟樹突細胞(mDC)的吸收來說是必須的。特別地，存在于特定的病毒神經節苷脂中的唾液乳糖分子被認為是用于mDC吸收的決定部分。此外，本發明還公開了唾液酸粘附素(⑶169，siglec-1)，位于數個免疫系統細胞表面上的細胞粘附蛋白，例如DC，連接至HIV-1表面中的唾液乳糖分子，從而能夠通過mDC攝入病毒。因此，唾液酸粘附素和唾液乳糖的相互作用允許HIV-1進入mDC。結果，這種相互作用的抑制就可用于預防HIV的擴散，通過由mDC阻礙CD4+T細胞的轉染。包膜病毒從受感染細胞的膜出芽獲得它們的包膜，并因此病毒包膜的組成將反映細胞的組成，其中病毒出芽自所述細胞。因為生物膜包含神經節苷脂，所以預期病毒包膜包含神經節苷月旨。此外，先前在HIV-1和數種其它病毒(例如SFV、SV、MuLV)的膜中檢測到神經節苷脂GM3。參見Chan R,等，J.Virol.2008 ;82:11228-11238和Kalvodova L,等，J.Virol.2009 ;83:7996-8003。因此，在本發明中確定的通過mDC的HIV吸收的機理可以與任何包膜病毒的吸收相聯系，并且由此，唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑的使用可預防通過任何包膜病毒的感染。由此，第一方面，本發明涉及一種唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑用于治療或預防與由包膜病毒導致的感染相關的疾病。
            
  [0088]在另一種實施方式中，本發明涉及唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑的應用，其用于制備治療與由包膜病毒導致的感染相關的疾病的藥劑。
            
  [0089]在另一方面中，本發明涉及一種用于治療或預防與由主體內的包膜病毒導致的感染相關的疾病的方法，包括給所述受試者施用在唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑。
            
  [0090]適用于在本發明中使用的抑制劑可以使用用于檢測唾液酸粘附素和唾液乳糖或包含唾液乳糖的任意其它化合物之間相互作用的任意已知的試驗來確認。舉例來說，根據本發明使用的抑制劑可以使用在本發明的實施例5中所描述的試驗來確認，基于抑制劑的能力的確定來降低通過包含在它們的結構中具有唾液乳糖的脂質的大的單層囊泡的成熟樹突細胞的捕捉。在它們的結構中包含唾液乳糖并且可被結合至大的單層囊泡內的脂質包括單、雙和三唾液酸化神經節苷脂，其包含唾液乳糖部分，例如但不限于GMl、GM2、GM3、⑶Ib和 GTlb。
            
  [0091]根據本發明使用的合適的抑制劑包括但不限于唾液乳糖、包含唾液乳糖部分的分子、抗唾液酸粘附素抗體、抗唾液乳糖抗體和包含唾液乳糖部分的分子的囊泡。
            
  [0092]在優選的實施方式中，根據本發明使用的抑制劑為唾液乳糖。
            
  [0093]在優選的實施方式中，包含唾液乳糖部分的分子為具有少于四個唾液酸的神經節苷脂。
            
  [0094]在表I中描述了適用于用作唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑的神經節苷脂。
            
  [0095]GM3aNeu5Ac (2-3)bDGalp (1-4)bDGlcp (1-1)Cer
            
  [0096]GM2bDGalpNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
            
  [0097]GM2aaNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
            
  [0098]GMl/GMla bDGalp(1-3)bDGalNAc[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
            
  [0099]GMlbaNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
            
  [0100]⑶3aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
            
  [0101]⑶2bDGalpNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
            
  [0102]⑶laaNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp (1-1)Cer
            
  [0103]GDI a aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-6) ]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
            
  [0104]⑶IbbDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp (1-1)Cer
            
  [0105]GTlaaNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp (1-4)bDGlcp(1-1)Cer
            
  [0106]GTl, GTlb aNeu5Ac (2-3) bDGalp (1-3) bDGalNAc (1-4) [aNeu5Ac (2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1) Cer
            
  [0107]OAc-GTlb aNeu5Ac (2-3) bDGalp (1-3) bDGalNAc (1-4) aXNeu5Ac9Ac (2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer
            
  [0108]GTlcbDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp (1-4)bDGlcp(1-1) Cer
            
  [0109]GT3aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGal(1-4)bDGlc(1-1)Cer
            
  [0110]表1:包含唾液乳糖殘基的神經節苷脂，其抑制唾液酸粘附素和唾液乳糖之間的相互作用。aNeu5Ac = 5_乙酰-α -神經氨酸；aNeu5Ac9Ac = 5, 9_ 二乙酰-α -神經氨酸；bDGalp = β -D-卩比喃半乳糖；bDGalpNAc = N-乙酰-β -D-卩比喃半乳糖；bDGlcp = β -D-批喃葡萄糖及Cer =神經酰胺(通用N-乙酰化鞘氨基醇)。
            
  [0111]本發明還提出神經節苷脂衍生物的應用，其中，一種或多種如下的功能基被取代或添加至主鏈，特別是神經酰胺主鏈:
            
  [0112]I)齒原子，結合至燒基、稀基、塊基或芳基自由基，
            
  [0113]2)醇基(伯醇、仲醇或叔醇)，
            
  [0114]3)乙醚基，
            
  [0115]4)羰基官能團(例如醛或酮)，
            
  [0116]5)羧酸基團，
            
  [0117]6)羧酸酐基團，
            
  [0118]7)氨基甲酰基團，
            
  [0119]8)鹵甲酰基，
            
  [0120]9)氛基、酷基、包括內酷基，
            
  [0121]10)芐基、苯基、甲苯磺酰基、甲苯基或磺酰基，
            
  [0122]11)氨基(伯氨、仲氨或叔氨)，
            
  [0123]12)異氰酸酯、氰酸酯、硫代異氰酸酯、硫代氰酸酯、氨基甲酸酯或
            
  [0124]13)疊氮化物或重氮基。
            
  [0125]在另一實施方式中，“唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑”為特異于唾液酸粘附素或唾液乳糖的抗體。
            
  [0126]本發明還包含如上所述的不同類型的抗體的片段的使用，所述抗體基本上保留了結合唾液酸粘附素的能力并防止其與包含唾液乳糖的分子相互作用。術語“抗體片段”包括例如為Fab、F(ab’)2、Fab’、單鏈Fv片段(scFv)、雙抗體和納米抗體的抗體片段。
            
  [0127]在另一實施方式中，唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑為抗唾液酸粘附素特異性抗體7D2(購自Abcam，產品目錄號:abl8619)或其片段。在另一實施方式中，唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑為抗唾液酸粘附素特異性抗體7-239 (購自eB1science，產品目錄號=12-1699-41)或其片段。
            
  [0128]在另一實施方式中，唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑為唾液乳糖結合分子。這種類型的分子能夠結合包膜病毒表面上的唾液乳糖，并預防它們與唾液酸粘附素的相互作用。合適的唾液乳糖結合分子包括但不限于唾液乳糖結合凝集素和抗唾液乳糖抗體。合適的唾液乳糖結合凝集素包括但不限于唾液酸粘附素或其胞外域，歐洲接骨木(Sambucus nigra)(接骨木)樹皮凝集素(對具有α 2，6_鍵的唾液乳糖特異)、懷槐(Maackia amurensis)凝集素(對具有α 2，3_唾液酸鍵的唾液乳糖特異)和霍亂弧菌(Vibr1 cholerae)神經氨酸酶或凝集素類結構域。
            
  [0129]在另一實施方式中，唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑為囊泡，其包含包含唾液乳糖部分的分子。
            
  [0130]在一種實施方式中，所述囊泡為脂質體、脂質體-DNA復合物或脂質納米顆粒。在一種實施方式中，所述囊泡為脂質體。脂質體為人工制備的囊泡，其主要由脂質雙層組成并可被用作為用于施用營養物質和藥物制劑的輸送載體。脂質體可以具有不同的大小，例如但不限于直徑為數百納米并且可以包含一系列由狹窄的水性隔間分離的同心雙層的多層囊泡(MLV)、直徑小于50nm的小的單細胞囊泡(SUV)、以及直徑介于50至500nm之間的大的單層囊泡(LUV)。脂質體設計可以包括但不限于調理素或配體以改善脂質體與不健康組織或與活性作用的結合，所述活性作用例如但不限于內吞作用。脂質體可以包含低或高PH以改善藥物配方的輸送。在優選的實施方式中，所述囊泡為大的單層囊泡。
            
  [0131]MLV可以通過溶劑注射、脂質水合、逆向蒸發、冷凍干燥或通過重復冷凍和熔化來制備。SUV或LUV可以通過例如超聲降解法，通過具有所定義孔徑的聚碳酸酯過濾器的擠出，通過使用弗式壓碎器，即通過使MLV在高壓下穿過小孔，或者通過溶解注射方法，利用例如為醚或醇的溶劑來制備。可以形成的其它類型的囊泡包括單層囊泡(ULV)、大的單層囊泡(LUV);穩定的多層囊泡(SPLV)，寡層囊泡(OLV)，通過使用透析、柱層析、生物珠SM-2、逆向蒸發(REV)移除清潔劑來制備；通過高壓擠出形成的中等大小的單層囊泡，或者巨大的多泡囊泡(MW或GMW，美國專利US6，162, 462)脂質體，直徑至少I微米，通過利用合適的鹽(例如硫酸銨)的水溶液渦流脂質膜、均勻化所獲得的懸浮液以形成小的單層囊泡(SUV)的懸浮液、并在液氮中重復冷凍-融化所述SUV懸浮液、然后通過水來形成MW而制備。所有的這些和其它的脂質體制備方法均為本領域已知的。
            
  [0132]根據本發明的合適囊泡包含一個或多個膜，所述膜由至少一種選自由二油酰基磷脂酰乙醇胺(以下稱為“DOPE”)、棕櫚酰油酰基甘油膽堿磷酸(以下稱為“P0PC”)、膽固醇(以下稱為“CH0L”)、0，0’-二十四烷酰-N-(a-三甲基氨基乙酰基)二乙醇胺氯(以下稱為“DC-6-14”)、氫化提純的蛋黃卵磷脂、氫化提純的大豆卵磷脂、二棕櫚酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂和1-棕櫚酰-2-油酰卵磷脂組成的組的磷脂組成。優選地，所述脂質體為包含POPC, DPPC, CHOL和鞘磷脂(SM)的LUV。根據本發明LUV中的POPC、DPPC, CHOL, SM和包含唾液乳糖部分的含量比(摩爾比)為POPC:DPPC:CH0L:SM:包含唾液乳糖部分=25:16:10:45:4。包含在本發明中使用的可被結合至囊泡中的唾液乳糖部分的合適的分子包括如上所述的任意分子，其包括在表I中提及的任何神經節苷脂，以及其衍生物。在某些實施方式中，在其結構中包含唾液乳糖并可被結合至LUV內的分子包括單、二和三唾液酸化神經節苷脂，所述唾液酸化神經節苷脂包含唾液乳糖部分，例如但不限于GMl、GM2、GM3、⑶Ib和GTlb0
            
  [0133]在一種實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由I類絲狀病毒科病毒導致的疾病。I類絲狀病毒科病毒具有單鏈、未分段的(_)有義RNA基因組，并且其導致人類和非人類靈長類動物的嚴重出血熱。在某些方面中，絲狀病毒科病毒為埃博拉病毒，例如科特迪瓦(Cote d’ I voire) (Cl),蘇丹(Sudan) (S),扎伊爾(Zaire) (Z)或萊斯頓(Reston)(R)類的埃博拉病毒。在其它方面中，絲狀病毒科病毒為馬爾堡病毒。
            
  [0134]在另一實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由正粘病毒科病毒導致的疾病，例如流感病毒、托高土病毒、多理病毒(Dhori virus)或傳染性鮭魚貧血病毒。例如，在某些方面中，在這里提供的方法被用于治療或預防人體被流感A型病毒、流感B型病毒或流感C型病毒的感染。在某些方面中，流感A型病毒為H1N1、H2N2、H3N2或H5N1亞型。
            
  [0135]在另一實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由副黏液病毒科病毒導致的疾病，例如人副流感病毒、人呼吸道合胞病毒(RSV)、仙臺病毒、紐卡斯爾病病毒、腮腺炎病毒、風疹(麻疹)病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、禽肺病毒或犬瘟熱病毒。
            
  [0136]在另一實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由彈狀病毒科病毒導致的疾病，例如狂犬病病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、莫科拉病毒、狂犬相關病毒、杜梅海格病毒、歐洲蝙蝠病毒、鮭魚傳染性造血壞死病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、鯉魚春病毒血癥病毒或黑魚彈狀病毒。
            
  [0137]在另一實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由博爾納病病毒科病毒導致的疾病，例如博爾納病病毒。
            
  [0138]在另一實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由布尼亞病毒科病毒導致的疾病，例如布尼安維拉病毒、漢坦病毒、克里米亞-剛果病毒、加利福尼亞腦炎病毒、山谷熱病毒或白蛉熱病毒。
            
  [0139]在另一實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由沙拉病毒科病毒導致的疾病，例如舊世界沙拉病毒，拉沙熱病毒、伊派病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、莫巴拉病毒、莫佩亞病毒，或新世界沙拉病毒、例如胡寧病毒(阿根廷出血熱)、沙比亞病毒(巴西出血熱)、阿馬帕里病毒、佛雷斯病毒、瓜納瑞托病毒(委內瑞拉出血熱)、馬丘坡病毒(玻利維亞出血熱)、拉丁美洲病毒、博利瓦病毒、巴拉那病毒、Pichinde病毒，Pirital病毒，Tacaribe病毒，Tamiami病毒或Whitewater Arroyo病毒。在某些方面中，所述沙拉病毒科病毒為淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒、拉沙病毒，胡寧病毒，馬丘坡病毒，沙比亞病毒或瓜納瑞托病毒。
            
  [0140]在另一實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由蟲媒病毒導致的疾病。蟲媒病毒包含多于400種包膜RNA病毒的大組，其主要通過節肢動物介質(例如蚊子、沙蠅、跳騷、蜱類、虱子)來傳遞。在某些方面中，蟲媒病毒為披膜病毒科病毒，例如甲病毒屬(例如委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒或辛德畢斯病毒)或風疫病毒屬(例如風疫病毒)。例如，在某些方面中，在這里提供的化合物被施加至孕婦以治療或預防先天性風疹綜合癥(CRS)和與之相關的癥狀，例如出生體重低、耳聾和流產。
            
  [0141]在另一實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由黃病毒科病毒導致的疾病，例如黃病毒、瘟病毒、肝炎病毒、黃熱病毒、登革熱病毒或日本腦炎(JE)病毒。
            
  [0142]在另一實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由肝炎病毒導致的疾病，例如丙型肝炎病毒或類丙型肝炎病毒。
            
  [0143]在另一實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由亨尼毒導致的疾病，例如亨德拉病毒或尼帕病毒。
            
  [0144]在另一實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由布尼亞病毒科(-)_有義RNA病毒導致的疾病，例如布尼亞病毒、漢坦病毒、白蛉病毒或內羅病毒。
            
  [0145]在另一實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由沙拉病毒科病毒導致的疾病，例如淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、拉沙病毒、胡寧病毒、馬丘坡病毒或瓜納瑞托病毒。
            
  [0146]在某些方面中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由日本腦炎病毒導致的疾病，例如Alfuy病毒、日本腦炎病毒、科科百拉(Kokobera)病毒、Koutango病毒、庫寧(Kunjin)病毒、墨累谷(Murray Valley)腦炎病毒、圣路易(St.Louis)腦炎病毒、斯特拉特福德(Stratford)病毒、烏蘇圖(Usutu)病毒或西尼羅河(West Nile)病毒。
            
  [0147]在優選的實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由屬于逆轉錄病毒屬科的病毒導致的疾病。在更優選的實施方式中，所述包膜病毒為屬于慢病毒屬亞科的病毒。在又一優選的實施方式中，所述包膜病毒屬于慢病毒屬。在更優選的實施方式中，所述包膜病毒為靈長類慢病毒屬，并且特別地為人類免疫缺陷病毒(HIV)或類人猿免疫缺陷病毒(SIV)。
            
  [0148]在某些方面中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由日本腦炎病毒導致的疾病，例如Alfuy病毒、日本腦炎病毒、科科百拉(Kokobera)病毒、Koutango病毒、庫寧(Kunjin)病毒、墨累谷(Murray Valley)腦炎病毒、圣路易(St.Louis)腦炎病毒、斯特拉特福德(Stratford)病毒、烏蘇圖(Usutu)病毒或西尼羅河(West Nile)病毒。
            
  [0149]在優選的實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由屬于逆轉錄病毒屬科的病毒導致的疾病。在更優選的實施方式中，所述包膜病毒為屬于慢病毒屬亞科的病毒。在又一優選的實施方式中，所述包膜病毒屬于慢病毒屬。在更優選的實施方式中，所述包膜病毒為靈長類慢病毒屬，并且特別地為人類免疫缺陷病毒(HIV)或類人猿免疫缺陷病毒(SIV)。
            
  [0150]逆轉錄病毒的例子包括但不限于如下病毒屬:α逆轉錄病毒(例如禽白血病病毒(ALV)和勞氏肉瘤病毒(RSV))、β逆轉錄病毒(例如鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、SRV、HERV-K和JRSV)、Y逆轉錄病毒(例如鼠白血病毒(MLV)、貓白血病毒(FeLV)、GALV、PERV和HERV-W)、δ逆轉錄病毒(例如牛白血病毒(BLV)和導致癌癥的人類T-淋巴細胞病毒(HTLV-1和HTLV-1l))、ε逆轉錄病毒(例如白斑魚皮膚肉瘤病毒(WDSV)和SnRV)、慢性病毒(例如人類免疫缺陷病毒I (HIV-1))、人類免疫缺陷病毒2 (HIV-2)、類人猿免疫缺陷病毒(SIVmac和SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV、EIAV和MVV)和泡沫病毒(例如類人猿泡沫病毒(SFVcpz 和 SFVagm)、FFV 和 BFV)。
            
  [0151]在優選的實施方式中，包膜病毒為其中所述包膜病毒的包膜內的至少某些脂質包含唾液乳糖的病毒。在更優選的實施方式中，包膜病毒在病毒包膜中包含神經節苷脂，其中所述神經節苷脂包含至少一個唾液乳糖部分。在又一更優選的實施方式中，神經節苷脂包含少于四個唾液乳糖分子。在還一實施方式中，病毒在其包膜中包含一種或多種在表I中所示的神經節苷脂。
            
  [0152]在優選實施方式中，“與由包膜病毒導致的感染相關的疾病”為與HIV病毒相關的疾病。
            
  [0153]本發明還涉及預防或減輕與HIV感染相關的癥狀。這些包括與HIV感染的次要癥狀階段相關的癥狀，包括例如，帶狀皰疹、皮疹和指甲感染、口腔潰瘍、復發性鼻炎和喉部感染以及體重降低。此外，與HIV感染的主要癥狀階段相關的癥狀包括例如，口腔和陰道鵝口瘡(念珠菌屬)、持久性痢疾、體重降低、持久性咳嗽和復發性肺結核或復發性皰疹病毒感染，例如感冒瘡(單純皰疹)。可以根據本發明來治療的晚期艾滋病(AIDS)的其它癥狀包括例如，痢疾、惡心和嘔吐、鵝口瘡和口腔潰瘍、持久性的復發性陰道感染和宮頸癌、持久性全身性淋巴腺病變(PGL)、嚴重的皮膚感染、疣和癬、呼吸道感染、肺炎、尤其是卡氏肺孢子蟲肺炎(PCP)、帶狀皰疹(或帶狀皰行疹)、神經系統問題，例如疼痛、手腳麻木或“發麻”、神經學異常、卡波濟氏肉瘤、淋巴瘤、肺結核或其它類似的機會性感染。
            
  [0154]本發明抑制劑的有益效果包括例如，預防或延緩暴露至HIV的個體的初次感染，降低受HIV感染個體的病毒載荷，延長HIV感染的無癥狀階段，維持HIV感染患者的低病毒負載、所述患者的病毒水平已經通過抗逆轉錄病毒治療(ART)而被降低，提高CD4T細胞水平或減緩CD4T細胞的增加，HIV-1特異性和非特異性的，在單純藥物患者和利用ART治療的患者中，提高帶有AIDS的個體生命的總體健康或質量并延長帶有AIDS的個體的平均壽命。臨床醫生可以與治療之前的患者，或者未治療患者的預期癥狀，或者使用或未疫苗來治療的個體的臨床試驗進行免疫效果比較，從而確定治療是否對抑制AIDS有效。
            
  [0155]本發明的組合物可以與一種或多種其它的抗HIV劑或藥劑組合用于本發明的方法中。這些其它的化合物可以包含本發明的化合物或者例如已知為用于治療、預防或減緩HIV感染癥狀的市售化合物。
            
  [0156]在非限制性例子中，本發明的化合物可以與一種或多種以下抗HIV藥物聯合使用:
            
  [0157]I)復方藥物:依法韋倫、恩曲他濱或富馬酸替諾福韋酯(Atripla(R)/BMS, Gilead);拉米夫定或齊多夫定(Combivir (R)/GSK);阿巴卡韋或拉米夫定(Epzicom(R)/GSK);阿巴卡韋、拉米夫定或齊多夫定(Trizivir(R)/GSK);恩曲他濱、富馬酸替諾福韋酯(Truvada(R)/Gilead)。
            
  [0158]2)進入和融合抑制劑:馬拉維若(Celsentri (R)，Selzentry (R)/Pfizer);噴他夫西或恩夫韋肽(Fuzeon (R)/Roche, Trimeris)。在某些實施方式中，病毒進入抑制劑為融合抑制劑，CD4受體結合抑制劑為CD4模仿或gpl20模仿。在某些其它的實施方式中，病毒進入抑制劑為gp41對抗劑、CD4單克隆抗體或CCR5拮抗劑，包括CCR5拮抗劑亞屬，例如鋅指蛋白抑制劑。在又一種實施方式中，病毒進入抑制劑為CXCR4共受體拮抗劑。
            
  [0159]3)整合酶抑制劑:雷特拉韋或 MK-0518 (Isentress (R)/Merck)。
            
  [0160]4)逆轉錄酶抑制劑:在根據本發明的組合物中使用的合適的逆轉錄酶抑制劑為一種或多種選自由恩曲他濱、卡普韋林、替諾福韋、拉米夫定、扎西他濱、地拉夫定、奈韋拉平、地丹諾辛、司他夫定、阿巴卡韋、阿洛夫定、齊多夫定、外消旋恩曲他濱、阿立他濱、乙米韋林、艾弗他濱、TMC-278、DPC-083、氨多索韋、(_)_β _D_2，6-二氨基嘌呤二惡茂烷、MIV-210 (FLG)，DFC (由艾弗他濱)、二惡茂烷胸腺嘧啶核苷、胡桐素A、依曲韋林(TMC-125)、L697639、阿替韋啶(U87201E)、MIV-150、GSK-695634、GSK-678248、TMC-278、KP1461、KP-1212、洛德腺苷(FddA)、5_[(3，5- 二氯苯基)硫代]_4_異丙基-1-(4-吡啶基甲基)咪唑-2-甲醇氨基甲酸、(-)-12-D-2，6-二氨基嘌呤二惡茂烷、AVX-754、BCH-13520、BMS-56190 ((4S) -6-氯-4- [ (IE)-環丙基乙烯基]_3，~4~ 二氫-4-三氟甲基 _2 (IH)-喹唑酮)>TMC-120和L697639組構成的組的化合物，當以聯合治療使用的時候，所述化合物存在為治療HIV的有效量。
            
  [0161]5)蛋白酶抑制劑:可以與根據本發明的miRNA或多核苷酸編碼的miRNA結合的合適的蛋白酶抑制劑選自由利托那韋、洛匹那韋、沙奎那韋、安潑那韋、膦沙那韋、阿菲那韋、替拉那韋、印地那韋、阿扎那韋、TMC-126、達蘆那韋、莫折那韋(DMP-450)、JE-2147(AG1776)、L-756423、KN1-272、DPC-681、DPC-684、替利那韋(SC-52151)、BMS186318、決昔那韋(SC_55389a)，DMP-323, KN1-227, 1-[(2-羥基乙氧基)甲基]-6-(苯基硫代)_ 胸腺嘧啶,AG-1859, R0-033-4649, R-944, DMP-850, DMP-851 和貝卡那韋(GW640385)組成的組。與本發明的化合物聯合使用的優選的蛋白酶抑制劑包括沙奎那韋、利托那韋、印地那韋、阿菲那韋、安潑那韋、洛匹那韋、阿扎那韋、達蘆那韋、貝卡那韋、膦沙那韋和替拉那韋。特別有用的這樣的組合物包括例如AZT+3TC ；TDF+3TC ；TDF+FTC ；ABC+3TC ;和阿巴卡韋+3TC。
            
  [0162]另外，根據本發明的組合物可以進一步包含抗逆轉錄病毒劑，選自由疫苗、基因療法治療、細胞因子、TAT抑制劑和免疫調節劑組成的組，當以聯合治療使用的時候，其以治療HIV的有效量存在。
            
  [0163]另外，根據本發明的組合物可以進一步包含抗感染試劑，選自由抗真菌、抗細菌、抗腫瘤藥物(ant1-neoplasties,)、抗原生動物、DNA聚合酶抑制劑、DNA合成抑制劑、抗HIV抗體、HIV反義藥物、IL-2激動劑、α -葡糖苷酶抑制劑、嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑、凋亡激動劑、凋亡抑制劑和膽堿脂酶抑制劑組成的組，當以聯合治療使用的時候，所述化合物以治療HIV的有效量存在。
            
  [0164]另外，根據本發明的組合物可以進一步包含免疫調節劑，其選自由羥乙基磺酸戊烷脒、自體CD8+浸劑、Y-干擾素免疫球蛋白、胸腺肽、IGF-1、抗Leu3A、自動接種疫苗、生物刺激、體外光分離置換法、環孢霉素、雷帕霉素、FK-565, FK-506, GCSF, GM-CSF、高熱療、異丙肌苷、rVIG，HIVIG,被動免疫治療和脊髓灰質炎疫苗超免疫組成的組，當以聯合治療使用的時候，所述化合物以治療HIV的有效量存在。
            
  [0165]根據本發明抑制劑的和抗HIV試劑的組合物可以導致其抗HIV活性的協同效應。協同效應例如可以使用合適的方法來計算，例如Sigmoid-Emax, Loewe和平均效應方程。參見 Holford K, Scheiner L, Clin.Pharmacokinet.1981 ；6:429-453, Loewe S, MuischnekH, Arch.Exp.Pathol Pharmacol.1926 ； 114:313-326 和 Chou T,Talalay C,Adv.EnzymeRegul.1984 ;22:27-55。如上涉及的每個方程均可被用于實驗數據以生成相應的圖形，從而幫助評估藥物組合的作用。與如上涉及的方程相關的相應圖形分別為濃度效應曲線、等效線圖曲線和聯合指數曲線。
            
  [0166]根據本發明的抑制劑可以進一步包含制藥學可接受的載體。合適的載體包括但不限于水、葡聚糖、甘油、生理鹽水、乙醇及其組合。所述載體可以包含其它試劑，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑或增強配方效果的佐劑。佐劑例如可以選自由A1K(S04)2、AlNa (S04) 2、A1NH4 (S04)、二氧化硅、明礬、Al (OH) 3、Ca3 (PO4) 2、高嶺土、碳、氫氧化鋁、胞壁酰二肽、N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酸(thr-DMP)、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酸(CGP11687，還稱為nor_MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酸-L-丙胺酸-2-(1’，2’ - 二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)_乙胺
            
  (CGP19835A,還稱為 MTP-PE)、RIBI (MPL+TDM+CWS)的 2%角鯊烯 / Tween-80? 乳劑、脂多糖及其各種衍生物、包括脂質A、弗氏(Freund’s)完全佐劑(FCA)、弗氏非完全佐劑、默克(Merck)佐劑65、多核苷酸(例如多IC和多AU酸)、分支桿菌屬的蠟D、肺結核、在棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)、百日咳博代氏桿菌(Bordetella pertussis)中發現的物質、和布魯氏菌(Brucella)屬的成員，Titermax, ISCOMS, Quil A, ALUN,脂質A衍生物、霍亂毒素衍生物、HSP衍生物、LPS衍生物、合成肽基質或GMDP、白細胞介素1、白細胞介素
            
  2、Montanide ISA-51 和 QS-21、CpG 寡核苷酸、多 1:C 和 GM-CSF 組成的組。參見 HunterR,US5, 554，372 和 Jager E, Knuth A, W01997028816。
            
  [0167]根據本發明的抑制劑可以通過本領域技術人員已知的任何方式來施用，例如通過肌肉的、皮下的或靜脈內的注射，以及口部、鼻部或肛門給藥。參見Banga A, Parenteralcontrolled delivery of therapeutic peptides and proteins,“Therapeutic Peptidesand Proteins，，(Technomic Publishing C0.，Inc.，Lancaster, PA, US, 1995)。為了延長抑制劑發揮其效用的時間，所述抑制劑可被提供為嵌入的、油注射的或者作為微粒體系。所述的微粒體系可以是微顆粒、微膠囊、微球、納米膠囊或類似顆粒。參見Banga，1995，上述。基于合成聚合物的微粒載體已被示出作用為佐劑，從而除了提供控制釋放還增強免疫應答。鋁鹽也可用作為用以產生免疫應答的佐劑。
            
  [0168]根據本發明的抑制劑可被配制為殺菌劑組合物。殺菌劑組合物可以以單位劑型來配置，適用于精確劑量的單獨施用。在脈沖劑量中，提供包括所公開的免疫原的免疫原組合物的大藥丸施用，隨后在一段時間內不對個體施用公開的免疫原，隨后第二次施加大藥丸。治療有效量的抑制劑可以在治療過程中以單劑量或者以多劑量施加，例如每天。在特定的非限制性的例子中，包括所公開的免疫原的免疫原組合物的脈沖劑量在一天中、在一周中、或者在一個月中施加。無論效果是否為需要的(例如降低的指標、癥狀或HIV-1感染的實驗結果)，殺菌劑組合物都可被施加。通常來說，劑量足以治療或改善疾病的癥狀或指標，而不對個體產生不可接受的毒性。可采用系統或局部給藥。
            
  [0169]所使用的治療有效量可以根據疾病的嚴重程度和患者的年齡、體重、一般狀態及其它臨床因素。由此，合適的治療方法的最終確定將通過主治醫生來產生。典型地，在體外使用的劑量可以對原位施加藥物組合物的有用的量提供指導，并且動物模型可被用于確定治療特定疾病的有效劑量。參見Gilman R,等，Eds.，“Goodman andGilman's:The Pharmacological Basis of Therapeutics，，，第八版(Pergamon Press, NewYork, NY, US, 1990),和Gennaro A, Ed.，“Remington，s Pharmaceutical Sciences”，第十八版(Mack Publishing C0.，Easton, PA, US, 1990)。典型地，抑制劑的劑量范圍為約 0.1 μ g/kg體重至約100 μ g/kg體重。其它合適的范圍包括約I μ g/kg體重至約10 μ g/kg體重的劑量。在一個實施例中，所述劑量為約1.0 μ g至約50mg,例如I μ g至lmg、例如Img肽/個體。給藥方案可以在每天施用到一年之內盡可能少的施用之間變化，根據臨床因素，例如個體對于肽的敏感程度以及其疾病的發展速度。因此，個體可以接受第一劑量所公開的治療分子，并且隨后在之后的某個時間(例如至少一天之后，例如至少一周之后)接受第二劑量(或者甚至更多劑量)。
            
  [0170]本文公開的藥物組合物可以以劑量單位來制備和施加。固體劑量單位包括片劑、膠囊、經皮給藥體系和栓劑。治療量的施加可以通過以單獨劑量單位或者以數個更小劑量單位的形式單次施加，以及通過以特定的間隔多次施加分組劑量。合適的單獨或分組劑量包括但不限于約0.01,0.1,0.5、1、3、5、10、15、30或50 μ g蛋白質/kg/天。
            
  [0171]在治療應用中，向受試者施用治療有效量的抑制劑，在暴露至HIV或受到HIV感染之前或之后。當在暴露之前施加的時候，所述的治療應用可被稱為預防性應用(例如以疫苗的形式)。組合物的單次或多次施加可以根據需要的劑量和頻率以及個體的耐受性來進行。在一種實施方式中，所述劑量作為大藥丸一次施加，但是在另一實施方式中，可以周期性地施加直至達到治療結果、例如保護性免疫應答。通常來說，劑量足以治療或改善疾病的癥狀或指標，而不對個體產生不可接受的毒性。可采用全身施用和局部施用。
            
  [0172]有利的是，在這里公開的殺菌劑組合物可以與其它試劑聯合施加，所述其它試劑例如蛋白質、肽、抗體和其它抗HIV試劑。這樣的抗HIV治療試劑的例子包括核苷逆轉錄酶抑制劑，例如阿巴卡韋、AZT、二脫氧肌苷、恩曲他濱、拉米夫定、司他夫定、替諾福韋、扎西他濱或齊多夫定；非核苷逆轉錄酶抑制劑，例如地拉夫定、依法韋倫或奈韋拉平；蛋白酶抑制齊U，例如安潑那韋、阿扎那韋、印地那韋、洛匹那韋、阿菲那韋、膦沙那韋、利托那韋、沙奎那韋或替拉那韋；或融合蛋白抑制劑，例如恩夫韋肽。在特定的實施方式中，抑制劑與其它抗HIV治療試劑同時施加。在特定的實施方式中，免疫原組合物可以與其它抗HIV治療試劑相繼施加，例如在其它試劑之前或之后。本領域技術人員將認識到相繼施加意味著在適當的時間之后立即給予，例如數小時、數天、數周、數月或者甚至是數年之后。
            
  [0173]本發明的藥物組合物可以以多種形式而被應用于陰道，包括氣溶膠、泡沫、噴霧齊U、膏狀物、凝膠、膠狀物、霜劑、栓劑、片劑、子宮套、衛生棉條或例如為陰道環的裝置。它們可以是立即釋放或者控制釋放的形式。泡沫、霜劑和凝膠為優選的形式。適用于陰道應用的組合物以及它們的制備方法為本領域已知的。參見Vickery B,等，US4, 368，186，GazzaniG, US4, 371, 518, Tice T,等,US4, 389, 330, Joyce C，等，US4, 415，585，和 Riley T,等，US4, 551，148。
            
  [0174]在特別優選的實施方式中，藥物組合物被局部施用至陰道。典型地，所述的局部施用在陰道性交開始之前進行，適當地在陰道性交開始前O至60分鐘，優選O至5分鐘。所述施加可被應用于女性陰道內和周圍以及陰道區域(例如個體解剖部分，例如大陰唇、小陰唇、陰蒂)。
            
  [0175]本領域已知的藥霜為粘性液體或半固體乳劑，無論是水包油的還是油包水的。霜基為可水洗的，并且包含油相、乳化劑和水相。油相，有時還被稱為“內部”相，通常由礦脂和脂肪醇組成，所述脂肪醇例如十六烷醇或十八烷醇；盡管不是必須的，但是水相在體積上通常會超過油相，并且通常包含潤濕劑。霜劑配方中的乳化劑通常為非離子、陰離子、陽離子或兩性表面活性劑。
            
  [0176]例如，合適的載體基包括但不限于烴基或油質基，吸收基，水可移除基和水溶性基。在某些實施方式中，載體基為無刺激性的、無色的、穩定的、非PH依賴性的和/或可于本發明的抑制劑相容的。
            
  [0177]其中載體為固體的適用于直腸給藥的制藥配方最優選提供為單位劑量栓劑。合適的載體包括可可油和本領域常用的其它材料。栓劑可以通過活性組分與軟化的或融化的載體相混合、然后通過在模具中急劇冷卻并成型容易地形成。
            
  [0178]在另一實施方式中，本發明涉及將組合物局部施用至肛門。施用至肛門的組合物適當地為泡沫、霜劑或膠狀物，例如如上所述的關于陰道應用的那些。在肛門應用的情況中，優選使用涂藥器，其將組合物基本上均勻地分布在整個肛門。例如，合適的涂藥器為長度為2.5至25cm，優選5至1cm的管，沿著其長度具有規則分布的孔。
            
  [0179]在另一實施方式中，本發明方法可以通過口服施用藥物組合物來進行。口服給藥適當地通過以漱口水或含漱劑的形式進行組合物的施用。口服給藥特別優選用于預防牙齒處理期間的感染。適當地，組合物僅在牙齒處理開始之前被應用，并定期地用于整個處理。適用于嘴部局部給藥的配方包括止咳糖，其在香料基(通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠)中包含活性組分；含片，在惰性基(例如凝膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯樹膠)中包含活性組分；和漱口水，在合適的液體載體中包含活性組分。
            
  [0180]應當注意的是到當組合物為栓劑形式(包括陰道栓劑)的時候，所述栓劑將通常為I至5克，優選約3克，并且整個栓劑將被施用。陰道片劑將適當地為I至5克，優選約2克，并且整個片劑將被施用。當組合物為陰道霜劑的時候，適當地為0.1至2克，優選約0.5克的霜劑將被施用。當組合物為水溶性陰道霜劑的時候，適當地為0.1至2克，優選約0.6克被施用。當組合物為陰道泡沫噴霧的時候，適當地為0.1至2克，優選約0.5克的泡沫噴霧被施用。當組合物為肛門霜劑的時候，適當地為0.1至2克，優選約0.5克的霜劑被施用。當組合物為肛門泡沫噴霧的時候，適當地為0.1至2克，優選約0.5克的泡沫噴霧被施用。當組合物為漱口水或含漱劑的時候，適當地為I至10ml，優選約5ml被施用。
            
  [0181]本發明的組合物還可以是延時釋放組合物的形式。在這種實施方式中，抑制劑被結合至將釋放活性組分的組合物中，以將導致所述抑制劑的有效的陰道或肛門濃度的速率。參見1^界 D, Ed.，“Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals，，(PlenumPress, New York, NY, US1981), Pf ister J,等，J.Contr.Rel.1986 ;3: 229-233，Lanceff, US5, 248, 700, Behan J,等，US5, 185,155，和 Viegas T,等，US5, 143,731。
            
  [0182]本發明組合物還可以是相應于某些情況來釋放本發明抑制劑的形式，某些情況例如陰道性交或肛交。例如，所述組合物可以在囊泡或脂質體中包含抑制劑，其通過性交的機械作用而破裂。包含脂質體的組合物為本領域已知的。參見Deamer D, Uster P, Liposomepreparat1n:methods and mechanisms, Ostro M, Ed., “Liposomes，，(Marcel DekkerInc., New York, NY, US, 1983,第 27-51 頁)，Breimer D, Speiser P, Eds., “Topics inPharmaceutical Sciences，，Elsevier Science Publishers B.V., New York, NY, US, 1985,第 345-358 頁)，Sessa J,等，J.B1l.Chem.1970 ;245:3295-3300，和 Janoff A,等，US5, 231，112。
            
  [0183]還應當認識到的是，本發明組合物可以與制品相關聯，例如子宮內避孕器(IUD)、陰道隔膜、陰道環、陰道海綿、子宮托或安全套。在IUD或隔膜的情況中，延時釋放或機械釋放的組合物為優選的，而在安全套的情況中，機械釋放組合物為優選的。
            
  [0184]在另一實施方式中，本發明提供新的裝置，其對于預防HIV感染是有用的。特別地，本發明裝置為當被放置在適當的身體部分上或者合適的體腔內時釋放抑制劑的那些。由此，本發明提供了包含抑制劑或與抑制劑相關的IUD、陰道隔膜、陰道海綿、子宮托或安全套。
            
  [0185]由此，根據本發明的裝置可以是IUD，其包含一種或多種抑制劑。參見RamwellP，US3，888，975和Berthet J,等，US4，283，325。這種裝置可以是陰道內海綿，其包含抑制化合物并以時間控制的方式釋放抑制化合物。參見Robinson T, US3, 916, 898和BarrowsT, US4, 360,013o所述裝置還可以是釋放抑制劑的陰道分散器。參見Wong P，US4，961，931。
            
  [0186]本發明裝置還可以是安全套，其涂覆有抑制劑。在優選實施方式中，安全套涂覆有潤滑劑或滲透增強劑，其包含抑制劑和殺精劑，其任選地選自苯扎氯銨、芐索氯胺、氯化十六烷基銨基吡啶、氯化甲芐乙氧銨、溴化十四烷基三甲銨、苯扎溴銨、壬基酚醚、月桂醚和辛苯昔醇。然而，被推薦的是，安全套的使用應當與合適的潤滑劑的使用相關聯(既不會降低安全套的機械強度性能并且不會由于乳膠受到沖擊時提高其孔隙度)。例如，EP-A-0457127描述了用于處理安全套乳膠的基于硅油的潤滑劑，EP-A-0475664描述了潤滑劑組合物及其在安全套中的應用，以及FR-A-2666587描述了包含聚二甲基硅氧烷的潤滑劑。其它潤滑劑和滲透增強試劑的組合物及制備為本領域已知的。參見Copper E, US4, 557, 934, Cooper E, US4, 954, 487 James M,等，US4, 499，154 和 KellyP, US5, 208,031。
            
  [0187]3.本發明使用唾液酸粘附素抑制劑的治療方法
            
  [0188]本發明公開了唾液酸粘附素(⑶169，siglec-1)，位于數個免疫系統細胞、例如DC表面上的細胞粘附蛋白質，在HIV-1表面粘附至唾液乳糖分子以能夠由mDC攝入病毒。由此，通過降低唾液酸粘附素在細胞內的表達可以用于預防HIV-1進入細胞，并因此通過由mDC阻止CD4+T細胞的反式感染預防HIV的擴散。例如在本發明的實施例7中示出的，其中示出使用唾液酸粘附素特異性shRNA在DC中的沉默唾液酸粘附素表達導致唾液酸粘附素表達的劇烈下降以及通過所述細胞導致包含包含唾液乳糖的神經節苷脂的VLP捕捉的損失。因此，另一方面，本發明涉及唾液酸粘附素抑制劑，用于治療或預防與由包膜病毒導致的感染相關的疾病。另一方面，本發明涉及唾液酸粘附素抑制劑的使用，用于制備用于治療與由包膜病毒導致的感染相關的疾病的藥劑。另一方面，本發明涉及用于在需要其的受試者中治療或預防與由包膜病毒導致的感染相關的疾病的方法，其包括向所述受試者體施用唾液酸粘附素抑制劑。
            
  [0189]在某些實施方式中，所述的唾液酸粘附素抑制劑為特別是用于唾液酸粘附素的干擾RNA，或者包含多核苷酸編碼這樣的干擾RNA的載體。
            
  [0190]在一些實施方式中，所述唾液酸粘附素抑制劑為唾液酸粘附素特異性siRNA。所述的siRNA可以化學合成或者可以通過體外轉錄而獲得。siRNA典型地由雙RNA鏈構成，其具有15至40個核苷酸的長度并且可以包含具有I至6個核苷酸的3’和/或5’突出區域。突出區域的長度不依賴于siRNA分子的總長度。本發明的siRNA與唾液酸粘附素的預選擇區域mRNA為基本上同源的。適用于導致所述干擾的siRNA包括由RNA形成的siRNA，以及包含不同化學修飾的siRNA，例如:
            
  [0191]-siRNA中，其中核苷酸之間的鍵不同于天然生成的那些，例如硫代磷酸鍵，
            
  [0192]-siRNA鏈與功能性試劑，例如熒光團的軛合物，
            
  [0193]-siRNA鏈末端的修飾，特別是3’末端，通過與不同的位置2’的羥基官能團的修飾，
            
  [0194]-具有修飾糖的核苷酸，例如在位置2’的O-烷基化部分，例如2’-O-甲基核糖、對2’ -O-氟代核糖，
            
  [0195]-具有修飾堿基的核苷酸，像鹵代堿基(例如5-溴代尿嘧啶和5-碘代尿嘧啶)，烷基化堿基(例如7-甲基鳥苷)。
            
  [0196]本發明的siRNA可以使用一系列本領域技術人員已知的技術獲得。例如，siRNA可以由亞磷酰胺基團保護的核糖核苷開始在常規DNA/RNA合成器中化學合成。
            
  [0197]在另一實施方式中，唾液酸粘附素抑制劑為shRNA(短發夾RNA)。所述shRNA典型地包含短反義序列(具有19至25個核苷酸)，其后為5至9個核苷酸的環，再后為有義鏈。shRNA可以在常規DNA/RNA合成器中由亞磷酰胺基團保護的核糖核苷化學合成，或者可以由多核苷酸通過體外轉錄來獲得。shRNA通過核糖核酸酶Dicer在細胞內被加工,其消除發夾區域產生如上所述的siRNA。shRNA還可以包含如上所述的siRNA的情況中的不同的化學修飾。
            
  [0198]在另一實施方式中，唾液酸粘附素抑制劑為miRNA。在本發明中使用的合適的miRNA由19至約24個核苷酸構成，優選為21或22個核苷酸。miRNA可以經設計以使得它們雜交至RNA，高度特異性轉錄。miRNA經優化設計以使得其顯示出與所給出的目標mRNA100%的一致性,或者其示出基本上一致性(即允許至少I個、至少2個、至少3個或更多個不匹配)，根據其在miRNA鏈中的位置，僅一個非互補的的核苷酸就會降低抑制水平。miRNA可以經設計以使得它們靶標mRNA的未翻譯的5’區域，編碼區域或3’區域。
            
  [0199]典型地，miRNA的有效加工和功能僅當所述的miRNA具有特定的結構需求的時候為可能的，所述特定的結構需求例如Zeng等(RNA，2003，9:112-123)描述的那些。本發明的miRNA優選基于mirR-30結構,其中干區已被預選擇的mRNA的祀序列替代。miR-30在環區中的存在，盡管是所需要的，但是并不是絕對必須的，因為其可以容忍特定的變形，從而使得環區相對于miR-30中的環序列具有大于70%、優選大于79%、甚至更優選大于86%，并且甚至更優選大于93%的同一性。同一性百分比的確定可以使用如上所述的任意方法來確定。
            
  [0200]在另一實施方式中，唾液酸粘附素抑制劑為多核苷酸編碼的唾液酸粘附素特異性的siRNA、shRNA或miRNA。在多核苷酸編碼的shRNA或miRNA的情況中，它們包含含有通過發夾或通過莖環區域連接的shRNA和miRNA的有義和反義鏈的序列。在多核苷酸編碼siRNA的情況中,這些包含兩個轉錄單元,每個均通過調節在siRNA中形成的一個鏈(有義和反義)的轉錄的啟動子來形成。多核苷酸編碼siRNA可以包含會聚的或發散的轉錄單元。在發散的轉錄多核苷酸中，編碼每個形成siRNA的DNA鏈的轉錄單元前后位于多核苷酸中從而使得每個DNA鏈的轉錄取決于其自己的啟動子，所述啟動子可以是相同的或不同的(Wang, J.等，2003，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 100:5103-5106 和 Lee, N.S.,等，2002，Nat.B1technol.，20:500-505)。在會聚的轉錄多核苷酸中，產生siRNA的DNA域形成DNA域的有義和反義鏈，其兩側是兩個反向啟動子。在有義和反義RNA鏈的轉錄之后，它們將形成相應于功能siRNA的雜交。
            
  [0201 ] 原則上，任意啟動子均可用于表達shRNA、miRNA和siRNA，所提供的啟動子與siRNA表達siRNA的細胞相匹配。在優選的實施方式中，多核苷酸編碼的唾液酸粘附素特異性的siRNA、shRNA或miRNA包含特別是用于樹突細胞的啟動子，例如⑶Ilc啟動子、DC-STAMP啟動子和肌成束蛋白啟動子。適用于包含反向的轉錄單元的多核苷酸的其它啟動子組合包括2U6啟動子(Tran, N.等，2003，BMC B1technol.,3:21),鼠U6啟動子和人Hl啟動子(Zheng, L.，等，2004，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 101:135-140 和 W02005026322)以及人U6 啟動子和鼠 Hl 啟動子(Kaykas, A.&Moon, R., 2004, BMC Cell B1l., 5:16) ? 在優選的實施方式中，有義和反義siRNA鏈通過不同的啟動子來調節。在甚至更優選的實施方式中，兩個轉錄單元以收斂的方式來定向。
            
  [0202]在某些實施方式中，唾液酸粘附素抑制劑為對唾液酸粘附素具有特異性的反義寡核苷酸。
            
  [0203]反義結構可以經設計以結合至啟動子和其它控制域、外顯子、內含子或者甚至是唾液酸粘附素基因的外顯子-內含子邊界。反義RNA結構或者DNA編碼這樣的反義RNA可被采用以抑制宿主細胞內的基因轉錄或翻譯或者二者，體外或是體內，例如在宿主動物內，包括人體。包含“互補核苷酸”的核酸序列為能夠根據標準的Watson-Crick互補法則堿基配對的那些。也就是說，更大的嘌呤將與更小的嘧啶堿基配對以僅形成如下僅有的組合:鳥嘌呤與胞嘧啶配對(G:C)及在DNA的情況中腺嘌呤與胸腺嘧啶配對(A:T)或者在RNA的情況中腺嘌呤與尿嘧啶配對(A:U)。
            
  [0204]雖然所有的或部分的基因序列可被用于反義結構的情況下，但是統計學上，17個堿基長的任意序列應當僅在人類基因組中出現，并且因此足以指定獨特的靶向序列。盡管更短的低聚物更易于產生并容易在體內增加，但是在確定雜交的特異性中涉及大量的其它因素。寡核苷酸與其互補目標的結合親和性和序列特異性隨著其長度的增加而增加。預期將使用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個堿基對的寡核苷酸。人們可以容易地通過在體外簡單地測試結構確定所給出的反義核酸是否對靶向相應的宿主細胞基因是有效的，以確定內源基因的功能是否被影響或者具有互補序列的相關基因的表達是否受到影響。
            
  [0205]在特定的實施方式中，將希望采用包括其它元素的反義結構，例如包括C-5丙炔嘧啶的那些。包含尿苷和胞啶的C-5丙炔類似物的寡核苷酸已被示出為高親和性結合RNA并且對于基因表達的反義抑制劑是有效的(Wagner等，Science, 260:1510-1513，1993，在這里通過引用而納入本發明中)。
            
  [0206]在一些實施方式中，唾液酸粘附素抑制劑為對唾液酸粘附素特異性的靶向核酶。在本發明優選的實施方式中，核酶為錘頭狀核酶，衍生自植物類病毒的小的 RNA 分子(Symons, Ann.Rev.B1chem.61:641-671, 1992 ;Clouet_D’Orval 和Uhlenbeck, RNA, 2:483-491，1996 ；Haseloff 和 Gerlach,Nature334:585-591, 1988 ；Jeffries 和 Symons, Nucleic Acids Res.17:1371-1377, 1989 ；Uhlenbeck, Nature328:596-600, 1987 ;在這里通過引用而納入本發明中)。在其它的實施方式中，核酶可以是I型內含子、發夾核酶、VS RNA、丁型肝炎病毒核酶或Rnase P-RNA核酶(與RNA引導序列相關)。發夾圖形的例子描述于Hampel等，Nucleic Acids Res.18:299, 1990以及Hampel和Tritz, B1chemistry28:4929, 1989 ; 丁型肝炎病毒圖形的例子描述于Perrotta 和 Been, B1chemistry31:16, 1992 ；RNAseP 圖形的例子(與外部引導序列相關)描述于Yuan等，美國專利US5，624，824 ;脈孢菌VS RNA核酶圖形的例子描述于Saville 和 Collins, Cel161:685-696, 1990, Saville 和 Collins, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:8826-8830, 1991，Collins 和 Olive, B1chemistry32:2795-2799, 1993 ；I 型內含子描述于Cech等，美國專利US5，354，855。如上所述的圖形不應當被認為是對于本發明的限定，并且本領域技術人員將認識到在這里可被利用的核酶包含特定的基底結合位點，其與目標mRNA是互補的。這樣的核酶還包含將RNA裂解活性賦予分子的酶部分。所述酶部分存在于基底結合位點內或圍繞其。
            
  [0207]可以根據本發明使用唾液酸粘附素抑制劑來治療和/或預防與由包膜病毒導致的感染相關的疾病，所述疾病包括如述在使用唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑的方法的內容中的任何疾病。
            
  [0208]在一些實施方式中，與由包膜病毒導致的感染相關的疾病為由I型絲狀病毒科病毒、正粘病毒科病毒、副粘病毒科病毒、彈狀病毒科病毒、波那病毒科病毒、布尼亞病毒科病毒、沙拉病毒科病毒、蟲媒病毒、黃病毒科病毒、肝炎病毒、亨尼病毒、屬于逆轉錄酶病毒科的病毒導致的疾病。在更優選的實施方式中，包膜病毒為屬于慢病毒屬亞科的病毒。在又一更優選的實施方式中，包膜病毒屬于慢病毒屬。在更優選的實施方式中，包膜病毒為靈長類動物慢病毒屬，并且特別是人類免疫缺陷病毒(HIV)或類人猿免疫缺陷病毒(SIV)。
            
  [0209]在一些實施方式中，唾液酸粘附素抑制劑可被用于與一種或多種其它的抗HIV劑相結合。這些其它的化合物可以包含本發明的化合物，例如已知用于治療、預防或減緩HIV感染癥狀的市售化合物。合適的抗HIV試劑為在使用唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑的方法內容中描述的那些。
            
  [0210]在一些實施方式中，唾液酸粘附素抑制劑可用于與抗感染劑相結合。在某些實施方式中，唾液酸粘附素抑制劑可用于與免疫調節劑相結合。
            
  [0211]合適的藥物載體、給藥途徑、制劑和劑量制度已經在使用唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑的方法內容中詳細描述，并可同樣地應用于本方法。
            
  [0212]4.本發明的組合物及其治療應用
            
  [0213]本發明涉及HIV通過樹突細胞的攝取。這種攝取已被發現需要在病毒包膜中發現的神經節苷脂和在樹突細胞的表面中存在的CD169的相互作用。該內在化的病毒可以在樹突細胞的表面上處理并呈遞，由此誘導適應性免疫應答或可被傳遞至CD4+T細胞。由此，通過提供包含負載有目標抗原的樹突細胞以及⑶169和病毒包膜上神經節苷脂相互作用的抑制劑的組合物，其將能夠允許樹突細胞促使適應性免疫應答的產生，同時阻止它們內在化HIV并促進CD4+T細胞的反式感染的能力。由此，另一方面，本發明涉及組合物或試劑盒組件，包含負載抗原的抗原呈遞細胞和唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑。
            
  [0214]適用于本發明的樹突細胞可以是不同類型，例如但不限于骨髓DC(myDC)、類漿細胞DC(pDC)、朗格漢斯細胞和間質DC。最有效的專業APC為骨髓源的DC。由此，在優選的實施方式中，DC為骨髓DC。
            
  [0215]為了獲得包含樹突細胞前體和/或樹突細胞的起始細胞群體，使用本領域已知的方法將包含樹突細胞前體或樹突細胞的細胞、組織或器官的樣本從一個或多個個體分離。這樣的起始細胞群體可以從一個個體獲得或者可以從多于一個的供體匯集。
            
  [0216]在一種實施方式中，包含樹突細胞或樹突細胞前體的起始群體衍生自脾組織。在一種實施方式中，包含樹突細胞或樹突細胞前體的起始細胞群體衍生自胸腺組織。在一種實施方式中，包含樹突細胞或樹突細胞前體的起始細胞群體衍生自骨髓。在一種實施方式中，包含樹突細胞或樹突細胞前體的起始細胞群體衍生自外周血(例如衍生自全血)或者通過使用白細胞分離法。在一種實施方式中，細胞的起始細胞群體包含樹突細胞前體。在一種實施方式中，包含樹體細胞前體的細胞群體可以使用標準單核細胞白細胞分離法從外周血收集，該技術為本領域已知的。樹突細胞前體隨后可被收集(例如使用順序浮力密度離心步驟)。例如，白細胞分離法產物可以在浮力密度溶液(比重=1.077g/mL)中分層，并在1，OOOg下離心20分鐘以耗盡紅細胞和粒細胞。界面細胞被收集、沖洗并在第二浮力密度溶液(比重=1.065g/mL)中分層，并在805g下離心30分鐘以耗盡血小板和低密度單核細胞和淋巴細胞。所獲得的細胞小球富含樹突細胞前體。
            
  [0217]在另一實施方式中，包含樹突細胞的細胞起始群體可以使用本領域已知的方法獲得。這樣的群體可以包含骨髓樹突細胞、漿細胞樣樹突細胞、或者由單核細胞培養生成的樹突細胞(例如M0-DC、MDDC)。在一種實施方式中，樹突細胞或樹突細胞前體還可以衍生自包含這樣的細胞的混合細胞群體(例如衍生自循環或衍生自組織或者器官)。在特定的實施方式中，包含DC或樹突細胞前體的混合細胞群體為濃縮的以使得DC或樹突細胞前體構成大于 50% (例如 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%，95%,98%,99%，、99.5%、99.9%或更大)的細胞群體。在某些實施方式中，在這里描述的樹突細胞通過從細胞群體中的某些或全部非樹突細胞中分離來提純。在示例性的實施方式中，細胞可被提純以使得包含樹突細胞或樹突細胞前體的起始群體包含至少50 %或更多的樹突細胞或樹突細胞前體(例如 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,98%,99%,99.5%,99.9%或更大的純度)。
            
  [0218]在一種實施方式中，樹突細胞可以使用本領域已知的技術來分離。參見Inaba K，等，Curr.Protoc.1mmunol.2009 ；86:3.7.1-3.7.19 和 Woo J,等，Transplantat1n 1994 ；58:484-4914。本領域技術人員能夠實施對前述分離包含樹突細胞或樹突細胞前體的細胞的方法的改進，而無需使用過度的試驗。在一種實施方式中，樹突細胞可以使用熒光活化的細胞來提純，所述細胞對存在于它們表面上的抗原進行分類(例如在特定的樹突細胞的情況中的⑶11c)。在一種實施方式中，存在于細胞起始群體中的DC表達⑶I lc。在另一實施方式中，存在于細胞起始群體中的DC或樹突細胞前體表達II型分子。細胞起始群體可以使用本領域已知的技術進行監測，用于多種細胞表面標記的表達(例如包括CDl lc)。
            
  [0219]在另一實施方式中，包含樹突細胞和/或樹突細胞前體的細胞群體可以由存在于血液中作為PBMC的多能細胞獲得。盡管可以從血液極其容易的獲得，但是多能細胞還可以由它們存在于其中的任何組織獲得，包括骨髓和脾組織。這些多能細胞典型地表達CD14、⑶32、⑶68和⑶115單核細胞標記，幾乎不表達或者不表達⑶83、p55或輔助分子，例如CD40 和 CD86。
            
  [0220]在一種實施方式中，樹突細胞前體可以區分為在方案中使用至少一種試劑處理之前、期間或之后使用本領域已知的方法的樹突細胞以制備誘導致耐受性的或者誘導免疫原樹突細胞。例如，當在存在例如為GM-CSF和IL-4或IL-13的組合的細胞因子的情況下培養的時候，多能細胞會產生不成熟的樹突細胞。在另一種實施方式中，FLT3配體可被用于該目的。例如，在一種實施方式中，包含樹突細胞或樹突細胞前體的細胞起始群體可在存在一種或多種促使區分DC的試劑的情況下體外培養。在一種實施方式中，一種或多種GM-CSF或IL-4被用于促進DC在體外的發展(例如通過1-15天、2-10天、3_9天、4_8天或5_6天或其它時間的培養，來獲得充分的區分)。在一種實施方式中，誘導的樹突細胞被完全區分(在誘導之前、期間或之后以產生誘導的致耐受性樹突細胞或者誘導的免疫原樹突細胞)。
            
  [0221]在另一實施方式中，包含DC或DC前體的細胞起始群體可以由PBMC獲得。從血液獲得PBMC的方法，使用例如通過合適的介質來區別沉降的方法，其為已知的并且適用于在本發明中使用。在本發明優選的實施方式中，多能細胞通過減少血小板的PBMC、以及T和B淋巴細胞的群體而獲得。多種不同的方法可被用于完成非多能細胞的消除。根據一種方法，標記有對待移除的細胞(例如T或B淋巴細胞)特異的抗體的免疫磁珠可被用于從PBMC群體直接地或間接地移除T和B細胞。T細胞還可以通過用神經氨酸苷酶處理的紅血細胞從 PBMC 群體消除。參見 O’Doherty U,等，J.Exp.Med.1993 ; 178:1067-1078。
            
  [0222]如上所述，不成熟樹突細胞的培養可以通過在存在細胞因子的情況下培養多能細胞而獲得，所述細胞因子會通過足夠的時間促使它們分化以實現所期望的分化水平(例如1-10天、2-9天、3-8天或4-7天)。作為例子，每個濃度在約200至約2000U/ml之間、在約500 至 1000U/ml 之間，或者在約 800U/ml (GM-CSF)至 1000U/ml (IL-4)之間的 GM-CSF 和IL-4的組合會產生顯著量的不成熟樹突細胞。GM-CSF(10-200ng/ml)和IL-4(5_50ng/ml)的組合也可被使用。還期望的是在培養的不同階段改變細胞因子的濃度從而使得新培養的細胞在存在比所確定的培養(在培養兩天之后500U/ml IL-4)更高濃度的IL_4 (1000U/ml)的情況下培養。其它的細胞因子，例如IL-13被發現用于替代IL-4。在另一種實施方式中，FLT3配體可被用于該目的。用于該目的的其它方案為本領域已知的。
            
  [0223]用于從粘附血液單核部分獲得這些不成熟樹突細胞的方法為本領域已知的。參見 Romani N,等，J.Exp.Med.1994 ；180 (I): 83-93 和 Sallusto F，Lanzavecchia A, J.Exp.Med.1994 ;179:1109-1118。簡略地，淋巴細胞消除的PBMC以約I百萬細胞/cm的密度被固定在組織培養板中，在包含例如為GM-CSF和IL-4的細胞因子的完全培養基中，每個濃度在約800至1000U/ml之間并且IL-4以約1000U/ml存在。另一種不成熟樹突細胞的來源為增殖的樹突細胞前體的培養。參見Steinman R,等，W01993020185。因為由⑶34+增殖前體制備的樹突細胞對于表達成熟特征的樹突細胞是成熟的，所以它們還可能經過發展階段，其中它們為多能的。
            
  [0224]在一種實施方式中，包含樹突細胞的細胞起始群體可以是濃縮的，對于通過使不成熟樹突細胞與樹突細胞成熟因子相接觸的成熟樹突細胞的存在來說。如在這里所涉及的，樹突細胞成熟因子實際上可以是一種或多種特定物質，其單獨作用或者與其它試劑一起導致不成熟樹突細胞成熟，例如與一種或多種佐劑、TLR激動劑、CD40激動劑、炎癥活化齊U、炎性細胞因子或其組合一起。
            
  [0225]樹突細胞可以在體外由外周血單核細胞(PBMC)使用基本上由在培養瓶中播種PBMC以使得所述細胞的粘附被允許構成的方案來產生。然后，使用白介素4(IL4)和粒細胞-巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)處理細胞，導致差異化的細胞在約一周之后成為不成熟的樹突細胞(iDC)。任選地，所述細胞可以使用腫瘤壞死因子a (TNFa)處理而被成熟化。
            
  [0226]樹突細胞可以使用標準方法由多種合適的來源獲得。用于分離樹突細胞的這些來源包括外周血、脊髓、腫瘤浸潤細胞、癌周組織浸潤細胞、淋巴結活檢、胸腺、脾、皮膚、臍帶血、由外周血獲得的單核細胞、由外周血獲得的⑶34-或⑶14-陽性細胞、以及任意其它合適的組織或流體。
            
  [0227]任選地，樹突細胞的穩定的細胞培養可被使用。例如，樹突狀細胞/腫瘤細胞雜交瘤和數個樹突狀細胞/腫瘤細胞雜交體可被利用。參見Falo L,等，ΕΡ1168924。這些雜交體和雜交瘤由腫瘤細胞和樹突狀細胞的融合產生。例如，源自自體同源的腫瘤細胞系的永生腫瘤細胞可與自體同源的HLA匹配的異源樹突狀細胞融合。自體腫瘤細胞系可以由原發性腫瘤及其轉移性腫瘤獲得。可替換地，自體的永生樹突狀細胞或者異源的HLA匹配的樹突狀細胞系可與自體同源的腫瘤細胞融合。參見Fitzpatrick D,等，W02002048167。另一種可被使用的細胞系為 CBl。參見 Paglia P,等，J.Exp.Med.1993 ; 178:1893-1901。
            
  [0228]根據本發明的組合物的負載抗原的樹突細胞通過樹突細胞與包含所期望抗原的產生免疫的組合物接觸，在足以使用病毒免疫原脈沖所述細胞的條件下來制備。
            
  [0229]如在這里所預期的，本發明可以包括任何適用于負載至APC中以引發免疫應答的抗原的使用。在一種實施方式中，微生物抗原可被使用。抗原分子可以是例如但不限于病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、過敏原或環境抗原、分化抗原、腫瘤抗原、胚胎抗原、致癌基因抗原和突變腫瘤抑制因子基因、由染色體易位獲得的獨特的腫瘤抗原或其衍生物。還可能的是抗原多肽是病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、過敏原或環境抗原、分化抗原或腫瘤抗原的免疫原片段。合適抗原的例子包括但不限于:
            
  [0230]I)病毒抗原:能夠對病毒引發免疫應答的病毒抗原包括動物和人逆病毒和慢病毒抗原，例如 HIV-1 的那些，即 HIV-1 抗原(例如 at, nef, gpl20 或 gpl60, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev)或者即刻早期蛋白(例如 HSVl 或HSV2 的 ICP27, ICP47, ICP4, ICP36)，乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或肝炎核心抗原)，丙型肝炎病毒(例如核心、E1、NS3或NS5抗原)，源自副粘病毒(例如呼吸道合胞體病毒，例如F和G蛋白質或其衍生物)，源自副流感病毒，源自風疹病毒(例如蛋白質El和E2)，麻疹病毒，腮腺炎病毒，人乳頭狀瘤病毒(例如 HPV6、ll、16、18、eg L1、L2、El、E2、E3、E4、E5、E6、E7)，蟲媒病毒(例如黃熱病毒、登革熱病毒、森林腦炎病毒、日本腦炎病毒)，或流感病毒細胞(例如HA、NP、NA或M蛋白質，或其組合)，輪狀病毒抗原(例如VP7sc和其它輪狀病毒部分)，和類似的病毒。參見 Fields B, Knipe D.Eds., “Fundamental Virology”,第二版(Raven Press, NewYork, NY, 1991)。
            
  [0231]2)細菌抗原:細菌抗原,例如源自奈瑟菌屬(Neisseria spp.)的抗原,包括淋病奈瑟菌(N.gonorrhea)和腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)(例如轉鐵蛋白結合蛋白、乳鐵蛋白結合蛋白、PiIC和粘附素)；源自化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的抗原(例如M蛋白質或其片段以及C5A蛋白酶)；源自無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、變異鏈球菌(Streptococcus mutans)的抗原；杜克雷嗜血桿菌(Haemophilus ducreyi)；莫拉菌屬(Moraxella spp.),包括卡他莫拉菌屬(M.catarrhalis),還被稱為粘膜炎布蘭漢球菌(Branhamella catarrhalis)(例如高分子量和低分子量粘附素和侵襲素)；源自鮑特桿菌屬(Bordetella spp.)的抗原，包括百日咳鮑特桿菌(B.pertussis)，副百日咳鮑特桿菌(B.parapertussis)和支氣管鮑特桿菌(B.bronchiseptica)(例如百日咳桿菌粘附素、百日咳毒素或其衍生物，絲狀血凝素、腺苷酸環化酶、菌毛)；源自分支桿菌屬(Mycobacterium spp.)的抗原,包括結核分枝桿菌、牛分支桿菌、麻風病分支桿菌、鳥分枝桿菌、副結核分支桿菌，分枝桿菌球；軍團桿菌屬(Leg1nella spp.),包括嗜肺軍團菌；(例如 ESAT6,抗壓 85A, -B 或 _C、MPT44、MPT59、MPT45、HSP10、HSP65、HSP70、HSP75、HSP90、PPD19kDa [Rv3763], PPD38kDa [Rv0934]);源自埃希氏菌屬(Escherichia spp.)的抗原，包括腸毒性大腸桿菌(例如定居因子、熱不穩定毒素或其衍生物、熱穩定毒素或其衍生物)，源自腸出血性大腸桿菌或致腸病的大腸桿菌的抗原(例如類志賀毒素及其衍生物)；源自弧菌屬(Vibr1 spp.)的抗原，包括霍亂弧菌(V.cholera)(例如霍亂毒素或其衍生物)；源自志賀氏菌(Shigella spp.)的抗原，包括宋內志賀氏菌、痢疾志賀菌、弗氏志賀菌；耶爾森氏菌屬(Yersinia spp.),包括小腸結腸炎耶爾森菌(例如Yop蛋白質)；源自鼠疫桿菌、假結合性桿菌的抗原；彎曲桿菌屬(Campylobacter spp.),包括空腸彎曲菌(例如毒素，粘附素和侵襲素)；源自沙門氏菌屬(Salmonella spp.)的抗原,包括S.typhi, S.enterica和S.bongori ;李斯特菌屬(Listeria spp.),包括單增李斯特菌屬;螺桿菌屬(Helicobacter spp.),包括幽門螺桿菌(H.pylori)(例如脲酶，過氧化氫酶，空泡毒素)；源自假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)的抗原，包括銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)；葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.),包括金黃色葡萄球菌(S.aureus)，表皮葡萄球菌(S.epidermidis);腸球菌屬(Enterococcus spp.),包括糞腸球菌、屎腸球菌；梭菌屬(Clostridium spp.)，包括破傷風梭菌(例如破傷風毒素及其衍生物)；源自C型肉毒桿菌(C.botulinumM即肉毒桿菌毒素及其衍生物)的抗原，源自艱難梭狀芽胞桿菌(例如梭菌毒素A或B及其衍生物)的抗原；源自桿狀菌屬的抗原，包括炭疽桿菌(例如炭疽熱毒素及其衍生物)；棒狀桿菌屬(Corynebacterium spp.),包括白喉桿菌(例如白喉毒素及其衍生物)；源自包柔氏螺旋體屬(Borrelia spp.)的抗原,包括伯氏疏螺旋體(例如OspA, OspC, DbpA, DbpB);源自伽氏疏螺旋體(例如OspA, OspC, DbpA, DbpB),埃氏疏螺旋體(例如OspA, OspC, DbpA, DbpB)的抗原，源自伯氏疏螺旋體((例如OspA, OspC, DbpA, DbpB)的抗原和源自赫氏疏螺旋體的抗原；源自埃立克體屬(Ehrlichia spp.)的抗原，包括E.equi和人粒細胞埃立克體病的試劑；發疫傷寒等的病原體(Rickettsia spp.),包括立克次(氏)體；衣原體屬(Chlamydia spp.),包括沙眼衣原體(例如M0MP,肝磷脂結合蛋白);源自肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)(例如M0MP,肝磷脂結合蛋白)的抗原，源自C.psittaci的抗原；螺旋體屬(Leptospira spp.),包括鉤端螺旋體；密螺旋體屬(Treponema spp.),包括梅毒螺旋體(例如稀有的外膜蛋白)，源自齒密螺旋體、痢疾密螺旋體的抗原，源自結核分枝桿菌(例如Rv2557，Rv2558, RPFs: Rv0837c, Rvl884c, Rv2389c, Rv2450, Rvl009, aceA(Rv0467), PstSl, (Rv0932), SodA(Rv3846), Rv2031cl6kDal.，Tb Ral2, Tb H9, Tb Ra35, Tb38_l, Erdl4, DPV, MTI, MSL, mTTC2 和 hTCCl)的抗原；源自衣原體(例如高分子量蛋白質(HWMP)，0RF3(EP366412)的抗原，以及公認的膜蛋白(Pmps);源自鏈球菌屬(Streptococcus spp.)的抗原,包括肺炎鏈球菌(PsaA, PspA,鏈球菌溶血素，膽堿結合蛋白，蛋白質抗原肺炎球菌溶血素，及其突變解毒衍生物)；衍生自嗜血桿菌屬(Haemophilus spp.)的抗原，包括B型流感嗜血桿菌(H.1nfluenzae type B)(例如PRP及其軛合物);源自非典型的流感嗜血桿菌(H.1nfluenzae)(例如0MP26，高分子量粘附素，P5，P6，蛋白質D和脂蛋白D，以及絲束蛋白及絲束蛋白衍生的肽，或多副本變體或其融合蛋白)的抗原。
            
  [0232]3)真菌抗原:真菌抗原，例如源自假絲酵母屬(Candida spp.)的抗原，包括
            
  C.albicans ;組織胞衆菌屬(histoplasma)真菌抗原(例如熱休克蛋白60 (HSP60)和其它的組織胞衆菌屬真菌抗原部分)；源自隱球酵母屬(Cryptococcus spp.)的抗原,包括新生隱球菌(例如蒴狀多糖和其它的隱球菌真菌抗原部分)；球孢子菌屬(coccid1des)真菌抗原(例如內孢囊抗原和其它的球孢子菌屬真菌抗原部分)；以及癬真菌抗原(例如發癬菌素核其它的球孢子菌屬真菌抗原部分)。
            
  [0233]4)原生動物抗原:原生動物抗原，例如源自痕原蟲屬(Plasmodium spp.)的抗原，包括惡性瘧原蟲(例如裂殖子表面抗原，孢子體表面抗原，環子孢子抗原，配子母細胞/接合體表面抗原，血液階段抗原pf.，55/RESA)和其它的瘧原蟲抗原部分(例如RTS.S、TRAP、MSP 1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、鉗合蛋白、PfEMP 1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP, SALSA、PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfsl6、Pfs48/45、Pfs230 和它們在瘧原蟲屬的類似物)；源自弓形體屬(Toxoplasma spp.)和弓形蟲(例如SAG2、SAGS、Tg34、p30和其它的弓形體病抗原部分)的抗原；血吸蟲(schistosomae)抗原(例如谷胱甘肽_S_轉移酶，副肌球蛋白，和其它的血吸蟲抗原部分)；主要利什曼原蟲和其它利什曼原蟲抗原(例如gp63，磷脂聚糖及其相關的蛋白質和其它的利什曼原蟲抗原部分)；和克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)抗原(例如75_77kDa抗原，56kDa抗原和其它的錐體蟲抗原部分)，源自內阿米巴屬(Entamoeba spp.)的抗原,包括痢疾變形蟲；巴貝西蟲屬(Babesiaspp.),包括果氏巴貝蟲；錐體蟲屬(Trypanosoma spp.),包括克氏錐體蟲；梨形鞭毛蟲屬(Giardia spp.),包括賈第鞭毛蟲；利什曼原蟲屬(leishmania spp.),包括碩大利什曼原蟲；肺囊蟲屬(Pneumocystis spp.),包括卡氏肺囊蟲；滴蟲病屬(Trichomonas spp.),包括陰道滴蟲；血吸蟲屬(Schisostoma spp.),包括S.mansoni。
            
  [0234]5)過敏原或環境抗原:過敏原或環境抗原例如天然產生的過敏原，像花粉過敏原(例如樹、草、雜草和花粉過敏原)，昆蟲過敏原(例如吸入劑，唾液和毒液過敏原)，動物毛發和皮屑過敏原，以及食物過敏原。源自分類學次序的樹、草和香草的重要的花粉過敏原為殼目木，木犀目，松木和懸鈴木科，包括落葉松(樺木屬)，棺木(赤楊)，榛子(榛屬)，角樹(鵝耳櫪屬)和橄欖樹(洋橄欖屬)，雪松(日本柳杉和檜屬)，懸鈴樹(懸鈴木屬)，禾草目的順序，包括(例如黑麥草屬，貓尾草屬，早熟禾屬，狗牙根屬，鴨茅屬，絨毛草屬，橘草屬，黑麥屬和蜀黍屬的草)，菊目和蕁麻目的順序(例如豚草屬，艾屬，和墻草屬的香草)。可以使用的其它的過敏原抗原包括嗜皮螨屬和嗜霉螨屬的屋塵螨過敏原，存儲螨(例如Lepidoglyphys, Glycyphagus和Tyrophagus),蟑螂,蚊和跳蚤(例如Blatella, Periplaneta, Chironomus 和 Ctenocepphalides)過敏原，哺乳動物(例如貓，狗和馬)過敏原，鳥，包括源自刺蜇或叮咬昆蟲的毒液過敏原(例如源自膜翅目昆蟲的分類學次序，包括蜜蜂(蜜蜂總科)，黃蜂和螞蟻(蟻科))。還可以使用的其它過敏原抗原包括真菌類呼吸道過敏原(例如源自鏈格孢屬和枝孢屬)。
            
  [0235]6)腫瘤抗原:腫瘤抗原例如為MAGE, MART-1/Me lan-A, gplOO, 二肽基肽酶IV(DPPIV)，腺苷脫氨基酶結合蛋白(ADAbp)，親環蛋白b，結腸直腸相關抗原(CRC) -0017-1A/GA733,癌胚抗原(CEA)及其抗原決定部位 CAP-1 和 CAP-2，etv6，amll，前列腺特異性抗原(PSA)及其抗原決定部位PSA-l，PSA-2和PSA-3，前列腺特異性膜抗原(PSMA)，T 細胞受體 / CDS-? 鏈，MAGE 屬腫瘤抗原(例如 MAGE-A1，MAGE-A2, MAGE-A3, MAGEA4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-AlI, MAGE-Al2, MAGE-Xp2(MAGE-B2)，MAGE-Xp3(MAGE-B3)，MAGE_Xp4(MAGE-B4)，MAGE-CI, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGEC5)，GAGE 屬腫瘤抗原(例如 GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9)，BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4,酪氨酸酶，p53, MUCM , HER2/neu, p21ras, RCASI, a -胎蛋白，E-鈣黏著蛋白，a -聯蛋白，13-聯蛋白，Y -聯蛋白，pl20ctn, gp10ftie1117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27,腺瘤性息肉病大腸桿菌蛋白(APC)，胞襯蛋白，聯接蛋白37，免疫球蛋白-個體基因型(Ig-個體基因型)，pl5，gp75，GM2和GD2神經節苷脂，病毒產物，例如人乳頭狀瘤病毒蛋白，Smad屬的腫瘤抗原，lmp-1，PlA, EBV-編碼的核抗原(EBNA)-1,腦磷酸化酶，SSX-1, SSX-2 (H0M-MEL40)，SSX-3, SSX-4, SSX-5, SCP-1和CT-7，以及c-erbB-2，急性淋巴細胞白血病(etv6，混合型白血病，親環蛋白b)，B細胞淋巴瘤(Ig-個體基因型)，神經膠質瘤(E-鈣黏蛋白，a-聯蛋白，13-聯蛋白，7-聯蛋白，pl20ctn),膀胱癌(p21ras),膽癌(p21ras),乳癌(MUC 屬，HER2/neu, c-erbB-2)，宮頸癌(p53, p21ras),結腸癌(p2Iras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC 屬)，結腸直腸癌(與結腸直腸相關的抗原(CRC)-0017-1A/GA733，APC)，絨毛膜癌(CEA)，上皮細胞癌(親環蛋白b)，胃癌(HER2/neu, c-erbB-2, ga733 醣蛋白),肝細胞癌,Hodgkins 淋巴瘤(lmp-1, EBNA-1),肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ES0-1)，淋巴細胞衍生的白血病(親環蛋白b)，黑素瘤(pl5蛋白質，gp75,癌胚抗原，GM2 和 GD2 神經節苷脂，MelanA/MART-l, cdc27, MAGE-3, p21ras,gp 10ftie1117),骨髓瘤(MUC 屬，p21ras)，非小細胞肺癌(HER2/neu, c-erbB-2),鼻咽癌(lmp-1, EBNA-1),卵巢癌(MUC屬，HER2/neu，c-erbB-2)，前列腺癌(前列腺特異性抗原(PSA)及其抗原決定部位 PSA-1, PSA-2 和 PSA-3、PSMA, HER2/neu、c-erbB-2、ga733 醣蛋白)，腎癌(HER2/neu，c-erbB-2)，子宮頸和食道的扁平細胞癌癥(例如人乳頭狀瘤病毒蛋白的病毒產物)，睪丸癌(NY-ES0-1)，和T細胞白血病(HTLV-1抗原決定部位)。
            
  [0236]在優選的實施方式中，用于獲得本發明的負載抗原的樹突細胞的抗原為病毒抗原。在更優選的實施方式中，病毒抗原為HIV抗原。
            
  [0237]如先前公開的，HIV隔離種群被劃分為離散的基因亞型。HIV-1已知為包含至少十個亞型(Al、A2、A3,、A4、B、C、D、E、PL F2、G、H、j 和 K)。參見 Taylor B,等，N.Engl.J.Med.2008 ；359 (18): 1965-1966。HIV-2 已知為包括至少五個亞型(A、B、C、D 和 E)。亞型B為在同性戀人群中和全世界靜脈注射藥物使用者中與HIV流行病相關的。絕大多數的HIV-1免疫原、實驗室適應的隔離種群、試劑和映射表位屬于亞型B。在撒哈拉以南的非洲、印度和中國，新的HIV感染的影響高，HIV-1亞型B僅占少數的感染，并且亞型HIV-1C表現為更加常見的感染亞型。因此，在特定的實施方式中，優選選擇特定亞型的免疫原(例如HIV-1亞型B或C)。需要在單個的免疫學組合物中包括多個HIV亞型(例如HIV-1亞型B和C，HIV-2亞型A和B，或者HIV-1，HIV-2，或HIV-3亞型的組合)的免疫原。
            
  [0238]合適的HIV免疫原包括HIV包膜(env ;例如NCBI參考序列NPJ357856)，gag(例如 p6、p7、pl7、p24、GenBank AAD39400J)，由 pol (例如 UniProt P03366)、nef (例如fenBank-CAA4I585J, Shugars D,等，J.Virol.1993 ；67(8):4639-4650)編碼的蛋白酶，以及變體、衍生物及其融合蛋白。參見G0mez C，等，Vaccine2007 ;25:1969-1992。合適的菌株和組合物可以通過本領域技術人員根據需要來選擇。
            
  [0239]本發明的負載抗原的樹突細胞(還被稱為“脈沖的樹突細胞”),通過將樹突細胞在體外或體內暴露至抗原來制備。在樹突細胞在體外被脈沖的情況中，樹突細胞可被放置在培養皿中并暴露至足夠量的抗原中，持續足夠的時間來允許抗原結合至樹突細胞。需要用以實現抗原結合至樹突細胞的用量和時間可以通過使用本領域已知的或者在這里公開的方法來確定。本領域技術人員已知的其它方法、例如免疫測定或結合測定可被用于檢測抗原在樹突細胞上的存在，在暴露至抗原之后。
            
  [0240]在本發明的另一實施方式中，樹突細胞可以使用載體來轉染，所述載體允許特定蛋白質通過樹突細胞的表達。通過樹突細胞表達的蛋白質隨后可被加工并呈遞在細胞表面上。轉染的樹突細胞隨后可被用作為免疫原組合物，用以對通過載體編碼的蛋白質產生免疫應答。載體可被制備為包括特定的多核苷酸，其編碼并表達免疫應答所期望的蛋白質。優選地，逆轉錄病毒載體被用于感染細胞。更優選地，腺病毒載體被用于感染細胞。
            
  [0241 ] 在另一實施方式中，載體可被靶向至通過改性病毒載體來編碼蛋白質或其部分的樹突細胞，其中蛋白質或其部分通過樹突細胞上的受體來認知，由此，樹突細胞受體由載體的占據將啟動載體的內吞作用，允許加工并呈遞通過病毒載體的核酸編碼的抗原。通過病毒傳遞的核酸對于病毒來說可以是天然的，當在樹突細胞上表達的時候，其編碼隨后在樹突細胞的MHC受體上加工并呈遞的病毒蛋白質。
            
  [0242]如在這里所預期的，多種不同的方法可被用于轉染多核苷酸至宿主細胞。所述方法包括但不限于磷酸鈣沉淀、脂質轉染、微粒轟擊、微注射、電穿孔、膠體分散體系(即高分子復合物、納米膠囊、微球、小珠和脂質基體系，包括水包油乳液、膠束、混合膠束和脂質體)。這些方法為本領域所理解的并描述于公開文獻中，從而能夠使本領域技術人員實施這些方法。
            
  [0243]在另一實施方式中，多核苷酸編碼的抗原被克隆至表達載體內，并且所述載體被引入至樹突細胞中從而產生負載的樹突細胞。多種不同類型的載體和將核酸引入至細胞中的方法均公開于可提供的公開文獻中。例如，表達載體可以通過物理、化學或生物方式被傳遞至宿主細胞內。參見 Brown T, “Gene Cloning”(Chapman&Hall, London, GB,1995) ；ffatson R,等，“Recombinant DNA，，，第二版(Scientific American Books, NewYork, NY, US, 1992) ；Alberts B,等，“Molecular B1logy of the Cell，，(GarlandPublishing Inc., New York, NY, US, 2008) ；Innis M,等，Eds.，“PCR Protocols.AGuide toMethods and Applicat1ns”(Academic Press Inc., San Diego, CA, US, 1990)；Erlich H,Ed., “PCR Technology.Principles and Applicat1ns for DNAAmplificat1n”(Stockton Press, New York, NY, US, 1989) ；Sambrook J,等，“MolecularCloning.A Laboratory Manual，，(Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY, US, 1989) ；Bishop T,等，“Nucleic Acid and Protein Sequence.A Practical Approach，，(IRL Press, Oxford, GB, 1987) ；Reznikoff ff, Ed., “MaximizingGene Express1n”(Butterworths Publishers, Stoneham,MA,US, 1987) ；Davis L,等，“Basic Methods in Molecular B1logy”(Elsevier Science Publishing C0., NewYork, NY, US, 1986), Schleef M, Ed.，“Plasmid for Therapy and Vaccinat1n”(Wiley_VCHVerlag GmbH, ffeinheim, DE, 2001)。
            
  [0244]容易理解的是，引入包含多核苷酸編碼的抗原的表達載體會產生脈沖細胞。本發明包括多種不同的用于脈沖樹突細胞的方法，包括但不限于使用蛋白質、cDNA或mRNA形式的全抗原來負載樹突細胞。然而，本發明不應當被構造為對用于脈沖樹突細胞的特定形式的抗原的限制。然而，本發明包括本領域已知的用于產生負載抗原的樹突細胞的其它方法。優選地，通過mRNA編碼的定義抗原轉染樹突細胞。相應于序列已知的基因產物的mRNA可以在體外使用合適的引物而快速地產生，并且轉錄反應與逆轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)相結合。利用mRNA對樹突細胞的轉染提供了相對于用于產生脈沖APC的其它負載抗原技術的優勢。例如，從微觀量的組織(即腫瘤組織)擴大RNA的能力將用于接種疫苗的APC的應用擴展至大量的患者。
            
  [0245]—旦樹突細胞已經利用目標抗原被脈沖，免疫原脈沖的樹突細胞就會被復原。不同的方案可被用于復原免疫原脈沖的樹突細胞，例如使用通過成熟細胞(例如⑶80)表達的任何標記的免疫隔尚。
            
  [0246]—旦目標抗原被負載至未成熟的樹突細胞中，所述的細胞就可被提交至體外成熟，通過細胞因子、TLR(鐘狀受體)配體和其它試劑。例如，本領域技術人員已知預發炎細胞因子、IL-1 β、IL-6和TNFa與前列腺素E2組合的混合物可被用于成熟DC，用于HIV的免疫治療。另一種替換形式為通過發炎細胞因子、TNFa、IL-2、IFNy和IFNa以及雙鏈RNA聚1:C(稱為a DCI)的組合成熟DC。所獲得的產物適合用作治療或預防疫苗。
            
  [0247]細胞表面標記的表達例如可以使用常規方法和儀器通過流式細胞術來確定。例如，使用市售抗體和本領域已知的常規方案的Cal ibur FACS (熒光活化的細胞種類，BectonDickinson C0., Franklin Lakes, NJ, US)體系可被使用。由此,在流式細胞術中呈遞高于背景信號的特異性細胞表面標記的信號的細胞可被選擇。背景信號被定義為在常規FACS分析中與用于檢測每個表面標記的特異性抗體相同類型的非特異性抗體給出的信號強度。為了標記被認為是陽性的，所觀察到的特異性信號不得不大于20%，優選
            
  60%,70%,80%,90%,500%, 1000%,5000%、10000%或更大的強度，相對于使用常規方法和儀器的背景信號的強度。
            
  [0248]所述的樹突細胞疫苗優選為與個體自體的。最有效的免疫治療疫苗利用基于自體同源的HIV的抗原(即對于每個宿主獨特的病毒準物種)。迄今為止在抗HIV免疫治療試驗中最有效的結果已經利用衍生自患者的自體同源病毒的負載有完全的、滅活的HIV病毒粒子的樹突細胞(DC)。樹突細胞還可由相同的患者獲得。在優選實施方式中，樹突細胞制備為與CD4+T細胞和CD14+單核細胞已被分離的個體自體同源的。
            
  [0249]術語“唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑”已在上文描述。在優選的實施方式中，抑制劑選自由唾液乳糖、包含唾液乳糖片段和抗唾液酸粘附素抗體的分子組成的組。在另一優選的實施方式中，包含唾液乳糖片段的分子為具有少于四個唾液酸的神經節苷脂。在另一優選的實施方式中，包含唾液乳糖并具有少于四個唾液酸的神經節苷脂選自在表I中所述的任何神經節苷脂或在表I中所示的任何神經節苷脂的組合。在優選的實施方式中，本發明的組合物包含至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或更多個神經節苷脂，其中所述的神經節苷脂選自表I中的神經節苷脂或者相應于任意其它的攜帶有唾液乳糖的神經節苷脂。
            
  [0250]根據本發明的組合物和試劑盒組件可用于在個體中相對于被負載在抗原呈遞細胞中的抗原產生免疫應答。抗原呈遞細胞將作用為誘導個體中CD4+和CD8+細胞啟動的疫苗，而唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用抑制劑的存在將阻止該情況，如果個體受到HIV感染，抗原呈遞細胞將不會攝取任何病毒并且不會在患者體內再次感染CD4+T細胞。由此，當組合物和試劑盒組件對于治療與HIV感染相關的疾病(使用負載有HIB抗原或抗原混合物的抗原呈遞細胞)特別有用時，它們通過促進對于形成部分導致疾病的細胞的抗原的免疫應答的刺激而對治療伴隨有HIV感染的疾病也是有用的，同時通過防止HIV由形成部分免疫原/疫苗組合物的抗原呈遞細胞的吸收來進一步最小化HIV的擴散。
            
  [0251]由此，另一方面，本發明涉及根據本發明的組合物或試劑盒組件，用于醫藥中。
            
  [0252]另一方面，本發明涉及包含根據本發明的組合物或試劑盒組件的免疫原或疫苗。
            
  [0253]另一方面，本發明涉及根據本發明的組合物或試劑盒組件，用于治療或預防需要對在抗原呈遞細胞中負載的抗原產生免疫應答的疾病。
            
  [0254]另一方面，本發明涉及根據本發明的組合物或試劑盒組件，用于制備用于治療個體中的疾病的藥劑，所述疾病為與需要對在抗原呈遞細胞中負載的抗原產生免疫應答相關的。
            
  [0255]在優選實施方式中，被給予組合物或試劑盒的受試者為感染HIV的患者。
            
  [0256]另一方面，本發明涉及治療患有疾病的個體的方法，所述疾病需要對抗原或者數個抗原產生免疫應答，所述抗原包含向所述個體施加根據本發明的組合物或試劑盒，其中在所述組合物或試劑盒組件中的抗原呈遞細胞負載有對其需要免疫應答的所述抗原或數個抗原。
            
  [0257]本發明的樹突細胞疫苗可以是治療疫苗，也就是說，給予受到HIV感染的已發展為AIDS的個體材料用于通過調節它們的免疫應答來幫助對抗疾病。治療HIV疫苗作為添加劑或者作為對用于HIV的現有抗逆轉錄酶病毒治療選擇的替換表現為有前途的方案。
            
  [0258]本發明的樹突細胞疫苗可以是預防疾病的AIDS疫苗，經設計以施用至受到HIV感染的還未發展為AIDS的個體。
            
  [0259]對HIV的免疫應答的產生可以通過測量來評估，例如病毒負載、T細胞增殖、T細胞存活、T細胞的細胞因子分泌或者抗原特異性抗體生成(例如抗體濃度)的增加。
            
  [0260]用于檢測受刺激的T細胞的方法為本領域技術人員已知的。然而，本領域技術人員可以容易地分析出適用于評估響應于Ag的T細胞的刺激的任何方法均可被使用。在下文描述的步驟提供了數個合適方法的例子:
            
  [0261]I)酶聯免疫斑點(ELISpot):源自預培養孔的非粘附性細胞被轉移至涂覆有所期望的抗細胞因子捕捉抗體(Abs ;例如抗-1FN、-1L-10、-1L-2、-1L-4)的板。利用生物素化的次級Abs和標準色度或熒光檢測方法來實現表達，例如鏈酶親和素-堿性磷酸酶和NBT-BCIP以及計算的斑點。ELISpot讀出隨后被表達為斑點形成細胞(SFC)/16PBMCst5
            
  [0262]2)上層清液細胞因子試驗:在培養上層清液中釋放的細胞因子通過不同的技術被測定，例如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、BD流式細胞小球微陣列術、B1rad B1-Plex試驗等。
            
  [0263]3) HLA II型四聚物:通過該步驟，認知特定肽表位的Ag反應性T細胞使用市售試劑(例如 MHC Class II Ultimers?, ProTmmune Ltd, Oxford, GB)或內部生成的試劑(例如Novak E,等，J.Clin.1nvest.1999 ；104:R63-R67)被檢測。
            
  [0264]4)激活標記(例如⑶69，⑶25，⑶137)的上調:通過該步驟，Ag特異性T細胞反應通過它們在Ag認知后暴露至膜的激活標記的差異性表達被檢測。
            
  [0265]5)細胞因子捕捉試驗:這種體系可以有效地替換ELISpot，從而形象化Ag特異性T細胞，根據他們的細胞因子反應(Miltenyi B1tec GmbH, Bergisch Gladbach, DE)。此外，其允許直接分類并克隆目標T細胞。
            
  [0266]6)0) 154試驗:該步驟被限于檢測Ag特異性OM+T細胞。參見ChattopadhyayP,等，Nat.Med.2005 ; 11:1113-11117 和 Frentsch Μ,等，Nat.Med.2005 ; 11:1118-1124。
            
  [0267]7)CD107試驗:該步驟允許形象化具有細胞因子電勢的Ag特異性CD8+T細胞。參見 Betts M,等，J.1mmunol.Methods2003 ;281:65-78。
            
  [0268]8) CFSE稀釋試驗:該步驟檢測Ag特異性T細胞(CD4+和CD8+)，根據它們在Ag認知后的增殖。參見 Mannering S，等，J.1mmunol.Methods2003 ;283:173-183。
            
  [0269]5.用于檢測并分離包膜病毒的方法
            
  [0270]存在于在包膜病毒的包膜中發現的特定神經節苷脂中的唾液酸粘附素和唾液乳糖片段之間的相互作用的識別允許通過確定它們結合至唾液酸粘附素以及通過從存在于試樣中的其它組分中分離結合至唾液酸粘附素的病毒來分離所述病毒的能力來檢測所述病毒。本發明的檢測和分離方法可以通過使用包膜的脂質標記而不是蛋白質標記來確定HIV病毒粒子。這是重要的，因為病毒蛋白質標記會在感染期間以很大的速率產生變異，從而使得沒有單獨的病毒檢測系統對檢測不同患者的病毒感染、或者從個別患者分離出病毒是有效的。因此，這種方法作為用于從試樣中檢測或分離HIV、以及分離HIV的診斷試驗是有用的。因此，在另一實施方式中，本發明涉及一種檢測試樣中包膜病毒的方法，包括:
            
  [0271](i)所述試樣與唾液酸粘附素或其功能等效變體接觸，所述功能等效變體基本上保留其結合唾液酸乳糖的能力，和
            
  [0272](ii)檢測結合至所述唾液酸粘附素或其功能等效變體的病毒。
            
  [0273]術語“功能等效變體”，當指的是唾液酸粘附素的時候，其被理解為通過修飾、插入或消除一個或多個氨基酸衍生自唾液酸粘附素的所有的多肽，提供為結合至唾液乳糖或在它們的主鏈上包含唾液乳糖的分子的功能被基本上保留。
            
  [0274]對唾液乳糖保留基本結合活性的唾液酸粘附素的功能等效變體為對唾液乳糖的親和性至少為115IT1, 114IT1, 113IT1, 112IT1, 110ITi或19IT1的那些。在另一實施方式中，適用于本發明的唾液酸粘附素的功能等效變體包括顯示至少99%、98%、97%、96%、95%、94%,93%,92%,91 %,90%,85%,80%,75%,70%,65%,60%,55%,50%,45%,40%,35%、30%或更小的天然產生的唾液酸粘附素至唾液乳糖或包含唾液乳糖的分子的結合活性的那些。
            
  [0275]唾液酸粘附素的合適的功能等效變體可以使用用于確定唾液酸粘附素至唾液乳糖或包含在表面含有唾液乳糖的神經節苷脂的神經節苷脂的細胞的結合親和力的標準試驗來確定。舉例來說，唾液酸粘附素的合適的功能等效變體可以通過使用基于固定化的唾液酸粘附素結合至人紅血球的能力的固相試驗來確定，所述人紅血球已被衍生為不同的鍵(例如 NeuAca2 - 3Galbl - 3GalNAc, NeuAca2 - 3Galbl - 3 (4)GlcNAc,或者NeuAca2 - 6Galbl - 4GlcNAc)中包含唾液酸。參見 Vinson Μ,等，J.B1l.Chem.1996 ;271:9267-9272)。作為試驗對照，可以使用未衍生的紅血球。可替換地，唾液酸粘附素的合適的功能等效變體可以通過利用固相試驗來確定，所述固相試驗基于通過包含含有聚丙烯酰胺的糖復合物(例如NeuAc α 2，3Gal β I, 4Glc或NeuAc α 2，6Gal β I, 4Glc)的唾液酸粘附素的固定化融合蛋白的結合的檢測。參見Hartnell A,等，Blood2001 ;97:288-296。
            
  [0276]功能等效變體還可以是顯示出與唾液酸粘附素具有高于至少25%、至少40%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或者至少99%的一致程度的那些。
            
  [0277]在第一步中，根據本發明的診斷方法涉及假設包含包膜病毒的試樣與唾液酸粘附素的接觸。
            
  [0278]根據本發明方法待分析的試樣包括生物學試樣，其為流體(例如血清、血液、尿、唾液、胰液、腦脊髓液、精液)以及任何流體生物學試樣(例如組織或活檢提取物、排泄物的提取物、唾液)，還可被用于本發明的試驗中。最優選地，進行試驗的生物學試樣為血清或血漿。
            
  [0279]基于結合的檢測試驗典型地涉及檢測試劑被結合至其的固相材料的使用，但是可以經調整以涉及非固定化抗原和抗體的結合(即溶液相免疫試驗)。反應產物通過從反應混合物移除固相(例如通過沖洗)來從過量試樣、試驗試劑、和其它物質中分離。由此，在優選的實施方式中，唾液酸粘附素或其功能等效變體被固定。
            
  [0280]大量不同的任意的固體載體可被用于本發明的試驗。用于固體載體的合適的材料為合成的聚合物，例如聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺或其它合成聚合物，例如為纖維素的天然聚合物，以及衍生的天然聚合物，例如醋酸纖維素或硝基纖維素，以及玻璃，特別是玻璃纖維。所述載體可以采用球形、桿形、管形以及微測定板或微滴定板的形式。例如為條形紙、小板和膜的層狀結構也是合適的。載體的表面為可滲透的并且對水溶液是不可滲透的。
            
  [0281]在優選的實施方式中，包膜病毒選自由HIV或埃博拉病毒組成的組。在又一更優選的實施方式中，HIV為HIV-1。
            
  [0282]在第二步中，根據本發明的檢測方法包括結合至所述唾液酸粘附素或其功能等效變體的包膜病毒的檢測。
            
  [0283]包膜病毒的檢測可以使用多種不同的本領域已知的技術來進行，并且包括包膜病毒基因組的檢測，并且更優選地，包膜病毒核酸的檢測(即RNA或DNA)以及包膜病毒蛋白質的檢測。檢測RNA和蛋白質表達的方法為本領域已知的，并且在上文已被大體上描述。在一個方面中，包膜病毒為HIV。在另一實施方式中，HIV的檢測通過結合抗體和一種或多種HIV蛋白質來進行。可被用于檢測的HIV的合適蛋白質包括但不限于存在于HIV包膜中的多肽(env ;例如 NCBI 參考序列 NPJ357856)，gag (例如 p6, p7, pl7, p24, GenBankAAD39400J)，pol編碼的蛋白酶(例如UniProt P03366)，nef編碼的蛋白酶(例如fenBank-CAA4I585J, Shugars, 1993，上述)。
            
  [0284]根據本發明優選的實施方式，唾液酸粘附素或其功能等效變體被結合至固體載體(即固定化)，并與測試抗HIV抗體存在的生物學試樣接觸培養。可添加阻滯劑以降低非特異性結合。
            
  [0285]將被理解的是，唾液酸粘附素或其功能等效變體可以利用生物學試樣以未結合狀態來培養，并隨后被結合至固體載體(即固定化)。所述載體隨后優選地被廣泛處理(即通過沖洗)以基本上移除非特異性結合的組分。由于這樣處理，就可以形成唾液酸粘附素或其功能等效變體和包膜病毒的復合物。
            
  [0286]可以根據本發明使用的一種類型的固相試驗為夾心試驗。在夾心試驗中，存在于固相上的標記直接與存在于試樣中的分析物含量成比例。這種類型的試驗方法通常為優選的，特別是對于低分析物濃度的可視化來說，因為標記在固相上的表觀被更加容易地檢測。
            
  [0287]可檢測到的標記抗體(能夠結合至包膜病毒的部分)隨后優選被添加，并且在足以允許抗體結合至可能存在的任意包膜病毒的條件下培養載體。載體隨后優選被廣泛處理(例如通過沖洗)以基本上移除任意未結合的抗體。如果包膜病毒存在于測試試樣，那么抗體和包膜病毒將形成免疫復合物。在這樣的試驗中，結合至載體的抗體的檢測為指示包膜病毒在所測試的試樣中存在。參見Schuurs A,等，US4，016，043以及Pankratz T,等，US5，876，935。抗體可以是從非人類物種(例如抗人IgG鼠源抗體、抗人IgG山羊抗體、抗人IgM山羊抗體)中分離的天然免疫球蛋白，或者其可以重組地或者合成地制備。其可以是完整的免疫球蛋白或者免疫球蛋白片段(例如FAb，F(Ab)2)。根據需要，其它的結合分子(能夠結合至包膜病毒)可被應用為與這樣的抗體相一致或者代替這樣的抗體。例如，抗體可以是生物素化的，并且第二抗體可以被標記的抗生物素蛋白或鏈霉親和素替代。
            
  [0288]為了消除束縛-自由分離步驟并減少化學結合試驗需要的時間和設備，均勻的試驗方法可被替換地采用。在這樣的試驗中，成對結合的一種組分還可被固定；然而，成對結合的第二組分的存在被檢測到，無需束縛-自由分離。均勻的光學方法的例子為EMIT方法(Syva, Inc.，Sunnyvale, CA, US)，其通過檢測熒光淬滅來進行；激光濁度測定乳膠粒子凝集方法(Behringwerke GmbH, Marburg, DE),通過檢測光散射的變化來進行；LPIA乳膠粒子凝集法(Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, JP) ;TDX 突光去極化法(AbbottLaboratories, Inc., Abbott Park, IL, US);以及突光能量轉移法(CisB1 Internat1nalSA, Paris, FR)。任意這樣的試驗可以適合用于根據本發明的目的。
            
  [0289]本發明的結合試驗可被構建為競爭試驗。在競爭試驗中，存在于測試試樣中的包膜病毒濃度越高，存在于固相上的標記量越低。
            
  [0290]在類似于夾心試驗的方式中，競爭試驗可以通過提供適量的標記包膜病毒并確定所測試的流體是否包含相同類型的包膜病毒來進行，所述包膜病毒將與用于結合至載體的標記抗體相競爭。在這樣的競爭試驗中，捕捉的標記包膜病毒的量與存在于測試試樣中的分析物的量成反比。
            
  [0291]在所有這樣的試驗方法中，試驗試劑的至少一種組分將優選被標記或者通過光的演化或猝滅被檢測。這樣的組分可以是第二抗體、抗HIV抗體、或者結合至抗HIV抗體的肽，根據所采用的免疫試驗方法。放射性同位素結合試驗方法(例如放射性免疫試驗)采用放射性同位元素作為這樣的標記；信號可以通過光的演化被檢測，在存在熒光或者熒光基團的情況下。參見Lucas F，等，US5, 698，411和Landrum E,等，US5, 976，822。酶結合試驗方法(例如ELISA)采用酶作為標記；信號可以通過顏色或光的演化被檢測，在存在顯色或熒光基團的情況下。其它標記，例如順磁標記，用作有色粒子、乳膠粒子、例如硒和金的膠體金屬、以及染料粒子的材料，也可被采用。參見Leuvering J, US4, 313，734，Gribnau T,等，US4, 373，932，和Baugher B,等，US5, 501，985。酶(特別是堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶或脲酶)作為可檢測標記(即酶免疫試驗或EM)的使用為優選的。
            
  [0292]酶標記的存在可以通過使用顯色底物(包括散發或吸收熒光、UV、可見光的那些)來檢測，其通過酶標記響應催化作用。當酶為堿性磷酸酶的時候，底物可以包括化學發光底物，例如AMPro? (3-(2'-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1，2- 二氧環乙燒),(DP-star? ( _■納4-氣-3-(甲氧基螺{1，2- _■氧環乙燒-3，2’ - (5’ _氣)二環[3.3.1.13’7]癸烷}-4-基)苯基磷酸酯)和csro? (二鈉3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧環乙烷-3，2-(5’_氯)三環[3.3.1.13’7]癸烷}-4_基)苯基磷酸酯)；顯色底物，例如對硝基苯基磷酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯(BCIP)，4-氯化硝基四氮唑藍(NBT)和碘硝基四唑(INT)。
            
  [0293]更優選地，可采用化學標記(例如膠體金、乳膠珠標記)。標記的檢測可以使用多個檢測器、多通道濾波器、光柵或者不同的熒光光譜來完成。參見Ward D,等.，”5，759，781。特別優選的是采用過氧化酶作為酶標記，特別是相應于顯色底物3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)，OPD或ABTS。在將過氧化酶標記抗體用作酶的情況中，能夠使用高碘酸鹽技術或者異雙功能試劑。參見Nakane P,等，J.Histochem.Cytochem.1974 ;22:1084-1090 和 Ishikawa E,等，J.1mmunoassay.1983 ；49 (3):209-327。
            
  [0294]用于本發明試驗的材料可理想地用于制備試劑盒。這樣的試劑盒可以包含一個或多個容器部件，例如瓶或者管；每個容器部件包含一個進行試驗測試時使用的分離元素。例如，一個容器部件可以包含唾液酸粘附素或其功能等效變體，第二容器可以包含可溶的、可檢測的標記的抗包膜病毒，優選為凍干的形式，或者為溶液的形式。此外，所述試劑盒還可以包含一個或多個容器，每個容器包含(不同的)預定量的包膜病毒或包含神經節苷脂的脂質微粒，所述的神經節苷脂包含唾液乳糖部分。這些在后的容器可被用于制備標準曲線，可以插入至標準曲線中，從包含未知量的包膜病毒的試樣獲得結果。
            
  [0295]在使用試劑盒時，使用者僅需要向容器中添加預測定量的疑似試樣，所述疑似試樣包含可測定的未知量的包膜病毒，預測定量的可檢測標記的抗體存在于第二容器中。在培養適當時間之后，免疫復合物形成(如果試樣包含包膜病毒)并從上層清液中分離，并且免疫復合物或上層清液流體通過放射性計數、添加酶基底和顏色演化，或者通過包含化學標記(例如膠體金、乳膠珠)被檢測。
            
  [0296]在另一實施方式中，本發明提供了一種從試樣中分離包膜病毒的方法，包括:
            
  [0297](i)使所述試樣與唾液酸粘附素或其功能等效變體接觸，所述功能等效變體基本上保留其結合唾液乳糖的能力，和
            
  [0298](ii)分離結合至所述唾液酸粘附素或其功能等效變體的病毒。
            
  [0299]在優選實施方式中，唾液酸粘附素或其功能等效變體可被結合至基質并用于包膜病毒的親和性純化，例如從細胞培養基或例如為血液和肝臟的生物組織。唾液酸粘附素或其功能等效變體例如可被粘附或固定至底物或載體上。包含包膜病毒決定子的溶液隨后與固定的唾液酸粘附素在適于形成唾液酸粘附素和包膜病毒的復合物的條件下接觸一定的時間。在接觸步驟期間所使用的條件被控制(例如通過PH或鹽濃度，即溶液中的離子強度)。應當注意不能超過唾液酸粘附素或其變體的用量(即流動應當足夠緩慢以獲得符合要求的吸附)。在該步驟中，溶液的其它組分基本上暢通無阻地穿過。任選地，基體隨后被沖洗(例如利用水溶液)，從而移除殘留的或松散結合的物質。
            
  [0300]在接下來的步驟中，未結合的材料從結合的復合物中分離。包膜病毒隨后從載體分離。所述分離(即洗脫)通常使用表示為洗脫液的第二溶液來進行，所述洗脫液在提供解吸附的條件下經過基質(即從唾液酸粘附素或其變體釋放HIV)。這樣的條件通常由pH或鹽濃度(例如離子強度、疏水性)的變化來提供。已知不同的洗脫方案，例如梯度洗脫液和分步進行洗脫液。洗脫液還可以通過包含競爭物質的第二溶液來提供，所述競爭物質將替代基質上的HIV。
            
  [0301]在優選實施方式中，包膜病毒選自由HIV或埃博拉病毒組成的組。在又一更優選的實施方式中，HIV為HIV-1。
            
  [0302]在另一實施方式中，本發明提供一種包含固定化的唾液酸粘附素或其功能等效變體的試劑盒，所述功能等效變體基本上保留了結合唾液乳糖的能力。固定化的唾液酸粘附素或其功能等效變體對于檢測試樣中的包膜病毒以及分離包膜病毒是有用的。
            
  [0303]唾液酸粘附素被結合至其的載體例如可以是單獨微粒的形式，優選為多孔的并且基本上為球形的微粒；整料的形式；或者膜的形式。本發明還包括的是適用于進行親和色譜分析法的體系，其包含使用如上定義的分離基質柱。所述柱體的尺寸可以是適于分析規模或者適于大規模的色譜分析法的。
            
  [0304]合適的載體材料為已知的。在一種實施方式中，所述載體為天然聚合物(例如瓊脂糖、藻酸鹽、角叉菜膠、膠質)。這樣的天然聚合物被已知為用于在冷卻或添加二價金屬離子的時候自發地形成物理交聯的網絡，并且如果需要可以添加化學交聯試劑。這些載體為根據標準方法容易制備的，例如反向懸浮膠凝。參見Hjerten S，B1chim.B1phys.Actal964 ;79 (2): 393-398。在另一實施方式中，所述載體由交聯的合成聚合物(例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基胺)組成。這樣的聚合物也是根據標準方法容易制備的。參見Arshady R, Chimica eL’ lndustrial988 ；70(9):70_75。由此，總的來說，載體材料基本上可以是任何材料，所述任何材料允許gpl20結合本發明的化合物的共價結合(例如如上所討論的聚合物、無機材料、例如硅石、陶瓷)。
            
  [0305]多種已知的方法對于通過合適的功能基將配體固定至載體都是可行的。結合方法的精確選擇將根據被固定配體的結構。在一種實施方式中，所述載體具有親水性表面，并且如果是多孔的話，孔的表面也為親水性的。這對于避免或者至少是減少任何非特異性的蛋白質的相互作用是有利的。如果表面具有用于結合配體的高密度基團，那么其也為有利的。這樣的結合基團通常為羥基、但是還包括其它的自由基，例如具有適用于移植的雙鍵的基團，胺，硫醇或環氧化物。如果載體材料具有不期望的表面特性，那么可以在結合配體之前對其涂覆親水性多羥基功能材料。用于結合親和性配體至合適載體來制備分離基質的技術和構思為本領域已知的。參見Berg H,等，W01998033572。
            
  [0306]6.本發明的軛合物
            
  [0307]唾液酸粘附素作為用于存在于在包膜病毒的薄膜中發現的神經節苷脂中的唾液乳糖殘基的特異性配體的識別，允許通過結合所述化合物至唾液酸粘附素來使用這種分子來靶向目標化合物的包膜病毒。唾液酸粘附素或其功能等效變體還可被連接(即直接地或者通過間隔分子)至治療藥物或染料、熒光分子、診斷酶或放射性同位素標記的實體以能夠識別包膜病毒或者治療性地靶向包膜病毒。
            
  [0308]由此，在另一實施方式中，本發明涉及一種包含唾液酸粘附素或基本上保留其結合唾液乳糖能力的功能等效變體的軛合物和治療劑。
            
  [0309]在優選實施方式中，治療劑為抗HIV試劑。在另一優選的實施方式中，抗HIV試劑選自由進入和融合抑制劑、整合酶抑制劑、反轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑組成的組。
            
  [0310]本發明的軛合物可以使用任何本領域技術人員已知的方法來獲得。由此能夠通過任何標準方法來獲得唾液酸粘附素或所述蛋白質的變體。例如，唾液酸粘附素可以通過從細胞提純來獲得，其中多肽為天然存在的(例如巨噬細胞)或者通過重組的方式由cDNA通過在不同有機體中表達來產生,例如大腸桿菌(Escherichia coli),釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或畢赤酵母(Pichia pastoris)。一旦提供足夠量的提純的唾液酸粘附素或其功能等效變體，后者就必須被結合至目標化合物。結合可以通過不同的方式實現。一種可能性為在不會干擾所述組分活性的位置直接結合功能基團至目標試劑。在本發明中應當理解的是，功能基團指的是用于所述分子特有的化學反應的分子中特定原子的基團。功能基團的例子包括但不限于羥基、醛、烷基、烯基、炔基、氨基化合物、氨甲酰、伯、仲、叔和季胺、氨氧基、疊氮化物、含氮的(二酰亞胺)、芐基、碳酸酯、酯、醚、乙醛酰、鹵代烷基、齒代甲酰基、亞胺、酰亞胺、酮、馬來酰亞胺、異腈、異氰酸酯、碳酰基、硝酸鹽、亞硝酸鹽、硝基、亞硝基、過氧化物、苯基、磷化氫、磷酸酯、膦酰、吡啶基、硫化物、磺酰基、亞硫酰基、硫酯、硫醇和氧化3，4-二羥基苯基丙胺酸(DOPA)基團。所述基團的例子為馬來酰亞胺或乙醛酰基團，其特別地與ApoA分子中的硫醇基團反應，以及氧化的3，4- 二羥基苯基丙胺酸(DOPA)基團，其與EDA分子中的伯胺基團反應。
            
  [0311]另外的可能性為通過使用相同的或不同的雙功能基團結合治療劑至唾液酸粘附素或其功能等效變體。雙功能基團可首先被結合至治療活性化合物，并且隨后被結合至唾液酸粘附素，或者可替換地，其能夠結合結合雙功能基團至唾液酸粘附素，并隨后結合后者至治療劑。這種類型的軛合物的示例性的例子包括已知為酮-肟的軛合物，其中軛合物的第一組分包含氨氧基基團，其被結合至存在于異雙功能基中的酮基，酮基反過來被結合至軛合物的第二組分中的氨基。參見Lam K,等，US20050255042。
            
  [0312]在另一實施方式中，用于結合唾液酸粘附素和治療劑的試劑可被光分解、化學、熱或者酶處理。特別地，可以通過酶而被水解的結合試劑可被用于目標細胞，從而使得治療活性化合物僅被釋放至細胞中。參見McCall J,等，WO 2004054622, Chien H,等，WO2006107617，Chan C，等，W02007046893 和 Govindan S，WO 2007112193。
            
  [0313]在優選實施方式中，其中治療活性化合物為包括寡肽、肽和蛋白質的肽性質化合物，能夠使用本領域技術人員已知的方法化學修飾多肽鏈，從而使得蛋白質可被共價連接至第二多肽。由此，用于共價連接兩個多肽的合適的方法包括基于通過存在于半胱氨酸片段中的硫醇基團結合的方法，基于通過存在于賴氨酸片段中的伯胺基團結合的方法，基于通過N-和C-端片段結合的方法可被使用。參見Morseman J,等，US 6,809,186。適用于修飾多肽的試劑允許它們結合至其它的化合物，包括:戊二醛(即允許結合化合物至多肽的N端)，碳二亞胺(即允許結合化合物至多肽的C端)，琥珀酰亞胺酯(例如MBS，SMCC)其允許激活N端和半胱氨酸片段，對二氨基聯苯(BDB)，其允許激活酪氨酸片段，和高碘酸鹽，其允許激活被糖基化的那些蛋白質中的碳水化合物部分。
            
  [0314]在治療活性化合物為肽性質的特定情況中，能夠在單獨的步驟中表達軛合物，使用本發明的基因構建編碼所述軛合物，所述構建在適用于其在不同的有機體中與轉錄以及任選地翻譯控制元素一起表達的載體中被引入。存在于本發明的表達盒中的轉錄以及任選地翻譯控制元素包括啟動子，其導引它們被有效連接的核苷序列以及必須或適用于轉錄的其它序列的轉錄，并且其在合適的時間和位置調節，例如啟動和終止信號、切割位置、多腺苷酸化信號、復制源、轉錄增強劑或者轉錄靜默劑。所述的元素以及用于構建表達盒的載體和根據本發明的重組載體通常根據所使用的宿主細胞來選擇。
            
  [0315]本發明的組合物可被施加至待治療的哺乳動物(包括人)，通過本領域已知的任意方式(例如口服、鼻內、皮下、肌肉、皮內、靜脈注射、動脈注射、非腸道或導管插入給藥)。
            
  [0316]本發明進一步涉及包含唾液酸粘附素或其功能等效變體的組合物的應用，所述組合物作為載體用于祀向一種或多種病毒抑制劑以提供對病毒感染、優選對HIV/AIDS病毒感染的協同作用。在本實施方式框架內，病毒抑制劑選自由進入和融合抑制劑、整合酶抑制齊U、反轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑組成的組。
            
  [0317]更通用地，本發明涉及唾液酸粘附素和常規使用的合適的可檢測標記的軛合物，所述可檢測標記例如熒光標記、發光標記、化學發光標記、酶標記、放射性標記或吸光率標記。
            
  [0318]本發明的軛合物可被施加至需要其的個體，用于治療或預防與由包膜病毒感染相關的疾病。因此，在另一方面中，本發明涉及根據本發明的軛合物，用于治療由包膜病毒感染導致的疾病。
            
  [0319]另一方面，本發明涉及根據本發明的軛合物的使用，用于制備用于治療由包膜病毒感染導致的疾病的藥劑。
            
  [0320]另一方面，本發明涉及一種用于在需要其的個體中治療由包膜病毒感染導致的疾病的方法,包括給所述個體施加根據本發明的軛合物。
            
  [0321]在優選實施方式中，由包膜病毒感染導致的疾病選自由通過絲狀病毒科的病毒導致的疾病以及通過逆轉錄酶病毒導致的疾病組成的組。
            
  [0322]在優選實施方式中，包膜病毒為HIV，在這種情況中，軛合物被用于治療與HIV感染相關的疾病。
            
  [0323]7.傳遞目標化合物至抗原呈遞細胞的方法
            
  [0324]在另一實施方式中，本發明涉及一種傳遞目標化合物至抗原呈遞細胞的方法，其包括所述的抗原呈遞細胞與包含所述化合物的脂質微泡接觸，并且其中所述脂質顆粒包含至少包含唾液乳糖部分的分子。
            
  [0325]使用本發明的方法而被傳遞至抗原呈遞細胞的化合物包括但不限于:
            
  [0326]I)抗原。合適的抗原包括一種或多種如上所述的病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、過敏原或環境抗原、或者腫瘤抗原。
            
  [0327]2)如上所述的抗逆轉錄病毒劑。優選地，抗逆轉錄病毒劑選自由進入和融合抑制齊U、整合酶抑制劑、反轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑組成的組。
            
  [0328]3)核酸(例如雙鏈RNA、免疫刺激寡核苷酸、質粒、反義和核酶)。
            
  [0329]4)放射性同位素，例如1251，1311，IllIn, 1231，99mTc和32P。這樣的組合物例如對治療患有自體免疫疾病的個體是有用的，所述自體免疫疾病具有異常的樹突細胞活性。樹突細胞通過毒素的消除可以減輕自體免疫疾病(例如多發性硬化癥、風濕性關節炎、自體免疫疾病)。
            
  [0330]5)酶活性毒素及其片段，例如白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(源自綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)),篤麻毒素A鏈，相思豆毒素A鏈，蒴蓮根毒素A鏈，α八疊球菌，Aleurites fordii蛋白質，石竹素蛋白質，Phytolaccaamericana 蛋白質(PAPI, PAPII 和 PAP-S)，Momordica charantia 抑制劑，毒蛋白，巴?毒素，Sapaonaria officinalis抑制劑，白樹毒素，分裂素，局限曲菌素，酹霉素，伊諾霉素，和單端孢霉烯族化合物。這樣的組合物對例如治療患有自體免疫疾病的個體是有用的，所述自體免疫疾病具有異常的樹突細胞活性。樹突細胞通過毒素的消除可以減輕自體免疫疾病(例如多發性硬化癥、風濕性關節炎)。
            
  [0331]6)免疫抑制藥物，例如特定的糖皮質激素(例如地塞米松、他克莫司、環孢霉素A)，其通過抑制協同刺激分子(即⑶80和⑶86)的表達和發炎細胞因子(即IL-6和TNF- α )的分泌而抑制DC的成熟和同種異體刺激能力。
            
  [0332]7)具有可檢測基團的化合物。所述的可檢測基團可以是任何具有可檢測物理或化學特性的材料，像光譜的、光化學的、生物化學的、免疫化學的、電的、光的或化學方法。本發明中有用的標記包括熒光染料(例如異硫氰酸熒光素、Alexa染料、德克薩斯紅(Texasred)、玫瑰精)，放射性同位素標記和例如為膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠)珠的量熱標記。
            
  [0333]在優選的實施方式中，目標化合物為抗原。第二方面，化合物為抗逆轉錄酶病毒試齊U。優選地，化合物為抗原。
            
  [0334]適用于制備脂質體的試劑包括但不限于磷脂質。所述脂質體可以包含甘油磷脂、神經鞘脂或其組合。
            
  [0335]適用于制備根據本發明的脂質體的甘油磷脂包括但不限于:
            
  [0336]I)包含不飽和脂肪酸的甘油磷脂，例如二硬脂酰-磷脂酰甘油(DSPG)，I, 2_ 二硬脂酰-s/z-丙三基-3-膽堿磷酸(DSPC)，二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)，磷脂酰甘油(PC)，磷脂酸(PA),和/或磷脂酰甘油(PG)，
            
  [0337]2)包含飽和脂肪酸的甘油磷脂，例如二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC)，二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)，和二棕櫚酰磷脂酰甘油(DMPG)，也可用于脂質體制備，和
            
  [0338]3)包含飽和和不飽和脂質的甘油磷脂，例如1-棕櫚酰-2-油酰-sn-丙三基-3-膽堿磷酸(POPC)和1，2- 二棕櫚酰-Sn-丙三基-3-膽堿磷酸(DPPC)。
            
  [0339]適用于制備根據本發明的脂質體的神經鞘脂包括但不限于神經鞘磷脂。
            
  [0340]當陽離子脂質體為優選的時候，十八烷胺可被使用，并且當需要陽離子脂質體為的時候，天然的酸性脂質，例如磷脂酰絲氨酸(PS)、PG、磷脂酰肌醇(PI)、PA和心磷脂(CL)可被添加。在某些實施方式中，可以包括膽固醇來穩定脂質體雙層。當使用多元未飽和的中性脂質的時候，可以包括少量的抗氧劑，包括但不限于α -生育酚或β -羥基甲苯胺(BHT)。
            
  [0341]脂質體大小范圍為20納米至大于1000納米。據此，脂質體可以是20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、lOOnm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、950nm，或 lOOOnm。在不例性的實施方式中,脂質體可以是10nm至200nm。脂質體的大小可以通過例如超聲波降解和過濾的方法來控制。脂質體為多樣化的并且可被形成為不同的大小和脂質組合物。參見 Basu S，Basu M,Liposome methods and protocols, methods in molecular b1logy,第 199 卷，“Liposome Technology，，，第三版，Gregoriadis G, Ed.(Informa HealthCareInc.，New York, NY, US, 2006)。
            
  [0342]將被理解的是，不同組分的比值可以根據需要來調節。在優選的實施方式中，除了包含唾液乳糖部分的分子，脂質體還包含甘油糖脂、膽固醇和神經鞘磷脂。
            
  [0343]在優選的實施方式中，甘油糖脂與膽固醇的比值為41/45。在優選的實施方式中，甘油糖脂與神經鞘脂(優選為神經鞘磷脂)的比值為41/10。在另一實施方式中，膽固醇與神經鞘脂的比值為9/2 (w/w)。
            
  [0344]在優選的實施方式中，甘油脂質為1-棕櫚酰-2-油酰-sn-丙三基_3_膽堿磷酸(POPC)，1，2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-膽堿磷酸(DPPC)或其組合。在又一更優選的實施方式中，脂質體包含25/16的POPC比DPPC。在另一實施方式中，脂質體包含25mol %的P0PC、16mol%的DPPC、45mol%的膽固醇和余量的神經鞘磷脂，其總共達到10mol %。在優選的實施方式中，脂質體包含4%神經節苷脂，其中神經鞘磷脂含量為10%。
            
  [0345]適用于在本發明中使用的神經節苷脂包括任何包含唾液乳糖殘基和少于四個唾液酸殘基的神經節苷脂。在優選的實施方式中，包含唾液乳糖片段的分子為包含少于四個唾液酸基團的神經節苷脂。在更優選的實施方式中，神經節苷脂為如在表I中所示的。在又一更優選的實施方式中，神經節苷脂選自由GM1，GM2, GM3,⑶Ib和GTlb組成的組。
            
  [0346]脂質體的核心為水性的并且可被用于保持將被傳遞至抗原呈遞細胞的化合物。在優選的實施方式中，所述化合物為抗原多肽，例如病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原、過敏原或環境抗原、分化抗原或腫瘤抗原的免疫原片段。在更優選的實施方式中，抗原為病毒抗原。在又一更優選的實施方式中，抗原為HIV抗原。
            
  [0347]在優選的實施方式中，抗原呈遞細胞為唾液酸粘附素表達細胞。在更優選的實施方式中，抗原呈遞細胞為樹突細胞。
            
  [0348]在一種實施方式中，在這里描述的方法被用于間接體內療法的治療。例如，包含目標化合物并且其中所述的脂質微粒包含至少一個含有唾液乳糖部分的分子的脂質微泡可以與免疫細胞(例如唾液酸粘附素表達細胞，并且更優選地為樹突細胞)在體外接觸，從而使得化合物通過細胞而被攝取。所述細胞隨后被轉移至患者(例如通過注射)以治療疾病(例如癌癥或者自體免疫疾病)。在一種實施方式中，免疫細胞(例如樹突細胞)從患者提取，與包含目標化合物的脂質微泡接觸，從而使得試劑被攝取至細胞內。
            
  [0349]可替換地，包含目標化合物的脂質微泡還可被用于在體內將化合物傳遞至細胞，使用本領域技術人員已知的方法。對于體內施加來說，脂質微泡典型地通過非腸道(即通過關節內、靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉或皮下，例如通過植入裝置)施加。在特別的實施方式中，藥物組合物可以通過快速濃注被靜脈注射給藥地或者腹膜內給藥。參見StadlerJ,等，US5, 286，634。細胞內核酸傳遞的方法也是本領域已知的。參見Straubringer K,等，“Methods in Enzymology”(Academic Press, New York, NY, US, 1983,第 512-527頁)，Mannino R,等，B1techniquesl988 ;6:682-690，Nicolau C,等，Crit.Rev.Ther.DrugCarrier Syst.1989;6:239-271。給予脂質基治療的其它方法也被在先描述。參見RahmanY,等，US3, 993，754，Sears B, US4, 145，410，Schneider S，US4, 224，179，Papahadjopoulos
            
  D,等，US4, 235，871，Lenk R,等，US4, 522，803，和 Fountain Μ,等，US4, 588，578。
            
  [0350]在另一實施方式中，包含目標化合物的脂質微泡還可被用于在體外傳遞化合物至細胞。
            
  [0351]在上文提及的所有公開物均通過引用而被納入本發明中。
            
  [0352]現在已經在大體上描述了本發明，通過參考以下的實施例其將更加容易地理解，其通過說明的方式被提供，并非限制本發明，除非另有所指。
            
  [0353]通用步驟
            
  [0354]1.HIV-1的分離和質譜分析
            
  [0355]利用HIV-1NL4_3感染MT-4細胞并與未感染的細胞共同培養。在觀察到細胞病變作用之前，收集并提純病毒。參見Lorizate，2009，上述。簡單地說，介質通過過濾被凈化，顆粒通過超速離心通過20% (w/w)蔗糖的軟墊而被濃縮。濃縮的HIV-1通過速度梯度離心以OptiPrep? 梯度被進一步提純(Axis-Shield PoC, Oslo, NO) ?
            
  [0356]收集可視的病毒組分并通過離心濃縮。最終的小球重新懸浮于1mM Hepes, 150mMNaCl (pH7.4)緩沖溶液中，在液氮中快速冷凍并在_80°C下存儲。為了進行脂質組合物分析，試樣一旦融化而被重新懸浮于甲醇中，并隨后在結合至具有電噴霧電離接口的正交加速飛行時間質譜儀的UPLC中評價(LCT Premier ；ffaters Corp.，Milford, MA, US)。使用正離子模式獲得數據，在W模式中的質量范圍為50 - 1500m/z。0.15s的掃描時間和0.0ls的中間掃描延遲在11500 (FWHM)的標稱儀器分辨率下使用。亮氨酸-腦啡肽被用作為鎖定噴霧校準。
            
  [0357]2.原代細胞培養
            
  [0358]外周血單核細胞(PBMC)由HIV-1血清反應陰性的個體獲得，并且單核細胞群體(>97% CD14.)利用 CD14+陽性選擇磁珠(Miltenyi B1tec GmbH, Bergisch Gladbach, DE)來分離。DC在存在l，000U/ml的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL_4(R&D)的情況下培養這些細胞而獲得。mDC通過在存在100ng/ml的脂多糖(LPS ；Sigma-AldrichC0.，Saint Louis, MO, US)額外的兩天的情況下在培養iDC第五天時分化。如上所述,DC在第七天免疫表型。參見Izquierdo-Useros, 2007,上述。由單核細胞至iDC的充分分化基于⑶14的減少和DC-SIGN的獲得，同時DC成熟化上調⑶83，⑶86和HLA-DR的表達。
            
  [0359]外周血單核細胞(PBMC)由HIV-1血清反應陰性的供體獲得，并且單核細胞群體或骨髓 DC 根據在 Izquierdo-Useros N.等.(J Virol., 2007, 81:7559 - 7570)中所描述的來分離并培養。單核細胞衍生的成熟DC利用100ng/ml的LPS(Sigma-Aldrich)或 ITIP(CellGenix 的 300IU/ml IL-1β , I, 000IU/ml IL-6, I, OOOIU/ml TNF-α 和Sigma-Aldrich 的 I μ g/ml PGE2)分化 48 小時。LPS 骨髓 DC 利用 100ng/ml 的 LPS 分化 24小時。自體同源的和異體的CD4+T細胞使用RossetteS印a -CD8+混合物(干細胞)而由PBMC富集，并利用補充有10IU/ml的IL-2 (Roche)的10%胎牛血清(FBS, Invitrogen)而保持在RPMl中。
            
  [0360]3.細胞系、質粒和病毒源
            
  [0361]HEK-293T 細胞系被保持在 D-MEM 介質(Invitrogen Corp., Carslbad, CA, US)中，同時CHO和MT4細胞系被分別保持在a-MEM和RPMI介質中。所有介質包含10%胎牛血清、100U/ml 的青霉素和 10 μ g/ml 的鏈霉素(Invitrogen Corp., Carslbad, CA, US) ?VLPHIV_Gag_eGFP 通過轉染分子克隆 pGag-eGFP (NIH AIDS Research and ReferenceReagent Program, NIH, Bethesda, MD, US)獲得。HEK-293T 細胞利用磷酸鈣(CalPhos ；BDB1sciences Corp., Franklin Lakes, NJ, US)在 T75 燒瓶中使用 30 μ g 的質粒 DNA 來轉染。CHO細胞使用7xl06細胞和40 μ g的質粒DNA被電穿孔(0.24Kv和950 μ F)。包含VLP的上清液被過濾(Millex HV, 0.45 μ m ；MiIlipore Corp., Billerica, MA, US)并在-80°C下冷凍直至使用。對于利用濃縮VLP的研究，收集培養基，通過過濾凈化，并且顆粒通過20% (w/w)蔗糖超速離心(28，000rpm、2小時、4°C、在SW32轉子中)被濃縮。最終的小球被再次懸浮于150mM NaCl, 1mM Hepes ρΗ7.4 Ofepes-鈉緩沖溶液)，在液氮中迅速冷凍并在_80°C下存儲。受感染的病毒源和VLPHIV_eag_eeFP的p24Gag含量通過ELISA(PerkinElmerInc.,Waltham, MA, US)和定量蛋白質印跡來確定。檢測利用aLiCoR Odyssey系統來實施，其采用內部研發的兔抗衣殼PAb和提純的Gag蛋白作為標準。
            
  [0362]HEK-293T和TZM-bl (通過美國國立衛生研究院[NIH]艾滋病研究和參考試劑計劃，由 JC Kappes, X Wu,和 Tranzyme Inc.獲得)被保持在 D-MEM(Invitrogen)中。Raji B細胞系(由Y.van Kooyk提供)在RPMI (Invitrogen)中培養。Raji DC-SIGN B細胞系(由Y.van Kooyk提供)被保持在具有lmg/ml G418 (Invitrogen)的RPMI中。所有培養基包含10% FBS, 100IU/ml 的青霉素，和 100 μ g/ml 的鏈霉素(均來自 Invitrogen)。VLPHIV_Gag_eGFP和 VLPHIV_Gag_Gherry 如上所述地獲得(Izquierdo-Useros N.等.Bloodll3:2732 - 2741)。HIVNl4-3 在分子克隆 PNL4_3 (M.Martin 的 NIH AIDS Research and Reference ReagentProgram)的轉染之后獲得。HIVNM_3_chOTy在pCHIV和pCHIV mCherry以1:1的比值共轉染之后獲得(Lampe M.等.Virology360:92?104)。缺乏包膜糖蛋白的HIVNM_3如在別處所描述地獲得(Izquierdo-Useros N.等.上述)。病毒源和VLP的p24Gag含量通過 ELISA(Perkin-Elmer)或定量蛋白質印跡來確定(Izquierdo-Useros N.等.PLoSB1ll0:el001315.do1:10.1371/journal, pb1.1001315)。在感染試驗中使用的 HIVNM_3 采用TZM-bl受體細胞系來滴定，根據在(Li M.等，2005，J.Virol.79:10108 - 10125)中描述的。
            
  [0363]4.脂質體的制備
            
  [0364]根據以下在先描述的擠出方法來制備大的單層囊泡(LUV)。參見Mayer L,等,Vesicles B1chim.B1phys.Actal986 ；858:161-168。脂質和神經節苷脂為市售的(Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL, US ；Santa Cruz B1technology, Inc., SantaCruz, CA, US)。LUVHIV_tIted脂質組合物為:1_掠櫚酸_2_油酸_sn_丙二基-3_膽喊憐酸(POPC) 25mol %:1,2- 二棕櫚酰-sn-丙三基_3_膽堿磷酸(DPPC) 16mol %:腦神經鞘磷脂(SM) 14mol %:膽固醇(Chol) 4511101%并且當Cer, PS或神經節苷脂存在(411101% )的時候，SM量被降低至1mol %。LUVPQrc_tKed脂質組合物為96mol % POPC,包含或不包含4mol %的Cer, GM3、GM2或GMl。所有的LUV包含2mol %的1，2- 二(十六酰)-sn-丙三基_3_磷脂酰乙醇胺(DHPE)-德克薩斯紅(分子探針；Invitrogen Corp.，Carslbad, CA, US)。脂質在氯仿:甲醇(2:1)中混合并在氮氣下干燥。痕量的有機溶劑通過真空泵移除I至2小時。然后，干燥的脂質膜被分散在1mM Hepes, 150mM NaCl (pH7.4)中并在通過具有10nm孔徑的兩疊聚碳酸酯膜(Nucleopore, Inc., Pleasanton, CA, US)使用熱管擠出機(Lipex擠出機！Northern Lipids, Inc.，Burnaby, CA)擠出10次之后經歷10個凍融循環。為了利用顯示類似熒光強度的等濃度LUV進行mDC脈沖，包含LUV的德克薩斯紅濃度在Bottcher磷酸鹽確定方法之后被定量，并且在SLM Aminco系列2分光突光計(Spectronic InstrumentsInc.，Rochester, NY, US)中在580nm下記錄設定激發的突光發射光譜。參見Bottcher C，等，Anal.Chimica Actal961 ;24:203-204。
            
  [0365]5.脂質體和VLP捕捉試驗
            
  [0366]所有的捕捉試驗以ΙΟΟμΜ特有的LUVtlted配方和和通過蛋白質印跡定量(2，500pg 的 VLPHIV_Gag_eGFP p24Gag，由 ELISA 確定)的 75ngVLP肌ag_eGFPGag 每 2xl05 細胞的恒定速率在37°C下平行進行脈沖mDC4小時。在大量沖洗之后，陽性DC通過具有FACSCalibur (B1sciences Corp., Franklin Lakes, NJ, US)的 FACS 使用 CellQuest 軟件(Becton Dickinson C0., Franklin Lakes, NJ, US)獲得，以分析所收集到的數據。前角和側向散射光門被用于從所有分析中排除凋亡細胞和碎片。
            
  [0367]完成競爭試驗，利用75ng的VLPHIV_eag_e(；FPGag以IxlO6細胞/ml的最終濃度在37°C下培養2xl05mDC4小時，在存在降低量的包含GM2的LUVHIV_tKed或100 μ M包含Cer-和PS-的LUVHIV_tEed的情況下。可替換地，細胞利用75ng的VLPHIV_Gag_e(；FP Gag和100 μ M包括或不包括GMl、⑶lb、GTlb, GQlb, Cer和PS的LUVHIV_tKed培養。隨后通過如上所述的FACS分析細胞。
            
  [0368]6.VLP和LUV的神經氨酸酶處理
            
  [0369]總共2x105DC在37 °C下利用25 μ M包含GM3的LUVHIV_tEed和75ng蔗糖-丸狀vLPHIV-Gag-eGFP Gag (其在 37?下利用 100 或 50mU 源自 Clostridium perfringens 的神經氨酸酶(Factor X Sigma-Aldrich C0., Saint Louis, MO, US)處理 12 小時或不處理)脈沖 2小時。12 小時培養在涂覆玻璃的板(SM1-LabHut Ltd., Churcham, Gloucestershire, GB)上在!fepes-鈉緩沖溶液中完成，并且反應通過添加包含FCS的RPMI培養基而停止。沖洗細胞并通過FACS評估來獲得tRed和eGFP陽性細胞的百分比。
            
  [0370]7.mDC的乳糖和GM3極性端基處理
            
  [0371]使用或不使用5 或 1mM 的乳糖(Sigma-Aldrich C0., Saint Louis, MO, US)以及可溶的GM3碳水化合物端基(Carbosynth Ltd., Compton, Berkshire, GB)在室溫下預培養mDC30分鐘。細胞隨后利用50 μ M包含GM3的LUVHIV_tKed和75ng蔗糖-丸狀VLPHIV_Gag_e(；FPGag在37°C下脈沖2小時，用于化合物試驗的最終濃度為5或10mM。通過如上所述的FACS分析細胞。
            
  [0372]8.最小化神經節苷脂能量結構和統計學分析
            
  [0373]使用Chem3D Ultra 軟件(CambridgeSoft Corp.，Cambridge, MA, US)來計算在真空中最小限度的能量結構，其采用MM2力場和最陡降演算法。最小均方根梯度被設定為
            
  0.1 ;最小和最大分別移動至0.00001和1.0。使用GraphPad Prism V.5軟件(GraphPadSoftware, Inc., La Jolla, CA, US)進行統計。
            
  [0374]9.DC 的轉導
            
  [0375]VSV-G-假病毒SIV3慢病毒載體(由A.Cimarelli友情提供)根據GoujonC.等，Gene Ther.，2006，13:991 - 994)制備。分離的單核細胞(5x10s)利用SIV3微粒感染并利用兩個不同的SIGLEC1-特異性或一個非靶向shRNA控制MISS1N慢病毒轉導微粒(Sigma-Aldrich)在MOI = 50下轉導。轉導的單核細胞被分化成為LPS mDC,并如上所述地對VLP捕捉和HIV-1反感染進行評估。DC充分的表型成熟根據Izquierdo-Useros N.等.上述來評價。攜帶在相同的pLK0.Ι-puro載體主鏈(MISS1N TurboGFP控制轉導微粒)上克隆的GFP受體基因的慢病毒轉導顆粒被用于通過FACS評價轉導效率(當采用細胞的時候，在第七天預計為75% -98% ) ο
            
  [0376]10.通過FACS的Siglec-Ι表面表達分析
            
  [0377]DC利用lmg/ml的人IgG (Baxter, Hyland Immuno)阻塞并根據制造商指示利用抗Siglec-l-PE7-239mAb(AbD Serotec)在4 °C下染色20分鐘。試樣利用FACSCalibur (Becton-Dickinson)使用CellQuest和FlowJo軟件進行分析以評價收集的數據。
            
  [0378]11.反式感染試驗
            
  [0379]DC利用如上所述的HIVNM_3處理并脈沖。在大量沖洗之后，細胞與TZM-bl⑶4+靶向細胞系共同培養以測量反式感染。脈沖的單核細胞衍生的DC或骨髓DC以1:1或5:1的比值分別以四倍或兩倍來共同培養。對于熒光素酶活性，細胞在48小時之后在Fluoroskan Ascent FL 光度計(Thermo Labsystems)中檢測(BrightGlo LuciferaseSystem ；Promega)。對于每個試樣，由非HIV-1脈沖的共同培養的或者由單獨的報告⑶4+細胞組成的基準值被減去。為了檢測可能的脈沖細胞生產性感染或者反復感染情況，某些DC在0.5μ M的蛋白酶抑制劑Saquinavir的存在下被共同培養。
            
  [0380]12.Siglec構建體的轉染
            
  [0381]Raji細胞(2xl06)利用包含Siglec-1、Siglec-5或Siglec-7的編碼區域的載體主干pCMV6-Entry (Origene)使用由制造商推薦的Amaxa核轉染來轉染。在轉染36小時后，細胞對如上所述的VLP捕捉和HIV-1反式感染(比例為2:1)進行評估。當被指示的時候，細胞利用降低濃度的3’-唾液乳糖(Carbosynth)或乳糖(Sigma-Aldrich)在VLP脈沖之前預培養30分鐘。在使用有缺陷包膜的病毒的試驗中，5x10s細胞利用10ng由ELISA評估的？24@在371:下脈沖4小時，并對如上所述的捕捉和反式感染(比例為2:1)進行評估。HEK-293T細胞使用Fugene HD(Promega)轉染并根據對Raji細胞所進行的描述在轉染24小時之后進行評估。在不同的光度計(Luminoskan Ascent, Thermo Labsystems)中測試HEK-293T的反式感染，并且所收集的數據被標準化至100%。評估兩種細胞類型的轉染效率均，利用抗 Siglec-l-PE7-239mAb、抗 Siglec-7-PE5_386mAb (AbD Serotec)和抗Siglec-5/14_PElA5mAb (B1legend)對細胞染色，并通過FACS進行評價。穩定的RajiDC-SIGN 細胞利用抗 DC-SIGN-PE DCN46mAb (BD Pharmigen)進行標記。
            
  [0382]13.統計學分析
            
  [0383]使用配對t檢驗(在P < 0.01下認為是顯著的)或者與GraphPad Prism V.5軟件相關的Spearman進行統計。
            
  [0384]實施例1
            
  [0385]在HIV-1或囊胞膜的外部葉狀結構中的神經節苷脂可以作用為產生mDC攝取的病毒附著因子
            
  [0386]鞘糖脂為在筏狀質膜域是富集的，HIV-1被認為是由其出芽的。基于這種前提，對用于mDC的HIV-1捕捉的鞘糖脂的潛在作用進行研究。GM3在衍生自T細胞系MT-4的HIVnl4.3中的存在通過質譜分析來確定。此外，也檢測了 HIV-1膜中包括的GM1、GM2和GDl的數個其它神經節苷脂。參見圖1A、1B和1C。
            
  [0387]為了測試在HIV-1或者囊胞膜的外部葉狀結構中的神經節苷脂是否可以作用為產生mDC攝取的病毒附著因子，模仿HIV-1 (LUVHIV_tEed)的大小和脂質組合物并包含不同的神經節苷脂的德克薩斯紅(Texas Red) (tRed)標記的大單層囊泡(LUV)被制備。參見圖6，Lorizate M,等，J.B1l.Chem.2009 ;284:22238-22247。所有的 LUV 顯示出相等的熒光強度。參見圖7。成熟的DC利用LUVHIV_tKed或VLP在37°C下脈沖4小時，并且通過熒光激活細胞分選術(FACS)確定熒光細胞的百分比。熒光VLPHIV_eag_eeFP捕捉高百分比的mDC。參見圖1D0在CHO細胞系中產生的VLP通過mDC也被有效地捕捉。參見圖8。攝取至mDC被進一步觀察到，對于小鼠逆轉錄病毒MuLV來說，其被在先示出為還包含神經節苷脂。參見ChanR,等，J.Virol.2008 ;82:11228-11238。
            
  [0388]另一方面，對于包含HIV-1的主要脂質組分的LUVHIV_tKed來說，未觀察到明顯的mDC攝取，但是缺乏神經節苷脂。參見圖1D。對于包含神經酰胺(Cer) (P〈0.0001，配對t檢驗)的LUVHIV_tKed來說，mDC攝取保持為陰性的。參見圖1D。當例如為GM3、GM2或GMl的單唾液酸神經節苷酯被結合至LUV中的時候其為完全不同的；mDC能夠捕捉這些脂質體，其為與效的。參見圖1D。為了確保這種捕捉并不僅是由于帶負電的神經節苷脂和mDC的表面電荷之間的靜電相互作用，平行分析了包含帶負電的磷脂酰絲氨酸(PS)的LUVHIV_tEed,并發現其對mDC捕捉為陰性的(P = 0.0081,配對t檢驗)。參見圖1D。這些結果揭示了單唾液酸神經節苷脂通過mDC介導囊泡捕捉，并且碳水化合物端基是該過程中必不可少的。
            
  [0389]實施例2
            
  [0390]包含神經節苷脂的大單層囊泡和VLP利用共同入口結構進入至mDC內并在mDC內達到相同的區室
            
  [0391]為了確定包含神經節苷脂的LUVHIV_tKed和VLPHIV_eag_eeFP(和HIV-1)是共同入口結構到達mDC內，進行了數個競爭試驗。成熟的DC利用減少量的包含GM2的LUVHIV_tKed和固定量的VLPHIV_eag‘FP在37°C下脈沖4小時。在大量沖洗之后，通過FACS確定eGFP-和tRed-陽性細胞的百分比。包含GM2的LUVHIV_tKed有效地競爭，對于以劑量依賴的方式攝取VLPHIV_eag_e(；FP至1^0內來說(P〈0.0001,配對t檢驗)。參見圖1E。對于包含Cer或缺少鞘糖脂的LUVHIV_tKed，沒有觀察到對于VLP攝取的競爭。因此，包含GM的LUVHIV_tKed和VLPHIV_eag_eeFP使用共同入口結構進入至mDC內，其依賴于碳水化合物端基。
            
  [0392]然后，無論包含GM的LUVHIV_tKed和VLPHIV_eag_eeFP是否到達相同的mDC內區室，均使用旋轉式圓盤共焦顯微鏡來進行研究。之前，已描述了用于捕捉至mDC內的HIV-1的三種類型的形式:自由的、極化的或囊狀隔間。參見Izquierdo-Useros N,等，J.Virol.2007 ；81:7559-7570。相同的形式對于包含GM的LUVHIV_tKed和顯示不同形式的mDC百分比也被觀察到，相類似地無需考慮所使用的顆粒。由此，VLPHIV_eag‘FP和包含GM的LUVHIV_tIted不僅僅是為了內在化，還用mDC內類似的區室作交換。為了確定VLPHIV_eag_eeFP和包含GM的LUVHIV_tKed是否被捕捉至相同的區室內，mDC在37°C下使用包含GM的LUVHIV_tKed預培養3小時，并隨后利用VLPHIV_eag‘FP額外培養3小時。固定細胞的共聚焦顯微鏡揭示出VLP廣泛地與包含GM的LUVHIV_tKed(包含GM1、GM2或GM3)在相同的細胞內區室中被共定位。參見圖2。
            
  [0393]實施例3
            
  [0394]不會影響mDC捕捉的囊泡的橫向脂質組織
            
  [0395]在HIV-1膜內，神經節苷脂被嵌合在液體有序膜中。參見LOrizate，2009和Chan，2008，上述。無論顆粒膜的液態次序或特定的脂質組合物(除了神經節苷脂)是否會影響mDC捕捉，其均因此而被評價。已知神經節苷脂與膽固醇在脂質筏中的相互作用會影響神經節苷脂構造并作為細胞受體改變其活性。參見Lingwood D,等，Nat.Chem.B1l.2011 ;7: 260-262，Simons K,等，Cold Spring Harb.Perspect.B1l.2011, Simons, 2000和Brown, 2000,上述。成熟DC利用由具有或不具有不同的神經節苷脂的1-棕櫚酰-2-油酰-sn-丙三基-3-膽堿磷酸(POPC)組成的LUVPQrc_tKed培養。參見圖 3A。與 LUVHIV_tKed相比，LUV
            

            
POPC-tEed 具有液體無序膜結構。用于LUV
            
  POPC-tEed 的結果非常類似于具有有效捕捉的LUVHIV_tKed，如果存在GMl、GM2或GM3，而對于包含Cer的LUVPQrc_tKed或者缺失神經節苷脂的LUVrorc_tM沒有觀察到攝取。參見圖3A。此外，顯示出被捕捉至自由的、極化的或囊狀的隔間內的顆粒的mDC百分比對于不同的顆粒也是非常相似的。參見圖3B。這些結果示出包含神經節苷脂的LUV使用與VLPHIV_eag_eeFP相同的捕捉和導向通路，而無需考慮它們的橫向脂質組織，并且所提供的是神經節苷脂自身為作為mDC捕捉的關鍵分子。
            
  [0396]實施例4
            
  [0397]具有位于碳水化合物端基不同位置上的多達三個唾液酸的復合神經節苷脂，其分享mDC攝取的共同結構決定因素
            
  [0398]為了獲得需要用于通過mDC有效識別的分子結構的進一步觀察，制備了攜帶更加復雜的神經節苷脂的LUVHIV_TKed。這些LUV在碳水化合物極性端基上包括兩個、三個和四個唾液酸基團(二 _、三-和四-唾液酸神經節苷脂)。使用等量的包含具有兩個或三個唾液酸(分別為⑶Ib和GTlb)的神經節苷脂的LUVHIV_tKed脈沖的成熟DC，通過與GMl_LUVHIV_tKed相同的效率來捕捉這些顆粒。對于包含具有四個唾液酸(GQlb)的神經節苷脂的LUVHIV_tIted，捕捉近乎完全地喪失。參見圖4A。據此，攜帶⑶Ib或GTlb的LUVHIV_tKed對于利用VLPHIV_eag_eeFP的mDC攝取為有效的競爭，而對于攜帶GQlb，PS或Cer的LUVHIV_tIted，沒有觀察到競爭。參見圖4B。這些結果表明復合位于碳水化合物端基不同位置上的具有多達三個唾液酸的神經節苷脂對于mDC攝取來說分享共同的結構決定因素。
            
  [0399]包含Cer的LUV的陰性表型表明碳水化合物端基對于mDC捕捉是特別需要的。唾液酸已被在先確定為用于特定病毒的細胞受體。參見Weis W，等，Naturel988 ;333:426-431。其對于mDC捕捉的重要性由此被測試。通過相等濃度的包含Cer，GMl或不具有唾液酸基團的GMl (缺乏唾液酸基的GMl)的LUVHIV_tKed對mDC的培養揭示了唾液酸依賴性的捕捉。參見圖5A。此外，包含GM3的LUVHIV_tKed和VLPHIV_eag_eeFP的原位神經氨酸酶處理顯著地降低了通過mDC的顆粒捕捉。參見圖5B。由此，神經節苷脂中的唾液酸部分對通過mDC的特定識別是必需的。制備包含GM4 (缺乏GM3的葡萄糖部分)或GalCer (缺少GM3的葡萄糖和唾液酸部分)的LUVHIV_tIted以評價碳水化合物端基的其它組分的貢獻。參見圖5C。使用包含GM4或GalCer的LUVHIV_tIte培養的成熟DC僅顯示出脂質體捕捉的背景水平，表明神經鞘脂的葡萄糖部分對于DC捕捉來說也是必需的。參見圖5C。
            
  [0400]實施例5
            
  [0401 ] 可溶碳水化合物與通過mDC的HIV-1分子識別的競爭
            
  [0402]如果碳水化合物部分構成用于HIV-1捕捉的分子識別決定因素，那么可溶碳水化合物就應當競爭VLP和LUV攝取。包含GM3的LUVHIV_tKed或VLPHIV_eag_eeFP通過mDC的捕捉在存在可溶GM3的情況下被完全阻斷，同時相等濃度的乳糖(缺少唾液酸基團)沒有作用。參見圖總的來說，這些數據清楚地示出神經節苷脂的唾液乳糖部分為用于有效的HIV-1識別和通過mDC的捕捉所需要的分子決定因素。在圖中競爭所需要的高濃度的可溶GM3與LUV中低濃度的神經節苷脂相比較(約小于1000倍；圖1C)，表明唾液乳糖至膜內Cer的附著提供了更好的結合親和性。此外，Cer自身的親水性部分為識別域的一部分，直接提高了與mDC的結合親和性。
            
  [0403]為了進一步理解識別域的結構決定因素，構建所測試的神經節苷脂的能量最小化的3D模型。參見圖5e。這些模型表明唾液乳糖存在于GM1、GM2、GM3、⑶Ib和GTlb，但是在GM4和缺乏唾液酸基的GMl中不存在。參見圖6。
            
  [0404]實施例6
            
  [0405]表達Siglec-1的細胞可以有效地捕捉VLPHIV_Gag_eGFP
            
  [0406]缺少Siglec-1的內源性表達并可在沒有非特定上調Siglec-1的情況下被有效地轉染的Raji B細胞系，可用于轉染。Raji B細胞系中的Siglec-1表達載體的轉染顯著地提高了 VLPHIV_eag_eeFP在Siglec-1陽性細胞群中的捕捉，并且這種作用通過抗SigleC-lmAb7D2的預處理而被消除(P = 0.0005 ;圖9)。在Siglec-1轉染細胞的Siglec-1陰性群體中或者Siglec-5或Siglec-7表達質粒的隨后轉染中沒有觀察到提高的捕捉(圖9)。利用唾液乳糖的預培養也阻礙了 VLP在Siglec-1轉染的Raji細胞中的捕捉(圖10)。抗Siglec-lmAb7D2的滴定顯示了 VLP捕捉的劑量依賴抑制(圖11)。mAb7D2調節抑制的特異性通過利用不同的Siglec蛋白質對這種mAb的預培養被確定。利用純化的Siglec-1的預培養完全恢復了 VLP捕捉，而利用純化的Siglec-7，-5/14或⑶83的預培養卻沒有效果(圖12)。盡管通過7D2mAb的抗原決定部位識別可能不會構成實際病毒結合部位，因為7D2Fab片段不會導致VLP捕捉的阻礙，利用7 - 239進行滴定，不同的a-Siglec-lmAb確定VLP捕捉的劑量依賴抑制(圖13A)。
            
  [0407]實施例7
            
  [0408]沉默Siglec-1導致通過DC捕捉VLPHIV_Gag_eGFP的下降
            
  [0409]為了證明在HIV-1捕捉和轉染過程中Siglec-1的至關重要的作用，實施補充的試驗方案=RNA干擾以降低在LPS mDC中Siglec-1的表達水平，并轉染Siglec-1至缺少這種受體的細胞內。在這種方法中，對于不同的shRNA具有慢病毒顆粒編碼的DC通過與vpx表達的慢病毒的同時感染被轉導，從而反作用限制因子SAMHDl并促進DC有效感染。兩種不同的Siglecl特異性shRNA的轉導,而不是非祀向shRNA控制,會導致Siglec-1表面表達的急劇減少以及VLPHIV_eag‘FP捕捉的同時降低(圖14)。
            
【權利要求】
            
1.一種唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑，用于治療或預防與由包膜病毒導致的感染相關的疾病。
            
2.根據權利要求1所述使用的抑制劑，其中，所述抑制劑選自由唾液乳糖、包含唾液乳糖部分的分子、抗唾液酸粘附素抗體和唾液乳糖結合分子、或者包含包含唾液乳糖部分的分子的囊泡組成的組。
            
3.根據權利要求2所述使用的抑制劑，其中，包含唾液乳糖部分的分子為具有少于四個唾液酸的神經節苷脂。
            
4.根據權利要求1至3任一項所述使用的抑制劑，其中，所述包膜病毒的包膜內的至少某些脂質包含唾液乳糖。
            
5.根據權利要求1至4任一項所述使用的抑制劑，其中，所述包膜病毒選自由逆轉錄酶病毒和絲狀病毒科的病毒組成的組，所述逆轉錄病毒優選為HIV。
            
6.根據權利要求5所述使用的抑制劑，其中，所述HIV為HIV-1。
            
7.根據權利要求4所述使用的抑制劑，其中，與由HIV感染相關的疾病為AIDS。
            
8.一種組合物或試劑盒組件，包含負載抗原的抗原呈遞細胞和唾液酸粘附素和唾液乳糖之間相互作用的抑制劑。
            
9.根據權利要求8所述的組合物或試劑盒組件，其中所述抑制劑選自由唾液乳糖、包含唾液乳糖部分的分子、抗唾液酸粘附素抗體和唾液乳糖結合分子組成的組。
            
10.根據權利要求9所述的組合物或試劑盒組件，其中包含唾液乳糖部分的分子為具有少于四個唾液酸的神經節苷脂。
            
11.根據權利要求8至10任一項所述的組合物或試劑盒組件，其中所述抗原呈遞細胞為樹突細胞。
            
12.根據權利要求8至11任一項所述的組合物或試劑盒組件，其中所述抗原為病毒抗原。
            
13.根據權利要求12所述的組合物或試劑盒組件，其中所述病毒抗原為HIV抗原。
            
14.根據權利要求8至12任一項所述的組合物或試劑盒組件，用于在藥劑中使用。
            
15.一種免疫原或疫苗，包含根據權利要求8至12任一項所述的組合物或試劑盒組件。
            
16.根據權利要求8至12任一項所述的組合物或試劑盒組件，用于治療需要對抗原產生免疫應答的疾病，所述抗原被負載于抗原呈遞細胞中。
            
17.根據權利要求8至12任一項所述的組合物或試劑盒組件，用于誘導針對抗原的免疫應答的方法中，所述抗原被負載于抗原呈遞細胞中。
            
18.一種用于檢測或分離試樣中的包膜病毒的方法，包括:  (i )使所述試樣和唾液酸粘附素或基本上保留其結合唾液乳糖能力的功能等效變體接觸，和  (ii)檢測或分離結合至所述唾液酸粘附素或其功能等效變體的病毒。
            
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述唾液酸粘附素為固定化的。
            
20.根據權利要求18或19任一項所述的方法，其中所述包膜病毒選自由逆轉錄酶病毒和絲狀病毒科的病毒組成的組。
            
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述逆轉錄酶病毒為HIV。
            
22.根據權利要求19所述的方法，其中所述HIV為HIV-1。
            
23.—種試劑盒，包含固定化的唾液酸粘附素或基本上保留其結合唾液乳糖能力的功能等效變體。
            
24.一種軛合物，包含唾液酸粘附素或基本上保留其結合唾液乳糖能力的功能等效變體以及治療試劑或診斷試劑。
            
25.根據權利要求24所述的軛合物，其中所述治療試劑為抗HIV試劑。
            
26.根據權利要求24或25所述的軛合物，用于在藥劑中使用。
            
27.根據權利要求24或25所述的軛合物，用于治療由HIV感染導致的疾病。
            
28.根據權利要求24所述的軛合物，其中所述診斷試劑為可檢測標記。
            
29.一種用于傳遞目標化合物至抗原呈遞細胞的方法，包含所述抗原呈遞細胞和包含目標化合物的脂質微粒接觸，其中所述脂質微粒包含至少包含唾液乳糖部分的分子。
            
30.根據權利要求29所述的方法，其中包含唾液乳糖部分的分子為包含少于四個唾液酸基團的神經節苷脂。
            
31.根據權利要求29或30所述的方法，其中所述抗原呈遞細胞為樹突細胞。
            
32.根據權利要求29至31任一項所述的方法，其中所述目標化合物為抗原或抗逆轉錄病毒劑。
            
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述抗原為HIV抗原。
            
34.一種唾液酸粘附素抑制劑，用于治療或預防與由包膜病毒導致的感染相關的疾病。
            
35.根據權利要求34所述的唾液酸粘附素抑制劑，其中所述唾液酸粘附素抑制劑選自由唾液酸粘附素特異性干擾RNA、唾液酸粘附素特異性反義寡核苷酸和唾液酸粘附素特異性核酶組成的組。
            
36.根據權利要求34或35任一項所述的唾液酸粘附素抑制劑，其中所述包膜病毒的包膜內的至少某些脂質包含唾液乳糖。
            
37.根據權利要求34至36任一項所述的唾液酸粘附素抑制劑，其中所述包膜病毒選自由逆轉錄酶病毒和絲狀病毒科的病毒組成的組。
            
38.根據權利要求37所述的唾液酸粘附素抑制劑，其中所述逆轉錄酶病毒為HIV。
            
39.根據權利要求38所述的唾液酸粘附素抑制劑，其中所述HIV為HIV-1。
            
40.根據權利要求39所述的唾液酸粘附素抑制劑，其中與由HIV感染相關的疾病為AIDS。
            
【文檔編號】A61P31/12GK104168903SQ201280063973 
            
【公開日】2014年11月26日   申請日期:2012年12月17日   優先權日:2011年12月22日
            
【發明者】努里亞·伊斯基耶多·烏塞羅斯, 漢斯-格奧爾格·克羅斯利德, 馬耶爾·洛里扎泰, 哈維爾·馬丁內斯·皮卡多   申請人:埃斯特韋實驗室有限公司, 探索艾滋病研究所私人基金會-儲蓄銀行, 加泰羅尼亞語第一高級研究所, 海德爾堡魯普雷希特-卡爾斯綜合大學
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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