包含金屬材料和氧化鉿材料的納米粒子、其制備和用途

包含金屬材料和氧化鉿材料的納米粒子、其制備和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及可有利地用于衛(wèi)生領(lǐng)域中作為診斷劑和/或治療劑的新穎納米粒子。本發(fā)明的納米粒子包含至少部分被氧化鉿材料覆蓋或包埋于其中的金屬材料。當與現(xiàn)有產(chǎn)品進行比較時，這些納米粒子提供顯著的益處/風險比。具體地，這些納米粒子增強已知的金屬納米粒子的效率。實際上，它們保持了金屬固有性質(zhì)并且現(xiàn)在另外可安全用于哺乳動物、特別是人類中。本發(fā)明還涉及制備所述納米粒子的方法、包含其的組合物以及其用途。
【專利說明】包含金屬材料和氧化鉿材料的納米粒子、其制備和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及可有利地用于衛(wèi)生領(lǐng)域中作為診斷劑和/或治療劑的新穎納米粒子。 本發(fā)明的納米粒子包含至少部分被氧化物材料、優(yōu)選氧化鉿材料覆蓋或包埋于其中的金屬 材料。當與現(xiàn)有產(chǎn)品進行比較時，這些納米粒子提供顯著的益處/風險比。具體地，這些納 米粒子增強已知的金屬納米粒子的效率。實際上，它們保持了金屬固有性質(zhì)并且現(xiàn)在另外 可安全用于哺乳動物、特別是人類中。本發(fā)明還涉及制備所述納米粒子的方法、包含其的組 合物以及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 納米技術(shù)為改善醫(yī)療保健提供了革命性策略。然而，正如對任何醫(yī)療保健產(chǎn)品一 樣，在納米醫(yī)學領(lǐng)域中，應(yīng)該從可根據(jù)醫(yī)藥產(chǎn)品的化學和藥理學性質(zhì)所預計的毒性、以及在 先前的觀察結(jié)果或文獻記錄方面所知道的毒性兩方面來考慮預期/非預期毒性的概念。
[0003] 當設(shè)計納米材料時，納米粒子毒理學問題是最重要的。為診斷性或治療性應(yīng)用而 開發(fā)的工程化納米材料的潛在毒性應(yīng)予以考慮并涵蓋諸如有毒物質(zhì)釋放至生物介質(zhì)中、氧 化還原現(xiàn)象、電子轉(zhuǎn)移和活性氧物質(zhì)（R0S)產(chǎn)生的現(xiàn)象。此外，蛋白質(zhì)吸附在納米粒子表面 上可能觸發(fā)各種不良現(xiàn)象，例如蛋白質(zhì)構(gòu)象改變和后續(xù)的酶活性損失、原纖化、或暴露于新 的抗原表位。藥物動力學是功效和安全性預測的一個決定性參數(shù)。在被單核吞噬細胞捕捉 后未降解或僅不良降解的納米粒子可以截留在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES)中，所述納米粒子在其 中積聚并且可以誘導不希望的副作用。
[0004] 納米粒子表面涂層（功能化）被視為是通過發(fā)揮諸如防止納米粒子生物反應(yīng)性和 納米粒子溶解等不同作用來改善納米粒子安全性的有吸引力的方法。實際上，具有保護殼 的納米粒子的涂層表現(xiàn)為降低其毒性的有效手段。合適的殼材料包括生物相容性有機或無 機物質(zhì)，例如聚乙二醇化合物（PEG化合物）、二氧化硅（Si0 2)以及生物相容性聚合物。然 而，這些涂層是環(huán)境上不穩(wěn)定的或可降解的，并且最初的無毒材料在其涂層脫落后，當納米 粒子的核暴露于身體時，可能變得有害。
[0005] 癌癥是世界范圍內(nèi)一種主要的死亡原因，2008年有760萬人死于癌癥（所有死亡 數(shù)的約13% )。死于癌癥的人數(shù)預計將繼續(xù)上升，在2030年估計將有1200萬人死于癌癥 (WHO)。手術(shù)、放射療法和藥物作為抗癌治療方式是至關(guān)重要的，根據(jù)被治療的癌癥類型而 定，其各自可單獨或組合使用。療法的選擇取決于腫瘤的位置和等級分類、疾病的階段以及 患者的健康狀態(tài)。
[0006] 靶向細胞周期和DNA的抗癌劑如細胞毒性劑或X射線在臨床使用中最有效并且當 單獨使用或與具有不同作用機制的藥物組合使用時已經(jīng)使癌癥患者的存活率產(chǎn)生顯著提 高。它們也非常有毒并顯示出狹窄的治療窗。
[0007] 因此，在癌癥領(lǐng)域調(diào)節(jié)治療率仍使人相當激動，旨在功效和安全性改善。
[0008] 納米技術(shù)為向癌細胞直接和選擇性地遞送治療提供了一種有利的解決方案。近年 來，金屬納米粒子已顯示為診斷和治療帶來了很大希望。在金屬納米粒子中，已特別提出了 金納米粒子，尤其是作為放射療法情形下的放射增敏劑（W02004/112590)、作為診斷情形下 的造影劑（W02003/075961)、作為高溫療法情形下的光熱劑（W02009/091597)，以及作為化 學療法情形下的藥物載體（W02002/087509)。
[0009] 金長久以來且仍被認為具生物惰性（即缺乏生物化學反應(yīng)性），因此可體內(nèi)用于 哺乳動物中（W02011/127061)。然而本發(fā)明人和其他人現(xiàn)在對這種觀點存在疑問。
[0010] 最近的論文已經(jīng)質(zhì)疑了金納米粒子在生物介質(zhì)中的惰性行為，這可減少其在醫(yī)療 應(yīng)用中的使用。
[0011] Cho WS.等[Acute toxicity and pharmacokinetics of13nm sized PEG-coated gold nanopaprticles. Toxicology and Applied Pharmacology236 (2009) 16-24]已經(jīng)進行 了使用涂布有PEG的13nm尺寸金納米粒子的體內(nèi)毒性研究。經(jīng)靜脈內(nèi)注射涂布有PEG-5000 的金13nm納米粒子（在BALB/C小鼠中每Kg體重0、0· 17、0· 85或4. 26mg)。發(fā)現(xiàn)納米粒子 在肝臟和脾臟中積聚長達7天。此外，透射電子顯微鏡（TEM)影像顯示肝臟Kupffer細胞 和脾臟巨噬細胞的眾多細胞質(zhì)囊泡和溶酶體包含涂布有PEG的金納米粒子。在治療后第7 天，對于被給與〇. 85mg/Kg和4. 26mg/Kg金納米粒子的小鼠，肝細胞的凋亡顯著更高。第7 天在高劑量組中凋亡的細胞為約10%。雖然對于涂布有PEG的13nm金納米粒子的毒性來 說短暫的炎性反應(yīng)是可忽略的，但肝細胞的凋亡是由涂布有PEG的13nm金納米粒子的治療 所引起的重要不良作用。
[0012] Sadauskas E.等[Protracted elimination of gold nanoparticles from mouse liver, Nanomedicine5 (2009) 162-9]研究了 40nm金納米粒子在靜脈內(nèi)注射后的命運。將金 納米粒子經(jīng)靜脈內(nèi)注射（〇. 5mL，每mL9. 101°個粒子）至成年雌性C57BL小鼠中。在1天、 1個月、3個月和6個月后將實驗組處死。在1天后將對照組處死。關(guān)于金含量從第1天 至第6個月下降9%的ICP-MS研究結(jié)果揭示，負載有金的Kupffer細胞的更新曠日持久。 AutoMetalloGraphic (AMG)染色顯示，在長期暴露期后含有金納米粒子的Kupffer細胞的 數(shù)目減少以及在1個月后AMG染色區(qū)域顯著減少。作者認為，這反映了 Kupffer細胞之間 的自相殘殺。他們觀察到看起來不健康的大的含金溶酶體在動物中存活3至6個月，其可 支持Kupffer細胞死亡和被周圍的Kupffer細胞吞噬的觀點。
[0013] Chen YS.等[Assessment of the in vivo toxicity of gold nanoparticles，Nanoscale Res. Lett. 4 (8) (2009)858-64]已經(jīng)進行了使用 3、5、12、17、37、 50和lOOnm金納米粒子的體內(nèi)毒性研究。將金納米粒子以每周8mg/Kg的劑量經(jīng)腹膜內(nèi)注 射到BALB/C小鼠中。尺寸范圍為8?37nm的金納米粒子在小鼠中誘發(fā)嚴重的疾病（中值 存活時間=21天）。對于患病群體中小鼠的主要器官的病理學檢查指示肝臟中Kupffer細 胞增加（Kupffer細胞的活化表明金納米粒子在這個區(qū)域中的潛在毒性）、肺部結(jié)構(gòu)完整性 損失（觀察到與肺氣腫類似的結(jié)構(gòu)）以及白髓在脾臟中擴散。病理異常與金納米粒子在患 病部位的存在相關(guān)。
[0014] 發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)并且現(xiàn)在本文描述，氧化鉿當與金屬材料適當組合使用時能夠 使所述金屬材料、特別是金無毒性，同時對金屬的治療和診斷性質(zhì)無害，從而使得本發(fā)明的 產(chǎn)品有利地可體內(nèi)用于哺乳動物中。
[0015] 發(fā)明人進一步認為，所要求保護的金屬材料與氧化鉿材料的組合可造成能量在腫 瘤結(jié)構(gòu)內(nèi)有效沉積，與標準治療相比，當通過輻射活化時，所述沉積造成體內(nèi)腫瘤破壞急劇 增強。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本文中發(fā)明人提供了一種納米粒子，其包含至少部分被氧化鉿材料覆蓋或包埋于 其中的金屬材料。在一個特定實施方式中，本發(fā)明的納米粒子為核-殼型金屬-氧化物納 米粒子，其包含完全被氧化鉿材料覆蓋或包埋于其中的金屬材料。他們還提供了一種包含 所述納米粒子以及藥學上可接受的載體的組合物。這種組合物可為診斷組合物或藥物組合 物。發(fā)明人進一步描述了他們的產(chǎn)品供用于哺乳動物中、優(yōu)選是人類中，作為診斷劑和/或 作為治療劑，特別是在腫瘤學中，更特別是當納米粒子暴露于輻射時。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1提供了本發(fā)明的納米粒子結(jié)構(gòu)的圖解。
[0018] 圖1A提供了金屬微晶或金屬微晶聚集體的圖解。
[0019] 圖1B提供了包含完全被氧化鉿材料覆蓋或包埋于其中的金屬材料的核-殼型金 屬-氧化物納米粒子的圖解。
[0020] 圖1C提供了包含至少部分被氧化鉿材料覆蓋或包埋于其中的金屬材料的納米粒 子的圖解。
[0021] 圖2提供了特別是在腫瘤學中，更特別是當納米粒子暴露于輻射時，本發(fā)明的納 米粒子結(jié)構(gòu)與不含氧化鉿材料的金屬納米粒子相比的益處/風險比的圖解。
[0022] 圖3提供了來自實施例1的60nm尺寸的金納米粒子的透射電子顯微鏡照片。
[0023] 圖4 :通過電子衍射測定所制備的金納米粒子（實施例1)的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。
[0024] 圖4A顯示參比納米粒子（使用具有立方面心結(jié)構(gòu)的金納米粒子作為參考物來確 立透射電子顯微鏡的相機常數(shù)（L λ))和來自實施例1的金納米粒子（GNP)的電子衍射圖。
[0025] SiS報道了金納米粒子（來自實施例1)的指數(shù)化，電子衍射圖顯示金納米粒子 的立方面心（CFC)結(jié)構(gòu)。
[0026] 電子衍射圖的指數(shù)化包括以下步驟：
[0027] 1)由參考物的電子衍射圖確立相機常數(shù)，
[0028] 2)測量來自實施例1的金納米粒子的電子衍射圖的環(huán)直徑（D1、D2、......、Dn)，
[0029] 3)使用表達式dm = L* λ / (Dn/2)來計算dm，
[0030] 4)使用現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫對各環(huán)進行指數(shù)化。
[0031] 圖5提供了來自實施例4的金納米粒子和氧化鉿材料的核@殼Au@Hf02型組合的 電子衍射圖照片。
[0032] 圖5A顯示來自實施例4的金@-Hf02納米粒子的電子衍射圖。
[0033] MM報道了金腿f〇2納米粒子（來自實施例4)的指數(shù)化。
[0034] 電子衍射圖的指數(shù)化包括以下步驟：
[0035] 1)由參考物的電子衍射圖確立相機常數(shù)（圖4A)，
[0036] 2)測量來自實施例4的Au@Hf02納米粒子的電子衍射圖的環(huán)直徑（D1、D2、……、 Dn),
[0037] 3)使用表達式dm = L* λ / (Dn/2)來計算dm，
[0038] 4)使用現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫對各環(huán)進行指數(shù)化。
[0039] 圖6提供了來自實施例4的金納米粒子與氧化鉿材料的核@殼Au@Hf02型組合的 透射電子顯微鏡照片。就此而言，可以觀察到殼覆蓋了金納米粒子表面。如由電子衍射所 示，這種殼包含氧化鉿材料。

【具體實施方式】
[0040] 本發(fā)明的納米粒子包含至少部分被氧化鉿材料覆蓋或包埋于其中的金屬材料。
[0041] 在用于使電子裝置的晶體管微型化的金屬-氧化物半導體（M0S)開發(fā)的情形下， Sargentis Ch.等[Simple method for the fabrication of a high dielectric constant metal-0xide-semiconductor capacitor embedded with Pt nanoparticles, Appl. Phys. Lett. 88(073106) (2006) 1-3]開發(fā)了一種簡單的電子蒸發(fā)法來制造在其Si02/Hf02界面上 包埋有Pt納米粒子的M0S裝置。所制造的Pt納米粒子具有4. 9nm的平均直徑并且片材密 度為3. 2X 1012個納米粒子/cm2。預期用于開發(fā)電子裝置的這種物體由部分包埋于氧化鉿 層中的金屬納米粒子構(gòu)成。與本發(fā)明的物體相反，這種物體為片材而非納米粒子。
[0042] 在一個特定實施方式中，本發(fā)明的納米粒子為包含完全被氧化鉿材料覆蓋或包埋 于其中的金屬材料的核-殼型金屬-氧化物納米粒子。
[0043] 在本發(fā)明的精神中，如下文進一步解釋，術(shù)語"納米粒子"是指尺寸在納米范圍內(nèi)、 典型地介于lnm與500nm之間的產(chǎn)品、特別是合成產(chǎn)品。
[0044] 金屬材料典型地為金屬微晶或金屬微晶聚集體。
[0045] 本發(fā)明的納米粒子有利地包含一個或幾個金屬微晶。
[0046] 在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的納米粒子包含幾個氧化鉿微晶和/或幾個氧 化鉿微晶聚集體。
[0047] 在一個特定實施方式中，各個金屬材料和各個氧化鉿材料存在于微晶或微晶聚集 體中。
[0048] 在另一個特定實施方式中，本發(fā)明的納米粒子為核-殼型金屬-氧化物納米粒子， 其包含完全被氧化鉿材料覆蓋的典型地為金屬微晶或金屬微晶聚集體的金屬材料。
[0049] 本文的術(shù)語"微晶"是指結(jié)晶產(chǎn)物?？筛鶕?jù)X射線衍射圖來分析微晶的尺寸以及 其結(jié)構(gòu)和組成。
[0050] 術(shù)語"微晶聚集體"是指彼此強烈地、通常是共價地結(jié)合的微晶集合體。
[0051] 金屬材料可以有利地選自金（Au)、銀（Ag)、鉬（Pt)、鈀（Pd)、錫（Sn)、鉭（Ta)、 鐿（Yb)、鋯（Zr)、鉿（Hf)、鋱（Tb)、銩（Tm)、鈰（Ce)、鏑（Dy)、鉺（Er)、銪（Eu)、欽（Ho)、鐵 (Fe)、鑭（La)、釹（Nd)、鐠（Pr)、镥（Lu)和它們的混合物。金屬優(yōu)選選自金、銀、鉭、鉬、鈀、 錫、鋯、鉿、镥和鐵，甚至更優(yōu)選選自鋯、鉿、鉭和金。金屬材料最優(yōu)選為金或鉭，甚至更優(yōu)選 為金。
[0052] 在一個特定實施方式中，氧化鉿材料可保護至少80%、例如85%、86%、87%、 88 %或89 %的金屬材料免于與生物材料發(fā)生任何相互作用。更優(yōu)選地，氧化鉿材料可保護 至少90%、典型地介于90%與98%之間、例如95%的金屬材料免于與生物材料發(fā)生任何相 互作用。
[0053] 在另一個特定實施方式中，本發(fā)明的納米粒子為核-殼型金屬-氧化物納米粒子， 也鑒定為核@殼型金屬@氧化物納米粒子，其包含完全被氧化鉿材料覆蓋或包埋于其中的 金屬材料。
[0054] 根據(jù)預期用途，本發(fā)明的納米粒子包含至少部分被氧化鉿材料覆蓋或完全被氧化 鉿材料覆蓋的金屬材料。
[0055] 例如，當本發(fā)明的納米粒子在診斷情形下用作造影劑或在治療情形下用作放射增 敏劑時，金屬材料有利地完全被氧化鉿材料覆蓋（核@殼型金屬@氧化物納米粒子），但是 當本發(fā)明的納米粒子在高溫療法情形下用作光熱劑或在化學療法情形下用作藥物載體時， 金屬材料優(yōu)選至少部分被氧化鉿材料覆蓋。
[0056] 在一個特定實施方式中，為了保持金屬材料的固有性質(zhì)，可能希望覆蓋或包埋金 屬材料的氧化鉿材料允許小分子的擴散。特別地，重要的是覆蓋或包埋金屬材料的氧化鉿 材料允許水或藥物的通過，但保護金屬材料免于與生物材料發(fā)生任何相互作用。
[0057] 在診斷或放射療法情形下，金屬組成的完全覆蓋是值得重視的。在診斷情形下，甚 至優(yōu)選這種完全覆蓋來優(yōu)化產(chǎn)品的安全使用。
[0058] 可調(diào)節(jié)氧化鉿材料對金屬材料的適當覆蓋率以使得通過BET(Brunauer、Emmett 和Teller)表面積分析測定的納米粒子的表面積等于或優(yōu)于通過CTAB表面積分析典型地 測定的納米粒子的表面積。
[0059] BET表面積分析是基于氣體（通常是氮氣）在納米粒子（所述納米粒子呈粉末形 式）表面上的吸收。BET表面積提供包括孔隙在內(nèi)的納米粒子的"總"表面。
[0060] CTAB表面積分析是基于十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)分子于納米粒子（所述納 米粒子處于溶液中）表面上的吸收。CTAB分子相對較大以使得其不被吸附于微孔中。因 此，CTAB表面積僅反映可用于與大分子相互作用、例如與生物材料相互作用的納米粒子的 表面。在本發(fā)明情形下可另外使用其他分子（例如蛋白質(zhì)）來估算這種納米粒子表面積。
[0061] 當納米粒子包含完全被氧化鉿材料覆蓋的金屬材料時，BET表面積與考慮到納米 粒子的形狀而計算的表面以及構(gòu)成納米粒子的金屬和氧化鉿材料的相對比例相關(guān)，兩者都 是典型地通過使用感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜（ICP MS)分析對金屬和鉿元素進行定量來測定。 [0062] 納米粒子的形狀可以例如為圓形、扁平形、細長形、多邊形、球形、卵圓形或橢圓形 等。形狀可以由制造方法確定或控制并且由本領(lǐng)域技術(shù)人員調(diào)適。
[0063] 因為粒子的形狀可以影響其"生物相容性"，所以優(yōu)選具有相當均勻的形狀的粒 子。出于藥物動力學原因，因此優(yōu)選形狀基本上為球形、圓形或卵圓形的納米粒子。這種形 狀也有利于納米粒子與細胞的相互作用或細胞對納米粒子的攝取。特別優(yōu)選球形或圓形。 [0064] 本文術(shù)語"納米粒子的尺寸"和"納米粒子的最大尺寸"是指"納米粒子的最大 尺度"。可以使用透射電子顯微鏡（TEM)來測量納米粒子的尺寸。也可以使用動態(tài)光散射 (DLS)來測量溶液中納米粒子的流體動力學直徑。這兩種方法可進一步彼此前后使用以比 較尺寸度量并證實所述尺寸。
[0065] 典型地，最大尺度為圓形或球形納米粒子的直徑，或卵圓形或橢圓形納米粒子的 最長長度。
[0066] 如本文所定義的納米粒子的最大尺度典型地介于約10nm與約250nm之間，優(yōu)選介 于約20nm與約lOOnm或約200nm之間，甚至更優(yōu)選介于約50nm與約150nm之間。
[0067] 金屬微晶尺寸（金屬微晶的最大尺度）典型地介于約2nm與約lOOnm之間，例如 介于約2nm與60nm之間或介于約lOnm與約50nm之間。金屬微晶尺寸的典型實例為5、10、 15、30 和 50nm。
[0068] 金屬微晶聚集體尺寸（金屬微晶聚集體的最大尺度）典型地介于約20nm與約 lOOnm之間，例如介于20nm與50nm之間。
[0069] 氧化鉿微晶尺寸（氧化鉿微晶的最大尺度）典型地介于約5nm與約50nm之間，優(yōu) 選介于約2nm與約50nm之間，例如介于5nm與30nm之間。氧化鉿微晶尺寸的典型實例為 2、5、10、15、20 和 25nm。
[0070] 氧化鉿微晶聚集體尺寸（氧化鉿微晶聚集體的最大尺度）典型地介于約20nm與 約1 OOnm之間，例如介于30nm與70nm之間。
[0071] 在核@殼型金屬@氧化物納米粒子的情形下，氧化鉿微晶尺寸或氧化鉿微晶聚集 體尺寸對應(yīng)于氧化鉿殼的厚度。
[0072] 在本發(fā)明的納米粒子中，可有利地用有利于金屬與氧化鉿材料之間的粘著的、在 本文中定義為"連接劑"的試劑來涂布金屬材料。本發(fā)明情形下的粘著意指在連接劑與金 屬之間以及在連接劑與氧化鉿材料之間建立起弱的（氫鍵或靜電）或強的（共價）相互作 用。優(yōu)選為強相互作用。連接劑為能夠典型地通過共價結(jié)合或靜電結(jié)合與金屬材料表面以 及與氧化鉿材料相互作用的化合物。
[0073] 連接化合物可包含兩個端基，&和R2。&的作用在于與金屬材料相互作用，而R 2 的作用在于與氧化鉿材料相互作用。
[0074] 札可選自例如羧酸根（r2-x-coo_)、膦酸（r2-x-po(oh)2)、磷酸（r 2-x-o-po(oh)2)、 磷酸根（R2-X-P〇4 3〇和硫醇（R2-X-SH)基團。
[0075] R2 可選自例如羧酸根（RrX-COO-)、硅烷（Rrx-Si (OR) 3)或（Si (OR) 4)、膦酸 〇?1^0(0!1)2)、磷酸〇?1-父-〇-?0(0!1) 2)、磷酸根〇?1^043_)和硫醇〇?1^!1)基團。
[0076] "X"為可為含有至少一個原子的線性或環(huán)狀鏈的鏈。"X"鏈可選自例如含有碳原 子的鏈（例如烷烴鏈）、含有碳和氧原子的鏈（例如聚環(huán)氧乙烷鏈或碳水化合物鏈）、含有 硅原子的鏈（例如硅酮鏈）以及含有磷原子的鏈（例如聚磷酸酯鏈）。
[0077] 在一個優(yōu)選實施方式中，所要求保護的納米粒子的金屬材料和/或氧化鉿材料結(jié) 合于藥物分子。
[0078] 藥物分子可經(jīng)由例如氫鍵相互作用、靜電相互作用或共價鍵合與金屬材料和/或 氧化鉿材料相互作用。藥物分子可進一步包含當納米粒子暴露于特定刺激時允許藥物分子 釋放的可裂解連接。
[0079] 所述可裂解連接可選自例如二硫鍵連接或?qū)H敏感的連接如腙鍵連接。
[0080] 能夠使連接裂解的特定刺激可為環(huán)境刺激或物理刺激，典型地為外部物理刺激。 能夠使連接裂解的環(huán)境刺激可為例如能夠使對pH敏感的連接裂解的pH，或能夠使二硫鍵 連接還原的還原環(huán)境。能夠使連接裂解的物理刺激可為例如輻射，特別是電離輻射。
[0081] 本發(fā)明情形中的藥物分子包括任何具有治療性或預防性作用的化合物。其可為影 響或參與例如組織生長、細胞生長或細胞分化的化合物。其還可以是能夠誘導生物作用例 如免疫反應(yīng)的化合物。
[0082] 實例的非限制性列表包括抗微生物劑（包括抗細菌劑，特別是抗生素、抗病毒劑 和抗真菌劑）；抗腫瘤劑，特別是抗癌化學治療劑如細胞生長抑制劑、細胞毒性劑，和預期 用于治療癌癥的任何其他生物或無機產(chǎn)品如治療性核酸、特別是微RNA(miRNA)、短發(fā)夾 RNA(shRNA)和/或小干擾RNA(siRNA)。在本發(fā)明情形下藥物還可以是前藥?？蛇M一步使 用所感興趣的藥物分子的任何組合。
[0083] 在另一個實施方式中，本文描述了其中用選自展現(xiàn)隱身性質(zhì)的試劑、允許與生物 靶標相互作用的試劑和其組合的生物相容性材料涂布氧化鉿材料的納米粒子。
[0084] 在通過靜脈內(nèi)途徑（一種可能的施用途徑）注射后的給定時間之后，已知增強的 滲透和滯留（"EPR"）作用造成納米粒子被動積聚在腫瘤塊中。實際上已經(jīng)觀察到腫瘤血 管明顯不同于正常毛細血管并且其血管"泄漏"促進納米粒子選擇性外滲，這在正常組織中 是不常見的。有效的腫瘤淋巴引流的缺乏阻止了滲透性納米粒子的清除并促進了其積聚。 因此本發(fā)明的納米粒子在靜脈內(nèi)施用后能夠成功地靶向原發(fā)性以及轉(zhuǎn)移性腫瘤。
[0085] 在一個優(yōu)選的實施方式中，所要求保護的納米粒子的氧化鉿材料可以用選自展現(xiàn) 隱身性質(zhì)的試劑的生物相容性材料涂布。實際上，當經(jīng)由靜脈內(nèi)（IV)途徑向受試者施用本 發(fā)明的納米粒子時，具有選自展現(xiàn)隱身性質(zhì)的試劑的材料的生物相容性涂層特別有利于優(yōu) 化納米粒子的生物分布。所述涂層造成納米粒子的所謂的"隱身性質(zhì)"。
[0086] 展現(xiàn)隱身性質(zhì)的試劑可為顯示出空間基團（steric group)的試劑。所述基團可 選自例如聚乙二醇（PEG);聚環(huán)氧乙烷；聚乙烯醇；聚丙烯酸酯；聚丙烯酰胺（聚（N-異丙基 丙烯酰胺））；聚脲；生物聚合物；多糖如葡聚糖、木聚糖和纖維素；膠原蛋白；兩性離子化 合物如聚磺基甜菜堿；等。
[0087] 在另一個優(yōu)選實施方式中，所要求保護的納米粒子的氧化鉿材料可以用選自允許 與生物靶標相互作用的試劑的生物相容性材料涂布。所述試劑可以典型地在納米粒子表面 上帶來正電荷或負電荷?？梢酝ㄟ^典型地在濃度在〇. 2g/L與10g/L之間變化的納米粒子 懸浮液上進行ξ電位測量來測定所述電荷，其中所述納米粒子懸浮在pH介于6與8之間 的水性介質(zhì)中。
[0088] 在納米粒子表面上形成正電荷的試劑可以是例如氨基丙基三乙氧基硅烷或聚賴 氨酸。在納米粒子表面上形成負電荷的試劑可以是例如磷酸鹽（酯）（例如聚磷酸鹽（酯）、 偏磷酸鹽（酯）、焦磷酸鹽（酯）等）、羧酸鹽（酯）（例如檸檬酸鹽（酯）或二羧酸，特別 是琥珀酸）或硫酸鹽（酯）。
[0089] 納米粒子或聚集體的生物相容性完全涂層可為有利的，特別是在靜脈內(nèi)（IV)情 形下，以避免粒子表面與任何識別元件（巨噬細胞、調(diào)理素等）的相互作用。"完全涂層"意 味著非常高密度的生物相容性分子的存在，能夠在粒子表面上至少產(chǎn)生一個完整的單層。
[0090] 生物相容性涂層特別提供納米粒子在流體中的穩(wěn)定性，例如生理流體（血液、血 漿、血清等）、任何等滲介質(zhì)或生理介質(zhì)，例如包含葡萄糖（5% )和/或NaCl (0. 9% )的介 質(zhì)，這是藥物施用所需的。
[0091] 可通過典型地在0. 22或0. 45 μ m過濾器上過濾之前和之后對納米粒子懸浮液進 行測量的干提取物定量來證實穩(wěn)定性。
[0092] 有利的是，所述涂層保留粒子在體內(nèi)的完整性，確?；蚋纳破渖锵嗳菪?，并促進 其可選的功能化（例如利用間隔分子、生物相容性聚合物、靶向劑、蛋白質(zhì)等）。
[0093] 根據(jù)本發(fā)明的特定納米粒子可以進一步包含靶向劑，使得其與靶細胞上存在的識 別元件相互作用。一旦納米粒子積聚在靶標位點上，這種靶向劑就典型地起作用。所述靶向 劑可以是任何對人類或動物體內(nèi)存在的分子顯示親和性的生物或化學結(jié)構(gòu)。例如，它可以 是一種肽、寡肽或多肽、蛋白質(zhì)、核酸（DNA、RNA、SiRNA、tRNA、miRNA等）、激素、維生素、酶、 由病理性細胞表達的分子的配體、特別是腫瘤抗原的配體、激素受體、細胞因子受體或生長 因子受體。所述靶向劑可以在例如由LHRH、EGF、葉酸鹽、抗B-FN抗體、E-選擇素/P-選擇 素、抗IL-2R抗體、GHRH等組成的群組中選擇。
[0094] 本發(fā)明的納米粒子可以通過不同途徑施用，例如局部（特別是腫瘤內(nèi)（IT))、皮 下、靜脈內(nèi)（IV)、皮內(nèi)、動脈內(nèi)、氣管（吸入）、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)和口服途徑（經(jīng)口）。納米粒 子可以在諸如腫瘤切除后的腫瘤床的虛擬腔等腔內(nèi)進一步施用。
[0095] 適當時，可以進行納米粒子的重復注射或施用。
[0096] 本發(fā)明的另一個特定目的涉及一種藥物組合物，其包含如上文所定義的納米粒 子，優(yōu)選以及藥學上可接受的載體或媒介物。
[0097] 本發(fā)明的另一個特定目的涉及一種診斷或成像組合物，其包含如上文所定義的納 米粒子，優(yōu)選以及生理學上可接受的載體或媒介物。
[0098] 組合物可以呈固體、液體（于懸浮液中的粒子）、氣溶膠、凝膠、糊狀物等形式。優(yōu) 選的組合物呈液體或凝膠形式。特別優(yōu)選的組合物呈液體形式。
[0099] 所使用的載體可以是用于這種應(yīng)用的任何經(jīng)典支持物，例如含鹽的、等滲的、無菌 的、緩沖的溶液等。它們還可以包含穩(wěn)定劑、甜味劑、表面活性劑、聚合物等。它們可以通過 使用已知的藥物配制技術(shù)而配制成例如安瓿、氣溶膠、瓶、片齊?、膠囊。
[0100] 在本文所述的組合物中，納米粒子的適當或所需濃度包含在約ΚΓ3毫克納米粒子 /克腫瘤與約100暈克納米粒子/克腫瘤之間，特別是約5暈克與約50暈克納米粒子/克 腫瘤之間。無論什么施用途徑，這些濃度都適用。
[0101] 在本文所述的組合物中，納米粒子的適當或所需濃度包含在約ΚΓ3毫克納米粒子 /毫升的腫瘤切除術(shù)后留下的虛擬腔體積與約100毫克納米粒子/毫升的腫瘤切除術(shù)后留 下的虛擬腔體積之間，特別是約5毫克至約50毫克的納米粒子/毫升的腫瘤切除術(shù)后留下 的虛擬腔體積。無論什么施用途徑，這些濃度都適用。
[0102] -般來說，呈液體或凝膠形式的組合物包含介于0. 05g/L與400g/L之間、介于 0· 05g/L 與 150g/L 之間、優(yōu)選至少 10g/L、20g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、80g/L、 100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L 或 350g/L 的納米粒子。
[0103] 在包含納米粒子的懸浮液的干燥步驟之后理想地測量干提取物。
[0104] 本發(fā)明的組合物、粒子和聚集體可以用于許多領(lǐng)域中，尤其是人類或獸醫(yī)學中。 [0105] 如本文所述的根據(jù)本發(fā)明的納米粒子和組合物優(yōu)選用于哺乳動物中，甚至更優(yōu)選 用于人類中，典型地當納米粒子暴露于輻射時作為診斷劑，和/或特別是在腫瘤學中，優(yōu)選 當納米粒子暴露于輻射、特別是電離輻射時作為治療劑。
[0106] 術(shù)語"輻射"是指電離和非電離輻射。非電離輻射包括無線電波、微波、紅外線和 可見光。電離輻射典型地包括紫外光、X射線和γ射線。
[0107] 術(shù)語"治療"和"療法"是指為糾正異常功能、為預防疾病、為改善病理體征而進行 的任何行為，例如特別是異常組織特別是腫瘤的尺寸或生長的縮減、所述尺寸或生長的控 制、異常細胞或組織的抑制或破壞、疾病進展的減緩、癌癥進展延遲的疾病穩(wěn)定化、癌轉(zhuǎn)移 形成的減少、疾病的消退或完全緩解（例如在癌癥的情形下）等。
[0108] 盡管不希望受任何特定理論約束，但發(fā)明人認為，當通過輻射活化納米粒子時，在 治療情形下，所要求保護的金屬材料與氧化鉿材料的組合可造成能量有效沉積在腫瘤結(jié)構(gòu) 內(nèi)。
[0109] 典型地，在靜脈內(nèi)注射后，增強的滲透和滯留（"EPR"）作用將造成納米粒子被動 積聚在腫瘤部位。在通過輻射活化納米粒子時，能量沉積將增強腫瘤灌注并因此進一步有 利于納米粒子腫瘤內(nèi)滲透。增強的納米粒子腫瘤內(nèi)滲透（納米粒子腫瘤內(nèi)生物利用度）將 增強本發(fā)明納米粒子的治療活性（圖2)。
[0110] 因此本發(fā)明的特定目的是基于本發(fā)明的納米粒子在制備藥物組合物中的用途，以 及相應(yīng)的方法，所述藥物組合物旨在當靶細胞暴露于輻射、特別是電離輻射時，改變、破壞 或消除動物中的所述細胞。
[0111] 靶細胞可以是任何病理細胞，也就是說，病理機制中所涉及的細胞，例如增殖性細 胞如腫瘤細胞、狹窄性細胞（成纖維細胞/平滑肌細胞），或免疫系統(tǒng)細胞（病理細胞克 ?。?。一種優(yōu)選的應(yīng)用是基于惡性細胞或組織的治療（例如破壞或功能改變）。
[0112] 本發(fā)明的另一個特定實施方式涉及當納米粒子暴露于輻射、特別是電離輻射時， 如上文所定義的組合物或納米粒子用于制造供治療癌癥的藥物組合物的用途。
[0113] 本公開進一步涵蓋當細胞暴露于輻射、特別是電離輻射時，本發(fā)明的納米粒子和/ 或組合物用于在動物中預防或治療癌癥或減輕癌癥癥狀的用途。
[0114] 經(jīng)典的癌癥管理系統(tǒng)性暗示多模態(tài)治療的同時存在（例如放射療法與化學療法 的組合）。
[0115] 本文所述的納米粒子經(jīng)受輻射，特別是在放射療法情形下，可以與不同的癌癥治 療方案聯(lián)合使用。所述方案可以選自：手術(shù)，放射手術(shù)，化學療法，包含施用以下物質(zhì)的治 療：細胞生長抑制劑、細胞毒性劑、靶向療法、疫苗、放射性核素、特別是免疫放射性核素以 及欲用于治療癌癥的任何其他生物或無機產(chǎn)品。
[0116] 本發(fā)明可以用于治療任何類型的惡性腫瘤如血液腫瘤或惡性腫瘤，以及實體瘤， 特別是上皮、神經(jīng)外胚層或間充質(zhì)源實體瘤。此外，納米粒子可以用于治療傳統(tǒng)上使用和/ 或指示需要放射療法的癌前病變或特定良性疾病。
[0117] 在治療情形下，本發(fā)明可應(yīng)用于原發(fā)性腫瘤或繼發(fā)性侵襲、局部區(qū)域性或遠距離 轉(zhuǎn)移，以及在預防情形下避免繼發(fā)性惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，例如避免觀察到的從黑色素 瘤、肺癌、腎癌、乳腺癌等的侵襲（轉(zhuǎn)移）。
[0118] 納米粒子可以在整個抗癌治療期內(nèi)的任何時間使用。它們可以例如以新佐劑（在 用于癌癥切除的手術(shù)干預之前）或以佐劑（在手術(shù)之后）形式施用。
[0119] 所述納米粒子還可以用于不能通過手術(shù)除去的晚期腫瘤。
[0120] 本文所述的納米粒子特定欲用于治療癌癥，其中放射療法是一種經(jīng)典的治療方 法。所述癌癥可特別選自由以下組成的群組：皮膚癌，包括與AIDS相關(guān)的惡性瘤、黑色 素瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，包括大腦、腦干、小腦、垂體、椎管、眼球和眼眶；頭頸部腫瘤；肺 癌；乳腺癌；胃腸道腫瘤，例如肝癌和肝膽道癌、結(jié)腸癌、直腸癌和肛門癌、胃癌、胰腺癌、食 道癌；男性泌尿生殖系腫瘤，例如前列腺癌、睪丸癌、陰莖癌和尿道癌；婦科腫瘤，例如子宮 頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、輸卵管癌、陰道癌和外陰癌；腎上腺和腹膜后腫瘤；與定位無關(guān) 的骨骼和軟組織肉瘤；淋巴瘤；骨髓瘤；白血??；以及兒科腫瘤，例如腎母細胞瘤（Wilm's tumor)、神經(jīng)母細胞瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、尤因肉瘤（Ewing's sarcoma)等。
[0121] 本文所述的納米粒子現(xiàn)在可進一步用于放射療法情形中，其中它們的使用允許在 保持其破壞腫瘤細胞的效率的同時降低放射療法的劑量。
[0122] 在電離輻射、特別是X射線、Y射線、放射性同位素和/或電子束的作用下，納米 粒子受激發(fā)并產(chǎn)生電子和/或高能光子。在電離后發(fā)射的那些電子和/或高能光子將經(jīng)由 自由基產(chǎn)生而造成直接和/或間接的細胞損傷，并最終造成細胞破壞，對患者產(chǎn)生更好的 結(jié)果。
[0123] 根據(jù)電離輻射的能量，納米粒子因此可以實現(xiàn)組織的破壞和/或簡單地用于成像 和/或診斷目的的可視化。
[0124] 粒子可以在大范圍的總輻射劑量下受到激發(fā)。
[0125] 量和時間表（以單一劑量形式或在分割或超分割治療方案情形下的，對照射的計 劃和遞送等）是針對任何疾病/解剖部位/疾病階段患者設(shè)置/患者年齡（兒童、成人、老 年患者）進行限定，并構(gòu)成任何具體情形的護理標準。
[0126] 在一種或多種場合下，通過使用任何目前可用的放射療法或造影系統(tǒng)，在施用納 米粒子后可以在任何時間應(yīng)用照射。
[0127] 如先前所示，適當?shù)妮椛浠蚣ぐl(fā)源優(yōu)選為電離輻射并且可以有利地選自由X射 線、Y射線、電子束、離子束和放射性同位素或放射性同位素發(fā)射組成的群組。X射線是特 別優(yōu)選的激發(fā)源。
[0128] 電離輻射典型地為約2KeV至約25000KeV，特別是約2KeV至約6000KeV(LINAC 源），或約2KeV至約1500KeV (例如鈷60源）。
[0129] 一般來說并且以非限制性方式，下列X射線可以在不同情況下應(yīng)用以激發(fā)粒子：
[0130] _2至50keV的淺層X射線：激發(fā)接近表面的納米粒子（幾毫米的穿透）；
[0131] -50至150keV的X射線：用于診斷但也用于治療；
[0132] -200至500keV的X射線（常電壓），其可穿透6cm的組織厚度；
[0133] -lOOOkeV至25, OOOkeV的X射線（兆電壓）。例如，可以經(jīng)由五個能量為15, OOOkeV 的聚焦X射線來進行用于前列腺癌治療的納米粒子激發(fā)。
[0134] 放射性同位素可以可選地用作電離輻射源（稱為鐳療法或近距離放射療法）。特 別地，可以有利地使用碘I 125(t72 = 60. 1天）、鈀PcTa% = 17天）、銫Cs137和銥Ir192。
[0135] 帶電粒子如質(zhì)子束、離子束如碳、特別是高能離子束也可以用作電離輻射源和/ 或中子束。
[0136] 電子束也可用作具有介于4MeV與25MeV之間的能量的電離輻射源。
[0137] 特定的單色照射源可用于以接近于或?qū)?yīng)于構(gòu)成金屬材料的原子或鉿元素的所 需X射線吸收限的能量選擇性產(chǎn)生X射線輻射。
[0138] 電離輻射源優(yōu)先可選自線性加速器（LINAC)、鈷60和近距離放射療法源。
[0139] 在診斷領(lǐng)域中，本發(fā)明的納米粒子可以用作造影劑，用于檢測和/或可視化任何 類型的組織。因此，本發(fā)明的一個目的涉及如上文所定義的納米粒子用于檢測和/或可視 化細胞、組織或器官的用途，所述納米粒子當暴露于特別是通過造影裝置所產(chǎn)生的輻射時 同樣呈生物惰性并且可活化（即可用作診斷劑）。
[0140] 本公開進一步提供包含本文所述的納米粒子或組合物以及其組合中的任一種的 試劑盒。典型地，所述試劑盒至少包含根據(jù)本發(fā)明的納米粒子、典型地為其懸浮液。一般來 說，所述試劑盒進一步包含一個或多個填充有一種或多種本發(fā)明組合物的本文所述成分的 容器?？梢越Y(jié)合所述容器提供標簽通知，其提供關(guān)于使用產(chǎn)品的說明以用于根據(jù)本發(fā)明方 法使用納米粒子或組合物。
[0141] 在以下實施例中，本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點將變得顯而易見，所述實施例是出于 說明目的而非作為限制而給出。
[0142] 實施例
[0143] 實施例1 :金微晶的合成
[0144] 通過在水溶液中用檸檬酸鈉還原金氯化物（HAuC14)而獲得金微晶。方案改編自 G. Frens Nature Physical Science241(1973)21〇
[0145] 在一個典型的實驗中，將碰11(：14溶液加熱至沸騰。隨后，添加檸檬酸鈉溶液。所 得溶液在沸騰下再維持5分鐘的時期。
[0146] 可通過小心地調(diào)節(jié)檸檬酸鹽/金前體比率來調(diào)節(jié)微晶尺寸（參見表1)。
[0147] 然后用水洗滌所制備的金微晶懸浮液并使用具有30kDa纖維素膜的超濾裝置 (Amicon攪拌單元，8400型，來自Millipore)來濃縮，至少濃縮至金濃度等于或大于lg/L。 通過ICP-MS測定金含量。
[0148] 最終在層流罩下通過0.22 μ m截止膜過濾器（PES膜，來自Millipore)過濾所得 懸浮液并儲存在4°C下。
[0149] 使用透射電子顯微鏡（TEM)通過計入200個以上粒子來測定金微晶尺寸。建立直 方圖并報道平均值和標準偏差。
[0150] 表1 :用檸檬酸鈉還原金氯化物而獲得的典型的金微晶?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)檸檬酸鹽/金 前體比率來調(diào)節(jié)尺寸。
[0151]

【權(quán)利要求】
1. 一種納米粒子，其包含至少部分被氧化鉿材料覆蓋或包埋于其中的金屬材料。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米粒子，其中所述金屬材料選自金（Au)、銀（Ag)、鉬（Pt)、 鈀（Pd)、錫（Sn)、鉭（Ta)、鐿（Yb)、鋯（Zr)、鉿（Hf)、鋱（Tb)、銩（Tm)、鈰（Ce)、鏑（Dy)、鉺 (Er)、銪（Eu)、欽（Ho)、鐵（Fe)、鑭（La)、釹（Nd)、鐠（Pr)、镥（Lu)和它們的混合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的納米粒子，其中至少80%的所述金屬材料被所述氧化鉿 材料保護免于與生物材料發(fā)生任何相互作用。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的納米粒子，其中所述金屬材料為金屬微晶或金屬 微晶聚集體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米粒子，其中所述納米粒子包含一個或幾個金屬微晶。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的納米粒子，其中所述納米粒子包含幾個氧化鉿微 晶或氧化鉿微晶聚集體。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的納米粒子，其中金屬微晶的最大尺度介于約2nm 與約100nm之間并且氧化鉿微晶的最大尺度介于約5nm與約50nm之間。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的納米粒子，其中納米粒子的最大尺度介于l〇nm 與250nm之間。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的納米粒子，其中所述金屬材料用有利于所述金屬 與所述氧化鉿材料之間的粘著的試劑涂布。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的納米粒子，其中所述金屬材料和/或所述氧化 鉿材料與藥物分子鍵合。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的納米粒子，其中每個藥物分子包含可裂解部分， 使得當所述納米粒子暴露于特定刺激時釋放出所述藥物分子。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的納米粒子，其中所述氧化鉿材料被選自展現(xiàn)隱 身性質(zhì)的試劑、允許與生物靶標相互作用的試劑和其組合的生物相容性材料涂布。
13. -種組合物，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的納米粒子以及藥學上可接 受的載體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至12所述的納米粒子或根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中當納 米粒子暴露于輻射時，所述納米粒子或組合物在哺乳動物中、優(yōu)選在人類中用作診斷劑。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至12所述的納米粒子或根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中優(yōu)選 當納米粒子暴露于輻射時，所述納米粒子或組合物在哺乳動物中、優(yōu)選在人類中用作尤其 是在腫瘤學中的治療劑。
【文檔編號】A61P35/00GK104093401SQ201280062223
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月16日
【發(fā)明者】艾格內(nèi)斯·波迪爾, 勞倫特·萊維, 馬里-艾迪斯·梅爾 申請人:納米生物技術(shù)公司