聚合物蛋白微粒的制作方法

聚合物蛋白微粒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了包含治療性蛋白核心和生物相容的且生物可降解的聚合物皮層的微粒，和制造和使用所述微粒的方法。本發明顯示，所述治療性蛋白在生理溶液中在延長的時期內，從所述微粒延長釋放。
【專利說明】聚合物蛋白微粒
發明領域
[0001]本發明涉及延長釋放的蛋白治療劑的制備、組合物和用途。特別地，本發明涉及多種聚合物包被的蛋白微球體的制備、組合物和用途，其用于蛋白質在基于水的或生理的環境中隨時間的延長和均勻的釋放。
[0002]發明背景
[0003]施用給生物學目標(例如視網膜或腫瘤)或胃腸外施用的治療性蛋白的延長釋放對于許多不同病況包括癌癥、心血管疾病、血管病況、骨科疾病、牙科疾病、創傷、自身免疫性疾病、腸胃失調和眼科疾病的治療是期望的。用于受控地和延長地遞送藥物的生物相容的和生物可降解的聚合物已使用了數十年。隨著聚合物隨時間的降解，治療性藥物緩慢釋放。
[0004]對于眼內治療劑，存在著對于延長釋放的制劑的顯著的、未被滿足的醫學需求，所述制劑用于通過盡可能少的眼內注射來隨時間有效地遞送蛋白治療劑。對于其他疾病，例如癌癥、炎性疾病和其他疾病，存在著對于包含蛋白治療劑的改良的可植入的延長釋放的制劑的需求。
[0005]本 申請人:已發現并于本文中公開和要求保護，制備和使用包含生物可降解聚合物和治療性蛋白的微粒 的方法，所述微粒能夠在延長的時間段內均勻地釋放治療有效量的治療性蛋白。
[0006]發明概述
[0007]在一個方面，本發明提供了包含聚合物包被的蛋白的微粒。在一個實施方案中，所述微粒具有約2微米至約70微米的直徑。在一個實施方案中，所述微粒具有約15微米的直徑。
[0008]在一個實施方案中，蛋白是抗原結合蛋白。在一個實施方案中，蛋白包含Fe結構域。在一個實施方案中，蛋白包含受體結構域。在一個實施方案中，蛋白是抗體。在另一個實施方案中，蛋白是受體-Fe融合蛋白。在另一個實施方案中，蛋白是陷講型(trap-type)蛋白，其包含同源受體片段和Fe結構域。在一個具體實施方案中，蛋白是VEGF-Trap蛋白。在一個實施方案中，VEGF-Trap蛋白包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
[0009]在一個實施方案中，聚合物是生物可降解聚合物。在一些實施方案中，聚合物選自聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚_D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-環氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)(PLGA-alpha-tocopheryl succinate esterified to polyethyleneglycol 1000)、聚酐聚[1，6-二(對-羧基苯氧基)己燒](pCPH)、聚(輕丁酸-共羥基戍酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε -己內酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚異丁基氰基丙烯酸酯、聚-Ν-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β -R-羥基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚β -R-蘋果酸、磷脂-膽固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/膽固醇、多糖、纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、藻酸鹽或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝膠聚合物、直鏈淀粉、菊粉、果膠和瓜爾膠、殼聚糖、殼多糖、肝素、透明質酸、基于環糊精(CD)的聚輪烷和聚類輪烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸鹽或酯(PBS)、明膠、膠原、纖維蛋白、絲心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、摻入潛在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(對苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其組合和共聚物。在一個實施方案中，聚合物是聚-ε-己內酯(PCL)或其衍生物或共聚物。在一個實施方案中，聚合物是PLGA或其衍生物或共聚物。在一個實施方案中，聚合物是乙基纖維素或其衍生物或共聚物。在一個實施方案中，聚合物是聚原酸酯或其衍生物或共聚物。
[0010]在一個實施方案中，微粒包含小于10微米的微粒化蛋白核心和聚合物皮層。在一個實施方案中，微粒化蛋白核心用聚合物包被至少50 %，也即，暴露不多于50 %的微粒化蛋白核心的表面。在一個實施方案中，用聚合物包被至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少99 %或100 %的微粒化蛋白核心的表面。
[0011]在一個實施方案中，粒度大于10微米的微粒包含(a)小于10微米的微粒化蛋白核心，其中所述蛋白是抗體或抗體片段、受體或其可溶性片段、可溶性T細胞受體片段、可溶性MHC片段、受體-Fe融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白中的任一種或多種；和(b)聚合物涂層，其中所述聚合物是下列中的任一種或多種:生物相容的聚合物、生物可降解聚合物、生物可蝕解聚合物、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-環氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6-二(對-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羥丁酸-共羥基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε-己內酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚異丁基氰基丙烯酸酯、聚-N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羥基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚β -R-蘋果酸、磷脂-膽固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿/聚乙 二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/膽固醇、多糖、纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、藻酸鹽或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝膠聚合物、直鏈淀粉、菊粉、果膠和瓜爾膠、殼聚糖、殼多糖、肝素、透明質酸、基于環糊精(CD)的聚輪烷和聚類輪烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸鹽或酯(PBS)、明膠、膠原、纖維蛋白、絲心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、摻入潛在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(對苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其組合和共聚物。
[0012]在一個實施方案中，具有約15微米至約30微米的平均直徑的微粒包含(a)約10微米至約12微米的微粒化蛋白核心，其中所述蛋白是VEGF-Trap蛋白；和(b)聚合物涂層，其中所述聚合物是下述中的任一種或多種:PCL、PLGA、乙基纖維素和聚原酸酯，以及其共聚物和衍生物。
[0013]在一個方面，本發明提供多個微粒，其具有約2微米至約70微米的粒度，并且包含約2微米至約30微米的微粒化蛋白核心和聚合物皮層。
[0014]在一個實施方案中，蛋白是抗原結合蛋白。在一些實施方案中，抗原結合蛋白是抗體或抗體片段、受體或其可溶性片段、可溶性T細胞受體片段、可溶性MHC片段、受體-Fe融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白中的任一種或多種。在一個實施方案中，蛋白包含Fe結構域。在一個實施方案中，蛋白是抗體。在另一個實施方案中，蛋白是受體-Fe融合蛋白。在另一個實施方案中，蛋白是陷阱型蛋白，其包含同源受體片段和Fe結構域。在一個具體實施方案中，蛋白是VEGF-Trap蛋白。在一個具體實施方案中，VEGF-Trap蛋白包含SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列。
[0015]在一個實施方案中，聚合物是生物相容的聚合物。在一個實施方案中，聚合物是生物可蝕解聚合物。在一個實施方案中，聚合物是生物可降解聚合物。在一些實施方案中，聚合物選自聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-環氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6_ 二(對-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羥丁酸-共羥基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε -己內酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚異丁基氰基丙烯酸酯、聚-Ν_(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羥基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚β -R-蘋果酸、磷脂-膽固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/膽固醇、多糖、纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、藻酸鹽或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝膠聚合物、直鏈淀粉、菊粉、果膠和瓜爾膠、殼聚糖、殼多糖、肝素、透明質酸、基于環糊精(CD)的聚輪烷和聚類輪烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸鹽或酯(PBS)、明膠、膠原、纖維蛋白、絲心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、摻入潛在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(對苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其組合和共聚物。在一個實施方案中，聚合物是聚-ε -己內酯(PCL)或其衍生物或共聚物。在一個實施方案中，聚合物是PLGA或其衍生物或共聚物。在一個實施方案中，聚合物是乙基纖維素或其衍生物或共聚物。在一個實施方案中，聚合物是摻入潛在性酸的聚原酸酯。
[0016]在一個實施方案中，多個微粒中的大多數微粒的微粒化蛋白核心用聚合物包被至少50%,也即，暴露不多于 50%的微粒化蛋白核心的表面。在一個實施方案中，用聚合物包被至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少99 %或100 %的微粒化蛋白核心的表面。
[0017]在一個實施方案中，具有約2微米至約70微米的粒度的多個微粒包含(a)約2微米至約30微米的微粒化蛋白核心，其中所述蛋白是抗體或抗體片段、受體或其可溶性片段、可溶性T細胞受體片段、可溶性MHC片段、受體-Fe融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白中的任一種或多種；和(b)聚合物皮層，其中所述聚合物是下列中的任一種或多種:生物相容的聚合物、生物可降解聚合物、生物可蝕解聚合物、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-環氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚-ε -己內酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚酐聚[1，6- 二(對-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羥丁酸-共羥基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚異丁基氰基丙烯酸酯、聚-N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β -R-羥基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚β -R-蘋果酸、磷脂-膽固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/膽固醇、多糖、纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、藻酸鹽或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝膠聚合物、直鏈淀粉、菊粉、果膠和瓜爾膠、殼聚糖、殼多糖、肝素、透明質酸、基于環糊精(CD)的聚輪烷和聚類輪烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸鹽或酯(PBS)、明膠、膠原、纖維蛋白、絲心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、摻入潛在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(對苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其組合和共聚物。
[0018]在一個實施方案中，具有約2微米至約70微米粒度、具有約15微米至約30微米粒度中值的多個微粒包含(a)具有約10微米至約12微米粒度中值的約2微米至約30微米的微粒化蛋白核心，其中所述蛋白是VEGF-Trap蛋白；和(b)聚合物皮層,其中所述聚合物是下述中的任一種或多種:PLA、PCL、PLGA、乙基纖維素和聚原酸酯及其共聚物和衍生物。
[0019]在一個方面，本發明提供了制備微粒的方法，所述微粒包含蛋白核心和聚合物皮層。在一個實施方案中，制備的微粒具有約2微米至約70微米的直徑，或約15微米至約30微米的直徑中值。在一個實施方案中，制備微粒的方法包括(I)獲得蛋白顆粒；(2)在包含聚合物和溶劑的溶液中懸浮蛋白顆粒；和(3)去除溶劑，其中形成了包含由聚合物皮層包被的蛋白核心的微粒。
[0020]在一個實施方案中，步驟(1)的蛋白顆粒是微粒化的蛋白顆粒，其通過噴霧干燥包含所述蛋白的溶液來獲得。在一些實施方案中，蛋白溶液通過雙噴嘴超聲法、單噴嘴超聲法或電噴射來噴霧干燥。在一些實施方案中，產生的微粒化蛋白顆粒(其形成制備的微粒的核心)具有約2微米至約30微米的直徑、約10微米至約12微米的直徑中值。
[0021]在一些實施方案中，形成核心的蛋白是抗原結合蛋白。在一些實施方案中，抗原結合蛋白是抗體(例如IgG)或抗體片段、受體或其可溶性片段、可溶性T細胞受體片段、可溶性MHC片段、受體-Fe融 合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白中的任一種或多種。在特別的實施方案中，蛋白是包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的VEGF-Trap蛋白。
[0022]在一個實施方案中，通過產生步驟(2)的蛋白-聚合物-溶劑混合物的分散相和允許溶劑從所述分散相產生的微滴中揮發來在步驟(3)去除溶劑。在一個實施方案中，通過噴霧干燥來產生分散相，所述噴霧干燥可通過雙噴嘴超聲法、單噴嘴超聲法或電噴射來進行。在一個實施方案中，通過應用熱或空氣或通過化學萃取來從微滴去除溶劑。
[0023]在一個實施方案中，聚合物是生物可降解的、生物可蝕解的和/或生物相容的。在一些實施方案中，聚合物是下列的任意一種或多種:聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-環氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α-生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6-二(對-羧基苯氧基)己烷](PCPH)、聚(羥丁酸-共羥基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε -己內酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚異丁基氰基丙烯酸酯、聚-Ν-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β -R-羥基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚β -R-蘋果酸、磷脂-膽固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/膽固醇、多糖、纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、藻酸鹽或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝膠聚合物、直鏈淀粉、菊粉、果膠和瓜爾膠、殼聚糖、殼多糖、肝素、透明質酸、基于環糊精(CD)的聚輪烷和聚類輪烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸鹽或酯(PBS)、明膠、膠原、纖維蛋白、絲心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、摻入潛在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(對苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其組合和共聚物。在一個實施方案中，聚合物是聚-ε -己內酯(PCL)或其衍生物或共聚物。在一個實施方案中，聚合物是PLGA或其衍生物或共聚物。在一個實施方案中，聚合物是乙基纖維素或其衍生物或共聚物。在一個實施方案中，聚合物是聚原酸酯或其衍生物，其包含對酸敏感的成分(acid labile elements)。在另一個實施方案中，聚合物是PLA。
[0024]在一個方面，本發明提供制備微粒的方法，所述方法包含如下步驟:⑴通過噴霧干燥包含蛋白的溶液形成具有約2微米至約30微米直徑、約10微米至約12微米直徑中值的微粒化蛋白顆粒，其中所述蛋白是抗原結合蛋白。在一些實施方案中，抗原結合蛋白是抗體或抗體片段、受體或其可溶性片段、可溶性T細胞受體片段、可溶性MHC片段、受體-Fe融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白(例如具有SEQID NO:1的序列的蛋白)中的任一種或多種；(2)在包含聚合物和溶劑的溶液中懸浮微粒化蛋白顆粒，其中所述聚合物是下列中的任一種或多種:聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-環氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6-二(對-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羥丁酸-共羥基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε-己內酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚異丁基氰基丙烯酸酯、 聚-N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羥基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚β -R-蘋果酸、磷脂-膽固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/膽固醇、多糖、纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、藻酸鹽或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝膠聚合物、直鏈淀粉、菊粉、果膠和瓜爾膠、殼聚糖、殼多糖、肝素、透明質酸、基于環糊精(CD)的聚輪烷和聚類輪烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸鹽或酯(PBS)、明膠、膠原、纖維蛋白、絲心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、摻入潛在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(對苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其組合和共聚物；和(3)通過下列來去除溶劑:噴霧干燥微粒化蛋白顆粒-聚合物-溶劑懸液，和通過應用熱或空氣或通過萃取溶劑而餾出溶劑，其中形成了具有約2微米至約70微米直徑、約15微米至約30微米直徑中值并且包含蛋白核心和聚合物皮層的微粒。
[0025]在一些實施方案中，通過雙噴嘴超聲法、單噴嘴超聲法或電噴射來進行步驟(1)或步驟(3)的噴霧干燥。
[0026]在一個實施方案中，制備微粒的方法包括如下步驟:(1)通過噴霧干燥包含VEGF-Trap蛋白的溶液來形成具有約10微米至約12微米直徑的微粒化VEGF-Trap顆粒；
(2)在包含摻入潛在性酸的聚原酸酯和相容的溶劑或者包含乙基纖維素和相容的溶劑的溶液中懸浮微粒化的VEGF-Trap顆粒；和(3)通過下列來去除溶劑:(a)噴霧干燥微粒化VEGF-Trap顆粒-聚原酸酯-潛在性酸-溶劑的懸液或微粒化VEGF-Trap顆粒-乙基纖維素-溶劑的懸液和(b)通過應用熱或空氣或通過萃取溶劑而餾出溶劑，其中形成了具有約15微米至約30微米直徑并且包含VEGF-Trap核心和聚原酸酯及其共聚物或衍生物的聚合物皮層的微粒。
[0027]在一個方面，本發明提供了治療性蛋白的延長釋放制劑，其用于隨時間過去釋放或遞送穩定水平的治療性蛋白。所述延長釋放制劑包含多個微粒，其具有約2微米至約70微米的粒度，其中每一個微粒包含約2微米至約30微米的微粒化蛋白核心和聚合物皮層。
[0028]在一個實施方案中，治療性蛋白是抗原結合蛋白。在一些實施方案中，抗原結合蛋白是抗體(例如IgG)或抗體片段、受體或其可溶性片段、可溶性T細胞受體片段、可溶性MHC片段、受體-Fe融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白(例如具有SEQ ID NO:1的一級結構的蛋白)中的任一種或多種。在一個實施方案中，治療性蛋白包含Fe結構域。在一個實施方案中，蛋白是抗體。在另一個實施方案中，蛋白是IgG。在另一個實施方案中，治療性蛋白是受體-Fe融合蛋白。在另一個實施方案中，治療性蛋白是陷阱型蛋白，其包含同源受體片段和Fe結構域。在一個具體實施方案中，治療性蛋白是VEGF-Trap蛋白。在另一個實施方案中，VEGF-Trap蛋白包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。[0029]在一個實施方案中，聚合物皮層包含生物相容的聚合物。在一個實施方案中，聚合物皮層包含生物可蝕解的聚合物。在一個實施方案中，聚合物皮層包含生物可降解的聚合物。在一些實施方案中，聚合物皮層包含選自下列的聚合物:聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-環氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[I, 6- 二(對-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羥丁酸-共羥基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε -己內酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚異丁基氰基丙烯酸酯、聚-N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β -R-羥基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚β -R-蘋果酸、磷脂-膽固醇聚合物、2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/膽固醇、多糖、纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、藻酸鹽或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝膠聚合物、直鏈淀粉、菊粉、果膠和瓜爾膠、殼聚糖、殼多糖、肝素、透明質酸、基于環糊精(CD)的聚輪烷和聚類輪烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸鹽或酯(PBS)、明膠、膠原、纖維蛋白、絲心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、摻入潛在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(對苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其組合和共聚物。在一個實施方案中，聚合物是聚-ε-己內酯(PCL)或其衍生物或共聚物。在一個實施方案中，聚合物皮層包含PLGA。在一個實施方案中，聚合物皮層包含乙基纖維素。在一個實施方案中，聚合物皮層包含PLA、PLGA、乙基纖維素和聚原酸酯及其共聚物或衍生物的任一種或多種。
[0030]在一個實施方案中，多個微粒包含具有一系列厚度的聚合物皮層的微粒的集合，以便微粒集合中的個體微粒以不同的速率降解，從而允許治療性蛋白以均勻的速率釋放。
[0031]在一個實施方案中，多個微粒包含未包被的微粒化蛋白顆粒和具有一系列厚度的聚合物皮層的微粒的混合物，其允許治療性蛋白根據皮層厚度以周期性間隔釋放。
[0032]在一個實施方案中，多個微粒包含具有不同疏水性水平的聚合物皮層的微粒的混合物，以控制降解和隨后釋放的時間安排(timing)或持續時間。在一個實施方案中，微粒各自包含內聚合物層和外聚合物層，其中外聚合物層限制內聚合物層的水合以控制治療性蛋白的釋放。
[0033]在一個實施方案中，當微粒在水性環境中時，治療性蛋白以約0.01mg/周至約0.30mg/周的速率以至少60天的持續時間從多個微粒中釋放。在一個實施方案中,水性環境是體外緩沖液。在一個實施方案中，水性環境是體內的。在一個實施方案中，水性環境是離體的。在一個實施方案中，水性環境是玻璃體液。
[0034]在一個實施方案中，延長釋放制劑包含多個微粒，其具有約2微米至約70微米的粒度并且包含(a)約2微米至約30微米的微粒化治療性蛋白的核心，其中所述治療性蛋白是抗原結合蛋白，所述抗原結合蛋白在一些情況下可以是抗體或抗體片段、受體或其可溶性片段、可溶性T細胞受體片段、可溶性MHC片段、受體-Fe融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白中的任一種或多種；和(b)具有一系列厚度的聚合物皮層，其中所述聚合物是下列中的任一種或多種:生物相容的聚合物、生物可降解聚合物、生物可蝕解聚合物、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA) ,PLGA-環氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA- α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6_ 二(對-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羥丁酸-共羥基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε -己內酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚異丁基氰基丙烯酸酯、聚-N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β -R-羥基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚β -R-蘋果酸、磷脂-膽固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/膽固醇、多糖、纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、藻酸鹽或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝膠聚合物、直鏈淀粉、菊粉、果膠和瓜爾膠、殼聚糖、殼多糖、肝素、透明質酸、基于環糊精(CD)的聚輪烷和聚類輪烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸鹽或酯(PBS)、明膠、膠原、纖維蛋白、絲心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、摻入潛在性酸的聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(對苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其組合和共聚物，其中所述微粒以約0.01mg/周至約0.30mg/周的速率釋放或遞送穩定水平的治療性蛋白至少60天。
[0035]在一個實施方 案中，延長釋放制劑包含多個微粒，其具有約2微米至約70微米的粒度、約15微米至約30微米的粒度中值，并且包含(a)具有約10微米至約12微米粒度中值的約2微米至約30微米的微粒化蛋白核心,其中所述蛋白是VEGF-Trap蛋白；和(b)具有一系列厚度的聚合物皮層，其中所述聚合物是PLGA、乙基纖維素和聚原酸酯及其共聚物或衍生物中的任一種或多種，從而在水性環境中微粒以約0.06±0.02mg/周的速率釋放或遞送穩定水平的VEGF Trap至少60天。
[0036]在一個方面，本發明提供了用于調節蛋白釋放的方法。在一個實施方案中，所述方法包括，制造如上文所述的多個微粒的步驟和隨后將所述微粒置于溶劑中的步驟。在一些實施方案中所述溶劑是水性的。溶劑可以是體外的，例如在磷酸鹽緩沖溶液中。溶劑可以是體內的，例如玻璃體液。
[0037]附圖
[0038]圖1 描述了從 50mg/ml 的 VEGF Trap 蛋白、25mg/ml 的 VEGF Trap 蛋白和 25mg/ml的VEGF Trap蛋白加0.1 %聚山梨酯80制備的蛋白顆粒群體中的具有給定直徑(ECD ( μ m))的無聚合物皮層的蛋白顆粒的相對量(體積％)。
[0039]圖 2 描述了從50mg/ml 的 VEGF Trap 蛋白加 50mg/ml P0E、250mg/ml POE和 50mg/mlEC制備的微粒群體中具有給定直徑(ECD ( μ m))的微粒的相對量(由MFI測定的體積％ )。
[0040]圖3 描述了在大約 60 天內從由 50mg/ml P0E、250mg/ml POE 或 50mg/ml EC 制備的微粒中釋放的VEGF Trap蛋白的量(以毫克計)。
[0041]發明詳述
[0042]本發明的微粒和蛋白核心顆粒在形狀上是大致球形的。一些微粒和蛋白核心接近球形，而其他的則在形狀上較不規則。因此，如本文中所用，術語“直徑”意指下列的每一個和任一個:(a)限定微粒或蛋白核心的球體的直徑，(b)適合在微粒或蛋白核心范圍內的最大球體的直徑，(c) (a)的限定球體和(b)的限制球體之間的任意測量值，包括兩者之間的平均值，(d)微粒或蛋白核心的最長軸的長度，(e)微粒或蛋白核心的最短軸的長度，(f)(d)的長軸長度和(e)的短軸長度之間的任意測量值，包括兩者之間的平均值，和/或(g)圓當量直徑(“ECD”)，如通過微流成像(MFI)、納米顆粒徑跡分析(NTA)或光阻法例如動態光散射(DLS)所測量的。通常參見 Sharma 等人，Micro-flow imaging: flow microscopyapplied to subvisible particulate analysis in protein formulations,AAPSJ.2010Sep ;12(3):455-64。直徑通常以微米(μ m或微米)表示。直徑可通過光學測量來測定。
[0043]術語“微粒化蛋白顆粒”或“蛋白顆粒”意指含有低的、很低的或接近于零的量的水(例如，按重量〈3%的水)的、包含多個蛋白分子的顆粒。如本文中所用，微粒化蛋白顆粒在形狀上通常是球形的并且具有2微米至約35微米的ECD。微粒化蛋白顆粒不限于任何特定的蛋白實體，并且適合于制備和遞送治療性蛋白。常用的治療性蛋白特別地包括抗原結合蛋白，例如可溶性受體片段，抗體(包括IgG)和抗體衍生物或片段，其它的含Fe蛋白，包括Fe融合蛋白，和受體-Fe融合蛋白，包括陷講型蛋白(Huang, C.，Curr.0pin.Biotechnol.20:692-99(2009))例如 VEGF-Trap。
[0044]本發明的微粒化蛋白顆粒可以用本領域已知的用于制造微米尺寸的蛋白顆粒的任何方法來制造。例 如，特別地，可通過噴霧干燥(參見下文所述)、冷凍干燥、氣流粉碎、懸滴結晶(Ruth 等人,ActaCrystallographica D56:524-28 (2000))、逐步沉淀(US7，998，477 (2011))、蛋白-PEG (聚乙二醇)水性混合物的冷凍干燥(Morita etal., Pharma.Res.17:1367-73 (2000))、超臨界流體沉淀(US6, 063，910 (2000))或高壓二氧化碳誘導的顆粒形成(Bustami et al., Pharma.Res.17:1360-66 (2000))來制造蛋白顆粒。
[0045]如本文中使用，術語“蛋白”意指，包含通過肽鍵彼此連接的兩個或更多個氨基酸殘基的分子。肽、多肽和蛋白還可包含修飾，包括但不限于糖基化、脂質連接、硫酸化、谷氨酸殘基的Y-羧化、羥基化和ADP-核糖基化。多肽可具有科學上或商業上的益處，包括基于蛋白的藥物。多肽特別地包括抗體和嵌合或融合蛋白。多肽可通過使用細胞培養方法由重組動物細胞系產生。
[0046]術語“抗體”意指由4條多肽鏈(通過二硫鍵相互連接的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈)組成的免疫球蛋白分子。每一條重鏈具有重鏈可變區(HCVR或VH)和重鏈恒定區。重鏈恒定區包含3個結構域:CH1、CH2和CH3。每一條輕鏈具有輕鏈可變區和輕鏈恒定區。輕鏈恒定區由一個結構域(CL)組成。VH和VL區域可進一步細分為高變區(稱為互補決定區(CDR))，其間間插有更為保守的區域(稱為框架區(FR))。每一個VH和VL包含3個CDR和4個FR，其從氨基末端至羧基末端按下列順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術語“抗體”包括任意同種型或亞類的糖基化和非糖基化的免疫球蛋白。術語“抗體”包括但不限于通過重組方法制備、表達、產生或分離的那些抗體，例如從被轉染以表達抗體的宿主細胞分離的抗體。IgG構成抗體的亞組。
[0047]術語“Fe融合蛋白”包含兩種或更多種蛋白的部分或全部，其中一個蛋白是免疫球蛋白分子的Fe部分，其在天然狀態下不是融合的。包含融合至抗體來源多肽的不同部分(包括Fe結構域)的某些異源多肽的融合蛋白的制備已描述于例如Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.ScL USA88:10535, 1991 ；Byrn 等人,Nature344:677, 1990 ;和 Hollenbaugh 等人，"Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins' in Current Protocols in Immunology, Suppl.4, pagesl0.19.1-10.19.11, 1992。術語“受體 Fe 融合蛋白”包括，偶聯至Fe部分的受體的一個或多個胞外結構域，所述Fe部分在一些實施方案中包含鉸鏈區和隨后的免疫球蛋白CH2和CH3結構域。在一些實施方案中，Fe融合蛋白包含與單個或多于一個配體結合的兩個或更多個不同的受體鏈。例如，Fe融合蛋白是陷阱蛋白，例如IL-1陷阱蛋白(例如Rilonac印t，其包含融合至與hlgGl的Fe融合的IL-1R1胞外區的IL-1RAcP配體結合區；參見U.S.Pat.N0.6，927，004，其通過引用整體并入本文)，或VEGF Trap (例如，Aflibercept,其包含與hlgGl的 Fe融合的融合至VEGF受體Flkl的Ig結構域3的VEGF受體 Fltl 的 Ig 結構域 2 ;例如 SEQ ID NO:1 ;參見 U.S.Pat.Nos.7，087，411 和 7，279，159，其通過引用整體并入本文)。
[0048]如本文中所用，術語“聚合物”意指，包含通過共價化學鍵連接的重復單體的大分子。在本發明的顆粒中使用的聚合物是生物相容的和生物可降解的。生物相容的和生物可降解的聚合物可以是天然的或合成的。天然的聚合物包括多核苷酸、多肽，例如天然存在的蛋白、重組蛋白、明膠、膠原、纖維蛋白、絲心蛋白、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物；和多糖，例如纖維素藻酸鹽或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝膠聚合物、直鏈淀粉、菊粉、果膠和瓜爾膠、殼聚糖、殼多糖、肝素和透明質酸。合成的生物相容的或生物可降解的聚合物包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-環氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α -生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6-二(對-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羥丁酸-共羥基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε-己內酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚異丁基氰基丙烯酸酯、聚-N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羥基丁酸酯(PHB)、聚-β -R-羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚β -R-蘋果酸、磷脂-膽固醇聚合物、2- 二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE) /膽固醇、乙基纖維素、基于環糊精(CD)的聚輪烷和聚類輪烷、聚丁烯琥珀酸鹽或酯(PBS)、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、摻入潛在性酸以控制降解速率的聚原酸酯、和特別地，聚(乙二醇)/聚(對苯二甲酸丁二醇酯)共聚物。
[0049]乙基纖維素(EC)是眾所周知的且易于獲得的在藥物和食品科學中使用的生物材料。其是纖維素衍生物，其中一些葡萄糖羥基被乙醚替換。參見Martinac等人，J.Microencapsulation, 22(5):549-561(2005)及其中引用的參考資料，其描述了使用乙基纖維素作為生物相容的聚合物來制備微球體的方法。關于乙基纖維素和制備乙基纖維素衍生物的方法的詳細描述，也參見US4，210，529(1980)及其中引用的參考資料。
[0050]聚-D, L-丙交酯_共-乙交酯(PLGA)也是眾所周知的被美國食品和藥品管理局(FDA)批準用于組織工程學和藥物遞送系統的生物相容的和生物可降解的聚合物。PLGA是包含乙醇酸和乳酸單體的聚酯。關于合成PLGA和制備PLGA納米顆粒的描述，參見Asteteand Sabliov, Biomater.Sc1.Polym.Ed.，17(3):247-89(2006)及其中引用的參考資料。
[0051]聚-ε-己內酯(PCL)是另一個被FDA批準在人類中用作藥物遞送裝置的生物相容的和生物可降解的聚合物。PCL是ε-己內酯的聚酯，其在體內迅速水解以形成無毒的或低毒性的羥基羧酸。關于制備PCL的描述,參見Labet and Thielemans, ChemicalSociety Reviews38:3484 3504 (2009)及其中引用的參考資料。關于制備和使用基于PCL的微球體和納米球體(用作遞送系統)的描述，參見Sinha et al.，Int.J.Pharm.，278(1): 1-23(2004)及其中引用的參考資料。
[0052]聚原酸酯(POE)是設計用于藥物遞送的生物可蝕解聚合物。其通常是乙烯酮縮二乙醇(優選環化二乙烯酮縮二乙醇，例如3，9-二亞甲基-2，4，8，10-四氧雜螺[5.5]_i烷)的聚合物，其通過乙二醇縮合來聚合以形成原酸酯鍵。聚原酸酯的合成和不同類型的描述可見于例如US4，304，767。可通過換入或換出不同的疏水二醇和多元醇(例如用癸三醇替換己三醇)；以及可通過將潛在性酸(例如辛二酸等)加入骨架以增加PH靈敏度來修飾聚原酸酯，以控制其藥物釋放特征和降解速率。其它的對聚原酸酯的修飾包括，整合胺以增加功能性。聚原酸酯的形成、描述和用途描述于US5，968，543 ；US4, 764, 364 ；Heller 和 Ba rr, Biomacromolecules, 5(5):1625-32(2004)；和 Heller, Adv.Drug.Deliv.Rev.，57:2053-62(2005)。
[0053]如本文中所用，表述“噴霧干燥”意指，通過使用噴霧干燥器從漿液或懸液產生包含微米尺寸的顆粒的干燥粉末的方法。噴霧干燥器使用霧化器或噴霧嘴來將懸液或漿液分散成液滴尺寸受控的噴霧。通過噴霧干燥可產生10至500 μ m的液滴尺寸。隨著溶劑(水或有機溶劑)的干燥，蛋白物質干燥成微米尺寸的顆粒，形成粉末樣物質；或者對于蛋白-聚合物懸液，在干燥期間，聚合物在蛋白負載周圍形成硬化的殼。
[0054]本發明的微粒包含由聚合物皮層或涂層包繞的蛋白核心。簡言之，形成微粒化蛋白顆粒，其隨后在聚合物溶液(聚合物溶于溶劑中)中被分散以形成蛋白-聚合物懸液。蛋白-聚合物懸液隨后被分散成微粒化(霧化)微滴，并將溶劑從微粒中餾出。
[0055]在一個實施方案中，通過制造蛋白溶液和隨后將蛋白溶液經歷分散和加熱以形成包含蛋白的干燥粉末來形成微粒化蛋白顆粒。用于形成微粒化蛋白顆粒的一個方法是噴霧干燥。在一個實施方案中，蛋白是治療性蛋白，所述治療性蛋白經配制包含緩沖劑、穩定劑和其他藥學上可接受的賦形劑，以制造治療性蛋白的藥物制劑。示例性藥物制劑描述于US7, 365，165，US7, 572，893，US7, 608，261，US7, 655，758，US7, 807，164，US2010-0279933，US2011-0171241 和 PCT/US11/54856 中。
[0056]包含在本發明的藥物制劑內的治療性蛋白的量可取決于所述制劑的期望的特定性質以及意欲使用所述制劑的特定環境和目的。在某些實施方案中，藥物制劑可包含約lmg/mL 至約 500mg/mL 的蛋白；約 5mg/mL 至約 400mg/mL 的蛋白；約 5mg/mL 至約 200mg/mL的蛋白；約25mg/mL至約180mg/mL的蛋白；約25mg/mL至約150mg/mL的蛋白4450mg/mL至約180mg/mL的蛋白。例如，本發明的制劑可包含約lmg/mL ;約2mg/mL ;約5mg/mL ;約IOmg/mL ；約 15mg/mL ；約 20mg/mL ；約 25mg/mL ；約 30mg/mL ；約 35mg/mL ；約 40mg/mL ；約 45mg/mL ;約 50mg/mL ;約 55mg/mL ;約 60mg/mL ;約 65mg/mL ;約 70mg/mL ;約 75mg/mL ;約 80mg/mL ；約 85mg/mL ;約 86mg/mL ;約 87mg/mL ;約 88mg/mL ;約 89mg/mL ;約 90mg/mL ;約 95mg/mL ;約lOOmg/mL ;約 105mg/mL ;約 11 Omg/mT,;約 115mg/mL ;約 120mg/mL ;約 125mg/mL ;約 130mg/mL ;約 131mg/mL ;約 132mg/mL ;約 133mg/mL ;約 134mg/mL ;約 135mg/mL ;約 140mg/mT,;約145mg/mL ;約 150mg/mL ;約 155mg/mL ;約 160mg/mL ;約 165mg/mL ;約 170mg/mL ;約 175mg/mL ;約 180mg/mL ;約 185mg/mL ;約 190mg/mL ;約 195mg/mL ;約 200mg/mL ;約 205mg/mL ;約210mg/mL ;約 215mg/mL ;約 220mg/mL ;約 225mg/mL ;約 230mg/mL ;約 235mg/mL ;約 240mg/mL ;約 245mg/mL ;約 250mg/mL ;約 255mg/mL ;約 260mg/mL ;約 265mg/mL ;約 270mg/mL ;約275mg/mL ;約 280mg/mL ;約 285mg/mL ;約 200mg/mL ;約 200mg/mL ;或約 300mg/mL 的治療性蛋白。
[0057]本發明的藥物制劑包含一種或多種賦形劑。術語“賦形劑”，如本文中所用，意指加入制劑以提供期望的稠度、粘度或穩定作用的任意非治療性試劑。
[0058]本發明的藥物制劑還可包含一種或多種碳水化合物，例如一種或多種糖。糖可以是還原性糖或非還原性糖。術語“還原性糖”包括例如具有酮或醛基的糖，且包含反應性半縮醛基團，所述基團允許糖用作還原劑。還原性糖的具體實例包括果糖、葡萄糖、甘油醛、乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和麥芽糖。非還原性糖可包含異頭碳，其為縮醛并且實質上不與氨基酸或多肽反應以起始麥拉德反應。非還原性糖的具體實例包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、蔗糖素、松三糖和棉子糖。糖酸包括例如糖二酸(saccharic acid)、葡糖酸和其他多羥基糖及其鹽。
[0059]包含在本發明的藥物制劑內的糖的量可根據意欲使用所述制劑的特定環境和目的而不同。在某些實施方案中，所述制劑可包含約0.1%至約20%的糖；約0.5%至約20%的糖；約1%至約20%的糖；約2%至約15%的糖；約3%至約10%的糖；約4%至約10%的糖；或約5%至約10%的糖。例如，本發明的藥物制劑可包含約0.5%;約1.0%;約1.5%;約 2.0% ;約 2.5% ;約 3.0% ;約 3.5% ;約 4.0% ;約 4.5% ;約 5.0% ;約 5.5% ;約 6.0% ；6.5% ;約 7.0% ;約 7.5% ;約 8.0% ;約 8.5% ;約 9.0% ;約 9.5% ;約 10.0% ;約 10.5% ；約 11.0% ;約 11.5% ;約 12.0% ;約 12.5% ;約 13.0% ;約 13.5% ;約 14.0% ;約 14.5% ；約 15.0% ;約 15.5% ;約 16.0% ；16.5% ;約 17.0% ;約 17.5% ;約 18.0% ;約 18.5% ;約19.0% ;約19.5% ;或約20.0%的糖(例如蔗糖)。
[0060]本發明的藥物制劑還可包含一種或多種表面活性劑。如本文中所用，術語“表面活性劑”意指，減少溶解了其的液體的表面張力和/或減少油和水之間的界面張力的物質。表面活性劑可是離子型或非離子型的。可包含在本發明的制劑中的示例性非離子型表面活性劑包括例如烷基聚(氧化乙烷)、烷基多聚葡萄糖苷(例如辛基葡糖苷和癸基麥芽苷)、脂肪醇例如鯨蠟醇和油醇、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA和椰油酰胺TEA。可包含在本發明的制劑中的具體非離子型表面活性劑包括例如，聚山梨酯例如聚山梨酯20、聚山梨酯28、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚山梨酯81和聚山梨酯85 ;泊洛沙姆例如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407 ;聚乙烯-聚丙烯二醇；或聚乙二醇(PEG)。聚山梨酯20也稱為吐溫20、脫水山梨醇單月桂酸酯和聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯。
[0061]包含在本發明的藥物制劑內的表面活性劑的量可根據所述制劑的期望的特定性質以及意欲使用所述制劑的特定環境和目的而不同。在某些實驗方案中，所述制劑可包含約0.05%至約5%的表面活性劑；或約0.1%至約0.2%的表面活性劑。例如，本發明的制劑可包含約 0.05% ;約 0.06% ;約 0.07% ;約 0.08% ;約 0.09% ;約 0.10% ;約 0.11% ;約0.12% ;約 0.13% ;約 0.14% ;約 0.15% ;約 0.16% ;約 0.17% ;約 0.18% ;約 0.19% ;約0.20% ;約 0.21% ;約 0.22% ;約 0.23% ;約 0.24% ;約 0.25% ;約 0.26% ;約 0.27% ;約0.28% ;約0.29% ;或約0.30%的表面活性劑(例如聚山梨酯20)。
[0062]本發明的藥物制劑還可包含一種或多種緩沖液。在一些實施方案中，緩沖液具有覆蓋pH范圍5.5-7.4的部分或全部的緩沖范圍。在一個實施方案中，緩沖液具有約
6.0±0.5的pKa。在某些實施方案中，緩沖液包含磷酸鹽緩沖液。在某些實施方案中，緩沖液以 5mM±0.75mM 至 15mM±2.25mM ;6mM±0.9mM 至 14mM±2.1mM ;7mM±l.05mM 至13mM±l.95mM ;8mM±l.2mM 至 12mM±l.8mM ;9mM±l.35mM 至 llmM±l.65mM ;10mM±l.5mM ；或約IOmM的濃度存在。在某些實施方案中，緩沖系統包含pH為6.0±0.5的10mM± 1.5mM的組氨酸。
[0063]本發明的藥物制劑可具有約5.0至約8.0的pH。例如，本發明的制劑可具有約5.0 ;約 5.2 ;約 5.4 ;約 5.6 ;約 5.8 ;約 6.0 ;約 6.2 ;約 6.4 ;約 6.6 ;約 6.8 ;約 7.0 ;約 7.2 ；約7.4 ;約7.6 ;約7.8 ;或約8.0的pH。
[0064]在一個具體實施方案中，治療性蛋白是VEGF Trap蛋白。用于形成微粒化VEGFTrap蛋白顆粒的藥物制劑可包含約10mg/mL至約100mg/mL的VEGF Trap蛋白、約IOmg/mL、約 15mg/mL、約 20mg/mL、約 25mg/mL、約 30mg/mL、約 35mg/mL、約 40mg/mL、約 45mg/mL、約50mg/mL、約 55mg/mL、約 60mg/mL、約 65mg/mL、約 70mg/mL、約 75mg/mL、約 80mg/mL、約 85mg/mL、約90mg/mL、約95mg/mL、或約100mg/mL的VEGF Trap蛋白。溶液可包含一種或多種約5mM至約50mM的緩沖液。在一個實施方案中，緩沖液是具有約6±0.5的pH的約IOmM的磷酸鹽。溶液還可包含約1%至約10%濃度的蔗糖。在一個實施方案中，溶液包含約2% w/w的蔗糖。 [0065]在一些實施方案中，治療性蛋白溶液包含在10mM、pH6.2的磷酸鹽、2%蔗糖和任選地0.1 %聚山梨酯中的約25mg/mL或約50mg/mL的VEGF Trap蛋白。
[0066]治療性蛋白制劑隨后經歷分散和干燥以形成微粒化蛋白顆粒。制造微粒化蛋白顆粒的一個方法是，將蛋白溶液經歷噴霧干燥。噴霧干燥在本領域內是公知的并且可在設備例如BtiCHI Mini Spray Dryer B-290 (Biichi Labortechnik AG, Flawi 1，CH)上進行。在一個具體實施方案中，將蛋白溶液(例如但不限于上文所述的任一種VEGF Trap制劑)以約2mL/min至約15mL/min或約7mL/min的速率注入噴霧干燥器。噴霧干燥器的入口溫度設置為高于水沸點的溫度，例如約130°C。出口溫度低于水沸點且高于室溫，例如55°C。在一個具體實施方案中，將蛋白溶液(例如VEGF Trap溶液或IgG溶液)在約130°C的入口溫度和約55°C的出口溫度下以約7mL/min的速率注入Mini Spray Dryer B-290,抽吸器設置為33m3/h，噴霧氣體設置為530L/h。
[0067]形成的微粒化蛋白顆粒的尺寸為約Ιμπι至約100 μ m直徑，取決于具體制劑和賦形劑和蛋白的濃度。在一些實施方案中，微粒化蛋白顆粒具有約Iym至約100 μ m、約Ιμπι至約40 μ m、約2 μ m至約15 μ m、約2.5 μ m至約13 μ m、約3 μ m至約10 μ m、約5 μ m、約6 μ m、約7 μ m、約8 μ m、約9 μ m、約10 μ m、約Ilym或約12 μ m的直徑。
[0068]微粒化蛋白顆粒隨后用生物相容的和生物可降解的聚合物包被。這可通過將微粒化蛋白顆粒懸浮在聚合物溶液中來實現。聚合物溶液實質上是溶解在溶劑中的聚合物。例如，生物相容的和生物可降解的聚合物可特別地溶解于二氯甲烷、四氫呋喃、乙酸乙酯或其他有用的溶劑中。乙酸乙酯是眾所周知的安全的溶劑，并且常常用于藥物、植入物和食物的制備。
[0069]在一些實施方案中，聚合物可是乙基纖維素(“EC”)、聚(乳酸)(“PLA”)、聚原酸酯(“Ρ0Ε”)、聚-D, L-丙交酯-共-乙交酯(“PLGA”)或聚-ε -己內酯(“PCL”)。聚合物可以以約 10mg/mL 至約 300mg/mL、約 15mg/mL 至約 295mg/mL、約 20mg/mL 至約 290mg/mL、約 25mg/mL 至約 280mg/mL、約 30mg/mL 至約 270mg/mL、約 35mg/mL 至約 265mg/mL、約40mg/mL 至約 260mg/mL、約 45mg/mL 至約 260mg/mL、約 50mg/mL 至約 255mg/mL、約 55mg/mL至約 250mg/mL、約 20mg/mL、約 25mg/mL、約 30mg/mL、約 35mg/mL、約 40mg/mL、約 45mg/mL、約50mg/mL、約 75mg/mL、約 100mg/mL、約 125mg/mL、約 150mg/mL、約 lTSmg/mLj^ZOOmg/mLj.^225mg/mL或約250mg/mL的濃度溶解于溶劑(例如乙酸乙酯)中。
[0070]將微粒化蛋白顆粒以約10mg/mL至約100mg/mL、約15mg/mL至約95mg/mL、約20mg/mL 至約 90mg/mL、約 25mg/mL 至約 85mg/mL、約 30mg/mL 至約 80mg/mL、約 35mg/mL 至約 75mg/mL、約 40mg/mL 至約 70mg/mL、約 45mg/mL 至約 65mg/mL、約 50mg/mL 至約 60mg/mL、約 25mg/mL、約 30mg/mL、約 35mg/mL、約 40mg/mL、約 45mg/mL 或約 50mg/mL 的濃度加入聚合物溶液。將顆粒混合以形成漿液或懸液，隨后將其經歷分散和干燥以形成聚合物包被的蛋白顆粒(即微粒)。
[0071]在一個實施方案中，蛋白顆粒-聚合物溶液懸液經歷噴霧干燥，其以與制備微粒化蛋白顆粒的方法類似的方式進行，但是使用減少的進入溫度以防止引燃有機溶劑或聚合物。簡言之，以約5mL/min至約20mL/min或約12.5mL/min的速率將蛋白顆粒-聚合物溶液懸液注入噴霧干燥器。以12.5mL/min的速率將懸液注入噴霧干燥器,抽吸器空氣和噴霧氣體的流速分別為約530L/h和35m3/h(mm)。入口溫度設置為90°C且出口溫度設置為約54°C。噴霧干燥器的入口溫度設置為高于溶劑閃點的溫度，例如設置為約90°C。出口溫度設置為低于進入溫度且高于室溫的溫度，例如約54°C。在一個具體實施方案中，將在約50mg/mL至約250mg/mL聚合物/乙酸乙酯溶液中包含約50mg/mL蛋白顆粒(例如VEGF Trap)的懸液
以約12.5mL/min的速率注入BtCHI Mini Spray Dryer B-290，其中入口溫度為約90°C，
出口溫度為約54°C，抽吸器設置為約35m3/h，噴霧氣體設置為約530L/h。
[0072]所產生的微粒(其含有在聚合物皮層內的蛋白顆粒核心)具有約2μπι至約70 μ m>^J 5 μ m 65 μ m>^J 10 μ m 60 μ m>^J 15 μ m 55 μ m>^J 20 μ m 50 μ m、約15 μ m、約20 μ m、約25 μ m、或約30 μ m的直徑。粒度差異在很大程度上反映聚合物皮層的厚度，盡管蛋白核心的直徑可在一定程度上造成粒度差異。操縱聚合物溶液的起始濃度和/或操縱聚合物本身可控制微粒的直徑。例如，使用50mg/mL聚合物制備的微粒具有約15 μ m至約20 μ m的粒度中值,然而使用250mg/mL聚合物制備的微粒具有約30 μ m的粒度中值.[0073]本發明的微粒用于蛋白治療劑的限時釋放或延長釋放。例如，預期VEGF Trap微粒用于VEGF Trap治療性蛋白在例如玻璃體(用于治療眼血管疾病)中或在皮下植入物(用于延長釋放VEGF Trap以治療癌癥或其他疾病)中的延長釋放。
[0074] 本發明的微粒在生理水性環境中在約37°C以相對恒定的速率在延長的時期內(至少60天)釋放蛋白。一般而言，用較高濃度的聚合物(例如250mg/mL)制備的微粒傾向于顯示相對線性的蛋白釋放特征；而用較低濃度的聚合物(例如50mg/mL)制備的微粒傾向于顯示起始的突然釋放和隨后的延遲的突然釋放。此外，相較于從較低濃度的聚合物形成的微粒，從較高濃度的聚合物形成的微粒顯示更慢的蛋白釋放速率。隨時間過去從微粒釋放的蛋白質的質量與起始蛋白材料的質量一致。沒有或幾乎沒有發生蛋白降解。
[0075]實施例
[0076]本申請提供下述實施例，以給本領域技術人員提供如何制造和使用本發明的方法和組合物的完整的公開內容和描述，并且下述實施例不意欲限制本發明的保護范圍。本申請已盡量確保所使用的數字(例如量、大小等)的準確性，但應當考慮到一些實驗誤差和偏差。
[0077]在下述實施例中，VEGF-Trap蛋白(“VGT”)(其為包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的多肽的二聚體)用作示例性受體-Fe融合蛋白。
[0078]實施例1:微粒化蛋白
[0079]在IOmM 磷酸鹽、2%蔗糖、ρΗ6.2 中含有 25mg/mL VEGF Trap 蛋白(“VGT”)、25mg/mL VGT加0.1 %聚山梨酯80和50mg/mL VGT的溶液各自獨立地在噴霧干燥超微粉粉碎機(BUCiI Mini Spray Dryer B-290, Biichi Labortechnik AG, FlawiI, CH)中被霧化以形
成包含VEGF Trap的微滴。利用加熱來將水從微滴中蒸發，從而形成包含VEGF Trap的粉末。入口溫度設置在130°C，出口溫度設置在約55°C。抽吸器設置在33m3/h，噴霧氣體設置在530L/h。以約7mL/min的速率注入VGT溶液。
[0080]形成的VGT顆粒的粒度通過微流成像(MFI)和動態光散射(DLS)來測量。圖1描述了由MFI測定的、衍生自25mg/ml VGT、25mg/ml VGT加0.1 %聚山梨酯80和50mg/ml VGT濃度中每一個的VGT顆粒的顆粒大小分布。對于所有的濃度，VGT顆粒的圓當量直徑(ECD)在約I μ m至約39 μ m的范圍內，其中大部分顆粒在約2 μ m至約14 μ m的粒度范圍內。對于25mg/ml VGT的溶液，顆粒主要集中在約2.5 μ m至約8.8 μ m的范圍內，并具有約6 μ m的眾數。對于25mg/ml VGT加0.1 %聚山梨酯80的溶液，顆粒主要集中在約2.5 μ m至約9.7 μ m的范圍內，并具有約6 μ m的眾數。對于50mg/ml VGT的溶液，顆粒主要集中在約2.7 μ m至約12.8 μ m的范圍內，并具有約7 μ m的眾數。通過MFI和DLS方法測定的各個制劑的直徑中值描述于表1中。
[0081]VGT顆粒在注射用水中進行重建，并且通過尺寸排阻(即，尺寸排阻-超高效液相色譜法(SE-UPLC))來檢查，以確定蛋白純度。相對于起始材料，在微粒化后沒有觀察到純度的變化(參見表3)。
[0082]表1:通過MFI和DLS測定的蛋白顆粒粒度中值(μ m)
[0083]
【權利要求】
1.包含用聚合物包被的蛋白的組合物，其中所述組合物是具有約5μ m至約40 μ m直徑的顆粒。
2.權利要求1的組合物，其中所述蛋白是抗原結合蛋白。
3.權利要求1或權利要求2的組合物，其中所述蛋白包含Fe結構域。
4.權利要求1-3的任一項的組合物，其中所述蛋白是抗體。
5.權利要求1-3的任一項的組合物，其中所述蛋白是受體-Fe融合蛋白。
6.權利要求1-4的任一項的組合物，其中所述蛋白是抗體片段。
7.權利要求5的組合物，其中所述蛋白是VEGF-Trap。
8.權利要求4的組合物，其中所述抗體是人單克隆抗體。
9.權利要求1-8的任一項的組合物，其中所述聚合物是生物可降解的聚合物。
10.權利要求1-9的任一項的組合物，其中所述聚合物選自--聚(乳酸)(PLA)、聚酐聚[I, 6- 二(對-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羥丁酸-共羥基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-D, L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚原酸酯(POE)、乙基纖維素(EC)和聚-ε -己內酯(PCL)。
11.權利要求10的組合物，其中所述蛋白是陷阱蛋白或抗體，并且所述聚合物是Ρ0Ε。
12.權利要求1-11的任一項的組合物,其中所述顆粒的平均直徑是約15μ m。
13.權利要求1-10的任一項的組合物，其中所述蛋白是陷阱蛋白或抗體，并且所述聚合物是PLGA。
14.一種微粒，其具有約2 μ m至約70 μ m的直徑，并且包含具有約2 μ m至約12 μ m的直徑的蛋白顆粒核心和生物可降解的聚合物皮層。
15.權利要求14的微粒，其中所述生物可降解的聚合物選自--聚(乳酸)(PLA)、聚酐聚[I, 6- 二(對-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羥丁酸-共羥基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-D, L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚原酸酯(POE)、乙基纖維素(EC)和聚-ε -己內酯(PCL)。
16.權利要求14或權利要求15的微粒，其中所述蛋白顆粒核心包含抗原結合蛋白。
17.權利要求14-16的任一項的微粒，其中所述抗原結合蛋白是受體-Fe融合蛋白。
18.權利要求14-17的任一項的微粒，其中所述蛋白顆粒核心包含VEGF-Trap，且所述聚合物皮層包含POE、PLA或PLGA。
19.權利要求14-16的任一項的微粒，其中所述抗原結合蛋白是抗體。
20.權利要求14-16和19的任一項的微粒，其中所述抗體是人IgG分子，并且所述聚合物皮層包含POE、PLA或PLGA。
21.多個微粒，其具有約2μ m至約70 μ m的直徑，并且包含具有約2 μ m至約12 μ m的直徑的蛋白顆粒核心和生物可降解的聚合物皮層。
22.權利要求21的多個微粒，其中所述微粒以不同的速率降解，并且在水性環境中在延長的時期內釋放蛋白。
23.權利要求22的多個微粒，其中所述時期為至少3天。
24.權利要求22或權利要求23的多個微粒，其中所述時期為至少60天。
25.權利要求21-24的任一項的多個微粒，其中所述蛋白是抗原結合蛋白。
26.權利要求21-25的任一項的多個微粒，其中所述蛋白是受體-Fe融合蛋白。
27.權利要求21-26的任一項的多個微粒，其中所述受體-Fe融合蛋白是VEGF-Trap，并且所述聚合物皮層包含POE、PLA或PLGA。
28.權利要求21-25的任一項的多個微粒，其中所述抗原結合蛋白是抗體。
29.權利要求28的多個微粒，其中所述抗體是人IgG分子，并且所述聚合物皮層包含POE、PLA 或 PLGA。
30.治療疾病的方法，其包括將治療上有效量的權利要求21-29任一項的多個微粒施用給患者，其中治療性蛋白在延長的時期內從所述微粒釋放。
31.權利要求30的方法，其中所述蛋白是VEGF-Trap，并且所述聚合物是POE、PLA或PLGA0
32.權利要求30或權利要求31的方法，其中所述疾病是眼科疾病，并且將所述微粒以不少于60天的間隔遞送至患者的玻璃體。
33.制備包含蛋白和生物可降解的聚合物的組合物的方法，所述方法包括如下步驟: a.獲得蛋白顆粒； b.在包含聚合物和溶劑的溶液中懸浮蛋白顆粒；和 c.去除溶劑， 其中形成包含由聚 合物包被的蛋白的顆粒。
34.權利要求33的方法，其中通過噴霧干燥包含所述蛋白的溶液來獲得所述蛋白顆粒。
35.權利要求34的方法，其中所述噴霧干燥通過雙噴嘴超聲法、單噴嘴超聲法或電噴射來進行。
36.權利要求33-35的任一項的方法，其中通過下述來蒸發所述溶劑:經由噴霧干燥產生步驟(b)的蛋白懸液的分散相。
37.權利要求33-36的任一項的方法，其中通過加熱蒸發、空氣蒸發或萃取來去除所述溶劑。
38.權利要求33-37的任一項的方法，其中所述聚合物選自--聚(乳酸)(PLA)、聚酐聚[I, 6- 二(對-羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羥丁酸-共羥基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-D, L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚原酸酯(POE)、乙基纖維素(EC)和聚-ε -己內酯(PCL)。
39.權利要求33-38的任一項的方法，其中所述蛋白是受體-Fe融合蛋白或抗體。
40.權利要求33-39的任一項的方法，其中所述蛋白是VEGF-Trap或IgG分子，并且所述聚合物是POE、PLA或PLGA。
41.權利要求33-40的任一項的方法，其中所述顆粒具有約15μ m的平均直徑。
42.調節蛋白釋放的方法，其包括，步驟(a)將蛋白與生物可降解的聚合物組合以形成蛋白-聚合物復合物；隨后步驟(b)將所述蛋白-聚合物復合物與溶劑接觸，其中所述聚合物隨時間過去而降解，并且所述蛋白逐漸地釋放到溶劑中。
43.權利要求42的方法，其中根據權利要求33-41的任一項進行步驟(a)。
44.權利要求42或權利要求43的方法，其中所述蛋白是VEGF-Trap或IgG分子，并且所述聚合物是POE、PLA或PLGA。
45.權利要求42-44的任一項的方法，其中所述顆粒具有約15μ m的平均直徑。
46.權利要求42-45的任一項的方法，其中所述蛋白在至少3天期間從所述蛋白-聚合物復合物釋放。
47.權利要求42-46的任一項的方法，其中所述蛋白在至少60天期間從所述蛋白-聚合物復合物釋放。
48.權利要求42-47的任一項的方法，其中所述溶劑是緩沖鹽水。
49.權利要求42-47的任一項的方法，其中所述溶劑是體內的。
50.權利要 求42-47和權利要求49的任一項的方法，其中所述溶劑是玻璃體液。
【文檔編號】A61K9/16GK103957898SQ201280056324
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年11月18日 優先權日:2011年11月18日
【發明者】H·陳, S·沃爾什 申請人:瑞澤恩制藥公司