癌癥免疫治療的制作方法

癌癥免疫治療的制作方法
【專利摘要】我們將多種TLR激動劑配制入GVAX(工程化以分泌GM-CSF的經致死性輻照的腫瘤細胞疫苗)。特別地，將在患者中發現是安全的GLA和R848、TLR4和TLR7/8激動劑與GVAX配制(TEGVAX–代表TLR激動劑增強的GVAX)，且該制劑在3種不同的臨床前模型包括可觸知的B16中有效產生抗腫瘤應答。與對照相比，用TEGVAX治療的小鼠中這些抗腫瘤應答與增加的能夠分泌在腫瘤微環境中循環的IFN的CD4和CD8T細胞，以及與顯著較高水平的p15E特異性CTL介導的細胞殺傷相關。當與抗-PD-1抗體組合時，TEGVAX能夠誘導建立的B16腫瘤的消退。
【專利說明】癌癥免疫治療
[0001]本發明在美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)的支持下完成。因此，根據基金號NIH K23-DE018464-02的條款，美國政府保留某些權利。
[0002]發明【技術領域】
[0003]本發明涉及癌癥治療領域。特別地，本發明涉及癌癥免疫治療。
[0004]發明背景
[0005]由于其在多種腫瘤類型中的安全性和可用性的廣泛歷史，被工程化以分泌GM-CSF的致死性輻照的腫瘤細胞疫苗(GVAX)是一種具有用于與免疫檢查點阻斷劑(blockade)抗體的組合治療的潛力的疫苗平臺。然而，由GVAX分泌的局部GM-CSF可以動員髓樣前體細胞(myeloid precursor)成為巨曬細胞和樹突細胞,但這種細胞因子可能不會誘導它們的激活。因此，GVAX的主要限制是在免疫系統的傳入臂(afferent arm)中最佳腫瘤抗原呈遞必需的抗原呈遞細胞(APC)的激活。表型模擬(phenocopy)見于針對感染因子(infectiousagent)的疫苗中的穩固免疫應答的一個簡單策略是，將多種TLR激動劑與基于癌細胞的疫苗組合。在臨床上，已經開發了用于癌癥患者的多種佐劑以增強癌癥疫苗的效價，并且這些佐劑中的許多典型地是TLR激動劑。
[0006]關于非靶向TLR刺激的一種真正顧慮是腫瘤細胞中慢性TLR刺激的促癌癥發生結果(procarcinogenic consequence)。腫瘤細胞上表達的TLR4受體的刺激已顯示促進腫瘤發生。然而，造血區室(hematopoietic compartment)中的TLR信號傳導已顯示引起抗腫瘤應答，其已被轉化為(translate into)多個臨床試驗。為了祀向腫瘤微環境中的樹突細胞并測試腫瘤微環境中的TLR4刺激是否能夠在體內誘導促癌癥發生效應，我們團隊瘤內注射了 LPS配制的GVAX，并發現TLR4配體吸附的GVAX(TLR4ligand absorbed GVAX)的瘤內注射改善了三種不同的鼠(murine)模型中的體內局部抗腫瘤應答。
[0007]本領域對獲得更安全和更有效的腫瘤治療存在持續性需求。
[0008]發明概述
[0009]根據本發明的一個方面，提供了可被用于治療癌癥患者的組合物。該組合物包括(a)表達細胞因子的、無增殖能力的(proliferation incompetent)、全癌細胞(wholecancer cell) ； (b)與人程序性死亡 I (Programmed Deathl, PD-1)特異性結合的抗-PD-1抗體；及(c)TLR(toll樣受體)激動劑；其中用TLR激動劑配制該全癌細胞。
[0010]根據本發明的另一方面，提供了一種方法。向癌癥患者施用劑(agent)。該劑是:
(a)表達細胞因子的、無增殖能力的、全癌細胞；(b)與人程序性死亡I (PD-1)特異性結合的抗-PD-1抗體；及(c) TLR(toll樣受體)激動劑；其中用TLR激動劑配制該全癌細胞。用TLR激動劑配制該全癌細胞。
[0011]根據本發明的另一方面，提供了一種試劑盒，其包括以下劑:(a)表達細胞因子的、無增殖能力的、全癌細胞；(b)與人程序性死亡I (PD-1)特異性結合的抗-PD-1抗體；及(c)TLR(toll樣受體)激動劑；其中用TLR激動劑配制該全癌細胞。任選地，用TLR激動劑配制該全癌細胞。
[0012] 這些實施方案和當閱讀本說明書時將對本領域技術人員明顯的其它實施方案，提供了技術。
[0013]附圖簡述
[0014] 圖1A-1D.TEGVAX可增加引流淋巴結中激活的類漿細胞DC(pDC)和常規DC(cDC)。圖1A.從疫苗注射后第3天,在非荷瘤小鼠(non-tumor bearing mice)中，定量來自疫苗引流 LN 的 pDC 和 cDC 門控群體(gated population)的 CD86。IDC-1005 是 10% (w/v)角S烯水包油媒介物(vehicle)中的GLA和R848，且TEGVAX是用輻照的GVAX配制的IDC-1005。圖1B.相比GVAX，在疫苗注射后第3天，TEGVAX誘導增加的來自引流淋巴結的pDC上的⑶86和⑶80激活標志物(*P〈0.05)。圖1C.相比GVAX，在疫苗注射后第3天，TEGVAX具有增加的來自引流淋巴結的cDC上的⑶86和⑶80激活標志物(*P〈0.05)。圖1D.從用TEGVAX或GVAX注射后第3至7天，來自DLN的CD86+pDC和cDC。
[0015]圖2A-2D.相比GVAX，TEGVAX在多種動物模型中誘導顯著的體內抗腫瘤應答。所有這些體內治療實驗都代表至少3個獨立實驗，且所有實驗中每一組都由10只小鼠/組構成。圖2A.用GVAX、TEGVAX(GVAX/IDC-1005)、和IDC-1005在對側肢中治療患有可觸知(palpable)的B16黑素瘤的小鼠，且每天測量腫瘤體積。IDC-1005是在10% (w/v)角鯊烯水包油乳劑中的GLA和R848。圖2B.在第7天、第14天和第28天(箭頭)，用疫苗和TLR激動劑的多次注射治療可觸知的B16黑素瘤。圖2C.用IO6SCCFVn-GVAX在對側肢中治療可觸知的SCCFVII舌癌，并每天測量腫瘤。用TEGVAX治療的C3H/He0UJ小鼠消退，并且分別在第22天和第27天在不同的部位(箭頭)用30^￥115\104和1\105再攻擊這些小鼠(*P〈0.05 ;**P〈0.01)。在這些再攻擊的部位無腫瘤生長。圖2D.用TEGVAX (GVAX和IDC-1005的I小時孵育)對比未孵育的GVAX和IDC-1005混合物進行B16治療試驗。相比未孵育組，孵育組具有顯著的抗腫瘤作用(*p〈0.05)。
[0016]圖3A-3D.TEGVAX治療增加了腫瘤壞死及腫瘤浸潤性淋巴細胞和APC。圖3A.收集來自每個治療組的B16腫瘤組織并用H&E染色。TEGVAX治療的腫瘤顯示增加的壞死灶數目(畫圓圈區域，20x)。圖3B.在20x放大倍率下，在10個獨立區域中定量用TEGVAX和GVAX治療的腫瘤組織中的壞死灶(**P〈0.01)。圖3C.每個治療組中冷凍的腫瘤組織用aCD4和a⑶8FITC綴合物染色，并用DAPI復染。在腫瘤微環境的腫瘤組織中，TEGVAX治療的B16黑素瘤具有增加的CD4和CD8細胞的浸潤。圖3D.用免疫熒光顯微鏡在10個不同的視場隨機計數腫瘤浸潤性⑶4、⑶8、和⑶86細胞。相比GVAX和IDC-1005治療的腫瘤，TEGVAX治療的B16腫瘤具有顯著增加的浸潤性淋巴細胞(*P〈0.05 ;**P〈0.01)。
[0017]圖4A-4D.TEGVAX誘導腫瘤中的ThI應答，以及B7-H1表達的上調。圖4A.從治療的小鼠收集腫瘤引流淋巴結，并進行來自CD4和CD8群體二者的IFNy的細胞內染色。圖4B.定量了每個治療組中⑶4+IFN Y +和⑶8+IFN Y +的平均熒光強度。圖4C.收集治療的腫瘤組織，并用大鼠抗-小鼠B7-H1抗體染色，且抗-大鼠Cy3綴合物被用于評價B7-H1陽性細胞。在40x放大倍率下，在10個不同的視場中進行盲定量，并概述在圖4D.中。
[0018]圖5A-5D.TEGVAX的體內抗腫瘤應答是⑶4和⑶8T細胞二者依賴性的。圖5A.在疫苗治療期間，GKl.5 (⑶4耗竭)和2.43(⑶8耗竭)抗體二者被腹腔內注射。圖5B.在TEGVAX和對照治療試驗中，⑶4、⑶8細胞被分別耗竭。圖5C.Rag2_/_小鼠中TEGVAX的抗腫瘤應答被消除。圖MyD88-/-和TRIF-/-雙敲除小鼠中，TEGVAX的抗腫瘤應答被消除。在這些TLR信號傳導缺陷小鼠中，TEGVAX的體內效應與GVAX是相同的(**P〈0.01)。[0019]圖6A-B.TEGVAX治療的小鼠具有增加的腫瘤特異性CTL細胞的數目。在用疫苗和佐劑治療的B16荷瘤小鼠中進行用P15E肽的體內CTL和ELISP0T試驗。圖6A.在來自每個治療組的疫苗治療后第25天進行體內CTL試驗。使用下式計算P15E肽特異性殺傷:(l-CFSEft% /CFSE% ) XlOO0圖6Β.在第23天，來自每個治療組的脾細胞的ELISP0T試驗。Ρ15Ε 肽脈沖進入 T2kb APC (**Ρ〈0.01)。
[0020]圖7A-7C.TEGVAX/抗-PD-1治療可誘導建立的B16腫瘤的消退。圖7A.右圖顯示用疫苗和抗-PD-1的各種組合治療的建立的B16腫瘤的腫瘤生長速率。圖7B.左圖顯示兩只小鼠-右邊的小鼠是用TEGVAX/抗-PD-1治療的小鼠之一，左邊的小鼠是用GVAX治療的小鼠之一。TEGVAX治療的小鼠沒有顯示任何消退。圓圈顯示腫瘤接種部位。箭頭顯示白癜風的部位。圖7C.收集腫瘤引流淋巴結并定量來自⑶4、⑶8、和⑶llc+DC細胞的THl細胞因子。
[0021]圖8(補充的圖1)在TEGVAX治療的小鼠的腫瘤引流LN中增加的IL_12、TNF-α和IFN-α。收集了每個治療組中的腫瘤DLN并分析了⑶Ilc+細胞上的Thl細胞因子譜。相比GVAX或對照治療組，TEGVAX治療的小鼠具有顯著增加的IL12、TNF_ a和IFN- a陽性CDllc+細胞。
[0022]圖9(補充的圖2)TEGVAX誘導建立的CT26模型中的抗腫瘤應答。將105CT26結腸癌細胞注射入足墊(footpad)，并用疫苗治療患有可觸知的腫瘤的小鼠。CT26-GVAX如Yoshimura等人(11)中描述的制備。相比單獨的CT26-GVAX或單獨的IDC-1005，TEGVAX顯著降低了小鼠CT 26結腸癌的生長(**P〈0.01)
[0023]圖10A-B(補充的圖3)被配制入TEGVAX的多種TLR激動劑具有最大的體內抗腫瘤應答。圖10A.患有可觸知的B16腫瘤的小鼠，用TEGVAX、GVAX、用R848配制的GVAX、或用GLA配制的GVAX治療。所有配制由在疫苗注射之前使B16-GVAX與在10% (w/v)角鯊烯水包油乳劑媒介物中的佐劑在4°C孵育I小時構成(**P〈0.01)。圖10B.含有媒介物不含GVAX的單獨佐劑不具有體內抗腫瘤效應。
[0024]圖11 (補充的圖 4)使用 Lipofectamine?2000 (Invitrogen)，用吸附的 GLA 和R848配制的TEGVAX具有與用水包油乳劑媒介物配制的TEGVAX可比的體內抗腫瘤效應(**Ρ〈0.01)。
[0025]圖12(補充的圖5)TEGVAX增加了具有來自疫苗的替代腫瘤抗原(surrogatetumor antigen)內源性內吞Q點(Q_dot)的激活DC的數目。GVAX和TEGVAX被Qtracker655 (Invitrogen)標記，并接種到小鼠的足墊中。3天后，收集引流胭LN (drainingpopliteal LN)，并用⑶3和⑶19抗體耗竭淋巴細胞。FACS分析定量來自疫苗的Q-點標記的內源性PDC和cDC。
[0026]發明詳述
[0027]我們已經開發了最佳配制的癌癥疫苗組合ro-1阻斷劑可在治療上用于治療腫瘤的體內證據。我們已經收集了證明該組合方案可以有效地針對建立的免疫原性不良的腫瘤的證據。該組合方案的所有組分已在患者中經單獨測試，并發現在臨床上是安全的。雖然 申請人:不打算受到任何提出的建議機制的約束，但是所公開的治療策略可通過適應性免疫逃避起效。
[0028]患有不同癌癥的患者可被該組合方案治療。此類癌癥包括結腸直腸癌、呼吸消化鱗狀細胞癌(aero-digestive squamous cancer)、肺癌、腦癌、肝癌、胃癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、頭頸癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、乳腺癌、黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、和腎癌。這個列表意在是說明性的而非限制性的。
[0029]全癌細胞針對治療接受者(recipient)可以是同種異體的、同基因的、或自體的。通常，它們可通過保留它們的免疫原性和它們的代謝活性的技術被處理以使得它們無增殖能力。一種通常使用的技術是輻照此類細胞。通常，使用患者具有的相同的一般類型的腫瘤細胞。例如，患有黑素瘤的患者通常將被施用無增殖能力的黑素瘤細胞。該細胞可天然地表達和分泌細胞因子或用指導此表達和分泌的核酸通過轉染表達和分泌細胞因子。一種合適的細胞因子是GM-CSF。例如，腫瘤細胞可表達編碼GM-CSF的轉基因，如美國專利號5，637，483,5, 904，920,6, 277，368 和 6，350，445，以及美國專利公布號 20100150946 中描述的，每一篇文獻都通過引用明確被并入。用于治療胰腺癌的表達GM-CSF、遺傳修飾的癌細胞的一個實例，在美國專利號6，033，674和5，985，290中描述，這兩篇文獻都通過引用明確被并入本文。可以使用其它細胞因子。可被使用的合適的細胞因子包括刺激樹突細胞誘導、募集和/或成熟的細胞因子。此類細胞因子包括，但不限于，以下的一種或多種:GM-CSF、0)40配體、11^-12、0(^3、0(^20、和 0(^21。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是具有免疫調節活性并與GenBank登錄號AAA52122.1具有至少約85%氨基酸序列同一性的細胞因子或片段。
[0030]根據一個可選的實施方案，細胞因子通過表達和分泌一種或多種細胞因子的失活的旁觀細胞(bystander cell)遞送。旁觀細胞可提供所有刺激樹突細胞的誘導、募集和/或成熟的細胞因子，或可補充由失活的腫瘤細胞分泌的細胞因子。表達免疫調節細胞因子的旁觀細胞系在美國專利號6, 464, 973和8, 012, 469, Dessureault等人,Ann.Surg.0ncol.14:869-84，2007，和 Eager 和 Nemunaitis, Mol.Ther.12:18-27，2005 中描述，每一篇文獻都通過引用明確被并入。
[0031]適于在治療方案和組合物和試劑盒中使用的抗體，包括任何與程序性死亡-1(PD-1)特異性結合的抗體。可被使用的抗體的示例性類型包括但不限于人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、抗體結合片段、和雙抗體。通常，抗體基本上由一個免疫球蛋白基因或多個免疫球蛋白基因或其片段編碼。抗體能夠特異性結合抗原或表位。參見，例如Fundamental Immunology,第三版，ff.E.Paul編著，RavenPress, N.Y.(1993) ；ffilson(1994) ；J.1mmunol.Methodsl75:267-273 ；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods25:85_97。抗體通常與抗原或表位特異性結合。特異性結合發生于對應的抗原或表位，即使在蛋白質和其它生物制劑的異種群體的存在下。抗體的特異性結合表明其以實質上大于與不相關的抗原結合的親和力與其靶抗原或表位結合。親和力中的相對差異通常為至少25%較高、更通常為至少50%較高、最通常為至少100%。例如，相對差異可以是至少2x、至少5x、至少10x、至少25x、至少50x、至少100x、至少ΙΟΟΟχ。
[0032]Toll樣受體(TLR)是感知微生物產物和/或啟動適應性免疫應答的蛋白質家族。TLR激活樹突細胞(DC)。TLR是保守的跨膜分子，含有富含亮氨酸重復的胞外域、跨膜結構域和細胞內TIR.(Toll/IL-1R)結構域。TLR識別微生物中的不同結構，通常被稱為“PAMP” (病原體相關分子模式)。與TLR結合的配體引起誘導產生參與炎癥和免疫的因子的細胞內信號傳導通路的級聯反應。[0033]可用于這些受體的示例性激動劑包括，但不限于脂蛋白、脂多肽、肽聚糖、酵母聚糖、脂多糖、奈瑟氏球菌孔蛋白、鞭毛蛋白、抑制蛋白、神經酰胺半乳糖脂(galactoceramide)、胞壁酰二肽、吡喃葡萄糖基脂質 A(glucopyranosyl lipid A,GLA)、和瑞喹莫德(R848)。肽聚糖、脂蛋白、和脂磷壁酸是革蘭氏陽性細胞壁組分。脂多糖由大多數細菌表達。鞭毛蛋白是由病原細菌和共生細菌分泌的細菌鞭毛的結構組分。神經酰胺半乳糖脂(a-GalCer)是天然殺傷T(NKT)細胞的活化劑。胞壁酰二肽是所有細菌共有的生物活性肽聚糖基序。此類激動劑通過Toll樣受體介導先天免疫激活。激動劑對其同源受體(cognate receptor)的特異結合通常用術語親和力表示。本發明的配體可以以約IO4IVTi和約IO8M-1之間的親和力結合。親和力根據Kd = koff/kon(koff是解離速率常數、kon是締合速率常數、且Kd是平衡常數)被計算。可使用單一或多種激動劑。
[0034]在人類中，已經鑒定了 10種TLR。在細胞表面上表達的TLR包括TLR-1、TLR-2、TLR-4、TLR-5和TLR-6，而TLR-3、TLR-7/8、和TLR-9在ER區室表達。基于不同的TLR表達模式，可鑒定人樹突細胞亞組(subset)。通過舉例的方式，當被刺激時，DC的髓樣或“常規”亞組(mDC)表達TLR1-8，且產生激活標志物(例如⑶80、⑶86、MHC I和II類、CCR7)、促炎細胞因子、和趨化因子的級聯反應。這種刺激和導致的表達的結果是抗原特異性CD4+和CD8+T細胞致敏(priming)。這些DC獲得占據抗原的增強的能力，并將它們以適當的形式呈遞至T細胞。相反，當激活時，DC的類漿細胞亞組(pDC)僅表達TLR7和TLR9，而導致NK細胞以及T細胞的激活。由于垂死的腫瘤細胞可負面影響DC功能，已表明，在癌癥治療的免疫治療方法中用TLR激動劑激活的DC可有利于致敏抗腫瘤免疫。還表明，使用輻照和化療成功治療乳腺癌需要TLR4激活。
[0035]本領域已知的且可用于本發明的TLR激動劑包括，但不限于以下:
[0036]Pam3Cys, TLR-1/2 激動劑；
[0037]CFA, TLR-2 激動劑；
[0038]MALP2, TLR-2 激動劑；
[0039]Pam2Cys, TLR-2 激動劑；
[0040]FSL-1，TLR-2 激動劑；
[0041]Hib-OMPC, TLR-2 激動劑；
[0042]聚肌苷酸:聚胞苷酸(polyribosinic:polyribocytidicacid, Poly 1: C), TLR-3激動劑；
[0043]聚腺苷酸-聚尿苷酸(poly AU)，TLR-3激動劑；
[0044]用聚-L-賴氨酸和羧甲基纖維素穩定的聚肌苷胞-聚胞苷酸(Hiltonol?)，TLR-3激動劑；
[0045]單磷酰基脂質(MPL)，TLR-4激動劑；
[0046]LPS，TLR-4 激動劑；
[0047]細菌鞭毛蛋白，TLR-5激動劑；
[0048]唾液酸化-Tn (STn)，與一些人癌細胞上的MUCl粘蛋白相關的碳水化合物和TLR-4激動劑；
[0049]咪喹莫特，TLR-7激動劑；
[0050] 瑞喹莫德，TLR-7/8激動劑；[0051]洛索立賓，TLR-7/8激動劑；及
[0052]未甲基化的CpG 二核苷酸(CpG-ODN)，TLR-9激動劑。
[0053]全癌細胞與TLR激動劑的制劑呈現為增強的功效的促成因素(contributingfactor)。制劑可以在諸如4°C溫度下一起孵育諸如1/4、1/2、1、2、3、5、10、24小時的時間段。可選地，可以采用在親脂性劑或乳化劑存在下的結合。此類劑在本領域是公知的。
[0054]可以設想各種給藥方案，同時或錯開時間(staggered timing)、單一或多種劑、單個周期或多個周期。
[0055]向癌癥患者施用治療劑的方法不同。示例性的方法包括但不限于皮下、靜脈內、肌內、動脈內、皮內、鞘內、腫瘤內、腹腔內、舌下、和硬膜外施用。可以向人、哺乳動物、哺乳類受試者、動物、獸醫受試者、安慰劑受試者、研究受試者、或實驗受試者施用。典型地，劑諸如外源配體、試劑、安慰劑、小分子、藥劑、治療劑、診斷劑或組合物與受試者在適當的解剖學位置相接觸。施用可以是用于治療、藥代動力學研究、診斷分析、研究、安慰劑或實驗方法的目的。根據本發明的劑可以，但并非不需要，作為單一組合物施用。雖然作為單一組合物施用被本發明設想，劑可作為分開的施用被遞送至單一受試者，施用可在相同或不同的時間、并且施用可通過相同施用途徑或不同施用途徑。在一些情況下，劑實際上可以在受試者的身體內相互接觸，體內形成組合物。
[0056]上述公開總體描述了本發明。本文公開的所有參考文獻通過引用被明確并入。可通過參考以下特定實施例獲得更完整的理解，其在本文被提供僅用于說明的目的并不預期限制本發明的范圍 。
實施例
[0057]為了評價多種TLR激動劑在臨床環境中誘導全身性抗腫瘤免疫的能力，我們用GVAX配制了吡喃葡萄糖基脂質A (GLA-TLR4激動劑)和瑞喹莫德(TLR7/8激動劑)，并研究了它們在可觸知的B16模型中的體內抗腫瘤效應。GLA是顯示具有比單磷酰基脂質A強的TLR4激動劑的合成的六酰化分子，其目前正作為癌癥疫苗中的TLR4激動劑佐劑經受臨床試驗。R848是被發現與咪喹莫特(TLR7激動劑)相比產生50-100倍細胞因子應答的TLR7/8激動劑，且該劑也已通過了患者中安全性的I期試驗。我們將已在患者中被單獨地測試為臨床上安全的這些佐劑組合，以配制TLR激動劑增強的GVAX (TEGVAX)，并在建立的腫瘤環境中檢查它們激活APC和提高抗腫瘤T細胞的潛能。
[0058]Li等人和Curran等人均表明，抗_PD_1和細胞疫苗可被組合以誘導體內抗腫瘤應答，但該報告利用非可觸知的腫瘤接種方法，該方法可能不會建模具有建立的腫瘤組織的臨床環境。Curran等人還將抗-CTLA-4與抗-PD-1和疫苗組合，但由于在臨床前和臨床研究中與易普利姆瑪(ipilimumab)相關的毒性，我們選擇抗-PD-1阻斷劑。由于我們專注于開發可在腫瘤微環境中產生顯著干擾素應答的安全疫苗，我們采用了嚴格的模型以測試TEGVAX和抗-PD-1對可觸知的、建立的B16腫瘤的組合治療。
[0059]實施例1
[0060]材料和方法
[0061]小鼠和試劑:6-8周齡雌性 C57BL/6、Balb/c、及 C3H/He0UJ 小鼠(Jackson 實驗室)根據 Johns Hopkins Hospital (JHH)Animal Care and Use Committee 被飼養。C57BL/6MyD88 / TRIF / 和 B6 (Cg) Rag2tml (Rag2 / )小鼠分別獲自 Franck Housseau 博士和 Fan Pan 博士(JHH)。B16 和 B16GVAX 細胞在含有 10 % AFCS、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100U/ml)的RPMI1640培養基中培養。Cytofix/Cytoperm試劑盒和抗體購自BDBioscience。CDllc+細胞通過抗小鼠 CDllc microBeads (MACS, Miltenyi Biotec)被分離。每2天一次(共5次)腹腔內注射200 μ g/劑量的⑶4耗竭GKl.5抗體(⑶4cbpletingGKl.5antibody)以及 CD8 耗竭 2.43 (CD8cbpleting2.43) (Bio X Cell)。表達阻斷抗-PD-1抗體的雜交瘤(克隆G4)獲自Charles Drake博士(JHH)。
[0062]在10% (w/v)角S烯水包油乳劑(Immune Design)中制備lmg/ml的吡喃葡萄糖基脂質 A (GLA)和 0.2mg/ml 的瑞喹莫德(R848)。IDC-1005 是 lmg/ml GLA 和 0.2mg/mL R848在乳劑媒介物中的混合物。接種前，將IDC-1005與輻照的GVAX細胞在4°C孵育0.5-2小時。用IDC-1005配制的GVAX被標記為TEGVAX。在某些情況下，用Lipofectamine使不含乳劑媒介物的GLA和R848被吸附進入GVAX細胞，并洗滌4次以除去未吸附的TLR激動劑和轉染子。
[0063]腫瘤治療試驗:C57BL/6小鼠在腳墊中被注射1_5χ104Β16。可觸知的腫瘤形成之后(5-10天)，將100 μ IlO6的用或未用IDC-1005配制的B16GVAX皮下注射到對側肢。對照組注射媒介物。對于所有這些實驗，使用10只小鼠/組。通過可比的方法，將SCCFVII/SF細胞和CT26細胞分別用于C3H/He0UJ小鼠和Balb/c小鼠(28)。以與B16相同的方式將先前制備的輻照的106SCCFVII/SF-GVAX用于SCCFVII模型(3)。對于CT26模型，轉導GM-CSF的CT26細胞被用作CT26GVAX(11)。對于所有疫苗，測定GM-CSF的滴度以確保GM-CSF表達水平介于50-500ng/106細胞/24小時范圍內。每天測量腫瘤。在某些情況下，接種前用Qtracker655 (Invitrogen)標記GVAX。對于F1D-1實驗,腫瘤是可觸知的之后，每周兩次腹腔內注射100 μ g/小鼠/注射連同疫苗治療。
[0064]DC激活分析:在疫苗治療后3-7天，收集來自荷瘤或幼稚的(naive)小鼠的脾和引流淋巴結(DLN)。將研碎的脾在含有DNA酶 I (Roche)和 Liberase Blendzyme2 (20, OOOMandlU/ml) (Roche)的介質中消化。通過耗竭⑶3+和⑶19+獲得富集DC的群體，并針對⑶IIc+和B220+門控。這些通過使用⑶80、⑶86、⑶40和MHCII抗體的多色FACS分析被評價。
[0065]ELISP0T 分析:ELISP0T 板(MultiScreenms 過濾板，Millipore)用小鼠IFN- Y Ab (MabTech)包覆 24 小時，且 T2kb 細胞用 10 μ g/ml 的 P15E (KSPffFTTL)肽脈沖過夜。將來自脾的IO6脾CD8細胞一式三份鋪板，以與脈沖的或未脈沖的105T2kb細胞共培養,或用I μ M PMA和10ng/ml離子霉素刺激作為陽性對照。在第3天，加入生物素化的抗小鼠IFN-YAb(MabTech)和鏈霉親和素-HRP。使用AEC底物試劑(BD)顯影斑點，并使用ELISP0T 酶標儀(Immunospot)分析。
[0066]體內CTL 分析:用 0.5μ M和 5μ M CFSE(Molecular Probes)標記脾細胞。5μΜCFSE標記的細胞用10 μ g/ml P15E (KSPffFTTL)肽脈沖。0.5 μ M CFSE標記的細胞用β -半乳糖苷酶(β-gal) (TPHPARIGL)肽脈沖。用這些細胞的1:1混合物靜脈注射小鼠，并在24小時后分離脾細胞 ，并通過流式細胞術分析。使用下式計算抗原特異性殺傷:(1-cfsep15E%
/CFSE0_半乳糖苷酶) XlOOο
[0067]免疫組織化學:用丙酮固定10 μ m厚的冷凍切片，并用I % BSA在室溫封閉30分鐘。對于石蠟包埋的組織，在如上所述的I % BSA封閉前，將切片固定在4%多聚甲醛中。α⑶4、α⑶8、α⑶86FITC綴合物和α⑶45和α Β7-Η1—抗在4°C孵育I小時。在某些情況下，Cy3綴合物抗體被用作二抗。DAPI用作核復染劑。在X40的放大倍率下，定量了10個隨機選擇的視場中的陽性細胞。在IHC切片被染色以及隨機標記(JF)后，盲法進行(LH)陽性染色的定量。顯微鏡是Nikon, Eclipse E800。相機是Nikon, DS-QiIMc。軟件是NIS-Element AR3.0。
[0068]細胞因子分析:收集的DC用Golgistop?(BD)蛋白質運輸莫能菌素(proteintransport monensin)和LPS0.1 μ g/ml孵育5小時。針對抗小鼠CDllc、CD86、MHCI1、IL_12、IFNa和TNFa表達染色DC，且在用Cytokit的膜透化作用后，針對抗小鼠IL_2、IFNa、IFN Y , TNF a表達染色收集的淋巴細胞。沖洗抗體后，通過FACS分析獲取數據。
[0069]實施例2
[0070]多種TLR激動劑增強的GVAX(TEGVAX)相比GVAX增加引流淋巴結中激活的常規樹突細胞和類漿細胞樹突細胞兩者
[0071]為了進一步增加由GVAX產生的抗腫瘤應答，我們將GLA和R848與GVAX組合，并測試該TEGVAX制劑是否會增加非荷瘤小鼠的DLN中激活的樹突細胞的數目。相比GVAX，TEGVAX能夠增強來自疫苗接種部位的DLN中的樹突細胞的激活表型(圖1)。分析了類漿細胞DC(pDC)和常規DC(cDC)兩者，且TEGVAX治療組的兩個群體都顯示增強的⑶80和⑶86激活標志物的表達(圖1A-C)。在佐劑注射后第3天，門控的DC顯示增加的激活標志物峰值，并且這持續直至第7天(圖1D)。最后，為了評價這些激活的DC是否提供用于抗腫瘤應答的合適的細胞因子環境，來自引流淋巴結的CDllc+細胞的細胞因子譜還表明IL-12、IFNa、TNFa的增加的數目，其可以使T細胞組分(T-cell r印ertoire)傾向對ThI應答(補充的圖1)。
[0072]實施例3
[0073]建立的腫瘤的TEGVAX治療顯著降低體內腫瘤生長速率
[0074]我們最初在治療模型中用建立的B16腫瘤測試了我們的TEGVAX。當接種的B16腫瘤是可觸知的時(通常在第7-10天)，我們用TEGVAX、GVAX、GLA/R848 (IDC-1005)、和媒介物對照在對側肢皮下治療荷瘤小鼠。如圖2A所示，接受TEGVAX的小鼠僅一次治療就顯示顯著較低的腫瘤生長速率。單獨的GVAX和單獨的TLR激動劑兩者具有一些適度的益處，但組合治療產生了最好的體內抗腫瘤應答。當我們比較TEGVAX與GVAX的制劑與單獨的GLA或與單獨的R848時，我們發現將GLA/R848制劑組合入GVAX具有最好的抗腫瘤應答(補充的圖2A)。
[0075]為了進一步提高抗腫瘤應答，我們用多種TEGVAX治療進行實驗，并發現多種TEGVAX治療的小鼠都沒有表現出可見于未治療的小鼠中的指數增長(圖2B)。由于激活的DC在該時間點的下降的水平，每7天一次注射TEGVAX(圖1D)。這些TEGVAX治療的具有郁積型腫瘤(smoldering tumor)的小鼠,用105B16細胞在不同于原發腫瘤部位的部位被接種，并且，在這些小鼠中，沒有腫瘤在第二部位生長，表明針對后續B16攻擊的體內免疫(數據未示出)。我們還在C3H小鼠的SCCFVII鱗狀細胞癌模型中以及在Balb/c小鼠的CT26結腸癌模型中測試了 TEGVAX，具有可比的結果，表明該抗腫瘤應答適用于多種腫瘤組織學，并且不依賴于鼠背景(圖2C)(補充的圖3)。對于SCCFVII模型，單一 TEGVAX治療實際上誘導了腫瘤的完全消退。再次，在這些小鼠中用SCCFVII腫瘤細胞的再攻擊沒有顯示腫瘤在第二部位生長的證據。
[0076] TEGVAX的抗腫瘤效應依賴于TEGVAX的制劑。當我們用GVAX和GLA/R848治療荷瘤小鼠而未在注射前共孵育I小時時，無抗腫瘤效應被記錄(圖2D)。我們認為共孵育時間可允許用角鯊烯油乳劑媒介物使疏水TLR激動劑吸附進入GVAX，并且該制劑對于TEGVAX的抗腫瘤應答是必要的。為了測試這一點，我們用Lipofectamine將GLA和R848吸附進入GVAX，并洗滌細胞以除去未吸附的佐劑/轉染子，并且我們發現由轉染方法產生的TEGVAX與由用親脂性媒介物的延長孵育方法產生的TEGVAX在它們的抗腫瘤功效方面是可比的(補充的圖4)。
[0077]實施例4
[0078]TEGVAX增加腫瘤微環境中淋巴細胞的浸潤，且這與腫瘤壞死的誘導、局部ThI應答、及腫瘤上增加的B7-H1表達相關
[0079]我們檢查了在我們的治療分析完成時收集的腫瘤組織，并檢查了腫瘤微環境的淋巴細胞。與那些用GVAX或對照治療的小鼠相比，組織學分析顯示用TEGVAX治療的那些小鼠中顯著增加的局灶性壞死的區域(圖3A、B)。用⑶4和⑶8抗體的免疫組織化學顯示TEGVAX治療的腫瘤在腫瘤組織中具有豐富的浸潤性CD4和CD8細胞(圖3C、D)。當我們檢查腫瘤引流淋巴結時，我們注意到，相比GVAX或對照治療，TEGVAX治療的小鼠具有增加的IFN Y +⑶4和⑶8。為了測試這些增加的ThI細胞是否與腫瘤細胞上的B7-H1上調有關，我們染色腫瘤組織，并發現相比GVAX和媒介物治療的小鼠，TEGVAX還顯著增加B7-H1的表達(圖 4C)。
[0080]實施例5
[0081]TEGVAX的抗腫瘤應答依賴于⑶4和⑶8細胞兩者，以及MyD88/TRIF信號傳導
[0082]為了評價T細胞對TEGVAX的抗腫瘤應答是否是重要的，我們用⑶4和CD8耗竭進行疫苗治療分析。當⑶4或⑶8T細胞耗竭時，TEGVAX治療效應被消除，表明⑶4和⑶8淋巴細胞二者對抗腫瘤免疫應答的重要性。使用Rag2K0小鼠的實驗證實了這些發現結果(圖5A、B、C)。
[0083]由于多種TLR激動劑被用作TEGVAX的制劑組分，我們試圖確定TLR信號傳導對于疫苗作用是否是關鍵的。用MyD88/TRIF雙敲除小鼠進行B16荷瘤小鼠的TEGVAX治療。再次，TEGVAX的抗腫瘤效應在這些小鼠中被完全消除，確認了 TEGVAX的抗腫瘤效應依賴于TLR信號傳導(圖OT)。
[0084]實施例6
[0085]TEGVAX增加腫瘤特異性pl5E特異性細胞毒性T細胞的數目
[0086]由于用TEGVAX的抗腫瘤效應與激活的DC相關的明確的體內證據，我們還檢查了免疫系統的效應臂(effector arm)。基于B16腫瘤中免疫顯性pl5E抗原的表達,我們進行了體內CTL試驗以定量分泌pl5E特異性IFNy的CTL的水平(圖6)。如圖6所示，在當TEGVAX治療組與其它對照組的生長速率存在明顯的分離的第21天時(圖1)，相比GVAX或其它對照小鼠，用TEGVAX治療的小鼠的脾中存在增加的pl5E特異性CTL的殺傷活性(圖6A)。還用以pl5E肽脈沖T2kb細胞作為APC對來自治療組和對照組中的每一個的⑶8T細胞進行ELISP0T試驗。這兩個獨立的試驗表明用TEGVAX治療的小鼠中增加的腫瘤特異性(抗-P15E) CTL的數目和活性(圖6B)。[0087]實施例7
[0088]與抗-PD-1抗體組合的TEGVAX可誘導建立的B16腫瘤的消退
[0089]由于TEGVAX增加pl5E_特異性細胞毒性T細胞以及產生IFN Y的⑶8細胞的數目的能力，我們將TEGVAX與免疫檢查點通路Β7-Η1/Η)-1的阻斷劑相組合。I3D-1在激活的T細胞上表達且其配體B7-H1在腫瘤細胞上的共定位與抗-PD-1阻斷劑的臨床療效相關，該配體87-!11被分泌正^^的T細胞 上調。這些發現暗示了支持的適應性免疫耐受機制是，抗-PD-1阻斷劑理想地適于與可產生強大的ThI應答的疫苗相組合。在我們的鼠模型中，TEGVAX增加了分泌IFNy的T細胞以及腫瘤細胞上上調的B7-H1的表達兩者(圖4)。當抗-PD-1抗體治療與TEGVAX組合時，在50%的治療的小鼠中記錄到建立的B16腫瘤的消退(圖7A)。在響應組合治療的這些小鼠中，記錄到白癜風，如圖7B中所示。用單獨的抗I3D-1或抗I3D-1與GVAX —起治療的小鼠相對于單獨的GVAX治療，腫瘤生長速率無改善。相比用單獨的TEGVAX或抗-PD-1，這些體內腫瘤治療試驗與從用TEGVAX和抗-PD-1治療的小鼠的腫瘤DLN中收集的增加的ThI細胞因子的協同作用相關(圖7C)。
[0090]實施例8
[0091]討論
[0092]在此報告中，我們用TLR4 (GLA)和TLR7/8 (R848)激動劑配制了 GVAX，并在3個不同的鼠模型中證明相比單獨的GVAX或單獨的TLR激動劑，體內抗腫瘤應答的顯著增強。我們證明，這些佐劑增加了激活的類漿細胞DC(pDC)以及常規DC(cDC)的數目。這些體內抗腫瘤應答是T細胞依賴的，且相比GVAX治療組，TEGVAX治療組中B16模型中的腫瘤特異性pl5E特異性T細胞升高。關于這些實驗，我們使用了針對建立的B16腫瘤的治療模型，該B16腫瘤是在它們成為可觸知的之后則不能被已知的疫苗制劑治療的免疫原性差的腫瘤。隨著反復的TEGVAX治療，腫瘤傾向于顯示“郁積型”生長速率，如圖2中所示的。對于SCCFVII模型，僅用TEGVAX的單一治療誘導可觸知的腫瘤的消退。對于CT26結腸癌模型，對可觸知的病變的TEGVAX治療也表現出體內抗腫瘤效應(補充的圖3)。TEGVAX治療與在腫瘤引流淋巴結中增加的IFNY+CD4和⑶8細胞以及腫瘤細胞上增加的B7-H1表達相關。當TEGVAX與抗-PD-1阻斷劑組合時，我們觀察到建立的B16腫瘤的消退，如圖7中所示的。
[0093]GLA和R848最初被選擇，因為相比其它TLR激動劑，這些佐劑顯著誘導增強的抗腫瘤細胞因子譜，并且兩者都在患者中被測試是安全的。TLR4激動劑GLA，在其激活鼠和人樹突細胞的能力方面與單磷酰脂質A(MPL)進行比較，且GLA被認為在體內和體外增加多種ThI型細胞因子方面是更有效的。TLR7/8激動劑R848，也被發現相對于咪喹莫特在增加I型IFN譜方面具有顯著改善。因此，我們的關于建立的腫瘤的體內結果，證明了 TEGVAX作為癌癥疫苗的高轉化潛力。有趣的是，當我們檢查治療的小鼠的腫瘤微環境時，我們注意到相比GVAX，TEGVAX治療的小鼠中來自腫瘤引流淋巴結的⑶4和⑶8細胞的增加的IFN Y水平以及來自腫瘤的增加的B7-H1表達(圖4)。
[0094]因此，我們的臨床前研究是測試疫苗與抗-PD-1阻斷劑的組合治療的很好的場所。B7-H1的誘導對腫瘤細胞的重要性及其與淋巴細胞上的ro-1的接合作為關鍵的免疫逃避機制，在臨床前模型中被證實，且B7-H1表達在臨床上與多種癌癥類型較差的預后相關。對于患有晚期黑素瘤、肺癌、和腎癌的患者，用阻斷抗-PD-1抗體的單一治療導致顯著的存活益處，且同時進行的組織學分析證明B7-H1和IFNy的表達與對ro-Ι阻斷劑的應答之間的強的相關性。在上皮組織以及B16-F10腫瘤細胞中，IFN Y可誘導B7-H1表達。累加地，這些發現結果支持適應性耐受機制，由此抗-PD-1阻斷劑能夠通過部分經由IFNy誘導腫瘤上的B7-H1解開其駐留腫瘤特異性細胞毒性T細胞的抗腫瘤功效，駐留腫瘤特異性細胞毒性T細胞誘導其自身的抑制。因此，抗-PD-1阻斷劑理想地適于與誘導IFNy的疫苗的組合治療。圖7中顯示的用TEGVAX/抗-PD-1治療時建立的B16的消退，為抗-PD-1治療與適當的疫苗組合的臨床試驗提供體內臨床前理由。
[0095]以前的報道表明，抗-PD-1、抗-CTLA-4和疫苗的組合，可促進抗腫瘤應答，但它們的體內試驗涉及對不可觸知的、非建立的B16腫瘤開始治療。我們的治療試驗要嚴格的多，其中我們在B16接種后7-10天開始治療，在該時間點上大多數免疫治療是失敗的。此外，我們不需要將抗-PD-1與其它免疫檢查點阻斷劑抗體結合以證明建立的腫瘤的消退。
[0096]當我們檢查來自腫瘤的引流淋巴結時，TEGVAX和抗_PD_1組合的協同效應被證實。腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的收集是不可行的，因為消退的腫瘤或小的腫瘤尺寸不能采樣用于流式細胞術的足夠的細胞。然而，相比單獨的TEGVAX或抗-PD-1治療組中的適度提高，來自胭淋巴結的⑶4和⑶8淋巴細胞兩者和⑶Ilc+樹突細胞展示IL-2、IL-12和IFN-Y表達水平的數倍增加(圖7C)。這些ThI細胞因子與相比TEGVAX和PD-1治療組TEGVAX/抗-PD-1治療組中pl5E特異性CTL的增加的數目相關(數據未顯示)。
[0097]從轉化的角度來看，易普利姆瑪與3-4級毒性和治療相關死亡的獨立的報道相關，因此抗-CTLA-4抗體的添加可能不是改善我們的體內結果的第一選擇。然而，由于免疫檢查點分子的許多家族中顯著的冗余，以及臨床級檢查點阻斷抗體的可用性，存在向抗-PD-1治療增加其它免疫檢查點阻斷抗體的可能性。由于增加的IFNy可潛在地上調腫瘤微環境中的B7-H1的可能性，可選的方法是使用可與抗-PD-1組合的安全的疫苗增加腫瘤特異性CTL的水平。對于本研究的目的，我們選擇了具有TLR4和TLR7/8活性的兩種TLR激動劑，但其它TLR激動劑(鞭毛蛋白、CpG、等)或其它PAMP分子是否可以進一步增強抗腫瘤應答還不清楚。最后，應重申的是，TEGVAX的所有組分已在患者中經測試是安全的。由于其自身作為有效的抗腫瘤劑的證明，與抗-PD-1抗體組合的TEGVAX具有用于臨床試驗的高轉化潛力。
[0098]我們先前證明了使用LPS配制的GVAX的瘤內注射的體內應答，但現在我們報道了用TLR4和TLR7/8激動劑兩者配制的GVAX作為治療劑的有效得多的應答。在這些治療模型中，相比全身性注射，作為瘤內注射的基礎的機理是不同的，但累加地，這些實驗證明，瘤內注射或全身性注射用細胞疫苗配制的TLR激動劑將不可能具有促癌癥發生作用。腫瘤細胞中的MyD88-NF-K B信號傳導通路已顯示具促癌癥發生后果。然而，TLR激動劑已清楚地顯示激活樹突細胞中的MyD88-TRIF通路以致敏用于抗腫瘤應答的適應性免疫系統。在本報道中，配制入GVAX的TLR激動劑可刺激引流淋巴結中的DC，且在我們的全身性治療模型中未能夠證明任何不利的促癌癥發生作用。
[0099]GVAX以及在一些模型中TLR激動劑自身，具有腫瘤生長速率中的早期適度的影響，但在所有被研究的鼠模型中，TEGVAX組與對照組之間具有明確的分離。我們還將TEGVAX與GLA/GVAX和R848/GVAX進行比較，且清楚的是，TEGVAX組合了 TLR4和TLR7/8兩者的活性，具有最佳的體內抗腫瘤應答(補充的圖2)。對于B16實驗，有活力的B16腫瘤細胞被皮下注射在遠離最初的腫瘤接種或疫苗接種的部位，且未記錄到腫瘤生長。類似地，對于SCCFVII模型，再攻擊實驗顯示僅單一的TEGVAX治療后就沒有腫瘤長出(圖2C)。
[0100]我們認為TLR4和TLR7/8兩種刺激的組合，可以增加cDC以及pDC 二者以誘導T細胞穩固地致敏為抗腫瘤T細胞，該抗腫瘤T細胞負責TEGVAX的體內抗腫瘤作用。用MyD88-TRIF雙敲除小鼠進行TEGVAX治療試驗，且抗腫瘤作用被完全消除(圖4C)。MyD88是TLR7/8信號傳導的關鍵介導者(mediator)，且TRIF和MyD88兩者均是TLR4信號傳導的關鍵的下游介導者。當我們檢查引流淋巴結CDllc+細胞時，我們注意到相比對照，TEGVAX治療組中增加的ThI細胞因子表達(圖5)。CDllc和這些ThI細胞因子的點陣圖提供以下信息:雙陽性中的增加主要源自CDllc+群體中的移位(shift)，表明TLR激動劑的添加主要誘導了 APC至淋巴結的增加的運輸，而不是增加基于每個細胞的炎性細胞因子的產生。為此，我們用Q-點標記了 TEGVAX，并定量引流淋巴結中通過細胞至細胞轉移被Q-點標記的內源APC(補充的圖5)。對于pDC和cDC兩者的群體，存在數量上更多的用Q-點標記的激活的DC，與我們以下的假設相一致:TLR佐劑增加腫瘤和引流淋巴結之間循環的激活的DC數目，其中它們可以致敏T細胞。
[0101]我們以前的關于吸附LPS的GVAX的工作證明，TLR4激動劑吸附進入細胞疫苗對于體內抗腫瘤功效是關鍵的。我們推測，GLA和R848吸附進入GVAX對于觀察到的TEGVAX的增強的抗腫瘤應答也是關鍵的。當我們簡單地共注射了 GLA和R848佐劑與GVAX而沒有任何孵育時，不存在體內抗腫瘤應答(圖2D)。只有當TLR激動劑和GVAX與親脂性媒介物孵育一小時，我們才獲得能夠誘導針對B16模型的局部應答以及誘導針對SCCFVII模型的消退的TEGVAX制劑。為了進一步測試這一點，我們使用不含角鯊烯水包油乳劑的Lipofectamine，用GLA和R848配制了 GVAX，并在B16模型中證明了可相比的體內抗腫瘤應答(補充的圖4)。因此，以后工作的一個方面，涉及TEGVAX制劑的進一步優化。
[0102]累加地，本 報道證明，作為治療性疫苗，TEGVAX提供了超越GVAX的顯著改善，其可以顯著增強腫瘤特異性T細胞的致敏，即使針對已建立的腫瘤，并且它是待被加入癌癥患者中與抗-PD-1阻斷抗體或其它形式的免疫檢查點阻斷劑的組合治療的優越的候選物。
【權利要求】
1.一種組合物，所述組合物包括: 表達細胞因子的、無增殖能力的、全癌細胞； 與人程序性死亡I (PD-1)特異性結合的抗-PD-1抗體；及 TLR(toll樣受體)激動劑； 其中用所述TLR激動劑配制所述全癌細胞。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述細胞因子是GM-CSF(粒細胞單核細胞刺激因子)。
3.根據權利要求1所述的組合物，其中所述全癌細胞是所述患者自體的。
4.根據權利要求1所述的組合物，其中用TLR7/8激動劑配制所述全癌細胞。
5.根據權利要求1所述的組合物，其中用TLR4激動劑配制所述全癌細胞。
6.根據權利要求1所述的組合物，其中用TLR4和TLR7/8激動劑配制所述全癌細胞。
7.根據權利要求1所述的組合物，其中所述TLR激動劑選自由以下構成的組:GLA、R848、和其組合。
8.根據權利要求1所述的組合物，其中所述癌細胞是黑素瘤細胞。
9.根據權利要求1所述的組合物，其中用乳劑媒介物配制所述TLR激動劑和全腫瘤細胞。
10.根據權利要求1所述的組合物，其中用Lipofectamine?配制所述TLR激動劑和全腫瘤細胞。
11.根據權利要求1所述的組合物，其中用陽離子脂質配制所述TLR激動劑和全腫瘤細胞。
12.—種方法，所述方法包括: 向癌癥患者施用以下的免疫治療劑: 表達細胞因子的、無增殖能力的、全癌細胞； 與人程序性死亡I (PD-1)特異性結合的抗-PD-1抗體；及 TLR(toll樣受體)激動劑； 其中用所述TLR激動劑配制所述全癌細胞。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述細胞因子是GM-CSF(粒細胞單核細胞刺激因子)。
14.根據權利要求12所述的方法，其中所述全癌細胞是所述患者自體的。
15.根據權利要求12所述的方法，其中用TLR7/8激動劑配制所述全癌細胞。
16.根據權利要求12所述的方法，其中用TLR4激動劑配制所述全癌細胞。
17.根據權利要求12所述的方法，其中用TLR4和TLR7/8激動劑配制所述全癌細胞。
18.根據權利要求12所述的方法，其中所述TLR激動劑選自由以下構成的組:GLA、R848、和其組合。
19.根據權利要求12所述的方法，其中所述全癌細胞是黑素瘤細胞。
20.根據權利要求12所述的方法，其中用乳劑媒介物配制所述TLR激動劑和全腫瘤細胞。
21.根據權利要求12所述的方法,其中用Lipofectamine?配制所述TLR激動劑和全腫瘤細胞。
22.根據權利要求12所述的方法，其中用陽離子脂質配制所述TLR激動劑和全腫瘤細胞。
23.—種試劑盒，所述試劑盒包括以下劑: 表達細胞因子的、無增殖能力的、全癌細胞； 與人程序性死亡I (PD-1)特異性結合的抗-PD-1抗體；及 TLR(toll樣受體)激動劑。
24.根據權利要求23所述的試劑盒，還包括用于施用和/或配制所述劑的說明書。
25.根據權利要求23所述的試劑盒，還包括乳劑媒介物。
26.根據權利要求2 3所述的試劑盒,還包括Lipofectamine?。
27.根據權利要求23所述的試劑盒，還包括陽離子脂質。
【文檔編號】A61P35/00GK103957939SQ201280055855
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年9月19日 優先權日:2011年9月19日
【發明者】Y·J·金, D·M·帕多略, J·傅 申請人:約翰霍普金斯大學