人類notch1引誘物的制作方法
【專利摘要】本文提供Notch1融合蛋白。這些融合蛋白包含連續氨基酸，所述氨基酸的序列開始于所述融合蛋白的N端并與人類Notch1受體蛋白的細胞外結構域和抗體的Fc部分中的氨基酸序列相同。所述人類Notch1受體蛋白的所述細胞外結構域(ECD)的所述氨基酸序列以存在于EGF樣重復序列(10)的N端的氨基酸開始，并至少延伸到EGF樣重復序列(23)的C端氨基酸。所述人類Notch1受體蛋白的所述ECD的N端部分可延伸到EGF樣重復序列(24)的C端氨基酸或可延伸到EGF樣重復序列(36)的C端氨基酸。還提供了這些融合蛋白的組合物。還提供了使用本文中描述的所述融合蛋白治療年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病性視網膜病變以及癌癥的方法。
【專利說明】人類N0TCH1引誘物
【技術領域】
[0001]本申請案要求2011年10月4日申請的美國臨時申請案第61/543，186號的優先權，所述申請案的內容特此以引用的方式并入。
[0002]在整個本申請案中，按作者和括號內的出版日期引用各種公開案。這些公開案的完整引文可見于本說明書的結尾處或每一實驗部分的結尾處。這些公開案的揭示內容特此以引用的方式并入本申請案中，以更充分描述本發明所屬領域。
【背景技術】
[0003]Notch蛋白在涉及脈管系統、造血系統以及神經系統的發育決定中起關鍵作用。因此，對其功能的了解是了解如何在發育期間和在成人組織中控制細胞命運決定和承諾的關鍵。迄今，若干關于Notch或Notch配體基因破壞的報導已描述血管表型，強調此路徑是指導血管發育的機制的基本部分。異常Notch活性與人類病理學有關；包括癌癥和血管性病癥(CADASIL)兩者。對腫瘤血管生成中Notch的分析最近才開始；然而對Notch的可能下游標靶的發現表明在與血管生成相關的病理過程中的作用。舉例來說，VEGFR-3與腫瘤血管生成和腫瘤淋巴管生成兩者有關。若干其它可能Notch標靶的表達或功能也與腫瘤血管生成相關；包括印hrinB2、Id3、血管生成素I以及TOGF-B。對這些標靶在Notch基因功能中的作用的見解將明顯促 進未來對人類病理學中Notch的分析。
[0004]本發明的其它背景可見于美國專利申請公開案第US2011-0008342A1號，其全部內容特此以引用的方式并入本申請案中，以更充分描述本發明所屬領域。
【發明內容】
[0005]本發明提供一種融合蛋白，其包含連續氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0006](a)人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域，之后為
[0007](b)抗體的Fe部分，
[0008]其中人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域
[0009]⑴以存在于EGF樣重復序列10的N端的氨基酸開始，且
[0010](ii)至少延伸到EGF樣重復序列23的C端氨基酸。
[0011 ] 在一個實施例中，本發明的融合蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與延伸到EGF樣重復序列24的C端氨基酸的人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列相同。在另一實施例中，融合蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與延伸到EGF樣重復序列36的C端氨基酸的人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列相同。
[0012]在一個目前優選實施例中，本發明的融合蛋白包含NotchlEGF樣重復序列10-24(在本文中也指示為Notchl引誘物10-24)。此融合蛋白結合于JAGGED-1而不結合于D114使蛋白能夠避免由D114路徑抑制引起的令人不愉快的副作用，如肝毒性、血管贅瘤或心臟和肺中的壞死。[0013]由于其對JAGGED-1的配體特異性，還考慮并預期Notchl引誘物10_24融合蛋白將展示抗JAGGED相關腫瘤惡性疾病(如乳癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))和其中JAGGED配體被報導為由生長因子高度表達或誘導的相關癌癥的優異抗腫瘤活性。
[0014]另外，考慮了此融合蛋白相對于來自先前描述的Notchl融合蛋白的經轉染細胞的分泌概況將具有優異的分泌概況。此又將為蛋白純化提供改進的效率。
[0015]本發明進一步提供包含所述融合蛋白和載劑的組合物。
[0016]本發明還提供了一種治療罹患年齡相關性黃斑變性(AMD)的個體的方法，所述方法包含以有效治療個體的AMD的量向個體投與本發明的融合蛋白。
[0017]另外，本發明提供了一種治療罹患糖尿病性視網膜病變的個體的方法，所述方法包含以有效治療個體的糖尿病性視網膜病變的量向個體投與本發明的融合蛋白。
[0018]本發明再進一步提供了一種治療罹患癌癥的個體的方法，所述方法包含以有效治療個體的癌癥的量向個體投與本發明的融合蛋白。
[0019]本發明還提供了一種治療罹患年齡相關性黃斑變性(AMD)的個體的方法，所述方法包含以有效治療個體的AMD的量向個體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0020](a)人類Notchl 受體蛋白的細胞外結構域，之后為
[0021](b)抗體的Fe部分，
[0022]其中人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域
[0023](i)包含存在于EGF樣重復序列9的N端的氨基酸，且
[0024](ii)至少延伸到EGF樣重復序列13的C端氨基酸，
[0025]其限制條件為如果N端氨基酸是EGF樣重復序列I的N端氨基酸，那么C端氨基酸并非EGF樣重復序列36的C端氨基酸。
[0026]本發明還提供了一種治療罹患糖尿病性視網膜病變的個體的方法，所述方法包含以有效治療個體的糖尿病性視網膜病變的量向個體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0027](a)人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域，之后為
[0028](b)抗體的Fe部分，
[0029]其中人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域
[0030](i)包含存在于EGF樣重復序列9的N端的氨基酸，且
[0031](ii)至少延伸到EGF樣重復序列13的C端氨基酸，
[0032]其限制條件為如果N端氨基酸是EGF樣重復序列I的N端氨基酸，那么C端氨基酸并非EGF樣重復序列36的C端氨基酸。
[0033]本發明進一步提供了一種治療罹患癌癥的個體的方法，所述方法包含以有效治療個體的癌癥的量向個體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0034](a)人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域，之后為
[0035](b)抗體的Fe部分，
[0036]其中人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域
[0037](i)包含存在于EGF樣重復序列9的N端的氨基酸，且[0038](ii)至少延伸到EGF樣重復序列13的C端氨基酸，
[0039]其限制條件為如果N端氨基酸是EGF樣重復序列I的N端氨基酸，那么C端氨基酸并非EGF樣重復序列36的C端氨基酸。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1a-1b:截短型Notchl引誘物變體的示意圖。圖1a是Notchl引誘物1_36和Notchl引誘物1-24的示意圖，所述Notchl引誘物各自與Dl 14和JAGGED-1兩者相互作用并充當泛Notch抑制劑。圖1b是四個截短型Notchl引誘物變體10-36、14-36、10-24以及14-24的示意圖。
[0041]圖2a_2b:截短型Notchl引誘物變體在293T細胞中的表達和分泌。圖2a展示總細胞溶解產物和上清液的蛋白印跡法以及Notchl引誘物1-13、1-24以及1_36的分子量。圖2b展示總細胞溶解物和上清液的蛋白印跡法以及Notchl引誘物10-36、14-36、10-24以及14-24的分子量。
[0042]圖3a_3c:引誘物1_13、1_24以及1-36的Notch報導某閔分析。圖3a含有多個與熒光素酶基因連接的CSL結合位點的Notch報導基因構筑體的示意圖。圖3b顯示表達DLL4的HELA細胞的結果。圖3c顯示表達JAGGED-1的HELA細胞的結果。
[0043]圖4a_4b:引誘物10-26、14-36、10-24以及14-24的Notch報導基因分析。圖4a顯示表達DLL4的HELA細胞的結果。圖4b顯示表達JAGGED-1的HELA細胞的結果。
[0044]圖5a_5b:293T細胞溶解產物的使用抗Fe或抗FLAG抗體的免疫印跡法，所述293T細胞溶解產物經Notchl引誘物和可溶性(圖5a)或全長(圖5b)Notchl配體共轉染。
[0045]圖6 =Notchl引誘物和Notchl的共免疫沉淀。
[0046]圖7a_7c:在第P2天注射表達不同Notchl引誘物的腺病毒之后P5小鼠視網膜的同工凝集素B4染色。圖7a是對照引誘物、Notchl引誘物1_13、NotchlO-24引誘物以及DAPT。圖 7b 是 Fc、Notchl 引誘物 1-13,Notchl 引誘物 10-24 以及 Notchl 引誘物 1-24。在圖7c中定量視網膜的血管區域。平均血管覆蓋區域土S.D.*P值〈0.05。
[0047]圖8a_8d:表汰Notchl引誘物的HUVEC的基因表達剖析。圖8a、8b、8c以及8d中分別闡述Notch受體(Notchl、Notch2、Notch3以及Notch4)的mRNA轉錄物的定量RT-PCR。
[0048]圖9a_9b:表汰Notchl引誘物的HUVEC的基因表達剖析。圖9a中為HEYl的mRNA轉錄物的定量RT-PCR。圖9b中為HEY2的mRNA轉錄物的定量RT-PCT0
[0049]圖1Oa-1Ob:表汰Notchl引誘物的HUVEC的基因表達剖析。圖1Oa中為HEYL的mRNA轉錄物的定量RT-PCR。圖1Ob中為HESl的mRNA轉錄物的定量RT-PCT0
[0050]圖1la-1le:表汰Notchl引誘物的HUVEC的基因表達剖析。圖1la中為DLL4的mRNA轉錄物的定量RT-PCR ;圖1lb中為JAGGED-1的mRNA轉錄物的定量RT-PCR ;圖1le中為VEGFR-1的mRNA轉錄物的定量RT-PCR ;圖1ld中為VEGFR-2的mRNA轉錄物的定量RT-PCR ；且圖1le中為VEGFR-3的mRNA轉錄物的定量RT-PCR。
[0051]M 12a-12c:VEGF 受體的流式細胞術。表達 VEGFR-1 (圖 12a) ；VEGFR-2 (圖 12b)以及VEGFR-3 (圖12c)的Notch引誘物的HUVEC的直方圖。
[0052]圖13a和13b:表汰Notchl引誘物的HUVEC的基因表達剖析。圖13a和13b兩者中為全長VEGFR-1和可溶性VEGFR-1的mRNA轉錄物的定量RT-PCR。[0053]圖14:在小鼠乳房腫瘤細胞(Mm5MT)、人類胰臟癌細胞(KPl)、小鼠路易斯肺癌細胞(LLC)以及小鼠黑色素瘤細胞(B16-F10)中表達的Notch受體和配體的基因表達剖析。
[0054]圖15a-15d:Notch引誘物1_13、10-24以及1_24對Mm5MT和KPl腫瘤細胞的細胞增殖和細胞凋亡的作用。圖15a為在Mm5MT-FGFT細胞中的腫瘤增殖研究的結果。圖15b為在KPl-VEGF中的增殖研究的結果。在右上象限中指示凋亡細胞的百分比。平均凋亡細胞百分比土S.D.。圖15c為在Mm5MT-FGF4中的細胞凋亡研究的結果。圖15d為在KPl-VEGF中的細胞凋亡研究的結果。
[0055]圖16a_16c:圖16a為小鼠血清中Fe、Notchl引誘物1_13、10_24以及1-24的蛋白印跡法分析，在所述小鼠中靜脈內注射表達Notchl引誘物1-13、10-24以及1_24或作為對照的Fe的腺病毒。圖16b和16c為通過抗人類IgG Fe抗體免疫染色且經DAPI對比染色的腫瘤切片。比例尺:30微米。[0056]圖17a_17c:圖17a為表達Notchl引誘物1_13、10-24、1_24或作為對照的Fe的小鼠的成像。Notchl引誘物降低Mm5MT腫瘤的生長。通過Xenogen IVIS成像系統評估發光信號的總輻射率來監測腫瘤生長，且結果顯示于圖17b中。在即將收集腫瘤之前最后一天測量腫瘤重量，且結果顯示于圖17c中。
[0057]圖18a_18c:圖18a為表達Notchl引誘物1-13、10-24、1-24或作為對照的Fe的小鼠的成像。Notchl引誘物降低KPl腫瘤的生長。通過Xenogen IVIS成像系統評估發光信號的總輻射率來監測腫瘤生長，且結果顯示于圖18b中。在即將收集腫瘤之前最后一天測量腫瘤重量，且結果顯示于圖18c中。
[0058]圖19a-19b =Notchl引誘物對腫瘤脈管系統的作用。針對內皮粘蛋白(綠色)和D114(紅色)對腫瘤切片進行免疫染色，且結果顯示于圖19a中。腫瘤脈管系統的定量是基于腫瘤切片中的內皮粘蛋白陽性區域，且結果是在圖1%中。
[0059]圖20a_20b:腫瘤內皮含量的免疫熒光分析。針對內皮粘蛋白和D114對KPl腫瘤進行免疫染色，且結果顯示于圖20a中。腫瘤脈管系統的定量是基于KPl腫瘤切片中的內皮粘蛋白陽性區域，且結果是在圖20b中。
[0060]圖21a_21b =Notchl引誘物對腫瘤脈管系統的作用。在腫瘤收集之前2分鐘，將熒光黃偶聯的凝集素(IOOyg)注射到小鼠中。針對內皮粘蛋白(紅色)和所灌注凝集素(綠色)對腫瘤切片進行免疫染色，且所灌注凝集素與腫瘤血管相關。免疫染色的結果是在圖21a中。血管相關凝集素的量反映功能腫瘤脈管系統，且結果顯示于圖21b中。
[0061]圖22a_22b:針對內皮粘蛋白(綠色)和NG2(紅色)對腫瘤切片進行共免疫染色，且結果闡述于圖22a中。測量NG2陽性區域的百分比作為腫瘤中的周細胞募集的參數，且結果顯示于圖22b中。
[0062]圖23a_23c:來自不同Notch引誘物組的具有發光信號的LLC腫瘤負載小鼠的第12天照片是在圖23a中。基于總輻射率監測并定量腫瘤生長，且結果闡述于圖23b中。在第12天腫瘤收集之前測量腫瘤重量，且結果顯示于圖23c中。
[0063]圖24a_24c:來自不同Notch引誘物組的具有發光信號的B16-F10腫瘤負載小鼠的第12天照片是在圖24a中。基于總輻射率監測并定量腫瘤生長，且結果闡述于圖24b中。在第12天腫瘤收集之前測量腫瘤重量，且結果顯示于圖24c中。
[0064]圖25a_25b:在第12天從LLC腫瘤負載小鼠收集肺和肝，在30mg/mL D-熒光素中孵育并通過Xenogen IVIS成像系統分析。成像結果闡述于圖25a中。總輻射率結果闡述于圖25b中。
[0065]圖26a-26c:在第12天從B16-F10腫瘤負載小鼠收集肺和肝，在30mg/mL D-熒光素中孵育并使用Xenogen IVIS成像系統分析。來自Fe組的肺成像闡述于圖26a和26b中且肝成像闡述于圖26c中。
[0066]圖27a_27c:Notchl引誘物誘導輕度杯狀細朐增牛。與泛Notch抑制劑、Notchl引誘物1-24和1-36類似，配體特異性引誘物使杯狀細胞數目略微增加。保存小腸的正常結構并與對照比較。結果顯示于圖27a中。計算每視野的平均杯狀細胞數目，且結果顯示于圖27b中。圖27c顯示腫瘤負載小鼠對Notchl引誘物耐受良好。未觀測到處理組與對照之間的重量變化有顯著差異。平均重量變化土S.D.(η = 5)。
[0067]圖28:人類NOTCHl蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
[0068]圖29:人類Notchl引誘物10-24的核酸序列闡沭于SEQ ID NO: 2中。人類Notchl信號肽對應于SEQ ID NO: 2的核苷酸1-69，EGF樣重復序列10-24對應于SEQ ID NO: 2的核苷酸70-1788，且人類Fe對應于SEQ ID NO: 2的核苷酸1789-2502。人類Notchl引誘物10-24的氨基酸序列闡述 于SEQ ID Ν0:3中。
[0069]圖30:人類Notchl引誘物10-36的核酸序列闡沭于SEQ ID NO:4中。人類Notchl信號肽對應于SEQ ID NO:4的核苷酸1-69，EGF樣重復序列10-36對應于SEQ ID NO:4的核苷酸70-3243，且人類Fe對應于SEQ ID NO: 4的核苷酸3244-3957。人類Notchl引誘物10-36的氨基酸序列闡述于SEQ ID Ν0:5中。
[0070]圖31:人類Notchl引誘物14-24的核酸序列闡沭于SEQ ID NO:6中。人類Notchl信號肽對應于SEQ ID NO:6的核苷酸1-69，EGF樣重復序列14-24對應于SEQ ID NO:6的核苷酸70-1320，且人類Fe對應于SEQ ID NO: 6的核苷酸1321-2034。人類Notchl引誘物14-24的氨基酸序列闡述于SEQ ID Ν0:7中。
[0071]圖32:人類Notchl引誘物14-36的核酸序列闡沭于SEQ ID NO:8中。人類Notchl信號肽對應于SEQ ID NO:8的核苷酸1-69，EGF樣重復序列14-36對應于SEQ ID NO:8的核苷酸70-2775，且人類Fe對應于SEQ ID NO: 8的核苷酸2776-3489。人類Notchl引誘物14-36的氨基酸序列闡述于SEQ ID Ν0:9中。
[0072]圖33a_33c =Notchl引誘物變體展示對體外和視網膜血管生成的獨特作用。圖33a顯示使用HUVEC纖維蛋白珠粒發芽分析的Notchl引誘物評估。7天后，內皮細胞形成管樣結構。表達NI1—13引誘物的HUVEC顯示顯著增加的發芽。相比之下，表達N1.24或NI1—24引誘物的HUVEC形成較短、較細的芽，與Fe對照相反。在圖33b中定量含有管腔的芽的數目。平均芽數目±3.0.撲值〈0.05。視網膜用a SMA免疫染色以鑒定血管平滑肌細胞。Ν11(ι_24和NI1—24引誘物顯著降低沿視網膜動脈的血管平滑肌細胞覆蓋。結果顯示于圖33c中。
[0073]圖34a_34c =Notchl引誘物增加內皮細胞i千移。以1.0 X IO5個細胞/孔將慢病毒轉導的HUVEC接種于24孔板中，并過夜使其變得匯合。接著，在每一孔中制造劃痕，且對遷移到受傷區域中的HUVEC進行拍照(圖34a)，并使用TScratch程序定量。平均遷移率土S.D.*P值〈0.03(圖34b)。圖34c顯示，Notchl引誘物增加內皮細胞增殖。以1.0X104個細胞/孔將經Fc、Notchl引誘物1-13、1-24、1-36或NlIC慢病毒轉導的HUVEC接種于24孔板中。在第I天和第4天定量細胞數目。平均細胞數目±3.0.撲值〈0.005。[0074]圖35a_35b:表汰Notchl引誘物的HUVEC顯示內皮網絡和分支增加。圖35a.在24孔板中以1.0X IO5個細胞/孔將HUVEC接種于膠原層之間并培養4天。圖34b.通過計數分支點數目來定量HUVEC形成網絡的能力。HUVEC-N1IC和HUVEC-Notch4/in13由于其缺乏適當網絡而不包括在內。平均分支點數目±3.0.撲值〈0.005。
[0075]圖36:針對Notch配體、JAGGED-1以及DLL4的定量實時PCR。與普通培養板或膠原凝膠上的HUVEC比較，在纖維蛋白凝膠上培養的HUVEC顯著上調JAGGED-1表達且同時下調DLL4表達。mRNA轉錄物的平均相對值土 S.D.*P值〈0.002。
[0076]圖37a-37b:Notchl 引誘物 1_13、10_24 以及 1_24 減少 Mm5MTFGF4 中的集落形成。圖37a.在24孔板中以3X IO3個細胞/孔將Mm5MT_FGF4、KP1-VEGF, LLC以及B16-F10腫瘤細胞接種于半固體瓊脂培養基中，并培養3周。向培養物中添加3mg/ml MTT以使集落可視化。圖37b.進行集落區域的定量。集落區域的平均百分比±5.0.撲值〈0.001。
[0077]圖38 =Notchl引誘物阻斷異種移植腫瘤生長。使用皮下注射到裸小鼠中的Mm5MT-FGF4、KPl-VEGF、LLC或B16-F10評估腫瘤生長。腫瘤移植后3天靜脈內注射編碼不同Notchl引誘物變體的Ad。在Notchl引誘物治療組中腫瘤顯著較小。在收集時測量腫瘤重量。平均腫瘤重量±3.0.樸值〈0.05(11 = 4-5)。
[0078]圖39a-39c:Notchl 引誘物 1_24 和 1_36 類似地降低 Mm5MT_FGF4 (圖 39a)和KPl-VEGF腫瘤(圖39b)的生長。由長度(L)和寬度(W)計算腫瘤體積(V) (V = 0.5XLXW)，其是每周測量一次。平均腫瘤體積土S.D.*P值〈0.05。Notchl引誘物1-24和1_36顯著減少腫瘤脈管系統。CD31免疫熒光顯示來自Notchl引誘物組的腫瘤中的血管含量降低且結構被破壞。比例尺:30微米。數據顯示于圖39c中。
[0079]圖40a_40b =Notchl引誘物阻斷異種移植腫瘤生長。圖40a顯示，Notchl1-13引誘物阻斷D114/Notch活性且引起腫瘤脈管系統增加，而Notchl.24或Notchl1—24引誘物減少所有腫瘤模型中的腫瘤血管。通過內皮粘蛋白免疫熒光(綠色)分析腫瘤脈管系統。圖40b顯示對圖40a影像中來自多個腫瘤切片的內皮粘蛋白陽性區域定量的數據。內皮粘蛋白陽性區域的平均百分比土S.D.*P值〈0.003 (η = 4-5)。比例尺:30微米。
[0080]S41a-41c =Notchl引誘物破壞腫瘤血管生成，減少灌注且誘導缺氧。針對內皮粘蛋白(紅色)和所灌注凝集素(綠色)對來自經熒光黃偶聯的凝集素注射的小鼠的腫瘤切片進行免疫染色。內皮粘蛋白相關的凝集素的量反映功能性腫瘤脈管系統和正常灌注。用APC偶聯的抗缺氧探針抗體(紅色)和DAPI (藍色)對來自經缺氧探針腹膜內注射的小鼠的腫瘤切片進行免疫染色，并針對腫瘤缺氧定量。數據顯示于圖41a中。凝集素陽性區域的平均百分比土S.D.*P值〈0.006 (η = 4-5)顯示于圖41b中。缺氧探針陽性區域的平均百分比土S.D.*P值〈0.002，#P值〈0.05 (η = 4-5)顯示于圖41c中。來自引誘物治療的小鼠的腫瘤顯示缺氧和壞死顯著增加。比例尺:30微米。
[0081]圖42a_42c:Notchl引誘物破壞腫瘤血管生成。Mm5MT_FGF4腫瘤切片的IV型膠原(紅色)和內皮粘蛋白(綠色)免疫熒光。IV型膠原的存在與腫瘤脈管系統相關，表明Notchl引誘物抑制腫瘤血管生成，而不引起血管消退。影像顯示于圖42a中。平均IV型膠原陽性區域和平均內皮粘蛋白陽性區域土S.D.分別顯示于圖42b和42c中*P值〈0.002。
[0082]圖43a_43d:靶向JAGGED-1的Notchl引誘物破壞腫瘤中的壁細胞-內皮細胞相互作用。針對內皮粘蛋白(綠色)和NG2(紅色)對腫瘤切片進行共免疫染色。影像顯示于圖43a中。比例尺:10微米。測量NG2陽性區域的百分比作為腫瘤中周細胞覆蓋的參數。內皮粘蛋白或NG2陽性區域的平均百分比土S.D.分別顯示于圖43a和43b中。圖43d顯示NG2陽性/內皮粘蛋白陽性區域*P值〈0.02 (η = 4-5)。
[0083]圖44:靶向JAGGED-1的Notchl引誘物破壞腫瘤中的壁細胞-內皮細胞相互作用。針對內皮粘蛋白(綠色)和a SMA(紅色)對腫瘤切片進行共免疫染色。覆蓋有血管平滑肌細胞的大血管通常位于腫瘤外周。比例尺:10微米。
[0084]圖45:針對Notch下游標靶HEYl、HEY2、HEYL, HESl對表達NI引誘物或JAGGED-1shRNA 的 HUVEC 進行的定量 RT-PCR。
[0085]圖46:針對VEGF受體對表達Notchl引誘物或JAGGED-1shRNA的HUVEC進行的定量RT-PCR和流式細胞術。
[0086]圖47a_47b:圖47a顯示針對VEGF等體對表汰Notchl引誘物的HUVEC或講行的定量RT-PCR。圖47b顯示可溶性VEGFR-1的酶聯免疫吸附分析的結果。
[0087]圖48a_48b:對腫瘤切片的VEGFR-1免疫熒光證實NIich24引誘物和1_24增加可溶性VEGFR-1表達。免疫熒光影像顯示于圖48A中。平均VEGFR-1陽性區域土S.D.顯示于圖48b中*P值〈0.02。比例尺:30微米。
[0088]圖49 jNotchl引誘物對其它Dll和Jag家族成員的配體特異性。在與表達Notch配體的HeLa細胞共培養的表達全長大鼠Notchl和IICSL-Luc的HeLa細胞中測量Notch信號活化。僅Nll-13、Nl1J4以及NV36引誘物抑制DLLl誘導的Notch信號傳導，表明EGF樣重復序列1-9對抑制DLLl誘導的Notch信號傳導是必不可少的。然而，Nl1^13引誘物并不抑制JAG2。僅NIich24能阻斷JAG2，暗示Notchl的EGF樣重復序列10-24賦予JAGGED特異性。平均熒光素酶誘導倍數土 S.D.*P值〈0.005。
【具體實施方式】
[0089]術語
[0090]如本申請案中所用，除非本文中另外明確提供，否則以下術語中的每一者應具有下文所述含義。
[0091]“投與”可使用本領域普通技術人員已知的任何方法來實現或進行。所述方法包含例如損害內、肌內、皮下、靜脈內、腹膜內、脂質體介導、經粘膜、經腸、局部、經鼻、口服、經肛門、經眼或經耳遞送方式。
[0092]“粘附”應意指通過任何方式附接。在一個實施例中，粘附意指通過共價鍵附接。在另一實施例中，粘附意指以非共價方式附接。
[0093]“氨基酸”、“氨基酸殘基”以及“殘基”在本文中可互換使用以指代并入蛋白質、多肽或肽中的氨基酸。氨基酸可為例如天然存在的氨基酸或可以類似于天然存在的氨基酸的方式起作用的天然氨基酸的類似物。
[0094]如本文中所用的“C端”和“N端”氨基酸是指分別在給定蛋白質、蛋白質結構域或氨基酸序列模體的羧基或氨基末端處或緊鄰其的氨基酸，以使得在所述C端氨基酸或N端氨基酸更遠處無蛋白質、蛋白質結構域或氨基酸序列模體的結構、功能或表征所必需的氨
基酸殘基。
[0095]“抗體”應包括(但不限于)(a)包含兩條重鏈和兩條輕鏈且識別抗原的免疫球蛋白分子；(b)多克隆或單克隆免疫球蛋白分子；以及(c)其單價或二價片段。免疫球蛋白分子可源自于普通已知類別中的任一者，所述類別包括(但不限于)IgA、分泌型IgA、IgG、IgE以及IgM。IgG亞類為本領域普通技術人員所熟知，且包括(但不限于)人類IgGl、IgG2、IgG3以及IgG4。抗體可為天然存在和非天然存在的抗體兩者。此外，抗體包括嵌合抗體、完全合成抗體、單鏈抗體以及其片段。抗體可為人類或非人類抗體。可通過重組方法使非人類抗體人類化，以降低其在人類中的免疫原性。抗體片段包括(但不限于)Fab和Fe片段。在一個實施例中，“抗體的Fe部分”是通過免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化所獲得的可結晶片段且稱為免疫球蛋白的“效應區”，所述片段由兩條利用二硫鍵連接的重鏈的C端半部分組成。在另一實施例中，“抗體的Fe部分”意指重鏈的一個C端半部分的全部或實質上全部。
[0096]關于抗體，“人類化”意指其中CDR區外的一些、大部分或所有氨基酸經源自于人類免疫球蛋白分子的相應氨基酸置換的抗體。氨基酸的小添加、缺失、插入、取代或修飾是可容許的，只要其不消除抗體結合給定抗原的能力即可。適合的人類免疫球蛋白分子包括(但不限于)IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA以及IgM分子。各種公開案描述如何制造人類化抗體，例如美國專利第4,816, 567號、第5，225，539號、第5，585, 089號以及第5,693, 761號以及PCT國際公開案第W090/07861號。[0097]如本文中所用的術語“組合物”，如在醫藥組合物中，打算涵蓋包含活性成分和組成載劑的惰性成分的產物，以及直接或間接由所述成分中的兩者或兩者以上的組合、復合或聚集產生、或由所述成分中的一或多者的解離產生、或由所述成分中的一或多者的其它反應類型或相互作用產生的任何產物。
[0098]如本文中所用的“有效量”是指能夠治療患有腫瘤、疾病或病癥的個體的量。因此，有效量將隨所治療個體以及待治療的病狀而變。本領域的普通技術人員可執行常規滴定實驗以測定所述充足量。化合物的有效量將視個體和所用特定給藥途徑而變化。基于所述化合物，所述量可連續遞送，如通過連續泵送或以周期性間隔(例如在單獨一或多次情況下)進行。本領域普通技術人員無需過度實驗即可測定多個量的特定化合物的所需時間間隔。在一個實施例中，有效量是在約1μ g/kg-10mg/kg之間。在另一實施例中，有效量是在約10 μ g/kg-lmg/kg之間。在另一實施例中，有效量是100 μ g/kg。
[0099]如與Notch受體蛋白結合使用的“細胞外結構域”意指Notch的全部或一部分，其
(i)存在于細胞外(即，作為跨膜部分或細胞內部分存在)和(ii)與完整Notch受體蛋白所結合的細胞外配體結合。Notch的細胞外結構域可任選地包括信號肽(“sp”)。“細胞外結構域”、“E⑶”以及“胞外結構域”是同義的。
[0100]“抑制”病癥或不希望的生物過程的發作應意指減小病癥或過程發作的可能性或徹底預防病癥或過程發作。在優選實施例中，抑制病癥或過程的發作意指徹底預防其發作。
[0101]“NotcWNotch蛋白”以及“Notch受體蛋白”是同義的。另外，術語“基于Notch的融合蛋白”和“Notch引誘物”是同義的。以下Notch氨基酸序列是已知的并特此以引用的方式并入:Notchl (Genbank 登錄號 S18188 (大鼠))；Notch2 (Genbank 登錄號 NP_077334 (大鼠))；Notch3 (Genbank 登錄號 Q61982 (小鼠))；以及 Notch4 (Genbank 登錄號 T09059 (小鼠))。以下Notch核酸序列為已知的并特此以引用的方式并入:Notchl (Genbank登錄號XM_342392(大鼠)和 NM_017617 (人類));Notch2 (Genbank 登錄號 NM_024358 (大鼠)、M99437 (人類和 AF308601 (人類))；Notch3 (Genbank 登錄號 NM_008716(小鼠)和XM_009303(人類))；以及 Notch4 (Genbank 登錄號 ΝΜ_010929 (小鼠)和 NM_004557 (人類))。
[0102]術語“核酸”、“多核苷酸”以及“核酸序列”在本文中可互換使用，且每一者是指脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物。脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸可為天然存在的或其合成類似物。“核酸”應意指任何核酸，包括(但不限于)DNA、RNA以及其雜合體。形成核酸分子的核酸堿基可為堿基A、C、G、T以及U以及其衍生物。這些堿基的衍生物為此項技術中所熟知，且例示于PCR系統、試劑以及消耗品(PCR Systems, Reagents and Consumables)(珀金埃爾默目錄1996-1997，美國新澤西州布蘭斯堡的羅氏分子系統公司(Perkin ElmerCataloguel996-1997, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, New Jersey,USA))中。核酸包括(但不限于)反義分子和如核糖酶和DNA酶的催化性核酸分子。核酸還包括編碼肽類似物、片段或衍生物的核酸，所述肽類似物、片段或衍生物在一或多個氨基酸殘基的一致性方面不同于天然存在形式(缺失類似物，其含有少于所有指定殘基；取代類似物，其中一或多個殘基由 一或多個殘基置換；以及添加類似物，其中一或多個殘基添加到所述肽的末端或中間部分)，且共享天然存在形式的一些或所有性質。
[0103]術語“多肽”、“肽”以及“蛋白”在本文中可互換使用，且每一者意指氨基酸殘基的聚合物。氨基酸殘基可為天然存在的或其化學類似物。多肽、肽以及蛋白質還可包括如糖基化、脂質附接、硫酸鹽化、羥基化以及ADP-核糖基化的修飾。
[0104]如本文中所用的“醫藥學上可接受的載劑”意指所述載劑與調配物的其它成分相容，且對其接受者無害，并涵蓋標準醫藥學上接受的載劑中的任一者。所述載劑包括例如0.01-0.1M且優選包括0.05M磷酸鹽緩沖液或0.8%鹽水。另外，所述醫藥學上可接受的載劑可為水性或非水性溶液、懸浮液以及乳液。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、如橄欖油的植物油以及如油酸乙酯的可注射有機酯。水性載劑包括水、醇性/水性溶液、乳液以及懸浮液，包括鹽水和緩沖介質。腸胃外媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer’sdextrose)、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏和不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體和營養補充劑，電解質補充劑(如基于林格氏右旋糖的電解質補充劑)等。還可存在防腐劑和其它添加劑，如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。
[0105]“個體”應意指任何生物體，包括(但不限于)哺乳動物，如小鼠、大鼠、犬、豚鼠、雪貂、兔以及靈長類動物。在一個實施例中，個體是人類。
[0106]“治療”意指減緩、終止或逆轉疾病或病癥的進展。如本文中所用的“治療”還意指改善與疾病或病癥相關的癥狀。疾病包括(但不限于)腫瘤血管生成、動脈粥樣硬化、創傷愈合、早產兒視網膜病變、子癲前癥、糖尿病性視網膜病變、缺血、中風、心血管疾病、牛皮癬、淋巴水腫、腫瘤生成和腫瘤淋巴管生成、年齡相關性黃斑變性(AMD)、濕性AMD、胰臟癌和乳癌。
[0107]血管生成是在創傷愈合過程、女性月經周期和子宮內膜重塑期間以及在胚胎發育和器官生長期間遇到。在病理學環境中，血管生成在如類風濕性關節炎、牛皮癬、黃斑變性、糖尿病性視網膜病變以及腫瘤生長的不同疾病中起重要作用。
[0108]已有重要的體內證據，包括臨床觀察，異常血管生成與包括類風濕性關節炎、炎癥、癌癥、牛皮癬、退化性眼睛病狀等的多種疾病病狀有關。[0109] 使用Notch融合蛋白的其它疾病是代謝病癥，如(但不限于)糖尿病、肥胖、糖尿病前期、動脈粥樣硬化、缺血、中風、心血管疾病、調節胰島素的表達以及調節胰島素的功倉泛。
[0110]Notch融合蛋白的使用也適用于代謝綜合癥，所述代謝綜合癥是指增加人患心血管疾病和糖尿病的風險的醫學病癥的組合。關于所述綜合癥的其它已知名稱是綜合癥X、胰島素抗性綜合癥、雷文氏綜合癥(Reaven’s syndrome)。所述綜合癥的若干特征包括:空腹高血糖、高血壓、中央型肥胖(也稱為內臟性肥胖)、降低的高密度脂蛋白(LDL)、升高的甘油三酯、升高的尿酸水平。上文所列的空腹高血糖包括2型糖尿病或空腹葡萄糖受損以及葡萄糖耐受或胰島素抗性受損。除代謝綜合癥之外，Notch引誘物可具有糖尿病前期的適應癥。
[0111]單位、前綴和符號可以其SI可接受形式表示。除非另有指示，否則核酸序列沿5’到3’取向從左到右寫，且氨基酸序列沿氨基端到羧基端取向從左到右寫。氨基酸在本文中可由其通常已知的三個字母符號或由IUPAC-1UB生物化學命名委員會(IUPAC-1UBBiochemical Nomenclature Commission)推薦的一個字母符號來提及。同樣地，核苷酸可由其通常接受的單個字母代碼來提及。
[0112]本文中使用以下縮寫:E⑶:細胞外結構域；IC:細胞內結構域:NE⑶/Fe:基于Notch 的融合蛋白；N1 =Notchl ；N2:Notch2 ；N3:Notch3 ；N4:Notch4 ；D11: δ 樣；DLL1: δ樣 I ;DLL4: δ 樣 4 JAG JAGGED ;JG JAGGED JAGGED-1 JAGGED I ；JG1 JAGGED I ；EC:內皮細胞；HUVEC:人類臍靜脈內皮細胞；m.0.1.:感染倍數；VEGF:血管內皮細胞生長因子；VEGFR:血管內皮細胞生長因子受體；sp:信號肽；H)GF:血小板衍生生長因子；H)GFR:血小板衍生生長因子受體；P1GF:胎盤生長因子。
[0113]本發明的實施例
[0114]在一個實施例中，融合蛋白是包含連續氨基酸的融合蛋白，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0115](a)人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域，之后為
[0116](b)抗體的Fe部分，
[0117]其中人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域
[0118]⑴以存在于EGF樣重復序列10的N端的氨基酸開始，且
[0119](ii)至少延伸到EGF樣重復序列23的C端氨基酸。
[0120]本發明的融合蛋白的另一實施例中包含與延伸到EGF樣重復序列24的C端氨基酸的人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
[0121]在另一實施例中，連續氨基酸的序列包含SEQ ID N0:3中所述以位置24的胱氨酸開始并以位置833的賴氨酸結束的序列。
[0122]本發明的融合蛋白的另一實施例中包含與延伸到EGF樣重復序列36的C端氨基酸的人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
[0123]在另一實施例中，連續氨基酸的序列包含SEQ ID NO:5中所述以位置24的胱氨酸開始并以位置1318的賴氨酸結束的序列。
[0124]在任何本發明的融合蛋白的另一實施例中，抗體的Fe部分是人類抗體的Fe部分。
[0125]在本發明的融合蛋白的另一實施例中，(a)人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域位于信號肽之后。在另一實施例中，信號肽是人類Notchl蛋白的信號肽或IgG重鏈的信號肽。
[0126]在任何本發明的融合蛋白的另一實施例中，人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列延伸到EGF樣重復序列24的C端氨基酸。在另一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO:3中所述的連續氨基酸序列。
[0127]在任何本發明的融合蛋白的另一實施例中，人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列延伸到EGF樣重復序列36的C端氨基酸。在另一實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO:5中所述的連續氨基酸序列。
[0128]還提供了一種組合物，其包含任何本發明的融合蛋白和載劑。
[0129]在一個實施例中，融合蛋白以有效抑制JAGGED-1的活性的量存在于醫藥學上可接受的載劑中。
[0130]還提供了一種治療罹患年齡相關性黃斑變性(AMD)的個體的方法，所述方法包含以有效治療個體的AMD的量向個體投與任何本發明的融合蛋白。
[0131 ] 在一個實施例中，AMD是濕性AMD。在另一實施例中，AMD是干性AMD。
[0132]還提供了一種治療罹患糖尿病性視網膜病變的個體的方法，所述方法包含以有效治療個體的糖尿病性視網膜病變的量向個體投與任何本發明的融合蛋白。
[0133]在任何本發明的方法的一個實施例中，所述方法進一步包含投與血管內皮生長因子(VEGF)的抑制劑。在另一實施例中，VEGF的抑制劑是VEGF-A、PGIF、VEGF-B, VEGF-C或VEGF-D的抑制劑。
[0134]在任何本發明的方法的一個實施例中，所述方法進一步包含投與VEGF受體抑制劑。在另一實施例中，VEGF受體抑制劑是VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
[0135]還提供了一種治療罹患癌癥的個體的方法，所述方法包含以有效治療個體的癌癥的量向個體投與任何本發明的融合蛋白。
[0136]在一個實施例中，癌癥是胰臟癌。在另一實施例中，癌癥是乳癌。
[0137]還提供了一種治療罹患年齡相關性黃斑變性(AMD)的個體的方法，所述方法包含以有效治療個體的AMD的量向個體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0138](a)人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域，之后為
[0139](b)抗體的Fe部分，
[0140]其中人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域
[0141](i)包含存在于EGF樣重復序列9的N端的氨基酸，且
[0142](ii)至少延伸到EGF樣重復序列13的C端氨基酸，
[0143]其限制條件為如果N端氨基酸是EGF樣重復序列I的N端氨基酸，那么C端氨基酸并非EGF樣重復序列36的C端氨基酸。
[0144]在一個實施例中，AMD是濕性AMD。在另一實施例中，AMD是干性AMD。
[0145]還提供了一種治療罹患糖尿病性視網膜病變的個體的方法，所述方法包含以有效治療個體的糖尿病性視網膜病變的量向個體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同:
[0146](a)人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域，之后為[0147](b)抗體的Fe部分，
[0148]其中人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域
[0149](i)包含存在于EGF樣重復序列9的N端的氨基酸，且
[0150](ii)至少延伸到EGF樣重復序列13的C端氨基酸，
[0151]其限制條件為如果N端氨基酸是EGF樣重復序列I的N端氨基酸，那么C端氨基酸并非EGF樣重復序列36的C端氨基酸。
[0152]在任何本發明的方法的一個實施例中，所述方法進一步包含投與血管內皮生長因子(VEGF)的抑制劑。在另一實施例中，VEGF的抑制劑是VEGF-A、PGIF、VEGF-B, VEGF-C或VEGF-D的抑制劑。
[0153]在任何本發明的方法的一個實施例中，所述方法進一步包含投與VEGF受體抑制劑。在另一實施例中，VEGF受體抑制劑是VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
[0154]還提供了一種治療罹患癌癥的個體的方法，所述方法包含以有效治療個體的癌癥的量向個體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續氨基酸，所述氨基酸的序列開始于融合蛋白的N端并與以下 中存在的氨基酸序列相同:
[0155](a)人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域，之后為
[0156](b)抗體的Fe部分，
[0157]其中人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域
[0158](i)包含存在于EGF樣重復序列9的N端的氨基酸，且
[0159](ii)至少延伸到EGF樣重復序列13的C端氨基酸，
[0160]其限制條件為如果N端氨基酸是EGF樣重復序列I的N端氨基酸，那么C端氨基酸并非EGF樣重復序列36的C端氨基酸。
[0161]在一個實施例中，癌癥是胰臟癌。在另一實施例中，癌癥是乳癌。
[0162]在任何本發明的方法的一個實施例中，人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列以存在于EGF樣重復序列9的N端的氨基酸開始并延伸到EGF樣重復序列23的C端氨基酸。
[0163]在任何本發明的方法的另一實施例中，人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列以存在于EGF樣重復序列9的N端的氨基酸開始并延伸到EGF樣重復序列36的C端氨基酸。
[0164]在任何本發明的方法的另一實施例中，人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列以存在于EGF樣重復序列I的N端的氨基酸開始并延伸到EGF樣重復序列13的C端氨基酸。
[0165]在任何本發明的方法的另一實施例中，人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列以存在于EGF樣重復序列I的N端的氨基酸開始并延伸到EGF樣重復序列24的C端氨基酸。
[0166]在任何本發明的融合蛋白的一個實施例中，人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列由EGF樣重復序列10-24組成。在另一實施例中，所述融合蛋白包含連續氨基酸，其序列闡述于SEQ ID N0:3中。
[0167]在任何本發明的融合蛋白的一個實施例中，人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列由EGF樣重復序列10-36組成。在另一實施例中，所述融合蛋白包含連續氨基酸，其序列闡述于SEQ ID N0:5中。
[0168]在任何本發明的融合蛋白的一個實施例中，人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列由EGF樣重復序列14-24組成。在另一實施例中，所述融合蛋白包含連續氨基酸，其序列闡述于SEQ ID N0:7中。
[0169]在任何本發明的融合蛋白的一個實施例中，人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域的氨基酸序列由EGF樣重復序列14-36組成。在另一實施例中，所述融合蛋白包含連續氨基酸，其序列闡述于SEQ ID N0:9中。
[0170]在任何本發明的融合蛋白的一個實施例中，抗體的Fe部分是人類抗體的Fe部分。在任何本發明的融合蛋白的另一實施例中，信號肽是人類Notchl蛋白的信號肽或IgG重鏈的信號肽。
[0171]還提供了一種醫藥組合物，其包含本文中描述的融合蛋白中的任一者和醫藥學上可接受的載劑。
[0172]本發明提供了一種治療個體的年齡相關性黃斑變性(AMD)的方法，所述方法包含以有效治療個體的量向個體投與任何一種本發明的融合蛋白的融合蛋白，由此治療個體的AMD。
[0173]在一個實施例中，融合蛋白是用于治療個體的年齡相關性黃斑變性的本發明的融合蛋白中的任一者。
[0174]本發明還提供了一種治療個體的年齡相關性黃斑變性(AMD)的方法，所述方法包含以有效減少血管生成的量向個體投與JAGGED-1抑制劑，由此治療個體的AMD。在一個實施例中，AMD是濕性AMD。在另一實施例中，JAGGED抑制劑是Notchl融合蛋白。
[0175]其它Notchl融合蛋白描述于例如2008年8月22日申請并代表紐約市的哥倫比亞大學理事會(The Trustees of Columbia University in the City of New York)的 PCT國際申請案第PCT/US2008/010045號中，所述申請案的全部內容特此以引用的方式并入本申請案中。在另一實施例中，Notchl融合蛋白是任何本文中描述的融合蛋白。
[0176]本發明還提供了 JAGGED-1抑制劑，其用于治療個體的年齡相關性黃斑變性。在一個實施例中，AMD是濕性AMD。在另一實施例中，JAGGED抑制劑是Notchl融合蛋白。在另一實施例中，Notchl融合蛋白是任何本文中描述的融合蛋白。
[0177]在本發明的一個實施例中，所述方法進一步包含投與血管內皮生長因子(VEGF)的抑制劑。在另一實施例中，VEGF的抑制劑是VEGF-A、PGIF、VEGF-B, VEGF-C或VEGF-D的抑制劑。
[0178]在本發明的一個實施例中，所述方法進一步包含投與VEGF受體抑制劑。在另一實施例中，VEGF受體抑制劑是VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
[0179]本發明提供了一種治療個體的胰臟癌的方法，所述方法包含以有效治療個體的量向個體投與本文中描述的融合蛋白中的任一者，由此治療患有胰臟癌的個體。
[0180]在一個實施例中，融合蛋白是用于治療個體的胰臟癌的本發明的融合蛋白中的任
一者O
[0181]本發明提供了一種延遲或抑制腫瘤生長的方法，其中所述腫瘤包含胰臟癌細胞，所述方法包含使腫瘤與有效延遲或抑制所述腫瘤的生長的量的本文中描述的融合蛋白中的任一者接觸。[0182]在一個實施例中，融合蛋白是用于抑制腫瘤生長的本發明的融合蛋白中的任一者，其中所述腫瘤包含胰臟癌。
[0183]本發 明提供了一種治療個體的乳癌的方法，所述方法包含以有效治療個體的量向個體投與本發明的融合蛋白中的任一者，由此治療個體的乳癌。
[0184]在一個實施例中，融合蛋白是用于治療個體的乳癌的本發明的融合蛋白中的任一者。
[0185]本發明提供了一種延遲或抑制腫瘤生長的方法，其中所述腫瘤包含乳癌細胞，所述方法包含使腫瘤與呈有效延遲或抑制所述腫瘤的生長的量的本發明的融合蛋白中的任一者的量接觸。
[0186]在一個實施例中，融合蛋白是用于抑制腫瘤生長的本發明的融合蛋白中的任一者，其中所述腫瘤包含乳癌細胞。
[0187]在以下實驗細節部分中說明本發明。此部分經闡述以幫助理解本發明，但不打算且不應理解為以任何方式限制如其后權利要求書中所闡述的本發明。
[0188]實駘細節
[0189]第一系列的實驗
[0190]引言
[0191]Notch信號傳導需要允許Notch受體和配體互相作用的細胞-細胞接觸。Notch細胞外結構域的主要部分包含最多36個含有Ca2+結合共有序列的EGF樣重復序列。Notch配體在其細胞外區域中也含有EGF樣重復序列，但其可通過富含半胱氨酸的結構域的存在或不存在來區分。JAGGED配體家族含有16個EGF樣重復序列和富含半胱氨酸的結構域，δ樣配體家族含有8個或更少EGF樣重復序列。若干條證據顯示，DSL區域賦予Notch結合特異性且C端EGF樣重復序列有助于促進結合(清水(Shimizu)等人；格利滕貝格(Glittenberg)等人；亨德森(Henderson)等人)。此處，顯示EGF樣重復序列11-13為Notch/Dll I和Notch/JAGGED-1相互作用所必需的(科德爾(Cordle)等人；漢布爾頓(Hambleton)等人)。
[0192]基于與作為Notch抑制劑的人類IgG Fe (Notchl引誘物)融合的大鼠Notchl細胞外結構域的36-EGF樣重復序列產生新穎可溶性構筑體(舟橋(Funahashi)等人)。已顯示，Notchl引誘物抑制由Notch配體JAGGED-U Dlll以及D114刺激的Notch活性。此發現暗示，Notch的EGF樣重復序列足以與Notch配體有效地相互作用且因此預防Notch受體被其配體活化。已研究Notch-配體特異性是否由細胞外EGF樣重復序列決定。另外，已充分確定Notch是抗血管生成療法的標靶中的一者，因此已基于人類N0TCH1產生新的Notchl引誘物構筑體用于治療目的。大鼠Notchl和人類N0TCH1蛋白質序列是96%同源(92.6%一致)，且已顯示大鼠和人類Notchl引誘物在Notch信號傳導和功能分析中的活性無法區分。此處，使用人類Notchl引誘物，其將簡單地稱為Notchl引誘物，在下一章節中用于體外研究以及體內和腫瘤實驗。
[0193]除對Notch路徑的廣泛遺傳和細胞研究以外，Notch-配體相互作用的分子表征仍難以捉摸。為增進對Notch-配體識別的分子基礎的了解，還產生包括EGF樣重復序列1-13和1-24的Notchl引誘物截短片段。由于EGF樣重復序列11-13參與配體結合，故假設11-13可為仍保留配體結合活性的Notch的最短形式。Notchl引誘物1_36的分子量以其糖基化、分泌形式為約ISOkD或超過250kD，故探究其是否可經修飾或縮短以使得其以較高含量產生并分泌用于治療目的。所用這些新的引誘物變體評估其抑制作用以及其配體特異性。本文中所述結果證明Notchl引誘物1-13充當D114特異性抑制劑，且Notchl引誘物1-24充當泛Notch抑制劑。
[0194]還成功地構筑JAGGED-1特異性抑制劑。構筑并測試第二代Notchl引誘物(包括10-24、10-36、14-24 以及 14-36)。證明僅 Notchl 引誘物 10-24 具有 JAGGED-1 特異性，并在基于內皮細胞的分析、視網膜血管生成以及基因譜分析中呈現不同活性。基于其不同活性，使用引誘物1-13、10-24以及1-24作為可能的抗腫瘤和抗血管生成劑來進行腫瘤研究。[0195] 材料和方法
[0196]Notchl引誘物奪體的產牛
[0197]全長Notchl引誘物1-36和Notch引誘物1-24的示意圖顯示于圖1(a)中。產生四個源自于Notchl引誘物1-36和1-24構筑體的PCR突變誘發的截短型Notchl引誘物變體。這些是NotchlO-36引誘物、Notchl4-36引誘物、NotchlO-24引誘物以及Notchl4_24引誘物。這些引誘物的示意性代表圖闡述于圖1b中。人類Notchl的氨基酸序列闡述于SEQID NO:1中。人類Notchl弓丨誘物10-24的核酸序列闡述于SEQ ID N0:2中，且氨基酸序列闡述于SEQ ID N0:3中。人類Notchl引誘物10-36的核酸序列闡述于SEQ ID N0:4中，且氨基酸序列闡述于SEQ ID N0:5中。人類Notchl引誘物14-24的核酸序列闡述于SEQ IDN0:6中，且氨基酸序列闡述于SEQ ID N0:7中。人類Notchl引誘物14-26的核酸序列闡述于SEQ ID N0:8中，且氨基酸序列闡述于SEQ ID N0:9中。
[0198]截短型Notchl引誘物奪體在293T細朐中的表汰和分泌.[0199]使用基于pCCL的Notchl引誘物質粒通過磷酸鈣轉染來轉染293T細胞。轉染后2天收集總細胞溶解產物，且使用兔抗人類Fe抗體進行蛋白印跡法。Notchl引誘物1-13、
1-24以及1-36引誘物的分子量分別是83kD、127kD以及178kD。參見圖2a。Notchl引誘物10-36、14-36、10-24以及14-24的分子量分別是140Kd、128kD、91kD以及73kD。參見圖
2b ο
[0200]Notch報導某閔分析
[0201 ] 為了評估Notch弓丨誘物對Notch信號傳導的作用，利用含有多個與熒光素酶基因連接的CSL結合位點(IICSL-Luc)的Notch報導基因構筑體。在與表達Notch配體的HeLa細胞共培養的表達Notchl和llCSL-Luc的HeLa細胞中測量Notch信號傳導的活化。所有Notch引誘物抑制DLL4誘導的Notch信號傳導。然而，Notchl-13并不抑制JAGGED-1。平均熒光素酶誘導倍數土 S.D.*P值〈0.002。參見圖3。顯示EGF樣重復序列1_9對于抑制DLL4誘導的Notch信號傳導必不可少(參見圖4a)。僅Notchl引誘物10_24能夠阻斷JAGGED-1，暗示EGF樣重復序列10-24可具有JAGGED-1特異性。參見圖4b。
[0202]Notchl引誘物與可溶件配體的共轉染
[0203]在293T細胞中將Notchl引誘物與可溶性配體(參見圖5a)或全長配體(參見圖5b)共轉染。用 pcDNA3.1 引誘物和 pCRII1-DLL4_FLAG 或 pCRII 1-JAGGED-1-FLAG 或空載體共轉染293T細胞。還添加DSG(—種交聯劑)以使引誘物與配體的相互作用穩定為蛋白質復合物。接著，收集細胞溶解產物并通過蛋白A/G瓊脂糖沉淀。接著通過抗FLAG抗體對沉淀復合物進行免疫印跡分析。Notchl引誘物1-13與DLL4相互作用，且Notchl引誘物10-24與JAGGED-1相互作用。
[0204]共免疫沉淀分析
[0205]使用Notchl引誘物和全長Notchl受體進行共免疫沉淀。通過蛋白A/G瓊脂糖沉淀細胞溶解產物，并使用抗Fe或抗Notchl抗體對其進行印跡分析。Notchl引誘物并不與Notchl受體相互作用。參見圖6。
[0206]視網臘血管牛成
[0207]將50 μ I 表達不同引誘物(1-13、10-24、1-24 以及 1-36)的 5.0X 109ffu/ml 腺病毒或50μ12π^/πι1 DAPT皮下注射到Ρ2新生兒瞳孔中。在Ρ5時收集視網膜且固定并使用同工凝集素Β4針對視網膜脈管系統進行免疫染色。通過血清的人類Fe蛋白印跡證實引誘物的表達和分泌。結果顯示于圖7a-7d中。Notchl引誘物1_13和10-24對視網膜血管生成展示相反作用。
[0208]某閔表汰剖析
[0209]i.原代細朐和癌癥細朐株
[0210]在37°C下將細胞培養物維持在5% CO2和95%潮濕空氣中。使HUVEC生長在EGM-2培養基(馬里蘭州沃克斯維爾的隆薩集團(Lonza Group, Walkersville, MD))。Mm5MT、LLC以及B16-F10是來自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC，弗吉尼亞州馬納薩斯(Manassas，VA))。將癌癥細胞株維持于具有10 %胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈霉素(Pen-Str印)的IX高葡萄糖DMEM(加利福尼亞州卡爾斯巴德的英杰公司(Invitrogen, Carlsbad, CA))中。
[0211]i1.表汰 Notchl 引誘物的 HUVEC
[0212]從慢病毒轉導的HUVEC收集RNA以用于反轉錄和定量RT-PCR。
[0213]對Notch受體(Notchl_Notch4)的mRNA轉錄物進行定量RT-PCR。結果顯示于圖8a-8d中。平均相對值土 S.D.*P值〈0.03。
[0214]對HEYl和HEY2的mRNA轉錄物進行定量RT-PCR。所有Notchl弓丨誘物均下調HEYl，但僅1-13和1-24下調HEY2。結果顯示于圖9a和9b中。平均相對值土S.D.*P值〈0.03。
[0215]對HEYL和HESl的mRNA轉錄物進行定量RT-PCT。還通過Notchl引誘物在HUVEC中的表達下調Notch信號傳導的下游標祀(HEYL和HES1)。結果顯不于圖1Oa和IOb中。平均相對值土 S.D.*P值〈0.03。
[0216]對DLL4、JAGGED-1、VEGFR-1、VEGFR-2 以及 VEGFR-3 的 mRNA 轉錄物進行定量RT-PCR。Notchl引誘物1-13和10-24對VEGFR-1轉錄物具有不同作用。結果顯示于圖1la-1le中。平均相對值土S.D.*P值〈0.03。
[0217]ii1.癌癥細胞株的基因表達剖析
[0218]利用四種不同細胞株:小鼠乳房腫瘤細胞(Mm5MT)、人類胰臟癌細胞(KPl)、小鼠路易斯肺癌細胞(mouse Lewis lung carcinoma cell, LLC)以及小鼠黑色素瘤細胞(B16-F10)。從培養的腫瘤細胞分離RNA并進行反轉錄。進行PCR以探究所有Notch受體和配體在這些細胞株中的表達。PCR結果顯示于圖14中。
[0219]細胞增殖和細胞凋亡細胞分析
[0220]使用不同Notchl引誘物變體慢病毒轉導腫瘤細胞并評估其細胞增殖和細胞凋亡。使用FITC偶聯的膜聯蛋白V抗體進行細胞凋亡分析。在圖15c和15d的右上象限中指示凋亡細胞的百分比。
[0221]通過蛋白印跡和免疫染色的Notchl檢測
[0222]將表達Notchl引誘物1-13、10-24以及1_24或作為對照的Fe的腺病毒靜脈內注射到成年小鼠中。進行蛋白印跡分析，參見圖16a。收集腫瘤，且通過免疫熒光評估腫瘤切片中的引誘物含量。參見圖16b。結果闡述于圖16a和16b中。
[0223]腫瘤牛長實齡
[0224]首先慢病毒轉導Mm5MT_FGF4和KPl-VEGF腫瘤細胞以表達熒光素酶，從而使用熒光素酶活性或發光信號監測腫瘤生長。以2種方式進行實驗:第一，通過慢病毒轉導將不同Notchl引誘物或Fe直接引入腫瘤細胞中；第二通過使用腺病毒。在腫瘤收集之前將Hypoxyprobe?(組織中的缺氧標記)和FITC偶聯的凝集素注射到小鼠中，以便分析腫瘤缺氧和血管灌注。通過使用Xenogen IVIS成像系統評估發光信號的總輻射率來監測腫瘤生長。平均總通量土S.D.*P值〈0.05 (η = 4-5)。結果闡述于圖17a_17c和18a_18c中。
[0225]腫瘤脈管系統表征
[0226]針對內皮粘蛋白(Endomucin)陽性區域(綠色)和D114(紅色)對腫瘤切片進行免疫染色。腫瘤脈管系統的定量是基于腫瘤切片中的內皮粘蛋白陽性區域。平均內皮粘蛋白陽性區域土S.D.*P值〈0.003(n = 4-5)。比例尺:30微米。結果闡述于圖19a和19b和圖20a和20b中。
[0227]腫瘤收集前2分鐘將熒光黃(fluorescein)偶聯的凝集素(100 μ g)注射到小鼠中。針對內皮粘蛋白(紅色)和所灌注凝集素(綠色)對腫瘤切片進行免疫染色，且所灌注凝集素與腫瘤血管相關。血管相關凝集素的量反映功能腫瘤脈管系統。平均凝集素陽性區域土S.D.*P值〈0.006(n = 4-5)。比例尺:30微米。結果闡述于圖21a和21b中。
[0228]在Mm5MT和KPl腫瘤切片h.的NG2和內皮粘蛋白免瘡熒光.[0229]針對內皮粘蛋白(綠色)和NG2 (紅色)對腫瘤切片進行共免疫染色。測量NG2陽性區域的百分比作為腫瘤中周細胞募集的參數。平均NG2陽性區域土S.D.*P值〈0.02 (η=4-5)。比例尺:10微米。結果闡述于圖22a和22b中。
[0230]腫瘤侵入和轉移
[0231]使用表達熒光素酶的皮下LLC和B16-F10腫瘤評估腫瘤侵入和轉移中的Notchl引誘物活性。在第12天對來自不同引誘物組(1-13、10-24以及1-24)的具有發光信號的腫瘤負載小鼠采集照片。基于總輻射率監測腫瘤生長并對其進行定量。平均總通量土S.D.(η=5)。在腫瘤收集前第12天測量腫瘤重量。平均腫瘤重量土S.D.*P值〈0.05(n = 5)。結果闡述于圖23a-23c和24a_24c中。
[0232]在第12天從腫瘤負載小鼠收集肺和肝，在30mg/mL D-熒光素中孵育并通過Xenogen IVIS成像系統分析。對于LLC模型，第12天來自每一組的小鼠開始發生肺轉移，且組間腫瘤負荷并非顯著不同。任一組中均未發現肝轉移。平均總通量土S.D.(η = 5)。結果顯示于圖25a和25b中。
[0233]在第12天從腫瘤負載小鼠收集肺和肝，在30mg/mL D-熒光素中孵育并通過Xenogen IVIS成像系統分析。器官的成像展示肺(圖26a和26b)和肝(圖26c)中來自Fe組的轉移病灶。引誘物治療組中未發現轉移。B16-F10腫瘤負載小鼠顯示引誘物治療組中肺和肝轉移的發生延遲。[0234]結果
[0235]TAGGED-1特異件Notchl引誘物的構筑
[0236]如由若干體外功能分析所示，Notchl引誘物變體呈現不同抑制活性，視Notch配體而定。顯示Notchl引誘物1-13僅抑制DLL4誘導的Notch信號傳導，且其在功能分析中的抑制作用與其它DLL4中和劑(包括可溶性DLL4-FC和抗DLL4抗體)的抑制作用極其類似。基于原始構筑體，DLL4誘導的和JAGGED-1誘導的Notch活化兩者均需要EGF樣重復序列1-24。且，EGF樣重復序列1-13僅阻斷DLL4，而不阻斷JAGGED-1。因此，假設EGF樣重復序列14-24和14-36可呈現JAGGED-1特異性。然而，若干條證據表明EGF樣重復序列
11-13對于NOTCH與JAGGED-1的相互作用是必需的。因此，產生Notchl引誘物變體10-24和10-36作為可能的JAGGED-1特異性藥劑。對Notchl引誘物1_24或1_36質粒進行PCR突變誘發，以缺失前9個或13個EGF樣重復序列。通過在293T細胞中的表達和分泌來證實新的構筑體，如圖2中所示。其表達水平與先前引誘物變體的表達水平類似，因為與較小變體相比，較大變體以較低水平表達并分泌。
[0237]缺乏EGF樣重復序列1-9或1-13的Notchl引誘物奪體不能陽斷DLL4,佰Notchl引誘物10-24顯著抑制TAGGED-1誘導的Notch信號傳導
[0238] Notchl引誘物1-13作為DLL4特異性抑制劑起作用。實現新Notchl引誘物的構筑后，利用共培養信號傳導分析測試Notch引誘物的抑制作用和配體特異性。所有第2代Notchl引誘物均不抑制DLL4誘導的Notch信號傳導(圖3a_c)。此表明受體與DLL4的相互作用需要EGF樣重復序列1-9。然而，Notchl引誘物10-24顯著阻斷JAGGED-1誘導的Notch信號傳導，而其它引誘物并不具有任何作用(圖4a-b)。Notchl引誘物10_36還呈現較小JAGGED-1抑制，但其抑制作用并不一致或顯著。此發現備受關注，因為已顯示EGF樣重復序列11-13與δ樣和JAGGED配體兩者相互作用，但本文中所述基于細胞的信號傳導分析證明EGF樣重復序列1-9的不存在似乎將轉變Notch受體對JAGGED-1的親和力。
[0239]Notchl引誘物與Notch配體特異件結合
[0240]已證明Notchl引誘物為Notch抑制劑，且假設基于受體引誘物本身的性質，其通過與Notch配體競爭性相互作用且從而防止Notch受體活化來阻斷Notch信號傳導。為了進一步探究抑制機制，對Notchl引誘物和全長Notch配體、DLL4以及JAGGED-1進行共免疫沉淀。正如所料，顯示Notchl引誘物1-13僅與DLL4而非JAGGED-1相互作用，而Notchl引誘物10-24僅與JAGGED-1相互作用(圖5a和5b)。Notchl引誘物1_24與DLL4和JAGGED-1兩者相互作用，此支持先前的功能分析。
[0241 ] 盡管目前Notch胞外結構域的寡聚為未知的，但研究Notch I引誘物是否可與Notch受體相互作用并阻斷Notch活性。在293T細胞中對Notch引誘物和全長大鼠Notchl進行共免疫沉淀，且結果顯示在圖6中。從Fe沉淀物中未檢測到Notchl，表明Notchl引誘物可能通過與配體競爭且不與受體相互作用來抑制Notch信號傳導。
[0242]Notchl引誘物在視網臘血管牛成中杭血管牛成
[0243]出生后早期的小鼠視網膜已為經廣泛研究的血管生成模型。其在一系列明確界定的事件中發展血管模式，所述事件包括在外周的血管發芽和在中心的修剪和重塑。因此，利用視網膜血管生成作為模型來進一步探究Notchl引誘物的作用。已證明，DLL4阻斷或DLL4缺失增加血管生成發芽(洛博夫(Lobov)等人)，而內皮細胞特異性JAGGED-1缺陷引起血管生成發芽減 少(貝內迪托(Benedito)等人)。視網膜血管生成的一個標志是在血管前面出現延伸線狀偽足的內皮尖端細胞。Notch引誘物1-13表型模擬DLL4缺陷，因為視網膜脈管系統顯示尖端細胞數目和血管生成發芽顯著增加。然而，Notch引誘物10-24引起血管生成減少，與內皮細胞中JAGGED-1損失類似。兩種引誘物之間的視網膜脈管系統差異驚人顯著，且明顯指示Notch配體的不同抑制。Notchl引誘物1-24和1-36以及GS1、DAPT引起增加但嚴重破壞發芽血管生成(圖7a)。
[0244]表汰Notchl引誘物奪體的HUVEC的某閔剖析證明其陽.斷Notch信號傳導
[0245]接著，探究Notchl引誘物對Notch信號傳導和其下游標靶的作用(參見圖8_11)。NOTCHl的轉錄物水平隨著引誘物的表達而顯著減少(分別99%、97%以及97% )，指示NOTCHl是由Notch活性水平自動調節的。令人感興趣的是，其它NOTCH轉錄物水平不受這些引誘物的影響。N0TCH2和N0TCH3通常不在內皮細胞中表達，不過其有時可在培養的HUVEC中檢測到。Notch配體(JAGGED-1和DLL4)的表達不隨Notchl引誘物表達而改變。另外，還探究Notch信號傳導的直接下游標靶來驗證來自體外分析的結果。大部分標靶(包括HEY1、HEYL以及HES1)隨所有引誘物的表達而顯著降低，指示Notchl引誘物有效阻斷Notch活性。然而，不同于其它引誘物，Notchl引誘物10-24不降低HEY2的表達水平。此結果可表明Notch配體有差別的調節Notch對不同HEY和HES的活性。尚未完全了解對Notch信號傳導的JAGGED-1和DLL4 (或通常JAG和DLL配體)調節的機制，且這些表達剖析數據可暗示什么下游標靶在配體特異性Notch信號傳導中是重要的。已充分確定Notch路徑調節VEGF信號傳導。因此，進一步探究Notchl引誘物對VEGF受體表達是否具有任何作用。所有Notchl引誘物變體增加HUVEC中的VEGFR-2表達，與NIIC相反。此發現支持以下觀察結果:用Notchl引誘物抑制Notch活性會增強HUVEC增殖和遷移，此可能由VEGFR-2表達和活性的增加引起。此外，Notch的抑制似乎顯著降低VEGFR-3表達。Notchl引誘物1-13和1-24降低VEGFR-1表達；然而，Notchl弓丨誘物10-24增加其表達，與在表達NlIC的HUVEC中類似。此結果是出乎意外的，因為Notchl引誘物10-24顯示顯著的Notch抑制活性。通過流式細胞術驗證對VEGF受體的基因表達剖析。VEGFR-2的細胞表面表達在表達引誘物的HUVEC中增加，且VEGFR-3減少，如圖12中的直方圖中所示。然而，VEGFR-1表面表達并不顯著改變，如qRT-PCR數據所表明。已知VEGFR-1以多個亞型存在:跨膜受體和可溶性蛋白。這些亞型源自于不同mRNA剪接變體。來自qRT-PCR和流式細胞術的數據表明VEGFR-1表達增加可歸因于可溶性亞型轉錄物，而非表面受體。接著，重復表達分析，利用對可溶性亞型的剪接變體具有特異性的PCR引物。如圖13中所示，可溶性VEGFR-1轉錄物因Notchl引誘物10-24而增加到14倍，但未受Notchl引誘物1-13和1_24顯著影響。此發現暗示JAGGED-1抑制引起可溶性VEGFR-1而非全長受體上調，且DLL4抑制減少全長VEGFR-1且對可溶性VEGFR-1無作用。
[0246]界定所表達的Notch/Notch配體的癌癥細胞株的基因表達剖析
[0247]為了探究Notchl引誘物對腫瘤血管生成的作用，利用4種不同細胞株:小鼠乳房腫瘤細胞(Mm5MT)、人類胰臟癌細胞(KPl)、小鼠路易斯肺癌細胞(LLC)以及小鼠黑色素瘤細胞(B16-F10)。Mm5MT和KPl細胞株不隨皮下移植而轉移，但LLC和B16-F10轉移到肺和肝。因此，這些腫瘤模型能夠不僅研究引誘物對腫瘤生長和腫瘤血管生成的作用，而且能夠研究腫瘤細胞侵入和轉移。結果顯示于圖14中。Mm5MT和LLC類似地表達高水平的Notchl、Notch2 以及 Dll I 和低水平的 Notch3、Notch4 以及 JAGGED-1。KPl 細胞表達NOTCHl、N0TCH2、N0TCH3、JAGGED-1 以及 DLL4。且，B16-F10 細胞表達 Notch2、Notch3、Notch4 以及僅一種配體JAGGED-1。
[0248]Notchl引誘物對腫瘤細朐增葙和細朐凋亡無仵何作用
[0249]在于小鼠中利用這些腫瘤細胞用于腫瘤實驗之前，測試Notchl引誘物對培養物中的腫瘤細胞生長是否將具有任何作用。首先，使用不同Notchl引誘物變體(1-13、10-24以及1-24)慢病毒轉導所有Mm5MT和KPl腫瘤細胞，并進行增殖和細胞凋亡分析。在4天時期內觀測細胞增殖，且在實驗結束時細胞數目無顯著差異(圖15)。對于細胞凋亡，將培養的細胞再懸浮，與FITC偶聯的膜聯蛋白V抗體一起孵育，并通過流式細胞術分析。膜聯蛋白V陽性細胞的數目未觀測到顯著差異。
[0250]Notch引誘物分泌到血液循環中并當經由腺病毒載體表達時于腫瘤中檢測到
[0251]為了模擬引誘物的全身遞送，利用腺病毒遞送方法。將表達Notchl引誘物或作為對照的Fe的腺病毒靜脈內注射到成年小鼠中。所注射的腺病毒感染肝細胞并產生高血清水平的經編碼Notchl引誘物，其可通過蛋白印跡法來檢測(參見圖16a和b)。收集腫瘤之后，還通過免疫熒光評估腫瘤切片中的引誘物含量，所述免疫熒光顯示所有引誘物變體均到達腫瘤。
[0252]所有Notchl引誘物1_13、10_24以及1_24顯著減小腫瘤牛長并對腫瘤血管牛成顯示不同作用
[0253]由于Notchl引誘物1-24和1_36以類似方式抑制腫瘤生長和腫瘤血管生成，故僅使用1-24變體隨同配體特異性引誘物進行后續腫瘤實驗。已廣泛顯示DLL4阻斷通過增加非功能性腫瘤脈管系統來減少腫瘤生長(諾格拉-特羅伊塞(Noguera-Troise)等人；李奇微(Ridgway)等人；霍伊(Hoey)等人)。因此，預期D114特異性引誘物1_13以相同方式表現。首先慢病毒轉導Mm5MT-FGF4和KPl-VEGF腫瘤細胞以表達熒光素酶，以使得可針對熒光素酶活性或發光信號監測腫瘤生長。以2種方式進行腫瘤實驗:第一，通過慢病毒轉導將不同Notchl引誘物或Fe直接引入腫瘤細胞中；第二通過使用腺病毒。另外，在腫瘤收集之前將Hypoxyprobe? (組織中的缺氧標記)和FITC偶聯的凝集素注射到小鼠中，以便分析腫瘤缺氧和血管灌注。不同引誘物的存在引起腫瘤生長顯著降低。分別地，1-13、10-24以及l-36Mm5MT腫瘤的重量比對照小69%、52%以及39% (圖17a_17c)，且KPl腫瘤小40%,49%以及57% (圖18a-18c)。通常在移植后約一周腫瘤開始快速生長后，可見引誘物的作用。來自引誘物組的腫瘤生長看起來經延遲或甚至逆轉，如KPl腫瘤中所示。由于腫瘤數據是收集自代表活細胞中熒光素酶活性的發光信號，故預測在實驗末期腫瘤大小的減小可能是由死亡和壞死引起。
[0254]Notchl引誘物1-13引起非功能性腫瘤脈管系統增加
[0255]通過內皮粘蛋白免疫熒光和凝集素灌注分析腫瘤脈管系統。如圖19a和19b和20a和20b中所示，具有Notchl引誘物1_13的腫瘤顯示Mm5MT和KPl模型兩者中的血管密度顯著增加。與對照腫瘤相比，1-13腫瘤中的脈管系統顯著地更高度分支且具有更廣泛的內皮網絡。D114免疫熒光還顯示D114陽性內皮細胞增加，此支持內皮粘蛋白陽性細胞的高度發芽網絡。相比之下，來自10-24和1-24治療小鼠的腫瘤通過內皮粘蛋白免疫染色明確顯示血管含量降低。這些形態變化也由對來自內皮粘蛋白免疫熒光的血管區域的定量反映。另外，組織學評估顯示在所有實驗組中更廣泛的腫瘤缺氧，此表明引誘物1-13組中的增加的腫瘤脈管系統可能并不具適當功能。通過血管內凝集素來比較血管灌注的分布，針對凝集素陽性區域和內皮的內皮粘蛋白免疫熒光定量所述血管內凝集素。如圖21a和21b中所示，來自所有引誘物治療組的脈管系統均顯示較差的血管灌注，分別降低72%、90%以及84%。通常一些較大腫瘤血管經灌注，但大部分較小分支血管不含有熒光凝集素。因此，腫瘤缺氧和凝集素灌注數據表明Notchl引誘物1-13抑制Notch/D114信號傳導路徑并引起非功能性血管網絡增加。
[0256]腫瘤血管擴張和破壞的形態指示Notchl引誘物10-24的不同活性
[0257]與1-13腫瘤中增加的血管網絡不同，10-24腫瘤中的腫瘤脈管系統顯示內皮細胞含量和破壞的血管結構顯著降低。大部分腫瘤血管看起來較大且經擴張。已在體外顯示Notchl引誘物10-24充當JAGGED-1特異性抑制劑，因此預測腫瘤脈管系統中的這些形態變化可能由JAGGED-1抑制引起。Notch3是動脈一致性和血管平滑肌細胞成熟的主要Notch受體，且其表達和活性需要內皮表達的JAGGED-1(多芒熱(Domenga)等人；劉(Liu)、肯納德(Kennard)以及莉莉(Lilly))。因此，對JAGGED-1介導的Notch信號傳導的抑制可引起破壞的壁細胞覆蓋和異常腫瘤血管成熟。
[0258]通討Notch引誘物10-24和1_24的TAGGED-1陽斷引起內皮-周細朐相互作用失
M
[0259]由于在引誘物治療組中腫瘤中的內皮細胞含量顯著受影響，故進一步探究是否也改變血管周組分，尤其周細胞和巨噬細胞。圖22顯示在Mm5MT和KPl腫瘤切片上的NG2和內皮粘蛋白免疫熒光。在來自1-13組的切片中NG2陽性周細胞含量顯著增加。在腫瘤血管周圍發現周細胞，且其與腫瘤內皮的相互作用看起來正常并與對照腫瘤切片類似。所看到的NG2陽性周細胞極少呈無內皮粘蛋白陽性血管的自由組分形式。然而，在10-24和1-24腫瘤切片上的NG2免疫熒光顯示與腫瘤血管無關的周細胞數目顯著增加。NG2和內皮粘蛋白信號看起來有所減弱并以物理方式遭破壞。個別周細胞從腫瘤血管不規律地脫離，暗示正常血管結構損失。這些結果表明，需要JAGGED-1介導的Notch活化來調節和維持內皮-周細胞相互作用和功能，且這些相互作用的失調引起血管不穩定和缺陷性血管灌注。
[0260]Notchl引誘物不影響LLC腫瘤轉移，伯延遲在肺和肝中形成B16-F10微轉移
[0261]皮下LLC和B16-F10腫瘤轉移到小鼠的肺和肝中。因此，使用表達熒光素酶的腫瘤株，利用這兩種其它腫瘤模型來評估腫瘤侵入和轉移中的引誘物活性。圖23和24顯示所有Notchl引誘物顯著抑制LLC和B16-F10腫瘤兩者的生長，在重量上抑制40%、37%、32%和 58%,78%,71% (分別 LLC 和 B16-F10 ;1-13、10_24 以及 1-24) ? 收集并分析腫瘤負載小鼠的肺和肝(表1和2)。對來自肺和肝的發光信號的分析可靠地檢測轉移病灶(圖25和26)。從整個器官的總光子輻射率定量總轉移負荷，而也從個別信號評估轉移病灶的數目和大小。對于LLC總轉移負荷在引誘物組之間并無統計學上的差異，且微轉移數目也如此。在此時間點無肝轉移。令人感興趣的是，B16-F10腫瘤數據顯示一些來自對照組的小鼠具有肺和肝轉移，而引誘物組沒有轉移。盡管腫瘤轉移實驗可能需要不同實驗設計以延長腫瘤生長的長度，但這些數據表明Notchl引誘物可延遲腫瘤轉移。
[0262]表1.LLC腫瘤負載小鼠中的肺轉移的數目
【權利要求】
1.一種融合蛋白，其包含連續氨基酸，所述氨基酸的序列開始于所述融合蛋白的N端并與以下中的氨基酸序列相同: (a)人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域，之后為 (b)抗體的Fe部分， 其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細胞外結構域 (i)以存在于EGF樣重復序列10的N端的氨基酸開始，且 (?)至少延伸到EGF樣重復序列23的C端氨基酸。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細胞外結構域的所述氨基酸序列延伸到EGF樣重復序列24的C端氨基酸。
3.根據權利要求1所述的融合蛋白，其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細胞外結構域的所述氨基酸序列延伸到EGF樣重復序列36的C端氨基酸。
4.根據權利要求1到3中任一權利要求所述的融合蛋白，其中所述抗體的所述Fe部分是人類抗體的Fe部分。
5.根據權利要求2所述的融合蛋白，其中所述連續氨基酸的所述序列包含SEQIDNO:3中所述的序列，其以位置24的胱氨酸開始且以位置833的賴氨酸結束。
6.根據權利要求3所述的融合蛋白，其中所述連續氨基酸的所述序列包含SEQIDNO:5中所述的序列，其以位置24的胱氨酸開始且以位置1318的賴氨酸結束。
7.根據權利要求1所述的融合蛋白，其中(a)所述人類Notchl受體蛋白的所述細胞外結構域位于信號肽之后。
8.根據權利要求7所述的融合蛋白，其中所述信號肽是人類Notchl蛋白的信號肽或IgG重鏈的信號肽。
9.根據權利要求8所述的融合蛋白，其中所述連續氨基酸序列闡述于SEQID N0:3中。
10.根據權利要求8所述的融合蛋白，其中所述連續氨基酸序列闡述于SEQID N0:5中。
11.一種組合物，其包含根據權利要求1到10中任一權利要求所述的融合蛋白和載劑。
12.根據權利要求11所述的組合物，其中所述融合蛋白以有效抑制JAGGED-1的活性的量存在于醫藥學上可接受的載劑中。
13.一種治療罹患年齡相關性黃斑變性(AMD)的個體的方法，所述方法包含以有效治療所述個體的AMD的量向所述個體投與根據權利要求1到10中任一權利要求所述的融合蛋白。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述AMD是濕性AMD。
15.根據權利要求13所述的方法，其中所述AMD是干性AMD。
16.一種治療罹患糖尿病性視網膜病變的個體的方法，所述方法包含以有效治療所述個體的糖尿病性視網膜病變的量向所述個體投與根據權利要求1到10中任一權利要求所述的融合蛋白。
17.根據權利要求13到16中任一權利要求所述的方法，所述方法進一步包含投與血管內皮生長因子(VEGF)的抑制劑。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述VEGF的抑制劑是VEGF-A、PGIF、VEGF-B,VEGF-C或VEGF-D的抑制劑。
19.根據權利要求13到16中任一權利要求所述的方法，所述方法進一步包含投與VEGF受體抑制劑。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述VEGF受體抑制劑是VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
21.一種治療罹患癌癥的個體的方法，所述方法包含以有效治療所述個體的癌癥的量向所述個體投與根據權利要求1到10中任一權利要求所述的融合蛋白。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述癌癥是胰臟癌。
23.根據權利要求21所述的方法，其中所述癌癥是乳癌。
24.一種治療罹患年齡相關性黃斑變性(AMD)的個體的方法，所述方法包含以有效治療所述個體的AMD的量向所述個體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續氨基酸，所述氨基酸的序列開始于所述融合蛋白的N端并與以下中存在的氨基酸序列相同: (a)人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域，之后為 (b)抗體的Fe部分， 其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細胞外結構域 (i)包含存在于EGF樣重復序列9的N端的氨基酸，且 (?)至少延伸到EGF樣重復序列13的C端氨基酸， 其限制條件為如果所述N端氨基酸是EGF樣重復序列I的N端氨基酸，那么所述C端氨基酸并非EGF樣重復序列36的C端氨基酸。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述AMD是濕性AMD。
26.根據權利要求24所述的方法，其中所述AMD是干性AMD。
27.一種治療罹患糖尿病性視網膜病變的個體的方法，所述方法包含以有效治療所述個體的糖尿病性視網膜病變的量向所述個體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續氨基酸，所述氨基酸的序列開始于所述融合蛋白的N端并與以下中存在的氨基酸序列相同: (a)人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域，之后為 (b)抗體的Fe部分， 其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細胞外結構域 (i)包含存在于EGF樣重復序列9的N端的氨基酸，且 (?)至少延伸到EGF樣重復序列13的C端氨基酸， 其限制條件為如果所述N端氨基酸是EGF樣重復序列I的N端氨基酸，那么所述C端氨基酸并非EGF樣重復序列36的C端氨基酸。
28.根據權利要求24到27中任一權利要求所述的方法，所述方法進一步包含投與血管內皮生長因子(VEGF)的抑制劑。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述VEGF的抑制劑是VEGF-A、PGIF、VEGF-B,VEGF-C或VEGF-D的抑制劑。
30.根據權利要求24到27中任一權利要求所述的方法，所述方法進一步包含投與VEGF受體抑制劑。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述VEGF受體抑制劑是VEGFR-1或VEGFR-2抑制劑。
32.—種治療罹患癌癥的個體的方法，所述方法包含以有效治療所述個體的癌癥的量向所述個體投與融合蛋白，其中所述融合蛋白包含連續氨基酸，所述氨基酸的序列開始于所述融合蛋白的N端并與以下中存在的氨基酸序列相同: (a)人類Notchl受體蛋白的細胞外結構域，之后為 (b)抗體的Fe部分， 其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細胞外結構域 (i)包含存在于EGF樣重復序列9的N端的氨基酸，且 (?)至少延伸到EGF樣重復序列13的C端氨基酸， 其限制條件為如果所述N端氨基酸是EGF樣重復序列I的N端氨基酸，那么所述C端氨基酸并非EGF樣重復序列36的C端氨基酸。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述癌癥是胰臟癌。
34.根據權利要求32所述的方法，其中所述癌癥是乳癌。
35.根據權利要求24到34中任一權利要求所述的方法，其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細胞外結構域的所述氨基酸序列以存在于EGF樣重復序列9的所述N端的所述氨基酸開始并延伸到EGF樣重復序列23的C端氨基酸。
36.根據權利要求24到34中任一權利要求所述的方法，其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細胞外結構域的所述氨基酸序列以存在于EGF樣重復序列9的所述N端的所述氨基酸開始并延伸到EGF樣重復序列36的所述C端氨基酸。
37.根據權利要求24到34中任一權利要求所述的方法，其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細胞外結構域的所述氨基酸序列以存在于EGF樣重復序列I的N端的氨基酸開始并延伸到EGF樣重復序列13的所述C端氨基酸。
38.根據權利要求24到34中任一權利要求所述的方法，其中所述人類Notchl受體蛋白的所述細胞外結構域的所述氨基酸序列以存在于EGF樣重復序列I的所述N端的所述氨基酸開始并延伸到EGF樣重復序列24的C端氨基酸。
【文檔編號】A61K39/395GK103917247SQ201280054960
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年10月4日 優先權日:2011年10月4日
【發明者】簡·基塔吉斯科, 卡麗·肖波爾, 森德·康格薩瑪克森 申請人:紐約哥倫比亞大學理事會