酵母-muc1免疫治療組合物及其用途

酵母-muc1免疫治療組合物及其用途
【專利摘要】公開的是包含粘蛋白-1(MUC1)的基于酵母的免疫治療組合物，以及用于預防和/或治療特征為粘蛋白-1(MUC1)表達或過表達的癌癥的方法。
【專利說明】酵母-MUC1免疫治療組合物及其用途
[0001]政府權利
[0002]本發明是在與衛生和人力資源服務部(Department of Health and HumanServices)下屬機構，國家衛生研究院的研究和開發合作協議下創建的。美國政府在本發明中具有一定權利。
[0003]對相關申請的交叉引用
[0004]本申請要求35U.S.C.§ 119(e)下對2011年8月17日提交的美國臨時專利申請N0.61/524，407的優先權權益。美國臨時專利申請N0.61/524，407的完整公開內容通過提述并入本文。
[0005]關于聯合研究協議的聲明
[0006]本發明由或代表2008年5月8日執行的研究和開發合作協議各方完成。該研究和開發合作協議的成員有:GlobeImmune, Inc.和由國家癌癥研究所(National CancerInstitute)代表的美國衛生和人力資源服務部，該所是國家衛生研究院的一個所、中心或部門。
[0007]參考序列表
[0008]本申請含有通過EFS-Web作為文本文件電子提交的序列表。該文本文件，稱為“3923-40-PCT_ST25”，具有89KB的字節大小，并于2012年8月16日錄入。依照37CFR § 1.52 (e) (5)， 該文本文件中含有的信息通過提述完整并入本文。
發明領域
[0009]本發明一般涉及基于酵母的免疫治療組合物，以及用于預防和/或治療特征為粘蛋白-1(MUCl)表達或過表達的癌癥的方法。
[0010]發明背景
[0011]癌癥是世界范圍內的第一大死亡起因，而且開發針對癌癥的有效療法仍然是研究和臨床開發的最活躍領域之一。盡管已提出許多新辦法來治療和預防癌癥，但許多癌癥仍然具有較高的死亡率且可能難以治療或對常規療法相對不響應。
[0012]人的大多數癌癥和血液學惡性的特征至少部分在于稱為粘蛋白-1(MUCl)的蛋白質的異常過表達，該蛋白的正常功能是幫助保護上皮細胞免于毒素、微生物和其他類型的外部環境應激(Kufe等，Hybridomal984; 3:223-32)。MUCl是從兩個亞基的非共價相互作用形成的異二聚體蛋白，所述兩個亞基由單個轉錄本編碼，然后翻譯后加工成亞基，稱為MUCl-N和MUC1-C。MUCl正常見于分泌性內皮細胞的頂端邊界，且當細胞應答應激而失去極性時(正常細胞的一種可逆過程)，MUCl能與通常位于基底外側邊界的分子相互作用。另外，應答應激環境，MUCl-N亞基(一種含有用O-連接的多糖大量糖基化的可變數目串聯重復(VNTR)的大蛋白)可脫落。MUCl的另一個亞基，稱為MUC1-C，具有胞外域、跨膜域和細胞質尾部，且能結合負責將MUCl與表皮生長因子受體(EGFR) (Li等，J BiolChem2001; 276:35239-42; Schroeder 等，J Biol Chem2001; 276:13057-64)以及其他受體酪氨酸激酶如 ErbB2-4, 20FGFR321 和 PDGFR(Li 等,Mol Cancer Res2003; 1:765-75; Ren等，Mol Cancer Res2006; 4:873-83; Singh 等，Cancer Res2007; 67:5201-10)物理關聯的配體。另外，已將MUCl-C與多種包含ErbB受體、c-Src、β -連環蛋白(catenin)、轉錄因子(p53，ERa )和其他效應器如Grb2/S0S在內的信號傳導途徑關聯起來(Pandey等，CancerResl995; 55:4000-3; Kinlough 等，J Biol Chem2004; 279:53071-7)。
[0013]在經轉化的上皮細胞中，膜極性是不可逆的且MUCl表達在癌細胞的整個表面均上調(Kufe等，1984，見上)。MUCl過表達與降低的MUCl-N O-糖基化有關，且MUCl-N在細胞表面的高水平空間上阻斷細胞-細胞和細胞-胞外基質相互作用，這與惡性表型有關(Ligtenberg 等，Cancer Resl992;52:223-32;van de ffiel-van Kemenade 等，JImmunoll993; 151:767-76 ;ffesseling 等，MolBiol Celll996; 7:565-77)。基于其牽涉與腫瘤發生有關的多種信號傳導途徑，MUCl-C亞基現被視為一種癌蛋白，而且其過表達已顯示為涉及阻斷應答 DNA 損傷(Ren 等，Cancer Cell2004; 5:163-75;Raina 等，J BiolChem2004; 279:20607-12)、氧化性應激(Yin 和 Kufe, J Biol Chem2003; 278:35458-64; Yin等，J Biol Chem2004; 279:45721-7)、和缺氧(Yin 等，J Biol Chem2007; 282:257-66)對細胞凋亡的誘導，以及賦予錨地(anchorage)獨立性的生長和腫瘤原性(Li等，0ncogene2003;22:6107 -10;Huang 等，Cancer Biol Ther2003;2:702-6;Huang等，Cancer Res2005;65:10413-22;Schroeder 等，0ncogene2004;23:5739-47)。
[0014]如上文論述的，來自各實驗室的數據指示MUCl-NU亞基)在癌癥中通過賦予允許免疫逃避和潛在的轉移性傳播的細胞特性來起作用。MUCl_C(i3亞基)牽涉負責腫瘤引發和進展的信號傳導途徑。MUCl的這些雙重功能可解釋該抗原似乎在不同的癌癥適應證中所起的不同作用。例如，MUCl似乎是癌癥如乳腺癌和結腸癌中的早期標志物(例如參見 Kretschmer 等,Mol Cancer.201IFeblI;10(I):15;Mukhopadhyay 等,BiochimBiophys Acta.201 IApr; 1815 (2): 224-40; Saeki 等,Gastroenterology.201 IMar; 140 (3): 892-902)，而MUCl與癌癥如胰腺癌和食道癌中的上皮-間充質細胞轉換(EMT)途徑和轉移性傳播有關(例如參見 Xu 等，Life Sc1.2011Jun6; 88 (23-24): 1063-9; Besmer 等，CancerRes.2011Jull;71(13):4432-42; Roy 等,0ncogene2011Mar24; 30 (12):1449-59; Ye 等，LabInvest.2011May;91 (5):778-87),而且在急性髓細胞樣白血病(AML)中通過反應性氧種類來防止末端分化(例如參見 Yin 等,Blood.2011May5; 117 (18):4863-70;Fatrai 等,ExpHematol.20080ct; 36 (10): 1254-65)，由此允許這些癌細胞的不受限制的自身再生。
[0015]鑒于MUCl在癌細胞的惡性表型中的明顯作用，MUCl且尤其是MUC1-N，一直是抗癌治療辦法的聚焦點所在。事實上，大多數治療辦法靶向MUC1-N，即MUCl異二聚體的胞外部分。然而，這類靶向MUCl-N的辦法在臨床中迄今為止尚未成功，可能是由于來自從細胞脫落的MUCl-N的干擾。更近的研究已提出用針對胞外域的抗體，或用肽，綴合于糖聚合物的肽，小分子，用表達MUCl的腫瘤細胞的制備物，和用樹突細胞/腫瘤細胞融合物來靶向MUCl-C亞基。然而，目前沒有得到批準的特異性靶向MUCl的癌癥療法。因此，本領域中仍然需要有效治療和/或預防與MUCl表達或過表達有關的癌癥的新產品。
[0016]發明概述
[0017]本發明的一個實施方案涉及酵母-MUCl免疫治療組合物，其包含:(a) 一種酵母媒介物；和(b)由所述酵母媒介物表達且包含至少一種MUCl抗原的融合蛋白。在一個方面，所述MUCl抗原從N至C末端的次序組成為:MUC1SEA/胞外域(ED)，其中所述MUC1SEA/ED域包含在N末端側翼為來自MUC1SEA域非ED部分的一個或多個氨基酸的MUClED ;至少兩個可變數目的串聯重復(VNTR)域；MUC1跨膜(TM)域；和MUCl細胞質域(⑶)。
[0018]在一個方面，所述抗原包含兩個VNTR域。在一個方面，所述VNTR域具有與以下序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 11的位置126-145 ；SEQ ID NO: 11的位置61至1020之間的任何連續的20個氨基酸；SEQ ID N0:11的位置126至965之間的任何連續的20個氨基酸；SEQ ID NO: 12 ；SEQ ID NO: 14的位置90至130之間的任何連續的20個氨基酸；SEQ ID NO: 15的位置60至100之間的任何連續的20個氨基酸；和來自不同人MUCl蛋白的相應序列。在一個方面，所述VNTR域具有與以下序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 14的位置90至130之間的任何連續的20個氨基酸或SEQ ID NO: 15的位置60至100之間的任何連續的20個氨基酸。在一個方面，所述融合蛋白具有兩個VNTR域，且兩個VNTR域的氨基酸序列是SEQ ID NO: 14的位置90至130或SEQ ID NO: 15的位置60至100。
[0019]在一個方面，所述MUClED具有與選自以下的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 2的位置116-173 ;SEQ ID NO: 4的位置107-164 ；SEQ ID NO:6 的位置 107-164 ;SEQ ID NO:8 的位置98-155 ;SEQ ID N0:11 的位置1098-1155 ；SEQ ID NO: 14 的位置 32-89 ;SEQ ID NO: 15 的位置 2-59 ;和來自不同人MUCl 蛋白的相應序列。在一個方面，所述MUClED具有與SEQ ID NO: 14的位置32-894或SEQ IDNO: 15的位置2-59至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述MUClED具有SEQ ID NO: 14的位置32-89或SEQ ID NO: 15的位置2_59的氨基酸序列。在一個方面，所述MUC1SEA/ED具有與選自以下的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 2的位置115-173 ;SEQ ID NO: 4的位置106-164 ;SEQID NO:6 的位置 106-164 ；SEQ ID NO:8 的位置 97-155 ；SEQ ID NO: 11 的位置 1097-1155 ；SEQ ID NO: 14的位置31-89 ;SEQ ID NO: 15的位置1-59 ;和來自不同人MUCl蛋白的相應序列。在一個方面，所述MUC1SEA/ED具有SEQ ID NO: 14的位置31-89或SEQ ID NO: 15的位置1-59的氨基酸序列。
[0020]在一個方面，所述MUClTM域具有與選自以下的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 2的位置174-201、SEQ ID NO:4的位置165-192、SEQ ID NO:6 的位置 165-192、SEQ ID NO:8 的位置 156-183、SEQ ID NO: 11 的位g 1156-1183,SEQ ID NO: 14 的位置 131_158、SEQ ID NO: 15 的位置 101-128、和來自不同人MUCl蛋白的相應序列。在一個方面，所述MUClTM域具有與SEQ ID NO: 14的位置131-158或SEQ ID NO: 15的位置101-128至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述MUClTM域具有SEQ ID NO: 14的位置131-158或SEQ ID NO: 15的位置101-128的氨基酸序列。
[0021]在一個方面，所述MUCl⑶域具有與選自以下的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 2的位置202-273、SEQ ID NO:4的位置193-264、SEQ ID NO:6 的位置 193-264、SEQ ID NO:8 的位置 184-255、SEQ ID NO: 11 的位g 1184-1255,SEQ ID NO: 14 的位置 159_230、SEQ ID NO: 15 的位置 129_200、SEQ ID NO: 17的位置 7-78、SEQ ID NO: 17 的位置 79-150、SEQ ID NO: 17 的位置 151-222 ；SEQ ID NO: 18的位置1-72、SEQ ID NO: 18的位置73-144、SEQ ID NO: 18的位置145-216、和來自不同人MUCl蛋白的相應序列。在一個方面，所述MUCl⑶域具有與SEQ ID NO: 14的位置159-230或SEQ ID NO: 15的位置129-200的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述MUClCD域具有SEQ ID NO: 14的位置159-230或SEQ IDNO: 15的位置129-200的氨基酸序列。
[0022]在本發明該實施方案的一個方面，所述MUCl抗原具有與SEQ ID NO: 15至少95%、96%、97%、或98%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述MUCl抗原包含SEQ ID NO: 15或與SEQ ID N0:15至少99%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述MUCl抗原具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。
[0023]在本發明該實施方案的一個方面，所述融合蛋白還包含附接于MUC1SEA/ED N末端的MUCl信號序列。在一個方面，所述MUCl信號序列具有與選自以下的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 2 的位置 1_27、SEQ ID N0:4 的位置 1-32、SEQ ID NO:6 的位置 1-32、SEQ ID NO:8 的位置 1-27、SEQ ID NO: 11 的位置 1-23、SEQ ID N0:14的位置1-30、和來自不同人MUCl蛋白的相應序列。在一個方面，所述MUCl信號序列具有與SEQ ID NO: 14的位置1_30的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述MUCl信號序列具有SEQ ID ^):14的位置1_30的氨基酸序列。在一個方面，所述融合蛋白具有與SEQ ID勵:14至少95%、96%、97%、或98%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 14或與SEQ ID NO: 14至少99%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述融合蛋白具有SEQ ID N0:14的氨基酸序列。
[0024]在本發明該實施方案的一個方面，所述MUCl抗原相比于野生型MUCl序列包含1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多個氨基酸取代以形成在MUCl抗原內的I至11個激動劑表位(本文中亦稱為MUCl激動劑抗原)。在本發明該實施方案的一個方面，對于SEQ IDNO: 14或SEQ ID NO: 15的MUCl抗原部分，所述氨基酸取代選自:A96Y、P97L、G104V、S105Y、T106L、A147Y、C161V、T199L、D200F、S215Y 和 T239L。在一個方面，所述 MUCl 激動劑抗原具有與SEQ ID N0:23至少95%、96%、97%、或98%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述MUCl抗原包含SEQ ID N0:23或與SEQ ID NO:23至少99%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述MUCl抗原具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl抗原包含I至11個氨基酸取代以創建MUCl激動劑抗原。
[0025]本發明的另一個實施方案涉及包含以下的酵母-MUCl免疫治療組合物:(a) —種酵母媒介物；和(b)由所述酵母媒介物表達且包含至少一種MUCl抗原的融合蛋白。所述MUCl抗原由MUCl的兩個或更多個細胞質域(⑶)組成。在一個方面，所述MUCl抗原由MUCl的3個細胞質域(⑶)組成。在一個方面，所述3個⑶來自相同的MUCl蛋白。在一個方面，每個CD域包含與選自以下的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:2 的位置 202-273、SEQ ID NO:4 的位置 193-264、SEQ ID NO:6 的位置 193-264,SEQ ID NO:8 的位置 184-255,SEQ ID NO: 11 的位置 1184-1255,SEQ ID NO: 14的位置 159-230、SEQ ID NO: 15 的位置 129_200、SEQ ID NO: 17 的位置 7_78、SEQ ID NO: 17的位置 79-150、SEQ ID NO: 17 的位置 151-222、SEQ ID NO: 18 的位置 1-72、SEQ ID NO: 18的位置73-144、SEQ ID NO: 18的位置145-216、和來自不同人MUCl蛋白的相應序列。在一個方面，每個CD域包含與選自下組的氨基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 15 的位置 129-200、SEQ ID NO: 17 的位置 7-78、SEQ ID NO: 17的位置 79-150、SEQ ID NO: 17 的位置 151-222、SEQ ID NO: 18 的位置 1-72、SEQ ID NO: 18的位置 73-144 和 SEQ ID NO: 18 的位置 145-216。
[0026]在該實施方案的一個方面，所述MUCl抗原具有與SEQ ID NO: 18至少95%、96%、97%、或98%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述MUCl抗原具有SEQ ID N0:18的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 18至少99%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述MUCl抗原具有SEQID NO: 18的氨基酸序列。在一個方面，所述融合蛋白具有與SEQ ID NO: 17至少95%、96%、97%、或98%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述融合蛋白具有SEQ ID N0:17的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 17至少99%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述融合蛋白具有SEQ IDNO: 17的氨基酸序列。
[0027]本發明的另一個實施方案涉及一種酵母-MUCl免疫治療組合物，其包含:(a) —種酵母媒介物；和(b)由所述酵母媒介物表達且包含至少一種MUCl激動劑抗原的融合蛋白。在本發明該實施方案的一個方面，所述MUCl激動劑抗原相比于野生型MUCl序列包含1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多個氨基酸取代以形成在MUCl抗原內的I至11個激動劑表位(本文中亦稱為MUCl激動劑抗原)。在一個方面，所述MUCl激動劑抗原具有與SEQ ID NO:23或SEQ ID N0:25至少95%、96%、97%、或98%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述MUCl抗原包含 SEQ ID NO:23 或 SEQ ID NO:25 或與 SEQ ID NO:23 或 SEQ ID NO:25 至少 99%相同的氨基酸序列。在一個方面，所述MUCl抗原具有SEQ ID N0:23或SEQ ID N0:25的氨基酸序列。
[0028]本發明的再一個 實施方案涉及一種減輕腫瘤負擔、抑制腫瘤生長和/或增加患有表達MUCl的癌癥的個體存活的方法。所述方法包括對個體施用上文或本文別處所描述的酵母-MUCl免疫治療組合物。在一個方面，在首次施用所述組合物時在所述個體的癌癥中檢測所述MUCl表達。在一個方面，所述個體患有I期癌癥。在一個方面，所述個體患有II期癌癥。在一個方面，所述個體患有III期癌癥。在一個方面，所述個體患有IV期癌癥。
[0029]本發明的另一個實施方案涉及本文中描述的任一種酵母-MUCl免疫治療組合物治療疾病的用途。在一個方面，所述疾病是癌癥。
[0030]本發明的再一個實施方案涉及本文中描述的任一種酵母-MUCl免疫治療組合物在患有癌癥的個體中減少、停滯、逆轉或預防癌癥的轉移性進展的用途。
[0031]本發明的又一個實施方案涉及本文中描述的任一種酵母-MUCl免疫治療組合物預防或延遲表達MUCl的癌癥發生的用途。
[0032]本發明的另一個實施方案涉及一種免疫治療組合物的組合治療癌癥的用途，所述免疫治療組合物包含:(a)第一組合物，其為本文中描述的任一種酵母-MUCl免疫治療組合物；和(b)至少一種另外的免疫治療組合物，其包含酵母媒介物和并非MUCl抗原的抗原。在一個方面，所述并非MUCl抗原的抗原選自突變的Ras、癌胚抗原(CEA)、和/或短尾畸形蛋白。
[0033]在涉及關于本文中描述的酵母-MUCl免疫治療組合物的方法或用途的任一實施方案的一個方面，所述個體正接受或已接受針對癌癥的另一種療法治療，其包括但不限于，化療、靶向性癌癥療法、放射療法、過繼性T細胞轉移、從個體手術切除腫瘤、和/或施用一種或多種另外的免疫治療組合物。在一個方面，所述另外的免疫治療組合物包含是MUCl抗原的第二癌抗原或不是MUCl抗原的癌抗原。在一個方面，所述另外的免疫治療組合物包含酵母媒介物和不包括MUCl抗原在內的第二癌抗原。在一個方面，所述另外的免疫治療組合物包含的第二癌抗原包括但不限于，突變的Ras、癌胚抗原(CEA)、短尾畸形蛋白(Brachyury)、EGFR、BCR-Ab1、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2, PSMA、酪氨酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ESO-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c_erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤性結腸息肉病(APC)、Myc> von Hippel-Lindau 蛋白(VHL)、Rb-1> Rb_2、雄激素受體(AR)、Smad4、MDRU Flt_3、BRCA-U BRCA-2, pax3_fkhr、ews-fl1-1、HERV-H,HERV-K、TWIST、間皮素(Mesothelin)、和/或NGEP。在一個方面，第二癌抗原選自下組:突變的Ras、癌胚抗原(CEA)和短尾畸形蛋白。在一個方面，所述另外的免疫治療組合物是病毒載體疫苗。在一個方面，所述另外的免疫治療組合物是樹突細胞/腫瘤細胞融合物。
[0034]本發明的再一個實施方案涉及一種預防或延遲表達MUCl的癌癥發生的方法。所述方法包括對個體施用本文中描述的任一種酵母-MUCl免疫治療組合物的步驟。在一個方面，尚未在個體中檢測到所述癌癥。在一個方面，所述個體有形成癌癥的高風險。在一個方面，所述個體具有癌前期損傷。在一個方面，所述個體患有癌癥，但在所述癌癥中尚未檢測到表達MUCl的癌細胞。
[0035]在涉及本文中描述的酵母-MUCl免疫治療組合物的任一種方法或用途中，在一個方面，所述癌癥是上皮細胞起源的。在一個方面，所述癌癥可包括但不限于:乳腺癌、小腸癌、胃癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、黑素瘤、多髓細胞性白血病(multiple myelogenous leukemia) (MML)、慢性淋巴細胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia) (CLL)、急性髓細胞樣白血病(acute myeloid leukemia)(AML)、伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、分泌組織的癌癥、及其轉移 性癌。在一個方面，所述癌癥選自乳腺癌和結腸癌。在一個方面，所述癌癥選自乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌和AML。在一個方面，所述癌癥是AML，且對骨髓移植(BMT)療法的供體和受體兩者施用所述酵母-MUCl免疫治療組合物。在一個方面，所述癌癥是AML，且對所述個體施用所述酵母-MUCl免疫治療組合物連同阿糖胞苷和蒽環類抗生素療法。
[0036]在上文和本文別處描述的本發明的任一個實施方案中，在一個方面，所述酵母媒介物是整個酵母。在一個方面，所述酵母媒介物是經過加熱失活的。在一個方面，所述酵母媒介物來自突變的酵母菌株，其相比于野生型酵母菌株產生低糖基化的蛋白質。在一個方面，所述MUCl抗原在酵母媒介物的細胞壁上表達。在一個方面，所述MUCl抗原在酵母媒介物的周質或細胞質中表達。在一個方面，所述酵母媒介物來自酵母屬(Saccharomyces)。在一個方面，所述酵母媒介物來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0037]在上文和本文別處描述的本發明的任一個實施方案中，在一個方面，通過在維持于pH水平5.5至8的培養基中培養表達所述MUCl抗原的整個酵母產生所述免疫治療組合物。在一個方面，所述培養基用緩沖劑緩沖。在一個方面，在維持于pH水平6至8的培養基中培養所述酵母。
[0038]在上文和本文別處描述的本發明的任一個實施方案中，在一個方面，所述組合物還包含至少一種生物反應修飾劑。
[0039]在上文和本文別處描述的本發明的任一個實施方案中，在一個方面，所述組合物還包含藥學可接受的賦形劑。[0040]在上文和本文別處描述的本發明的任一個實施方案中，在一個方面，配制所述免疫治療組合物用于注射。
[0041]附圖簡述
[0042]圖1A是顯示全長MUCl蛋白的結構的示意圖。
[0043]圖1B是顯示在稱為G1-6101的基于酵母的免疫治療組合物中表達的融合蛋白結構的示意圖。
[0044]圖1C是顯示在稱為G1-6104的基于酵母的免疫治療組合物中表達的融合蛋白結構的示意圖。
[0045]圖2A是顯示G1-6101的MUCl融合蛋白表達的數字化圖像。
[0046]圖2B是顯示在去糖基化之前和之后來自G1-6101和6104的MUCl融合蛋白表達的數字化圖像。
[0047]圖2C是顯示G1-6104的MUCl融合蛋白表達的數字化圖像。
[0048]圖3是顯示G1-6105的MUCl融合蛋白表達的數字化圖像。
[0049]發明詳述
[0050]本發明一般涉及基于酵母的免疫治療組合物以及用于預防和/或治療特征為表達或過表達粘蛋白-1( 可在本文中一般性稱為“MUC1”，且其亦稱為或已知為“DF3抗原”或“HMFG”)的癌癥的方法。本發明包括包含酵母媒介物和新MUCl抗原的基于酵母的免疫治療組合物(亦稱為基于酵母的免疫治療組合物或產品)(本文中亦稱為“酵母-MUCl免疫治療組合物”、“酵母-MUCl免疫治療產品”或“酵母-MUCl免疫治療組合物”)的用途。發明人在本文中描述了新的酵母-MUCl免疫治療產品的構建和產生，并顯示酵母-MUCl免疫療法熟化人樹突細胞(DC)、增加來自DC的細胞因子產生(其與預期在腫瘤治療中有益的免疫應答有關)，并引發MUCl特異性T細胞系的活化。總之，本文中呈現的數據顯示酵母-MUCl免疫治療可用于引發MUCl特異性細胞免疫應答(CD4+和CD8+)而且預期酵母-MUCl免疫治療可用于預防和治療表達MUCl的腫瘤。
[0051 ] 酵母-MUCl免疫療法可容易地適應于在相同的酵母組合物內使用另外的腫瘤抗原，或與靶向其他腫瘤抗原的其他基于酵母的免疫治療物(序貫或同時)或其他免疫治療物和治療/療法組合用于癌癥。因此，所述酵母-MUCl免疫治療可適應于癌癥類型、癌癥階段、癌癥分級、腫瘤表達的抗原、和個體的總體醫學狀態(即該療法是易于個體化的)，且對于已患有癌癥的個體，其使用可隨著癌癥在個體中進展而改變從而提供在多種腫瘤階段的最大功效。酵母-MUCl免疫治療提供了具有廣泛基礎的預防性和/或治療性處理大范圍癌癥的機會。
[0052]事實上，酵母-MUCl免疫治療可以靈活方式使用以治療各種MUCl陽性癌癥，其通過針對該抗原在每種類型的癌癥適應證中所起的特定作用定制酵母-MUCl免疫療法。例如，由于MUCl已描述為癌癥如乳腺癌或結腸癌中的早期標志物，可在患有MUCl陽性惡化前乳腺增生或結腸息肉的患者中預防性使用基于酵母的免疫療法。另一個例子是，由于已將MUCl與癌癥如胰腺癌、卵巢癌和食道癌中的上皮-間充質細胞轉換(EMT)途經和轉移性擴散關聯，因此酵母-MUCl免疫治療物可作為這些癌癥中的標準護理治療的治療附加使用以促進MUCl陽性3期胰腺癌、卵巢癌和食道癌中轉移性擴散的停滯。再一個例子是，由于已顯示MUCl在急性髓細胞樣白血病(AML)中通過反應性氧種類來阻止末端分化，由此允許這些癌細胞的不受限制的自身再生，因此，酵母-MUCl免疫治療可作為MUCl陽性AML中的標準治療的附加使用以促進細胞凋亡并阻止惡性細胞的不受限制的自身再生。在AML患者中使用酵母-MUCl免疫治療的臨床試驗記載于實施例中。
[0053]本文中描述的酵母-MUCl組合物誘導先天免疫應答，以及針對靶抗原(MUCl)的適應性免疫應答，包括⑶4依賴性TH17和THlT細胞應答和抗原特異性⑶8+T細胞應答，其包括細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答，所有均沒有使用其中許多具有毒性問題的外源佐劑、細胞因子或其他免疫刺激性分子。另外，酵母-MUCl免疫治療組合物抑制調節性T細胞(Treg)數目和/或功能，由此增強例如可能正常被腫瘤存在抑制的效應器T細胞應答。而且，與通過生成抗體應答來免疫的免疫治療組合物相比，認為由酵母-MUCl免疫治療引發的抗原特異性的、基礎廣泛的和有力的細胞免疫應答在靶向腫瘤細胞中特別有效。事實上，大量研究已顯示在I類MHC分子的背景中當經由識別腫瘤肽的CD8+CTL來靶向腫瘤細胞時，免疫治療辦法得到增強。酵母-MUCl免疫治療高度擅長活化抗原提呈細胞，且具有交叉引發免疫應答的獨特能力，從而生成對腫瘤通常有效的CD8+CTL應答，甚至在面對可能是抑制性環境的情況中。由于該類型的免疫治療利用抗原提呈細胞呈現相關免疫原的天然能力，因此不需要知曉MUCl的CTL表位或II類MHC表位的準確身份以產生依照本發明的有效免疫治療。事實上，在單一的酵母-MUCl免疫治療組合物中可靶向多種⑶4+和⑶8+T細胞表位，因此本發明的酵母-MUCl免疫治療不限于使用短肽。確實，在這些組合物中使用含有靶抗原多個域的更長的多肽和融合蛋白是有效的。因此，通過使用酵母-MUCl免疫治療，避免了使用算法和復雜公式來鑒定推定的T細胞表位。
[0054]可在免疫方案(預防性或治療性)中有效利用酵母-MUCl而不使用外源佐劑、免疫刺激劑或分子、共刺激分析或細胞因子，盡管在期望時可以納入這類藥劑。而且，可重復施用酵母-MUCl免疫治療而不損失功效，這對于其他類型的免疫治療可能是成問題的。
[0055]本發明的組 合物
[0056]本發明的一個實施方案涉及基于酵母的免疫治療組合物，其可用于預防和/或治療特征為MUCl表達或過表達的癌癥(包括初始可能不含表達可檢測MUCl的細胞，但在癌癥進展的后期階段可能或將含有表達MUCl的細胞的癌癥)。所述組合物是酵母-MUCl免疫治療組合物，其包含:(a) 一種酵母媒介物；和(b)包含一種或多種MUCl抗原和/或其免疫原性域的癌抗原。MUCl抗原或其免疫原性域最典型地由酵母媒介物表達為重組蛋白(例如通過完整的酵母或酵母原生質球，其任選地可進一步加工成酵母胞質體、酵母空胞(ghost)、或酵母膜提取物或其級分)，盡管作為本發明的一個實施方案，將一種或多種MUCl抗原加載到酵母媒介物中或與本文中所述酵母媒介物復合、附接、混合或一起施用以形成本發明的組合物。
[0057]“酵母-MUCl免疫治療組合物”是一種特定類型的“基于酵母的免疫治療組合物”，其含有至少一種MUCl抗原或其免疫原性域。術語“基于酵母的免疫治療組合物”可與“基于酵母的免疫治療產品”、“基于酵母的免疫療法組合物”、“基于酵母的組合物”、“基于酵母的免疫治療物”、“基于酵母的疫苗”或這些術語的衍生物交換使用。“免疫治療組合物”是一種引發足以在受試者中實現至少一種治療益處的免疫應答的組合物。如本文中使用的，基于酵母的免疫治療組合物指包含酵母媒介物組分并在受試者中引發足以實現至少一種治療益處的免疫應答的組合物。更具體地，基于酵母的免疫治療組合物是包含酵母媒介物組分和通常地抗原組分，并能引發或誘導免疫應答如細胞免疫應答的組合物，所述細胞免疫應答包括但不限于T細胞介導的細胞免疫應答。在一個方面，可用于本發明的基于酵母的免疫治療組合物能誘導CD8+和/或CD4+T細胞介導的免疫應答，且在一個方面，是CD8+和CD4+T細胞介導的免疫應答，特別是針對靶抗原(例如癌抗原)的。CD4+免疫應答可包括THl免疫應答、TH2免疫應答、TH17免疫應答或上述的任意組合。基于酵母的免疫治療物尤其能夠生成THl和TH17應答。⑶8+免疫應答可包括細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答，而基于酵母的免疫治療物能生成這類應答。在一個方面，基于酵母的免疫治療組合物調控受試者中調節性T細胞(Treg)的數目和/或功能性。基于酵母的免疫治療還可改變為促進一種類型相對于另一種類型的應答，例如通過加入細胞因子、抗體，和/或調控酵母的制造過程。任選地，基于酵母的免疫治療組合物能引發體液免疫應答。
[0058]本發明的酵母-MUCl免疫治療組合物可以是“預防性”或“治療性”的。當預防性提供時，本發明的組合物在表達MUCl的癌癥形成或檢測出形成之前提供，其目標是預防、抑制或延遲表達MUCl的腫瘤的形成；和/或預防、抑制或延遲這類腫瘤的轉移和/或一般性預防或抑制個體中的癌癥進展。如本文中論述的，MUCl在幾種癌癥中表達。因此，預防性組合物可施用給看似無癌癥的個體(健康或正常的個體)、癌前期的個體(惡性前期損傷)、以及患有癌癥但其中尚未檢測到MUCl的個體(即在癌癥中的腫瘤細胞表達MUCl之前)。有形成癌癥，特別是與MUCl表達和/或轉移通常有關的癌癥的高風險的個體，可用本發明的組合物預防性治療。當治療性提供時，將所述免疫治療組合物提供給患有表達MUCl的癌癥的個體，其目標是改善癌癥，如通過減輕個體中的腫瘤負擔；抑制個體中的腫瘤生長；增加個體存活；和/或預防、抑制、逆轉或延遲個體中癌癥的進展。
[0059]通常而言，酵母-MUCl免疫治療組合物包含酵母媒介物和至少一種包含MUCl抗原或其免疫原性域的癌抗原，其中所述癌抗原由所述酵母媒介物表達、與其附接、加載入其中或與其混合。在一些實施方案中，所述癌抗原，MUCl抗原或其免疫原性域提供為融合蛋白。下文描述了適用于本發明的組合物和方法中的幾種MUCl蛋白和融合蛋白。在一些實施方案中，所述癌抗原和MUCl抗原是相同的元件。在一些實施方案中，所述癌抗原包含其他抗原，包括除了 MUCl抗原以外的其他癌抗原。在本發明的一個方面，可用作癌抗原的融合蛋白可包含兩種或更多種抗原，例如MUCl抗原和另一種并非MUCl抗原的癌抗原，或兩種不同的MUCl抗原。在一個方面，所述融合蛋白可包含一種或多種抗原的兩個或更多個免疫原性域如MUCl抗原的兩個或更多個免疫原性域，或一種或多種抗原的兩個或更多個表位如MUCl抗原的兩個或更多個表位。
[0060]依照本發明，用于酵母-MUCl免疫治療組合物的酵母媒介物是任何可連同一種或多種抗原、其免疫原性域或其表位用在本發明的組合物(例如治療性或預防性組合物)中的酵母細胞(例如全細胞或完整細胞)或其衍生物(見下文)。因此，所述酵母媒介物可包含但不限于，活的完整(全)酵母微生物(即具有其包括細胞壁在內的所有組分的酵母細胞)、殺死(死亡)或失活的完整酵母微生物、或完整酵母的衍生物，其包括:酵母原生質球(即缺少細胞壁的酵母細胞)、酵母胞質體(即缺少細胞壁和細胞核的酵母細胞)、酵母空胞(即缺少細胞壁、細胞核和細胞質的酵母細胞)、亞細胞酵母膜提取物或其級分(亦稱為酵母膜顆粒或先前作為亞細胞酵母顆粒)、任何其他酵母顆粒、或酵母細胞壁制備物。
[0061]酵母原生質球通常通過對酵母細胞壁的酶消化產生。這類方法記載于例如Franzusoff 等，1991，Meth.Enzymo1.194, 662-674,通過提述完整并入本文。
[0062]酵母胞質體通常通過酵母細胞的去核產生。這類方法記載于例如Coon, 1978, Natl.Cancer Inst.Monogr.48, 45-55,通過提述完整并入本文。
[0063]酵母空胞(ghost)通常通過將透化或裂解的細胞重密封產生，且可以但不必需地含有該細胞的至少一些細胞器。這類方法記載于例如FranzusofT等，1983，J.Biol.Chem.258，3608-3614 和 Bussey 等，1979，Biochim.Biophys.Acta553, 185-196，其各自通過提述完整并入本文。
[0064]酵母膜顆粒(亞細胞的酵母膜提取物或其級分)指缺少天然細胞核或細胞質的酵母膜。該顆粒可以具有任意大小，包括從天然酵母膜到通過超聲處理或其他本領域技術人員已知的膜破壞方法繼之以重密封產生的微顆粒的大小。用于產生亞細胞酵母膜提取物的方法記載于例如Franzusoff等，1991，Meth.Enzymol.194, 662-674。還可以使用酵母膜顆粒級分，其含有酵母膜部分和所述抗原或其他感興趣的蛋白質(當在制備酵母膜顆粒之前由酵母重組表達所述抗原或其他蛋白質時)。可以在膜的內部、膜的任一表面或其組合攜帶有抗原或其他感興趣的蛋白質(即蛋白質可在膜的內部和外部和/或跨越酵母膜顆粒的膜)。在一個實施方案中，酵母膜顆粒是重組酵母膜顆粒，其可以是完整的、受破壞的或破壞并重密封的酵母膜，在膜的表面上或至少部分包埋于膜內地包含至少一種期望的抗原或其他感興趣的蛋白質。
[0065]酵母細胞壁制備物的一個例子是在其表面上或至少部分包埋于細胞壁內地攜帶抗原的分離的酵母細胞壁的制備物，從而當對動物施用該酵母細胞壁制備物時，刺激針對疾病靶物的期望的免疫應答。
[0066]可使用任意酵母菌株來產生本發明的酵母媒介物。酵母是屬于以下三類之一的單細胞微生物:子囊菌(Ascomycetes)、擔子菌(Basidiomycetes)和半知菌(FungiImperfecti)。對將一種類型的酵母選擇用作免疫調控物的一個考慮是酵母的致病性。在一個實施方案中，所述酵母是非致病性菌株如釀酒酵母。非致病性酵母菌株的選擇使得對其施用酵母媒介物的個體的任何不良作用最小化。然而，如果酵母的致病性可通過本領域技術人員已知的任何手段抵消(例如突變體菌株)，那么可以使用致病性酵母。依照本發明的一個方面，使用非致病性酵母菌株。
[0067]可在本發明中使用的酵母菌株的屬包括但不限于酵母屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)(其可以是致病性的)、隱球菌屬(Cryptococcus)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅酵母屬(Rhodotorula)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)和西洋蓄霉屬(Yarrowia)。在一個方面，酵母的屬選自酵母屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬(Pichia)或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces),而在一個方面，使用酵母屬。可在本發明中使用的酵母菌株的物種包括但不限于，釀酒酵母、卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、白色假絲酵母(Candida albicans)、乳酒假絲酵母(Candida kefyr)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)、馬克斯克魯維酵母變種乳酸(Kluyveromyces marxianus var.lactis)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、深紅酵母(Rhodotorula rubra)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、和解脂西洋蓄霉酵母(Yarrowia Iipolytica)。要領會的是,在這些物種中有許多包括多種亞種、類型、亞型等，其意圖納入前述物種中。在一個方面，本發明中使用的酵母物種包括釀酒酵母、白色假絲酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母和粟酒裂殖酵母。可使用釀酒酵母，因為其易于操作且對于用作食品添加劑是“一般認為安全”或“GRAS”的(GRAS，FDA提出的細則62FR18938，1997年4月17日)。本發明的一個實施方案是能夠將質粒復制成特別高拷貝數的酵母菌株，如釀酒酵母cir°菌株。所述釀酒酵母菌株是一種能支持表達載體的這類菌株，所述載體允許以高水平表達一種或多種靶抗原和/或抗原融合蛋白和/或其他蛋白質。另一種可用于本發明的酵母菌株是釀酒酵母W303 ci。另外，可在本發明中使用任何突變體酵母菌株，包括那些展現出所表達的靶抗原或其他蛋白質的降低的翻譯后修飾的酵母菌株，如擴大N-連接的糖基化的酶中的突變。在本發明的一個方面，使用突變體酵母菌株產生酵母-MUCl免疫治療組合物，該突變體酵母菌株將MUCl抗原產生為相比于由野生型菌株產生的相同抗原(具有正常的糖基化)低糖基化的蛋白質。這類MUCl抗原可能更類似于由腫瘤細胞表達的MUl抗原，其隨 后可由抗原提呈細胞加工成獨特的T細胞表位，如此增強特異性的抗腫瘤應答。
[0068]本發明的酵母-MUCl免疫治療組合物包含至少一種包含MUCl抗原的癌抗原。依照本發明，術語“抗原”在本文中的一般使用指:蛋白質的任意部分(例如肽、部分蛋白質、全長蛋白質)，其中所述蛋白質對于細胞組合物(全細胞、細胞裂解物或破壞的細胞)、對于生物體(全生物體、裂解物或破壞的細胞)或對于糖類、或其他分子、或其部分是天然存在或合成性得到或設計的。抗原可引發通過免疫系統元件(例如T細胞、抗體)的抗原特異性免疫應答(例如體液和/或細胞介導的免疫應答)，其針對在體外、體內或離體所遇到的相同或類似的抗原。
[0069]抗原可以小至單個表位、單個免疫原性域或更大，并且可包含多個表位或免疫原性域。如此，抗原的大小可以小至約8-11個氨基酸(即肽)且大至:蛋白質的域、全長蛋白質、多聚體、融合蛋白、嵌合蛋白、全細胞、全生物體、或其任意部分(例如蛋白質片段(多肽)、全細胞的裂解物或微生物的提取物)。可用于本發明酵母-MUCl免疫治療物中的抗原是肽、多肽、蛋白質域、蛋白質亞基、全長蛋白質、多聚體、融合蛋白和嵌合蛋白。另外，抗原可包含糖類，其可加載到本發明的酵母媒介物或組合物中。會領會在一些實施方案中(例如當抗原由酵母媒介物從重組核酸分子表達時)，抗原是蛋白質(包括片段、域、亞基和全長蛋白質)、融合蛋白、嵌合蛋白或其片段，而非完整的細胞或微生物。對于酵母中的表達，在一個實施方案中，如果抗原是要由酵母表達的完整蛋白質的話，那么抗原具有能在酵母中重組表達的最小大小(換言之，包含或組成為抗原的由酵母表達的蛋白質優選為長度至少25個氨基酸)，且通常長度為至少或超過25個氨基酸、或至少或超過26個氨基酸、至少或超過27個氨基酸、至少或超過28個氨基酸、至少或超過29個氨基酸、至少或超過30個氨基酸、至少或超過31個氨基酸、至少或超過32個氨基酸、至少或超過33個氨基酸、至少或超過34個氨基酸、至少或超過35個氨基酸、至少或超過36個氨基酸、至少或超過37個氨基酸、至少或超過38個氨基酸、至少或超過39個氨基酸、至少或超過40個氨基酸、至少或超過41個氨基酸、至少或超過42個氨基酸、至少或超過43個氨基酸、至少或超過44個氨基酸、至少或超過45個氨基酸、至少或超過46個氨基酸、至少或超過47個氨基酸、至少或超過48個氨基酸、至少或超過49個氨基酸、或長度為至少或超過50個氨基酸、或長度為至少25-50個氨基酸、長度為至少30-50個氨基酸、或長度為至少35-50個氨基酸、或長度為至少40-50個氨基酸、或至長度為少45-50個氨基酸，盡管可以表達更小的蛋白質，且可以表達大得多的蛋白質(例如長度為數百個氨基酸或甚至長度為幾千個氨基酸)。在一個方面，可表達全長蛋白質或蛋白質的域，其在N和/或C末端缺少I至20個氨基酸。融合蛋白和嵌合蛋白也是可在本發明中表達的抗原。“靶抗原”是由本發明的免疫治療組合物特異性靶向的抗原(即一種抗原，通常是天然抗原，期望引發針對其的免疫應答)。“癌抗原”是一種包含至少一種與癌癥有關抗原(如腫瘤細胞表達的抗原)的抗原，從而靶向該抗原也就靶向了腫瘤細胞和/或癌癥。癌抗原可包含來自一種或多種蛋白質(包括一種或多種腫瘤有關的蛋白質)的一個或多個抗原。“MUC1抗原”是從MUCl蛋白得到、設計或產生的抗原(包括 MUC1-N、MUCl-C 或 MUCl-N 和 MUC1-C 兩者)。
[0070]當述及免疫應答的刺激時，術語“免疫原”是術語“抗原”的子集，因此在一些情況中，可與術語“抗原”交換使用。如本文中使用的，免疫原描述引發體液和/或細胞介導的免疫應答的抗原(即為免疫原性)，從而使得對個體施用免疫原產生針對由個體免疫系統遇到的相同或類似抗原的抗原特異性免疫應答。在一個實施方案中，免疫原引發細胞介導的免疫應答，包括CD4+T細胞應答(例如TH1、TH2和/或TH17)和/或CD8+T細胞應答(例如CTL應答)。
[0071]給定 抗原的“免疫原性域”或“免疫學域”可以是抗原的任何部分、片段或表位，其含有在對動物施用時可充當免疫原的至少一個表位(例如肽片段或亞基或抗體表位或其他構象性表位)。因此，免疫原性域大于單個氨基酸且其大小至少足以含有至少一個能充當免疫原的表位。例如，單一的蛋白質可含有多個不同的免疫原性域。免疫原性域在蛋白質內不需要是線性序列，如在體液免疫應答情況中的，其中涵蓋構象域。
[0072]表位在本文中定義為給定抗原內的單一免疫原性位點，在適宜的共刺激信號和/或免疫系統的活化細胞的背景中向免疫系統提供時，其足以引發免疫應答。換言之，表位是由免疫系統組分識別的抗原部分，其亦可稱為抗原決定簇。本領域技術人員將認可T細胞表位在大小和組成中與B細胞或抗體表位不同，且經由I類MHC途徑呈現的表位在大小和結構屬性上與經由II類MHC途徑呈現的表位不同。例如，由I類MHC分子呈現的T細胞表位通常長度為8至11個氨基酸，而由II類MHC分子呈現的表位在長度上不那么受限，且可以長達25個氨基酸或更長。另外，根據表位結合的特定MHC分子，T細胞表位具有預測的結構特征。表位可以是線性序列表位或構象性表位(保守的結合區域)。大多數抗體識別構象性表位。
[0073]MUC1(其亦可稱為“粘蛋白-1”還有“DF3抗原”或“HMFG1”)是由大多數上皮分泌組織在基底水平表達，且由上皮細胞起源的惡性以高水平表達的一種較大的糖蛋白。MUCl最通常發現為多形性、具有較大胞外域(亦稱為MUCl-N亞基)的I型跨膜蛋白質，其包含經由O-連接高度糖基化的可變數目串聯重復(VNTR;通常為20至125個重復)。MUCl蛋白編碼為單一轉錄物，然后在翻譯后加工成亞基，分別稱為MUCl-N和MUC1-C、或α和β亞基，其然后通過兩個亞基的非共價強相互作用形成異二聚體蛋白質。MUCl在“海膽精子蛋白質、腸激酶和集聚蛋白(agrin) ”(SEA)域內切割成其N-和C-亞基，該域為一種高度保守的蛋白質域，其基于初始鑒定于精子蛋白質中、腸激酶中、和集聚蛋白中發現而命名，并且在通常束縛于膜的許多重度糖基化的粘蛋白樣蛋白質中發現。MUCl蛋白在SEA域內的序列GSVVV(例如SEQ ID NO: 11的位置1097-1101)中存在的甘氨酸和絲氨酸殘基之間切割(Lillehoj 等,2003, Biochem.Biophys.Res.Commun.307:743 - 749; Parry等，2001，Biochem.Biophys.Res.Commun.283:715 - 720;Wreschner 等，2002，ProteinSc1.11:698 - 706)。
[0074]所述MUCl-C亞基包含胞外域(ED)，其為糖基化的且結合半乳凝素(galectin) _3配體，該配體相應地充當將MUCl與表皮生長因子受體(EGFR)和可能的其他受體酪氨酸激酶物理關聯的橋。MUCl-C還包含跨膜(TM)域、和含有幾個酪氨酸殘基的細胞質域(CD)，所述酪氨酸殘基在磷酸化時能充當具有SH2域的蛋白質的結合基序(對于MUCl蛋白以及已知和推定功能的詳細論述,參見Kufe, 2008, Cancer Biol.&Ther.7:81-84)。MUCl的備選的剪接變體(例如稱為MUC1/Y和MUC1/X)是MUCl “短”型，其缺乏大部分MUCl-N(包括較大的VNTR區)，但包含ED、TM和⑶區以及SEA域和N末端區信號序列區的部分。SEA域內的切割可能不發生在這些短型中。
[0075]已報告了編碼人MUCl的DNA和cDNA的分離和測序(參見例如Siddiqui等，1998，PNAS85:2320-2323; Abe 和 Kufe, 1993，PNAS90:282-286; Hareuveni 等，1990, Eur.J.Biochem.189(3)475-486;Gendler 等，1990，J.Biol.Chem.265(25) 15286-15293;Lan等，1990，J.Biol.Chem265 (25) 15294-15299; Tsarfaty 等，1990，Gene93 (2) 313-318; Lancaster, 1990, Biochem.Biophys.Res.Commun.173(3) 1019-1029)。含有 MUC1-N 和 MUC1-C 區的全長人MUCl前體蛋白質的一個例子記載于SwissProt登錄號P15941.3 (G1: 296439295)，且此處由SEQ ID NO: 11代表。可從編碼SEQ ID NO: 11的基因通過備選的轉錄本剪接創建出10種不同的MUCl同等型。例如，稱為MUC1/Y的同等型缺少SEQ ID NO: 11的位置54-105。各種其他同等型記載于該蛋白質的數據庫說明中。
[0076]為了例示MUCl蛋白內的域的鑒定(其可容易地應用于任何人MUCl蛋白以及其他哺乳動物MUCl蛋白)，可在SEQ ID N0:11中容易地鑒定出以下域。MUCl信號序列，本文中亦稱為前導序列，位于SEQ ID NO: 11的大概位置1-23 (MUC1信號序列在一些MUCl變體中鑒定為更長，且可能包含另外的氨基酸如位置1-32)。MUCl-N亞基或α亞基包含SEQID NO: 11的大概位置24-1097，而MUCl-C亞基或β亞基包含SEQ ID NO: 11的大概位置1098-1255。
[0077] 在MUCl-N亞基中，可發現VNTR(可變數目的串聯重復)域，其包含在此特定蛋白內的多個重復，包括大概位置為126-965的區域，其含有序列PAPGSTAPPAHGVTSAPDTR(例如SEQ ID NO: 11的位置126-145)的42個20氨基酸重復，該序列是通常識別的VNTR序列(亦見下文SEQ ID NO: 12，其指明了該序列內的常見多態性)。由于這些是重復的序列，因此可以從一個VNTR中的20氨基酸中的任意一個開始計數，然后對該第一氨基酸的重復重新開始編號。更具體地，由于單個VNTR域是之前和/或之后為另一個相同、近乎相同或同源性的20氨基酸序列的大概20氨基酸的序列，其可能在大量這類重復序列之內，因此為了描述VNTR區內的單個VNTR，可將給定VNTR的“位置I ”視為VNTR中20個氨基酸中的任一個，然后將對之前和之后的側翼氨基酸依此編號，其中位置I上游(之前)的氨基酸為前一VNTR的最后一個氨基酸(位置20)或連接于該VNTR的序列(如果這類之前序列并不也是VNTR)的最后一個氨基酸，而位置I下游的一個氨基酸為該VNTR的位置2，接著是位置3，諸如此類，直至序列重復于下一個VNTR。
[0078]SEQ ID NO: 11的位置61-1120包含上文論述的VNTR區，加上稱為“重復區域”的另外區域。例如，位置81-100、位置101-120、位置121-140、位置141-160、位置161-180、位置 181-200、位置 201-220、位置 221-240、位置 241-260、位置 261-180、位置 281-300，諸如此類，以20個氨基酸的增量直至SEQ ID N0:11的位置1001-1120，代表了該蛋白質中的重
復區域。
[0079]在由SEQ ID NO: 11代表的全長MUCl蛋白中(在切割成亞基之前)，SEA域跨越SEQ ID NO: 11的位置1034-1152。在SEQ ID NO: 11的氨基酸1097至1098對SEA域的切割產生MUCl-C域。在MUCl-C域內，胞外域(ED)見于SEQ ID NO: 11的大概位置1098-1155 ;跨膜(TM)域見于SEQ ID NOill的大概位置1156-1183 ;而細胞質域(⑶，亦稱為細胞質尾部)見于SEQ ID NO: 11的大概位置1184-1255。
[0080]給定MUCl-N亞基中的VNTR的數目是高度多態性的，且可以例如從20個變化到125個重復。串聯重復的二十肽通常在三個位置(SEQ ID NO: 12的位置9、18和19)的一個或多個中具有多態性:PAPGSTAP[P/A/Q/T]AHGVTSAP[DT/ES]R(SEQ ID NO: 12，中括號區域指示常見的多態性)，其中在SEQ ID NO: 12的位置18和19處的多態性以DT>ES的優先性存在，而其中在位置9處的單一替換以以下優先性存在:P>A、P>Q和P>T。最頻繁的替換DT>ES在高達50%的重復中存在。
[0081]已知MUCl的 多種轉錄本變體，但可在變體中容易地鑒定出在上文例示性SEQ IDNO: 11中描述的MUCl亞基、域或區，從而可基于給定的MUCl序列或來自另一 MUCl蛋白的相應序列設計或產生可用于本發明的MUCl抗原。例如，編碼人MUCl蛋白的一條核苷酸序列在本文中由 SEQ ID NO:1 代表,其對應于GENBANK?登錄號 NM_002456.4(G1:65301116)。SEQ ID NO:1編碼273個氨基酸的人MUCl蛋白(轉錄本變體1，亦稱為MUC1/ZD)，其氨基酸序列此處代表為 SEQ ID N0:2(亦見于GEMBANK?登錄號 NP_002447.4;G1:65301117)。在SEQ ID NO:2內，存在以下域:信號序列(SEQ ID N0:2的位置1_27) ;SEA域(SEQ ID NO:2的位置 55-170) ；ED(SEQ ID NO:2 的位置 116-173) ;TM域(SEQ ID NO:2 的位置 174-201)；和CD(SEQ ID NO:2的位置202-273)。SEA域內將ED域從SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位點在SEQ ID N0:2的位置115至116。該轉錄本變體不含如SEQ ID NO: 11中顯示的VNTR區。
[0082]編碼另一種人MUCl蛋白的另一條核苷酸序列在本文中由SEQ ID N0:3代表，其對應于GENBANKe登錄號 NM_001018016.1 (G1:67189006)。SEQ ID NO: 3 編碼 264 個氨基酸的人MUCl蛋白(轉錄本變體2，亦稱為“MUC1/Y”)，其氨基酸序列此處代表為SEQ IDNO:4(亦見于G「NBANK登錄號 NP_001018016.1;G1:67189007)。在 SEQ ID N0:4 內，
存在以下域:信號序列(SEQ ID N0:4的位置1-32) ;SEA域(SEQ ID NO:4的位置45-161)；ED(107-164of SEQ ID NO:4) ;TM域(SEQ ID NO:4 的位置 165-192) jPCD(SEQ ID N0:4 的位置193-264)。SEA域內將ED域從SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位點在SEQID NO:4的位置106至107。該轉錄本變體不含如SEQ ID NO: 11中顯示的VNTR區。
[0083]編碼另一種人MUCl蛋白的另一條核苷酸序列在本文中由SEQ ID N0:5代表，其對應于GENBANKf 登錄號 AY327587.1 (G1:33150003)。SEQ ID NO: 5 編碼 264 個氨基酸的
人MUCl蛋白(轉錄本變體2，亦稱為“MUC1/Y”)，其氨基酸序列此處代表為SEQ ID NO:6(亦
見于GENBANK."登錄號 AAP97018.1 (G1:33150004))。在 SEQ ID NO:6 內，存在以下域:
信號序列(SEQ ID NO:6 的位置 1-32) ;SEA 域(SEQ ID NO:6 的位置 45-161) ；ED(SEQ IDNO: 6 的位置 107 至 164) ;TM 域(SEQ ID NO: 6 的位置 165-192);和 CD (SEQ ID NO: 6 的位置193至264)。SEA域內將ED域從SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位點在SEQID NO:6的位置106至107。該轉錄本變體不含如SEQ ID NO: 11中顯示的VNTR區。SEQ IDNO:6與SEQ ID N0:499%相同，例示了在來自不同來源的MUCl序列中高程度的同源性。
[0084]編碼另一種人MUCl蛋白的另一條核苷酸序列在本文中由SEQ ID N0:7代表，其
對應于 GENBA\K '登錄號 NM_001018017 (G1: 324120954)。SEQ ID NO: 7 編碼 255 個
氨基酸的人MUCl蛋白(轉錄本變體3)，其氨基酸序列此處代表為SEQ ID Ν0:8(亦見于
GENBANK* 登錄號 ΝΡ_001018017.I ;G1:67189069)。在 SEQ ID NO:8 內，存在以下域:
信號序列(SEQ ID N0:8 的位置 1-27) ;SEA 域(SEQ ID NO:8 的位置 36-152) ；ED(SEQ IDN0:8 的位置 98-155) ;TM 域(SEQ ID N0:8 的位置 156-183) jPCD(SEQ ID N0:8 的位置184-255)。SEA域內將ED域從SEA域的N末端部分切掉的蛋白水解性切割位點在SEQ IDNO:6的位置97至98。該轉錄本變體不含如SEQ ID NO: 11中顯示的VNTR區。
[0085]人MUCl與來自其他動物物種的MUCl具有高度同源性，因此，可預期基于序列比較能夠鑒定給定的MUCl蛋白內的域。另外，能在本發明的酵母-MUCl免疫治療組合物的制備中利用來自其他動物物種特別是哺乳動物物種的MUCl的特定序列，尤其是在這些序列相同或實質性同源，且當這些序列引發針對靶抗原(例如腫瘤細胞表達的天然MUC1)的有效免疫應答的情況中。例如，鼠MUCl蛋白在本文中由SEQ ID N0:9的氨基酸序列代表。SEQID N0:9 對應于(..;:Ν1ΒΛΝΠ( '.登錄號 NM_013605(G1:7305292)。SEQ ID N0:9 編碼 631 個
氨基酸的鼠MUCI蛋白，其氨基酸序列此處代表為SEQ ID NO: 10(亦見于GENBANK?登錄號NP_038633 ;G1:7305293)。在SEQ ID NO: 10內，存在以下域:信號序列(大概為SEQID N0:10 的位置 1-20) ;VNTR(可在 SEQ ID NO: 10 的位置 21-425 中鑒定)；SEA 域(SEQ IDNO: 10 的位置 426-528) ；ED(SEQ ID NO: 10 的位置 475-536) ;TM 域(SEQ ID NO: 10 的位置531-559) JPCD(SEQ ID NO: 10 的位置 560-631)。SEA 域內將 ED 域從 SEA 域的 N 末端部分切掉的蛋白水解性切割位點在SEQ ID NO: 10的位置474至475。為了例示域內MUCl序列的保守水平，SEQ ID N0:10的鼠MUC1SEA域與SEQ ID NO: 11的人MUC1SEA域62%相同且68%同源或陽性(如由BLAST定義)。SEQ ID NO: 10的鼠MUClED與SEQ ID NO: 11的人MUC1ED56% 相同且 73% 同源。SEQ ID NO: 10 的鼠 MUClTM 域與 SEQ ID NO: 11 的人 MUClTM域 89%相同且 93% 同源。SEQ ID NO: 10 的鼠 MUClCD 與 SEQ ID NO: 11 的人MUC1CD88%相同且88%同源。
[0086]人MUCl，包括本文中描述的人MUCl蛋白和MUCl抗原，含有各種⑶4+和⑶8+T細胞表位。這類T細胞表位已記載于例如美國專利6，546, 643 ;美國專利N0.7，118，738 ;美國專利N0.7，342，094 ;美國專利N0.7，696，306 ;和美國專利申請公開文本N0.2008/0063653。
[0087]在本發明的一個實施方案中，MUCl抗原包含或組成為包含MUCl蛋白多個域的融合蛋白。在一個實施方案中，所述MUCl抗原從MUCl-C亞基的部分得到或設計。在一個實施方案中，所述MUCl抗原從MUCl-N亞基的部分得到或設計。在一個實施方案中，所述MUCl抗原從MUCl-C和MUCl-N亞基兩者的部分得到或設計。
[0088]在本發明的一個實施方案中，可用于本發明的基于酵母的免疫治療組合物中的融合蛋白包含至少兩種、至少三種、至少四種、或至少五種以下MUCl抗原，其在融合蛋白內以任意次序排列，且其中任一種可在融合蛋白內重復兩次或更多次(例如兩個或更多個CD區段的組合)=(I)MUCl信號序列；(2)MUC1SEA域的至少一部分和/或MUCl胞外域(ED)的至少一部分或其免疫原性域，在一個方面，其可以包含大部分或完整的ED加上側接來自SEA域的一個或多個側翼氨基酸；(3)至少兩個VNTR域；(4)至少一個MUCl跨膜域或其免疫原性域；和(5)至少一個MUCl細胞質域(CD)或其免疫原性域。這類融合蛋白不包含全長MUCl蛋白(即它不包含完整的MUCl-N亞基和完整的MUCl-C亞基)，且這類融合蛋白不包含全長MUCl-N亞基。在一個方面，這類融合蛋白不包含全長MUCl-C亞基。在一個方面，融合蛋白的區段(例如MUCl蛋白或域，包括免疫原性域)以不同于其會存在于天然或野生型MUCl蛋白中的區段排列次序進行排列。
[0089]可用于上文或本文別處描述的融合蛋白中的MUCl信號序列(或前導序列)可以是來自任意MUCl蛋白的信號序列，且在一個方面，為來自人MUCl蛋白的。在本發明的一個方面，用于本發明融合蛋白的MUCl信號序列具有包含或組成為選自以下氨基酸序列的氨基酸序列:SEQ ID N0:2 的位置 1-27、SEQ ID NO:4 的位置 1_32、SEQ ID N0:6 的位置 1-32、SEQ ID NO:8 的位置 1-27、SEQ ID NO: 11 的位置 1-23、SEQ ID NO: 14 的位置 1-30、來自不同MUCl蛋白如另一種人MUCl蛋白的相應序列，或與這些氨基酸序列中任一條至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。在本發明的一個方面，MUCl信號序列置于可用于本發明的融合蛋白的N末端。在本發明的一個方面，替換(代替)代替MUCl信號序列而使用非MUCl序列，如下文描述的與本發明融合蛋白一起使用的任一種N末端合 成肽和酵母衍生肽。
[0090]可用于上文或本文別處描述的融合蛋白中的MUCl海膽精子蛋白、腸激酶和集聚蛋白(SEA)域可以是包含來自任一種MUCl蛋白的至少一個免疫原性域的SEA域或其部分，且在一個方面，為來自人MUCl蛋白的。在本發明的一個方面，可用于本發明融合蛋白的MUC1SEA域的一部分包含至少來自MUCl胞外域(ED)的氨基酸序列，但可排除ED域上游的序列。在本發明的一個方面，可用于本發明融合蛋白的MUC1SEA域具有包含或組成為選自以下氨基酸序列的氨基酸序列:SEQ ID NO:2的位置55-170或位置116-170或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO:4的位置45-161或位置107-161或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO:6的位置45-161或位置107-161或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO:8的位置36-152或位置98-152或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO: 11的位置1034-1152或位置1098-1152或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO: 14的位置31-86或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO: 15的位置1_56或其至少一個免疫原性域，來自不同MUCl蛋白如另一種人MUCl蛋白的相應序列，或與這些氨基酸序列中任一種至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0091]可用于上文或本文別處描述的融合蛋白中的MUCl胞外域(ED)可以是包含來自任一種MUCl蛋白的至少一個免疫原性域的ED或其部分，且在一個方面，是來自人MUCl蛋白的。在本發明的一個方面，用于本發明融合蛋白的MUClED具有包含或組成為選自以下氨基酸序列的氨基酸序列:SEQ ID NO:2的位置116-173或其至少一個免疫原性域，SEQ IDNO:4的位置107-164或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO:6的位置107-164或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO:8的位置98-155或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO: 11的位置1098-1155或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO: 14的位置32-89或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO: 15的位置2-59或其至少一個免疫原性域，來自不同MUCl蛋白如另一種人MUCl蛋白的相應序列，或與這些氨基酸序列中任一種至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0092]可用于上文或本文中別處描述的融合蛋白中的MUCl單個可變數目串聯重復(VNTR)域可以是來自任何MUCl蛋白的VNTR域，且在一個方面，是來自人MUCl蛋白的。在本發明的一個方面，用于本發明融合蛋白的MUC1VNTR域具有包含或組成為選自以下氨基酸序列的氨基酸序列:SEQ ID NO: 11的位置126-145，SEQ ID NO: 11的位置61至1020之間的任何連續的20個氨基酸，或SEQ ID NO: 11的位置126至965之間的任何連續的20個氨基酸；SEQ ID NO: 12 (包括如上文描述的SEQ ID NO: 12內的任一種多態性)，SEQ ID NO: 14的位置90至130之間的任何連續的20個氨基酸，SEQ ID NO: 15的位置60至100之間的任何連續的20個氨基酸，來自不同MUCl蛋白如另一種人MUCl蛋白的相應VNTR序列，或與這些氨基酸序列中任一種至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0093]可用于上文或本文中別處描述的融合蛋白中的MUCl跨膜(TM)域可以是包含來自任何MUCl蛋白的至少一個免疫原性域的TM域或其部分，且在一個方面，是來自人MUCl蛋白的。在本發明的一個方面，用于本發明融合蛋白的MUClTM域具有包含或組成為選自以下氨基酸序列的氨基酸序列:SEQ ID NO: 2的位置174-201或其至少一個免疫原性域，SEQ IDNO:4的位置165-192或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO:6的位置165-192或其至少一個免疫原性域，SEQ I D NO: 8的位置156-183或其至少一個免疫原性域，SEQ ID N0:11的位置1156-1183或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO: 14的位置131-158或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO: 15的位置101-128或其至少一個免疫原性域，來自不同MUCl蛋白如另一種人MUCl蛋白的相應序列，或與這些氨基酸序列中任一種至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0094]可用于上文或本文中別處描述的融合蛋白中的MUCl細胞質域(CD)可以是包含來自任何MUCl蛋白的至少一個免疫原性域的CD或其部分，且在一個方面，是來自人MUCl蛋白的。在本發明的一個方面，用于本發明融合蛋白的MUClCD具有包含或組成為選自以下氨基酸序列的氨基酸序列:SEQ ID NO:2的位置202-273或其至少一個免疫原性域，SEQ IDNO:4的位置193-264或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO:6的位置193-264或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO:8的位置184-255或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO: 11的位置1184-1255或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO: 14的位置159-230或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO: 15的位置129-200或其至少一個免疫原性域，SEQ ID NO: 17的位置7-78或位置79-150或位置151-222或其至少一個免疫原性域；SEQ ID NO: 18的位置1_72或位置73-144或位置145-216或其免疫原性域，來自不同MUCl蛋白如另一種人MUCl蛋白的相應序列，或與這些氨基酸序列中任一種至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0095]在本發明的一個實施方案中，可用于本發明的基于酵母的免疫治療組合物的融合蛋白包含以下MUCl抗原，其從N至C末端次序為:⑴MUC1SEA域和MUCl胞外域(ED)的一部分，其包含大部分或所有的MUClED ；⑵至少兩個VNTR域；(3)MUCl跨膜域；和(4)MUCl細胞質域(⑶)。在一個實施方案中，所述融合蛋白包含以下MUCl抗原，其從N至C末端次序為:(I)MUCl信號序列；(2)MUC1SEA域和MUCl胞外域(ED)的一部分，其包含大部分或所有的MUClED ； (3)至少兩個VNTR域；⑷MUCl跨膜域；和(5)MUCl細胞質域(⑶)。要納入本發明融合蛋白中的另外或備選的元件可包括改進或協助融合蛋白的表達或穩定性，和/或允許融合蛋白的鑒定和/或純化的N末端和/或C末端肽，和/或融合蛋白區段之間的短介入接頭序列(例如1、2、3、4、或5個氨基酸的肽)，其可用于引入限制酶位點以協助克隆，作為宿主吞噬體蛋白酶的切割位點，加速蛋白質或抗原加工，及用于構建體的后來操作。這類元件在下文詳細描述。
[0096]可用于本發明的基于酵母的免疫治療組合物的這類融合蛋白的一個例子包含或包括以下MUCl抗原，其從N至C末端的次序為:
[0097](I)MUCl胞外域(ED)，其在N末端可由1、2、3、4、5或更多個側翼氨基酸附接，所述氨基酸來自位于野生型蛋白質中ED上游的SEA域的非ED部分，其中所述ED區段包含或組成為選自以下的氨基酸序列:SEQ ID N0:2的位置116-173 ;或SEQ ID NO:4的位置107-164 ；SEQ ID NO:6 的位置 107-164 ;SEQ ID NO:8 的位置98-155 ;SEQ ID N0:11 的位置1098-1155 ；SEQ ID NO: 14 的位置 32-89 ;SEQ ID NO: 15 的位置 2-59 ;來自不同 MUCl 蛋白如另一種人MUCl蛋白的相應序列；或與這些氨基酸序列中任一種至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列； [0098](2)至少兩個VNTR域，其中每個VNTR域包含或組成為選自以下的氨基酸序列:SEQID NO: 11的位置126-145，SEQ ID NO: 11的位置61至1020之間的任何連續的20個氨基酸，或SEQ ID NO: 11的位置126至965之間的任何連續的20個氨基酸；SEQ ID N0:12(包括如上文描述的SEQ ID NO: 12內的任一種多態性)，SEQ ID NO: 14的位置90至130之間的任何連續的20個氨基酸，SEQ ID NO: 15的位置60至100之間的任何連續的20個氨基酸，來自不同MUCl蛋白如另一種人MUCl蛋白的相應VNTR序列，或與這些氨基酸序列中任一種至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列；
[0099](3)MUCl跨膜(TM)域，其中所述TM域包含或組成為選自以下的氨基酸序列:SEQID NO:2 的位置 174-201，SEQ ID NO:4 的位置 165-192，SEQ ID NO:6 的位置 165-192，SEQID NO: 8 的位置 156-183，SEQ ID NO: 11 的位置 1156-1183，SEQ ID NO: 14 的位置 131-158，SEQ ID NO: 15的位置101-128，來自不同MUCl蛋白如另一種人MUCl蛋白的相應序列，或與這些氨基酸序列中任一種至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列；和
[0100](4)MUCl細胞質域(⑶)，其中所述⑶包含或組成為選自以下的氨基酸序列:SEQID NO:2 的位置 202-273，SEQ ID NO:4 的位置 193-264，SEQ ID NO:6 的位置 193-264，SEQID NO: 8 的位置 184-255，SEQ ID NO: 11 的位置 1184-1255，SEQ ID NO: 14 的位置 159-230，SEQ ID NO: 15 的位置 129-200，SEQ ID NO: 17 的位置 7-78 或位置 79-150 或位置 151-222 ；SEQ ID N0:18的位置1-72或位置73-144或位置145-216，來自不同MUCl蛋白如另一種人MUCl蛋白的相應序列，或與這些氨基酸序列中任一種至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0101]在該實施方案的一個方面，可用于本發明的基于酵母的免疫治療組合物中的融合蛋白包含或組成為SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。SEQ ID NO: 14包含以下MUCl抗原，其從N至C末端的次序為:(I)MUCl信號序列(SEQ ID NO: 14的位置1_30) ； (2)MUC1SEA/ED 區段(SEQ ID NO: 14 的位置 31-89) ； (3)包含兩個 VNTR 域的 VNTR 區段(SEQID NO: 14 的位置 90-130) ;(4)MUC1TM 域(SEQ ID NO: 14 的位置 131-158) ; (5)MUClCD(SEQID NO: 14 的位置 159-230);和(6)6 肽組氨酸標簽(SEQ ID NO: 14 的位置 231-236)。SEQID NO: 14由SEQ ID NO: 13代表的核苷酸序列編碼。SEQ ID NO: 15包含以下MUCl抗原，其從N至C末端的次序為:(1)MUC1SEA/ED區段(SEQ ID NO: 15的位置1-59)；⑵包含兩個VNTR 域的 VNTR 區段(SEQ ID NO: 15 的位置 60-100) ; (3)MUClTM 域(SEQ ID NO: 15 的位置101-128);和(4)MUC1CD(S EQ ID NO: 15 的位置 129-200)。任選地，SEQ ID NO: 14 或 SEQID NO: 15的融合蛋白包含N末端肽，其為設計為賦予對蛋白酶體降解的抗性并穩定表達的合成的N末端肽，代表性的為SEQ ID NO: 21，或來自酵母alpha前導序列的N末端肽如SEQID NO: 19或SEQ ID NO: 20，或適于與本文所述基于酵母的免疫治療物一起使用的另一種N末端肽。還是任選地，具有1、2、3個或更多個氨基酸的一種或多種接頭肽，如Thr-Ser的兩個氨基酸的接頭，可插入融合蛋白的區段之間。在融合蛋白C末端的6組氨酸標簽也是任選的。
[0102]在本發明的一個實施方案中，可用于本發明的基于酵母的免疫治療組合物的融合蛋白包含以下MUCl抗原，其從N至C末端的次序為:(1)至少兩個VNTR域；和⑵MUC1SEA域和MUCl胞外域(ED)的一部分，其包含大部分或所有的MUC1ED。這類融合蛋白可包含VNTR域側翼的MUCl-N區的另外部分。這類融合蛋白不包含完整的MUCl-N亞基。
[0103]在本發明的另一個實施方案中，可用于本發明的基于酵母的免疫治療組合物的融合蛋白包含以下MUCl抗原，其從N至C末端的次序為:(I)第一MUCl細胞質域(CD) ； (2)第二 MUCl細胞質域(CD);和(3)第三MUCl細胞質域(CD)。在一個實施方案中，可將另外的MUCl細胞質域納入這類融合蛋白。在一個實施方案中，至少一個MUCl⑶來自與其他MUCl⑶不同的來源(例如一個MUCl⑶來自第一人MUCl蛋白，而一個MUCl⑶來自第二 MUCl蛋白，其中在第一和第二 MUCl⑶之間可以有序列差異)。在一個實施方案中，該融合蛋白在N末端附接有MUCl信號序列。在另一個實施方案中，該融合蛋白可包含改進或協助融合蛋白的表達或穩定性，和/或允許融合蛋白的鑒定和/或純化的N末端和/或C末端肽，和/或融合蛋白區段之間的短介入接頭序列(例如具有1、2、3、4、或5個氨基酸的肽)，其可用于引入限制酶位點以協助克隆，作為宿主吞噬體蛋白酶的切割位點，加速蛋白質或抗原加工，及用于構建體的后來操作。
[0104]可用于本發明的基于酵母的免疫治療組合物中的這類融合蛋白的一個例子包含或包括以下MUCl抗原，其從N至C末端的次序為:
[0105](I)第一 MUCl細胞質域(⑶)，其中所述⑶包含或組成為選自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO: 2 的位置 202-273，SEQ ID NO: 4 的位置 193-264，SEQ ID NO: 6 的位置 193-264，SEQ ID N0:8 的位置 184-255，SEQ ID NO: 11 的位置 1184-1255，SEQ ID N0:14 的位置159-230，SEQ ID NO: 15 的位置 129-200，SEQ ID NO: 17 的位置 7-78 或位置 79-150 或位置151-222 ；SEQ ID NO: 18的位置1-72或位置73-144或位置145-216，來自不同MUCl蛋白如另一種人MUCl蛋白的相應序列，或與這些氨基酸序列中任一種至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列；
[0106](2)第二 MUCl細胞質域(⑶)，其中所述⑶包含或組成為選自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO: 2 的位置 202-273，SEQ ID NO: 4 的位置 193-264，SEQ ID NO: 6 的位置 193-264，SEQ ID N0:8 的位置 184-255，SEQ ID NO: 11 的位置 1184-1255，SEQ ID N0:14 的位置159-230，SEQ ID NO: 15 的位置 129-200，SEQ ID NO: 17 的位置 7-78 或位置 79-150 或位置151-222 ；SEQ ID NO: 18的位置1-72或位置73-144或位置145-216，來自不同MUCl蛋白如另一種人MUCl蛋白的相應序列，或與這些氨基酸序列中任一種至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列；
[0107](3)第三MUCl細胞質域(⑶)，其中所述⑶包含或組成為選自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO: 2 的位置 202-273，SEQ ID NO: 4 的位置 193-264，SEQ ID NO: 6 的位置 193-264，SEQ ID N0:8 的位置 184-255，SEQ ID NO: 11 的位置 1184-1255，SEQ ID N0:14 的位置159-230，SEQ ID NO: 15 的位置 129-200，SEQ ID NO: 17 的位置 7-78 或位置 79-150 或位置151-222 ；SEQ ID NO: 18的位置1-72或位置73-144或位置145-216，來自不同MUCl蛋白如另一種人MUCl蛋白的相應序列，或與這些氨基酸序列中任一種至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、或至少99%相同的氨基酸序列。
[0108]在該實施方案的一個方面，可用于本發明的基于酵母的免疫治療組合物中的融合蛋白包含或組成為SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。SEQ ID NO: 17包含以下MUCl抗原，其從N至C末端的次序為:(I)由SEQ ID NO: 21代表的合成肽(SEQ ID NO: 17的位置 1-6) ; (2)第一 MUCI CD (SEQ ID NO: 17 的位置 7-78) ; (3)第二 MUClCD (SEQ ID NO: 17的位置 79-150) ; (4)第 三 MUCI CD (SEQ ID NO: 17 的位置 151-222);和(5) 6 組氨酸標簽(SEQID NO: 17的位置223-228)。SEQ ID NO: 17由SEQ ID NO: 16代表的核苷酸序列編碼。SEQID N0:18包含以下MUCl抗原，其從N至C末端的次序為:(I)第一 MUC1CD(SEQ ID NO: 18的位置 1-72) ；(2)第二 MUC1CD(SEQ ID NO: 18 的位置 73-144) ； (3)第三 MUC1CD(SEQ IDNO: 18的位置145-216)。任選地，SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18的融合蛋白包含N末端肽，其為設計為賦予對蛋白酶體降解的抗性并穩定表達的合成的N末端肽，代表性的為SEQID NO: 21，或為來自酵母alpha前導序列的N末端肽如SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20，或適于與本文所述基于酵母的免疫治療物一起使用的另一種N末端肽。還是任選地，具有I至3個或更多個氨基酸的一種或多種接頭肽，具有1、2、3或更多個氨基酸的接頭序列，如Thr-Ser的兩個氨基酸的接頭，可插入融合蛋白的區段之間。在融合蛋白C末端的6組氨酸標簽也是任選的。
[0109]可用于本發明的MUCl抗原還包括具有與本文中描述的任一種MUCl蛋白、域、融合蛋白或抗原的氨基酸序列在蛋白質的全長上，或對于形成蛋白質部分的其限定的片段或域(例如免疫學域或功能域(具有至少一種生物學活性的域))至少85%，86%，87%，88%，89%，90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%相同的氨基酸序列的蛋白質。例如，本文中描述的MUCl蛋白的域包含信號序列、VNTR域、SEA域、胞外域(ED)、TM域和/或細胞質域(⑶)。上文已詳細描述了免疫學域。本文中描述的MUCl融合蛋白包括那些由SEQ IDNO: 14，SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18代表的。因此，可用于本發明的基于酵母的免疫治療物的MUCl抗原包含或組成為以下任一種的MUCl抗原:SEQ ID NO: 14，SEQID NO: 15，SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18，與 SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18的任一種至少約95%，96%，97%，98%或99%相同的氨基酸序列，和/或來自不同MUCl蛋白的相應序列(例如一種融合蛋白，其中一個或多個融合區段來自不同MUCl蛋白或MUCl蛋白激動劑序列的相應序列，從而相比于此處呈現的序列可能存在微小序列差異)。
[0110]使用從本文中例示的那些之外的序列(且特別是來自相同動物物種的序列或來源的)衍生或獲得的任一種MUCl蛋白或域的相應部分來創建與本文中所述融合蛋白具有相似或相同的總體結構的融合蛋白是簡單的。舉例而言，能容易地在來自任何來源的給定人MUCl蛋白中鑒定出對應于SEQ ID NO: 11的位置1034-1152的相應序列，其使用簡單的序列比對工具或過程。因此，與本文中例示的序列具有微小和/或保守差異的序列明確涵蓋在本發明中。
[0111]在本發明的一些方面，可對野生型或參照MUCl蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11個或更多個氨基酸進行氨基酸插入、缺失和/或取代，只要所得MUCl蛋白在用作本發明酵母-MUCl免疫治療組合物中的抗原時，引發針對天然MUCl蛋白如野生型或參照MUCl蛋白的免疫應答，其可包括增強的免疫應答、減少的免疫應答、或實質性相似的免疫應答。例如，本發明包括使用MUCl激動劑抗原，其可包含一種或多種已經突變以增強針對MUCl激動劑的T細胞應答的T細胞表位，如通過改進表位對MHC分子或對在MHC呈現背景中識別該表位的T細胞受體的親合力或親和力。因此，MUCl激動劑可改進針對由腫瘤細胞表達的天然MUCl的T細胞應答的效力或效率。多種MUClT細胞表位，包括記載于以下的激動劑表位:美國專利6，546，643 ;美國專利N0.7，118，738 ;美國專利N0.7，342，094 ;美國專利N0.7，696，306 ;和美國專利申請公開文本N0.2008/0063653,且這些表位中的任一種或多種可用于本發明的MUCl抗原，包括通過在本文描述的序列內添加、缺失或取代一個或多個氨基酸以使該序列符合在該位置處公開的表位序列。
[0112]本文中提供了 MUCl激動劑抗原的例子(見實施例3和4)。在一個實施方案中，適合用于本發明的MUCl激動劑抗原包含1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或所有11個以下取代，其中相對于由登錄號NP_001191214代表的野生型MUCl提供取代的位置(盡管可在任何其他野生型MUCl序列中容易地鑒定出相同或等同的位置):T93，Α161，Ρ162，G169，S170，Τ171，Α392，C406, Τ444，D445、或S460。在一個實施方案中，可用于本發明的基于酵母的免疫治療組合物的MUCl激動劑抗原包含或組成為SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 25的氨基酸序列。SEQ ID NO:23包含以下MUCl抗原，其從N至C末端的次序為=(I)MUCl信號序列(SEQ ID NO:23 的位置 1-30) ； (2)MUC1SEA/ED 區段(SEQ ID NO:23 的位置 31-89) ； (3)包含兩個 VNTR 域的 VNTR 區段(SEQID NO: 23 的位置 90-130) ; (4)MUClTM 域(SEQ ID NO: 23的位置 131-158) ; (5)MUClCD(SEQ ID NO:23 的位置 159-230) ； (6)MUCI 激動劑表位(SEQID NO:23 的位置 231-246)和(7)6 組氨酸標簽(SEQ ID NO:23 的位置 247-252)。SEQ IDNO: 23由SEQ ID NO: 22代表的核苷酸序列編碼(針對酵母表達優化過密碼子)。MUCl信號序列(SEQ ID N0:23的位置1-30)可用設計為賦予對蛋白酶體降解的抗性和/或穩定表達的不同N末端序列(如SEQ ID NO: 21代表的肽)，或來自酵母alpha前導序列的N末端肽如SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20取代。6組氨酸C末端標簽是任選的，且其促進蛋白質的鑒定和/或純化。相比于SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15中的MUCl抗原，SEQ ID NO: 23含有以下氨基酸取代以創建多種激動劑表位(參照SEQ ID NO: 23給出取代位置，并進一步參照由登錄號NP_001191214代表的野生型MUCl中的取代位置):A96Y(野生型MUCl中的位置161)，P97L(野生型MUCl中的位置162)，G104V (野生型MUCl中的位置169)，S105Y (野生型MUCl中的位置170)，T106L(野生型MUCl中的位置171)，A147Y(野生型MUCl中的位置392)，C161V (野生型MUCl中的位置406)，T199L (野生型MUCl中的位置444)，D200F (野生型MUCl中的位置445)，S215Y(野生型MUCl中的位置460)和T239L(野生型MUCl中的位置93)。
[0113]SEQ ID N0:25包含以下MUCl抗原，其從N至C末端的次序為:(I)本文中別處由SEQ ID NO: 19公開的alpha因子前導序列(SEQ ID NO:25的位置1-89) ; (2)Thr-Ser的接頭序列(SEQ ID NO:25的位置90-91) ； (3)對應于野生型蛋白質，只不過引入11個激動劑表位的全長MUCl激動劑蛋白(SEQ ID NO:25的位置92-566)和(7)6肽組氨酸標簽(SEQID NO:25的位置567-572)。SEQ ID N0:25由SEQ ID NO:24代表的核苷酸序列編碼(針對酵母表達優化過密碼子)。Alpha前導序列(SEQ ID NO:25的位置1_89)可用設計為賦予對蛋白酶體降解的抗性和/或穩定表達的不同N末端序列(如由SEQ ID N0:21代表的肽)，或來自不同酵母alpha前導序列的N末端肽如SEQ ID NO: 20，或MUCl信號序列取代。6組氨酸C末端標簽是任選的，且其促進蛋白質的鑒定和/或純化。相比于用作模板的野生型MUCl蛋白，G1-6106中的序列含有以下氨基酸取代以創建多種激動劑表位(參照SEQ IDN0:25給出取代位置，并進一步參照由登錄號NP_001191214代表的野生型MUCl中的取代位置):T184L(野生型MUCl中的位置93)，A232Y (野生型MUCl中的位置161)，P233L (野生型MUCl中的位置162)，G240V(野生型MUCl中的位置169)，S241Y(野生型MUCl中的位置170)，T242L (野生型MUCl中的位置171)，A483Y (野生型MUCl中的位置392)，C497V (野生型MUCl中的位置406)，T535L(野生型MUCl中的位置444)，D536F(野生型MUCl中的位置445)和S551Y(野生型MUCl中的位置460)。
[0114]因此，可用于本發明的基于酵母的免疫治療物的MUCl激動劑抗原包括包含或組成為SEQ ID N0:23或SEQ ID NO:25的MUCl抗原，或在這些更大融合蛋白中的MUCl特異性序列，或與SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25的任一種至少約95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列，或在這些更大融合蛋白中的MUCl特異性序列，和/或來自不同MUCl蛋白的相應序列(例如一種融合蛋白，其中一個或多個融合區段來自不同MUCl蛋白的相應序列，從而相比于此處呈現的序列可能存在微小序列差異)。
[0115]如上文論述的，N-末端表達序列和C-末端標簽，如那些上文對于SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 17, SEQ ID N0:23、或SEQ ID NO:25的融合蛋白所描述的，是任選的，但可選自本文中別處描述的幾種不同的序列以改進或協助表達、穩定性和/或允許鑒定和/或純化蛋白質。還有，適用于酵母的許多不同的啟動子是本領域中已知的。此外，出于多種原因，包括引入限制酶位點以促進克隆、作為宿主吞噬體蛋白酶的切割位點、加速蛋白質或抗原加工、及構建體的后來操作，可將短介入接頭序列(例如具有1、2、3、4、或5個氨基酸的肽)引入包含MUCl抗原的融合蛋白部分之間。
[0116] 任選地，使用特別可用于改進或穩定酵母中異源抗原表達的抗原構建體來產生包括融合蛋白在內的蛋白質，其被用作本發明酵母-MUCl免疫治療組合物的組分。在一個實施方案中，期望的抗原性蛋白質或肽在其氨基末端端融合至:(a) —種特定的合成肽，其穩定酵母媒介物中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后修飾(這類肽詳細記載于，例如美國專利公開文本N0.2004-0156858Α1，2004年8月12日公開，通過提述完整并入本文)；(b)至少一部分的內源性酵母蛋白質，其中任一種融合伴侶均提供蛋白質在酵母中表達的改進的穩定性和/或防止酵母細胞對蛋白質的翻譯后修飾(這類蛋白質亦詳細記載于，例如美國專利公開文本N0.2004-0156858A1，見上)；和/或(c)至少一部分的酵母蛋白質，其導致融合蛋白在酵母表面上表達(例如在本文中更詳細描述的Aga蛋白質)。另外，本發明任選地包括使用融合至編碼抗原的構建體C末端的肽，具體地用于蛋白質的選擇和鑒定。這類肽包括但不限于，任何合成或天然的肽，如肽標簽(例如6X His或6肽)或任何其他短表位標簽。附接于依照本發明的抗原的C末端的肽可在添加或不添加上述N末端肽的情況下使用，反之亦然。
[0117]在一個實施方案中，可用于要在酵母中表達的融合蛋白中的合成肽連接至抗原的N末端，該肽包括至少2個與該抗原異源的氨基酸位置，其中所述肽穩定酵母媒介物中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后修飾。所述合成肽和抗原的N末端部分一起形成具有以下要求的融合蛋白:(I)融合蛋白位置I的氨基酸殘基是甲硫氨酸(即合成肽中的第一氨基酸是甲硫氨酸)；(2)融合蛋白位置2的氨基酸殘基不是甘氨酸或脯氨酸(即合成肽中的第二氨基酸不是甘氨酸或脯氨酸)；(3)融合蛋白位置2-6處的氨基酸位置中沒有一處是甲硫氨酸(即位置2-6處的氨基酸，不管是合成肽還是蛋白質的部分(如果合成肽短于6個氨基酸)，均不包含甲硫氨酸)；和(4)融合蛋白位置2-6處的氨基酸中沒有一個是賴氨酸或精氨酸(即位置2-6處的氨基酸，不管是合成肽還是蛋白質的部分(如果合成肽短于5個氨基酸)，均不包含賴氨酸或精氨酸)。合成肽可以短至2個氨基酸，但在一個方面，是2-6個氨基酸(包括3、4、5個氨基酸)，并且可以長于6個氨基酸，以全整數而言，長達約200個氨基酸、300個氨基酸、400個氨基酸、500個氨基酸或更長。 [0118]在一個實施方案中，融合蛋白包含M-X2-X3-X4-X5-X6的氨基酸序列，其中M是甲硫氨酸；其中X2是除甘氨酸、脯氨酸、賴氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；其中X3是除甲硫氨酸、賴氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；其中X4是除甲硫氨酸、賴氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；其中X5是除甲硫氨酸、賴氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸；且其中X6是除甲硫氨酸、賴氨酸或精氨酸之外的任何氨基酸。在一個實施方案中，X6殘基是脯氨酸。增強抗原在酵母細胞中表達的穩定性和/或防止該蛋白在酵母中的翻譯后修飾的一種例示性的合成序列包括序列M-A-D-E-A-P (本文中由SEQ ID NO: 21代表)。除了表達產物的增強的穩定性以外，該融合伴侶似乎不會不利地影響針對構建體中免疫抗原的免疫應答。另外，合成的融合肽可設計為提供可由選擇劑如抗體識別的表位。
[0119]在一個實施方案中，MUCl抗原在N末端連接至酵母蛋白質,如alpha因子前原序列(亦稱為alpha因子信號前導序列)，其氨基酸序列在本文中由SEQ ID NO: 19或SEQ IDN0:20例示。酵母alpha因子前原序列的其他序列是本領域中已知的且涵蓋用于本發明中。
[0120]在本發明的一個方面，操作酵母媒介物從而通過表達的蛋白質產物的投遞或易位部分或全部地在酵母媒介物的表面上(胞外表達)表達或提供抗原。一種實現本發明這一方面的方法是使用間隔臂來將一種或多種蛋白質定位到酵母媒介物的表面上。例如，可使用間隔臂來創建抗原或其他感興趣的蛋白質與將該抗原或其他感興趣的蛋白質靶向到酵母細胞壁的蛋白質的融合蛋白。例如，可用于靶向其他蛋白質的一種這類蛋白質是使得抗原或其他蛋白質能靶向到酵母細胞壁從而將抗原或其他蛋白質位于酵母表面上的酵母蛋白質(例如細胞壁蛋白2(cwp2)、Aga2、Pir4或Flol蛋白質)。可將酵母蛋白質以外的蛋白質用于間隔臂；然而，對于任何間隔臂蛋白質，最期望具有針對靶抗原而非間隔臂蛋白質的免疫原性應答。如此，如果將其他蛋白質用于間隔臂，那么使用的間隔臂蛋白質不應生成對間隔臂蛋白質本身的較大免疫應答而覆蓋對靶抗原的免疫應答。本領域技術人員應以相對于對靶抗原的免疫應答較小的對間隔臂蛋白質的免疫應答為目標。間隔臂可構建為具有切割位點(例如蛋白酶切割位點)，其允許容易地按期望從酵母移去抗原或進行加工掉。可使用任何已知的測定免疫應答的幅度的方法(例如抗體產生、溶胞作用測定等)，而且這是本領域技術人員容易已知的。
[0121]另一種用于定位靶抗原或要暴露于酵母表面的其他蛋白質的方法是使用信號序列如糖基磷脂酰肌醇(GPI)來將靶物錨定至酵母細胞壁。或者，定位可通過附加將抗原或其他感興趣的蛋白質靶向到分泌途徑中(經由到內質網(ER)中的易位)的信號序列，從而使抗原結合與細胞壁結合的蛋白質(例如CWP)來實現。
[0122]在一個方面，所述間隔臂蛋白質是酵母蛋白質。酵母蛋白質可由約2至約800個氨基酸的酵母蛋白質組成。在一個實施方案中，所述酵母蛋白質為約10至約700個氨基酸。在另一個實施方案中，所述酵母蛋白質為約40至600個氨基酸。本發明的其他實施方案包括至少250個氨基酸、至少300個氨基酸、至少350個氨基酸、至少400個氨基酸、至少450個氨基酸、至少500個氨基酸、至少550個氨基酸、至少600個氨基酸、或至少650個氨基酸的酵母蛋白質。在一個實施方案中，所述酵母蛋白質長為至少450個氨基酸。優化抗原表面表達(若期望的話)的另一個考慮是應將抗原和間隔臂組合表位為單體還是二聚體還是三聚體，或者甚至更多的相連單元。單體、二聚體、三聚體等的使用允許抗原的適宜間隔或折疊，從而抗原的一些部 分(如果不是所有)以使其更具免疫原性的方式展現在酵母媒介物的表面上。
[0123]酵母蛋白質的使用可穩定融合蛋白在酵母媒介物中的表達，預防所表達的融合蛋白的翻譯后修飾，和/或將融合蛋白靶向到酵母中的特定區室中(例如要表達在酵母細胞表面上)。對于投遞到酵母分泌途徑中，使用的例示性酵母蛋白質包括但不限于:Aga(包括但不限于Agal和/或Aga2) ;SUC2(酵母轉化酶)；alpha因子信號前導序列；CPY ;Cwp2p (因其定位和保留在細胞壁中)；BUD基因(因在子細胞形成的初始階段期間位于酵母細胞芽處);Flolp ；Pir2p ;和 Pir4p。
[0124]可使用將蛋白質靶向、保留和/或穩定化到酵母媒介物其他部分(例如在胞質溶膠或線粒體或內質網或細胞核中)的其他序列。可用于上文任一個實施方案的合適的酵母蛋白質的例子包括但不限于，TK、AF、SEC7 ;磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PCKl、磷酸甘油激酶PGK和丙糖磷酸異構酶TPI基因產物(針對其在葡萄糖和胞質溶膠定位中的可抑制的表達)；熱激蛋白SSAl、SSA3、SSA4、SSCl，其表達受到誘導且其蛋白質在細胞暴露于熱處理時更熱穩定；線粒體蛋白質CYCl (針對到線粒體中的輸入)；ACT1。
[0125]本發明涵蓋產生酵母媒介物以及表達酵母媒介物、將其與抗原和/或其他感興趣的蛋白質和/或藥劑組合和/或關聯以產生基于酵母的免疫治療組合物的方法。[0126]依照本發明，術語“酵母媒介物-抗原復合物”或“酵母-抗原復合物”一般用于描述酵母媒介物與抗原的任何關聯，且與“基于酵母的免疫治療組合物”在這類組合物用于引發如上文所述的免疫應答時可交換使用。這類關聯包括由酵母(重組酵母)表達所述抗原、將抗原引入酵母、將抗原物理附接至酵母、及將酵母和抗原混合在一起，如在緩沖液或其他溶液或配制劑中。這些復合物的類型在下文詳細描述。
[0127]在一個實施方案中，將用于制備酵母媒介物的酵母細胞用編碼某蛋白質(例如抗原)的異源核酸分子轉染，從而使得該蛋白質由酵母細胞表達。這類酵母在本文中亦稱為重組酵母或重組酵母媒介物。然后，可將酵母細胞與藥學可接受的賦形劑一起配制并直接對患者施用、存儲用于后面施用、或作為完整細胞加載到樹突細胞中。還可以殺死酵母細胞，或可以將其衍生化如通過形成酵母原生質球、細胞質、空胞或亞細胞顆粒，其中任一種可繼之以存儲、施用、或將衍生物加載到樹突細胞中。還可將酵母原生質球直接用重組核酸分子轉染(例如原生質球從整個酵母產生，然后轉染)以產生表達該抗原的重組原生質球。可將重組表達抗原的酵母細胞或酵母原生質球用于產生包含酵母細胞質、酵母空胞、或酵母膜顆粒或酵母細胞壁顆粒、或其級分的酵母媒介物。
[0128]一般地，所述酵母媒介物和抗原和/或其他藥劑可通過本文中描述的任何技術聯合起來。在一個方面，將所述酵母媒介物用抗原和/或藥劑胞內加載。在另一個方面，抗原和/或藥劑共價或非共價附接于酵母媒介物。在又一個方面，所述酵母媒介物和抗原和/或藥劑通過混合聯合。在另一個方面，且在一個實施方案中，所述抗原和/或藥劑由酵母媒介物或由衍生酵母媒介物的酵母細胞或酵母原生質球重組表達。
[0129]要由本發明的酵母媒介物產生的許多抗原和/或其他蛋白質是任意數目的可由酵母媒介物合理產生的抗原和/或其他蛋白質，且范圍通常從至少I種至至少約6種或更多種，包括從約2種至約6種抗原和/或其他蛋白質。 [0130]抗原或其他蛋白質在本發明的酵母媒介物中的表達使用本領域技術人員已知的技術來實現。簡言之，將編碼至少一種期望的抗原或其他蛋白質的核酸分子以使得該核酸分子可操作地連接至轉錄調控序列的方式插入到表達載體中，從而在轉化到宿主酵母細胞中時能夠引起該核酸分子的組成性或受調節的表達。編碼一種或多種抗原和/或其他蛋白質的核酸分子可以在一種或多種表達載體上可操作地連接至一種或多種表達調控序列。特別重要的表達調控序列是那些調控轉錄啟動的，如啟動子和上游激活序列。任何合適的酵母啟動子均可用于本發明且多種這類啟動子是本領域技術人員已知的。用于在釀酒酵母中表達的啟動子包括但不限于，編碼以下酵母蛋白質的基因的啟動子:醇脫氫酶I (ADHl)或II (ADH2)、CUP1、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙糖磷酸異構酶(TPI)、翻譯延伸因子EF-1al pha (TEF2)、甘油醛_3_磷酸脫氫酶(GAPDH ;對于丙糖磷酸脫氫酶亦稱為TDH3)、半乳糖激酶(GALl)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶(GAL7)、m)P-半乳糖差向異構酶(GALlO)、細胞色素cl (CYCl)、Sec7蛋白(SEC7)和酸性磷酸酶(PH05)，包括雜合啟動子如ADH2/GAPDH和CYC1/GAL10啟動子，且包括ADH2/GAPDH啟動子，當細胞中的葡萄糖濃度較低時(例如約0.1至約0.2個百分數)其被誘導，以及CUPl啟動子和TEF2啟動子。類似地，許多上游激活序列(UAS)，亦稱為增強子，是已知的。針對在釀酒酵母中表達的上游激活序列包括但不限于，編碼以下蛋白質的基因的 UAS:PCK1、TP1、TDH3、CYC1、ADH1、ADH2、SUC2、GAL1、GAL7 和GALlO,以及由GAL4基因產物激活的其他UAS，其中在一個方面使用ADH2UAS。由于ADH2UAS由ADRl基因產物激活，因此當異源基因可操作地連接至ADH2UAS時，優選可以過表達ADRl基因。針對在釀酒酵母中表達的轉錄終止序列包括α-因子、GAPDH和CYCl基因的轉錄終止序列。
[0131]在甲基營養型酵母中表達基因的轉錄調控序列包括編碼醇氧化酶和甲酸脫氫酶的基因的轉錄調控區。
[0132]將核酸分子轉染到依照本發明的酵母細胞中可通過其中核酸分子可導入細胞中的任意方法實現，所述方法包括但不限于，擴散、活性運輸、浴式超聲處理、電穿孔、微注射、脂轉染、吸附、和原生質體融合。使用本領域技術人員已知的技術，經轉染的核酸分子可整合到酵母染色體中或維持在染色體外載體上。攜帶這類核酸分子的酵母媒介物的例子在本文中詳細公開。如上文論述的，還可通過用期望的核酸分子轉染完整的酵母微生物或酵母原生質球，其中產生抗原，然后進一步使用本領域技術人員已知的技術操作微生物或原生質球以重組產生酵母細胞質、酵母空胞和酵母膜顆粒或細胞壁制備物，來產生含有期望的抗原或其他蛋白質的細胞質、空胞和亞細胞酵母膜提取物或其級分。
[0133]用于重組酵母媒介物的 產生并通過酵母媒介物表達抗原和/或其他蛋白質的有效條件包括其中可培養酵母菌株的有效培養基。有效培養基通常是包含可同化的糖、氮和磷酸鹽源，以及適宜的鹽、礦物質、金屬和其他營養物如維生素和生長因子的水性培養基。所述培養基可包含復雜的營養物或可以是限定的最小培養基。本發明的酵母菌株可在多種容器中培養，包括但不限于，生物反應器、Erlenmeyer瓶、試管、微滴定皿和皮氏培養皿(Petri plate)。培養在適于該酵母菌株的溫度、pH和氧含量進行。這類培養條件完全在本領域普通技術人員的技能范圍之內(參見例如，Guthrie等(編)，1991，Methodsin Enzymology, vol.194, Academic Press, San Diego)。例如，在一個方案中，可使用從酵母-MUCl免疫治療組合物的起始板和/或起始培養物獲得的培養物接種含有適宜培養基的液體培養物，并在30°C生長約20小時，伴隨著250rpm的攪拌。然后，原代培養物在期望時可擴展成更多的培養物。來自轉化酵母的載體的蛋白質表達(例如MUCl表達)可以是組成性的(如果利用的啟動子是組成性啟動子的話)，或者可以是通過添加針對該啟動子的適宜誘導條件誘導(如果利用的啟動子是可誘導啟動子的話)(例如在CUPl啟動子的情況中為硫酸銅)。在可誘導啟動子的情況中，可在培養物生長至適宜細胞密度之后啟動蛋白質表達的誘導，所述密度可以在約0.T1.U./ml或更高密度。
[0134]適于培養本發明酵母-MUCl免疫治療組合物的培養基的一個非限制性的例子是U2培養基。U2培養基包含以下組分:15g/L的葡萄糖、6.7g/L的含硫酸銨的酵母氮基、和各0.04mg/mL的組氨酸、色氨酸和腺嘌呤、以及0.06mg/ml的亮氨酸。適于培養本發明酵母-MUCl免疫治療組合物的培養基的另一個非限制性的例子是UL2培養基。UL2培養基包含以下組分:15g/L的葡萄糖、6.7g/L的含硫酸銨的酵母氮基、以及各0.04mg/mL的組氨酸、色氨酸和腺嘌呤。
[0135]在本發明的一些實施方案中，在中性pH條件下生長酵母。如本文中使用的，術語“中性pH”的一般性使用指在約pH5.5至約pH8的pH范圍，且在一個方面，為約pH6至約
8。本領域技術人員會領會當用pH計測量時可能存在微小波動(例如以數十分之一或數百分之一計)。如此，使用中性PH來生長酵母細胞意指對于培養中的大部分時間酵母細胞在中性pH中生長。在一個實施方案中，酵母生長在維持于至少5.5的pH水平(即不允許培養基的pH掉至低于pH5.5)的培養基中。在一個其他方面，酵母生長在維持于約6、6.5、7、7.5或8的pH水平。在一個方面，通過使用適宜的緩沖劑來創建緩沖的培養物或生長培養基來維持中性pH。在培養酵母中使用中性pH促進幾種生物學效應，其為使用酵母作為用于免疫調控的媒介物所期望的特征。例如，在中性PH培養酵母允許酵母的良好生長，而不對細胞世代時間有不利影響(例如延遲倍增時間)。酵母可持續生長至較高密度而不喪失其細胞壁柔韌性。使用中性PH允許產生具有柔韌細胞壁的酵母和/或在所有收獲密度對消化細胞壁的酶(例如葡聚糖酶)更敏感的酵母。期望該性狀，因為具有柔性細胞壁的酵母能誘導相比于在更酸性條件下生長的酵母不同或改進的免疫應答，例如通過促進已吞噬酵母的抗原提呈細胞的細胞因子分泌(例如THl型細胞因子，包括但不限于IFN-Y、白介素-12(IL-12)和IL-2，以及促炎性細胞因子如IL-6)。另外，這類培養方法提供了對位于細胞壁內的抗原的更大的可達性。在另一個方面，對一些抗原使用中性PH允許通過用二硫蘇糖醇(DTT)處理來釋放二硫鍵連接的抗原，這對于在更低pH(例如pH5)的培養基中培養表達抗原的酵母時是不可能的。在使用中性PH條件來培養用于本發明的酵母的一個非限制性例子中，使用例如4.2g/L Bis-Tris來緩沖上文描述的UL2培養基。
[0136]發明人在本文中顯示，使用中性pH條件生長的本發明的酵母-MUCl免疫治療組合物是更有力的樹突細胞的激活劑且活化MUC-1特異性T細胞以產生比在標準條件下生長(其中不維持中性pH)的相同酵母-MUCl免疫治療組合物更高水平的IFN- Y (見實施例)。
[0137]在一個實施方案中，利用對酵母糖基化的量的控制來控制酵母的抗原(特別是在表面上)的表達。酵母糖基化的量能影響抗原特別是在表面上表達的抗原的免疫原性和抗原性，因為糖模塊傾向于較大。如此，在依照本發明的酵母的調控中應考慮酵母表面上糖模塊的存在及其對靶抗原周圍三維空間的影響。可使用任何方法來降低或增加酵母的糖基化的量，如期望的。例如，可使用選擇的具有較低糖基化的酵母突變體菌株Hf^nmnnUochl和mnn9突變體)，或可通過突變消除靶抗原上的糖基化接受體序列。或者，可使用具有短小糖基化模式的酵母，例如畢赤酵母。還可以使用降低或改變糖基化的方法來處理酵母。
[0138]在本發明的一個實施方案中，作為在酵母媒介物中抗原或其他蛋白質重組表達的備選，將酵母媒介物用蛋白質或肽，或用糖類或其他充當抗原和/或可用作依照本發明的免疫調控劑或生物反應修飾劑的分子胞內加載。其后，可將現胞內含有抗原和/或其他蛋白質的酵母媒介物施用給個體或加載到載體如樹突細胞中。肽和蛋白質可直接插入到本發明的酵母媒介物中，其通過本領域技術人員已知的技術，如擴散、活性運輸、脂質體融合、電穿孔、吞噬作用、凍融循環和浴式超聲處理。可用肽、蛋白質、糖類或其他分子直接加載的酵母媒介物包括完整的酵母，以及原生質球、空胞或細胞質，其可在產生后用抗原和其他藥劑加載。或者，完整的酵母可用抗原和/或藥劑加載，然后可從其制備原生質球、空胞、細胞質或亞細胞顆粒。可將任意數目的抗原和/或其他藥劑加載到該實施方案中的酵母媒介物中，從至少1、2、3、4種或任何全整數直至成百或上千種抗原和/或其他藥劑，如通過加載例如微生物或其部分會提供的。
[0139] 在本發明的另一個實施方案中，抗原和/或其他藥劑物理附接至酵母媒介物。抗原和/或其他藥劑對酵母媒介物的物理附接可通過本領域中合適的任何方法實現，包括共價和非共價聯合方法，其包括但不限于，將抗原和/或其他藥劑化學交聯至酵母媒介物的外部表面或將抗原和/或其他藥劑生物學連接至酵母媒介物的外部表面，如通過使用抗體或其他結合伴侶。化學交聯可例如通過包括戊二醛連接、光親和性標記、用碳二亞胺處理、用能連接二硫鍵的化學物處理、以及用本領域中標準的其他交聯化學物處理在內的方法來實現。或者，可以使改變酵母膜的脂質雙層或細胞壁組成的化學物與酵母媒介物接觸，從而使得酵母的外部表面更可能融合或結合至具有特定電荷屬性的抗原和/或其他藥劑。還可將靶向性藥劑如抗體、結合肽、可溶性受體和其他配體納入抗原中作為融合蛋白或與抗原關聯以用于抗原對酵母媒介物的結合。
[0140]當抗原或其他蛋白質在酵母表面上表達或物理附接至表面時，在一個方面，可仔細選擇間隔臂來優化抗原或其他蛋白質在表面上的表達或含量。間隔臂的大小能影響抗原或其他蛋白質暴露多少用于酵母表面上的結合。如此，根據使用的是哪種/些抗原或其他蛋白質，本領域技術人員會選擇對于酵母表面上的抗原或其他蛋白質實現適宜間隔的間隔臂。在一個實施方案中，所述間隔臂是至少450個氨基酸的酵母蛋白質。間隔臂已在上文詳細論述。
[0141]在又一個實施方案中，所述酵母媒介物與抗原或其他蛋白質彼此聯合，其通過更被動的、非特異性的或非共價的結合機制，如通過將酵母媒介物和抗原或其他蛋白質溫和地一起混合在緩沖液或其他合適的配置劑中(例如加藥配液(admixture))。
[0142]在一個實施方案中，可將完整的酵母(有或無異源抗原或其他蛋白質的表達)碾碎或以產生酵母細胞壁制備物、酵母膜顆粒或酵母片段(即不完整的)方式加工，且在一些實施方案中，酵母片段可與包含抗原的其他組合物(例如DNA疫苗、蛋白質亞基疫苗、殺死或失活的病原體、病毒載體疫苗)一起提供或一起施用以增強免疫應答。例如，可利用酶處理、化學處理或物理力(例如機械剪切或超聲處理)來將酵母分解成用作佐劑的部分。
[0143]在本發明的一個 實施方案中，可用于本發明的酵母媒介物包括已殺死或失活的酵母媒介物。酵母的殺死或失活可通過多種本領域中已知的適宜方法中的任一種來實現。例如，酵母的加熱失活是將酵母失活的一種標準途徑，且本領域技術人員若期望的話能通過本領域中已知的標準方法來監測靶抗原的結構變化。或者，可以使用將酵母失活的其他方法，如化學、電、放射性或UV方法。參見例如，披露在標準酵母培養教科書如Methods ofEnzymology, Vol.194, Cold Spring Harbor Publishing(1990)中的方法學。使用的任一種失活策略均應考慮到靶抗原的二級、三級或四級結構并保留這類結構以優化其免疫原性。
[0144]可使用本領域技術人員已知的許多技術將酵母媒介物配制成本發明的基于酵母的免疫治療組合物或產品。例如，酵母媒介物可通過凍干干燥。包含酵母媒介物的配制物還可通過將酵母包裝成餅狀或片劑來制備，如對于用在烘焙或釀造操作中的酵母所進行的。另外，可將酵母媒介物與藥學可接受的賦形劑如宿主或宿主細胞耐受的等滲緩沖劑混合。這類賦形劑的例子包括水、鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液、漢克氏溶液和其他生理學平衡的水性鹽溶液。還可使用非水性媒介物，如不揮發性油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酸酯。其他可用的配制物包括含有粘度增強劑，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、甘油或葡聚糖的懸液。賦形劑還可含有少量的添加劑，如增強等滲性和化學穩定性的物質。緩沖劑的例子包括磷酸鹽緩沖劑、碳酸氫鹽緩沖劑和Tris緩沖劑，而防腐劑的例子包括硫柳汞(thimerosal)、間甲酚或鄰甲酚、福爾馬林和苯甲醇。標準的配制劑可以是液體注射劑或可吸納到合適的液體中作為懸液或溶液用于注射的固體。如此，在一種非液體配制物中，所述賦形劑可包含例如右旋糖、人血清清蛋白、和/或防腐劑，在施用前可向其加入無菌水或鹽水。
[0145]在本發明的一個實施方案中，組合物可包含另外的亦可稱為生物反應修飾劑化合物的藥劑，或產生這類藥劑/修飾劑的能力。例如，可用至少一種抗原和至少一種藥劑/生物反應修飾劑化合物轉染或加載酵母媒介物，或者本發明的組合物可連同至少一種藥劑/生物反應修飾劑施用。生物反應修飾劑包括佐劑和能調控免疫應答的其他化合物(其可稱為免疫調控化合物)，以及修飾其他化合物或藥劑如基于酵母的免疫治療物的生物學活性的化合物，這類生物學活性不限于免疫系統影響。某些免疫調控化合物能刺激保護性的免疫應答，而其他能抑制有害的免疫應答，且免疫調控與給定的基于酵母的免疫治療物組合是否有用至少部分可取決于要治療或預防的疾病狀態或狀況，和/或要治療的個體。某些生物反應修飾劑優先增強細胞介導的免疫應答而其他優先增強體液免疫應答(即能刺激其中相比于體液免疫具有水平升高的細胞介導免疫的免疫應答，或反之)。某些生物反應修飾劑具有與基于酵母的免疫治療物的生物學特性共同的一種或多種特性，或增強或補充基于酵母的免疫治療物的生物學特性。本領域技術人員已知許多技術來測量對免疫應答的刺激或抑制，以及區分細胞介導的免疫應答與體液免疫應答，和區分一種類型與另一種類型的細胞介導的應答(例如TH17應答對THl應答)。
[0146]可用于本發明的藥劑生物反應修飾劑可包括但不限于，細胞因子、趨化因子、激素、脂質衍生物、肽、蛋白質、多糖、小分子藥物、抗體及其抗原結合片段(包括但不限于抗細胞因子抗體、抗細胞因子受體抗體、抗趨化因子抗體)、維生素、多核苷酸、核酸結合模塊、適體、和生長調控物。一些合適的藥劑包括但不限于，IL-1或IL-1或IL-1R的激動劑、抗IL-1或其他IL-1拮抗劑；IL-6或IL-6或IL-6R的激動劑、抗IL-6或其他IL-6拮抗劑；IL-12或IL-12或IL-12R的激動劑、抗IL-12或其他IL-12拮抗劑；IL_17或IL-17或IL-17R的激動劑、抗IL-17或其他IL-17拮抗劑；IL_21或IL-21或IL-21R的激動劑、抗IL-21或其他IL-21拮 抗劑；IL-22或IL-22或IL-22R的激動劑、抗IL-22或其他IL-22拮抗劑；IL-23或IL-23或IL-23R的激動劑、抗IL-23或其他IL-23拮抗劑;IL_25或IL-25或IL-25R的激動劑、抗IL-25或其他IL-25拮抗劑；IL_27或IL-27或IL-27R的激動劑、抗IL-27或其他IL-27拮抗劑；1型干擾素(包括IFN-α )或I型干擾素或其受體的激動劑或拮抗劑；II型干擾素(包括IFN-Y)或II型干擾素或其受體的激動劑或拮抗劑；抗CD40、CD40L、淋巴細胞活化基因3 (LAG3)蛋白質和/或ΜΡ321 (源自LAG3的可溶性形式的T細胞免疫刺激性因子)、抗CTLA-4抗體(例如以釋放無變應性T細胞)；Τ細胞共刺激物(例如抗CD 137、抗CD28、抗CD40) ；alemtuzumab (例如CamPath? )、地尼白介素-毒素連接物(denileukin diftitox)(例如 ON ΑΚθ.<.:);抗0)4 ;抗 CD25 ;抗 F1D-U抗 F1D-LU抗PD-L2 ;阻斷F0XP3的藥劑(例如廢除活性/殺死⑶4+/⑶25+Τ調節性細胞)；Flt3配體、咪喹莫特(imiquimod) (Aldara?)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF);粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、沙格司亭(sargramostim) ( Leukine? );激素包括但不限于促乳素和生長激素；Toll樣受體(TLR)激動劑，包括但不限于TLR-2激動劑、TLR-4激動劑、TLR-7激動劑和TLR-9激動劑；TLR拮抗劑，包括但不限于TLR-2拮抗劑、TLR-4拮抗劑、TLR-7拮抗劑和TLR-9拮抗劑；抗炎性劑和免疫調控劑，包括但不限于C0X-2抑制劑(例如塞來考昔(Celecoxib)、NSAID)、糖皮質激素類、他汀類、和沙利度胺(thalidomide)及其類似物，
包括IMiD?(其為沙利度胺的結構和功能類似物(例如REVL丨MID*? (Ienalidomide)、ACTIMID? (pomalidomide));促炎性劑，如真菌或細菌組分或任何促炎性細胞因子或趨化因子；免疫治療疫苗，包括但不限于基于病毒的疫苗、基于細菌的疫苗或基于抗體的疫苗；和任何其他免疫調控劑、免疫加強劑、抗炎性劑、促炎性劑和任何調控抗原提呈細胞或TH17、THl和/或T調節細胞的數目、調控其活化狀態、和/或調控其存活的藥劑。這類藥劑的任意組合均由本發明涵蓋，且與基于酵母的免疫治療物組合或在方案中一起施用(例如同時、序貫或以其他形式一起)的任一種這類藥劑均為由本發明涵蓋的組合物。這類藥劑是本領域中公知的。這些藥劑可單獨使用或與本文中描述的其他藥劑組合使用。
[0147]藥劑可包括給定蛋白質或其肽或域的激動劑和拮抗劑。如本文中使用的，“激動劑”是結合受體或配體并產生或觸發應答的任意化合物或藥劑，包括但不限于小分子、蛋白質、肽、抗體、核酸結合劑等，其可包括模擬或增強結合受體或配體的天然存在物質的作用的藥劑。“拮抗劑”是阻斷或抑制或降低激動劑作用的任何化合物或藥劑，其包括但不限于小分子、蛋白質、肽、抗體、核酸結合劑等。
[0148]本發明的組合物還可包括可用于預防或治療癌癥的任何其他藥劑或組合物或方案，或治療或改善癌癥(特別是與MUCl表達或過表達有關的癌癥)的任何癥狀的任何化合物，或與之一起施用(同時、序貫或間歇地)。另外，本發明的組合物可與其他免疫治療組合物，包括預防用藥和/或治療性免疫治療一起使用。可用于治療癌癥的另外的藥劑、組合物或方案(例如治療方案)包括但不限于，化療、腫瘤的手術切除、放療、同種異體或自體同源性的干細胞移植、T細胞過繼性轉移、其他類型的免疫治療，包括基于病毒載體的免疫治療和樹突細胞/腫瘤融合免疫治療、和/或靶向性癌癥療法(例如小分子藥物、生物制劑、或單克隆抗體療法，其特異性靶向牽涉腫瘤生長和進展的分子，包括但不限于，選擇性雌激素受體調控物(SERM)、芳香酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑、組蛋白脫乙酰基酶(HDAC)抑制劑、類維生素A(retin0id)受體激活劑、細胞凋亡刺激物、血管發生抑制劑、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑、或免疫刺激物)。這些另外的治療劑和/或治療方案中的任一種可在本發明的免疫治療組合物之前、同時、交替、或之后施用，或在不同的時間點施用。例如，在連同化療或靶向性癌癥療法對個體施用時，可能期望在化療或靶向性癌癥療法的劑量之間的“假期”期間施用酵母-MUCl免疫治療組合物，以使得免疫治療組合物的功效最大化。腫瘤的手術切除可經常先于酵母-MUCl免疫治療組合物的施用，但另外或初始的手術可在酵母-MUCl免疫治療組合物的施用期間或之后進行。
[0149]本發明還包括包含本文中描述的任一種組合物，或本文中描述的組合物的任一種分別組分的試劑盒。試劑盒可包含另外的試劑和用于使用本發明的任一種組合物來預防或治療與MUCl表達或過表達有關或特征為MUCl表達或過表達的癌癥的書面用法說明書或指導。
[0150]用于施用或使用本發明組合物的方法
[0151]設計本發明的酵母-MUCl免疫治療組合物用于預防或治療與MUCl表達或過表達有關或特征為MUCl表達或過表達的癌癥，包括通過預防這類癌癥的出現、停滯這類癌癥的進展或消除這類癌癥。更具體地，酵母-MUCl免疫治療組合物可用于預防、抑制或延遲表達MUCl的腫瘤的形成，和/或預防、抑制或延遲腫瘤遷移和/或其他組織的腫瘤侵入(轉移)和/或一般性預防或抑制個體中癌癥的進展。酵母-MUCl免疫治療組合物還可用于改善癌癥的至少一種癥狀，如通過減輕個體中的腫瘤負擔；抑制個體中的腫瘤生長；增加個體的存活；和/或預防、抑制、逆轉或延遲個體中癌癥的進展。
[0152]與本發明的組合物和方法有關的癌癥是表達或可以表達MUCl的任何癌癥，或鄰近于表達或可以表達MUCl的癌癥的癌癥，包括上皮組織的癌癥，且包括但不限于，乳房、小腸、胃、腎、膀胱、子宮、卵巢、睪丸、肺、結腸、胰腺、前列腺、睪丸的癌癥及其轉移性癌。另外，MUCl是或可以在血液癌癥，如淋巴瘤、白血病和骨髓瘤中表達，包括但不限于，慢性淋巴細胞白血病(CLL)、多髓細胞性淋巴瘤(MML)、急性髓細胞樣白血病(AML)、Epstein-Barr病毒(EBV)轉化的B細胞、伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
[0153]在一個方面，在首次施用所述組合物時未在個體的癌癥中檢測出MUC1。當未在個體的癌癥中檢測出MUCl時，個體可能具有更早期的癌癥，其中尚未顯現MUCl表達(例如I期或II期)，或其中不能在任何事件中檢測出MUCl表達(即MUCl可能以或不以低水平表達或在少量腫瘤細胞中表達，但使用標準檢測方法尚未能容易地檢出)。或者，所述個體可能具有癌癥前期損傷或腫瘤，或者可能已知傾向于形成癌癥(例如由家族史、遺傳標志等已知)。在本發明的這些方面，通過使用酵母-MUCl免疫治療組合物來預防、延遲或抑制表達MUCl的腫瘤細胞的形成。
[0154]在另一個方面，在首次施用所述組合物時在或能在個體的癌癥中檢測出MUCl表達。在本發明的這一方面，所述個體可能患有I期、II期、III期或IV期癌癥。在這一方面，酵母-MUCl免疫治療組合物的使用降低、消除或延遲或停滯了表達MUCl的腫瘤的生長，其能引起個體中腫瘤負擔的降低、抑制表達MUCl的腫瘤生長、和/或個體的增加的存活。
[0155]本發明的另一個實施方案涉及一種治療癌癥，尤其是表達MUCl的癌癥的方法。所述方法包括對患有表達 MUCl的癌癥的個體施用本文中描述的酵母-MUCl免疫治療組合物，其可包括包含以下的組合物:(a) —種酵母媒介物；和(b)包含至少一種MUCl抗原的癌抗原。在一個方面，所述方法減輕患者中的腫瘤負擔。在一個方面，所述方法增加患者的存活。在一個方面，所述方法抑制個體中的腫瘤生長。
[0156]在一個方面，用至少一種可用于治療癌癥的其他治療性化合物或治療性方案來另外地治療所述個體。這類治療劑和方案已在本文中別處詳細論述。例如，在關于本文所述發明方法的任一個實施方案中，在一個方面，當個體患有癌癥(不考慮腫瘤細胞中可檢測的MUCl表達的狀態)時，所述個體正接受或已接受過針對癌癥的另一種療法治療。這類療法可包括任一種治療性方案或使用本文中先前描述的任一種治療性化合物或藥劑，包括但不限于，化療、放療、靶向性癌癥療法、腫瘤的手術切除、干細胞轉移、細胞因子療法、過繼性T細胞轉移、和/或第二免疫治療組合物的施用。在施用第二免疫治療組合物的情況中，這類組合物可包括但不限于，另外的基于酵母的免疫治療、基于重組病毒的免疫治療(病毒載體，例如參見PCT公開文本N0.W0/00/34494)、細胞因子療法、免疫刺激物療法(包括具有免疫刺激特性的化療)、DNA疫苗、樹突細胞/腫瘤融合免疫治療(例如參見PCT公開文本N0.W0/2009/062001)、和其他免疫治療組合物。
[0157]在一個方面，第二免疫治療組合物包含并非MUCl抗原的第二癌抗原。例如，可與酵母-MUCl免疫治療組合物組合使用的第二免疫治療組合物是包含由同一腫瘤類型表達、或要治療的個體患有或可能形成的其他腫瘤表達的另一種癌抗原的酵母-免疫治療組合物。這類癌抗原包括但不限于以下任意一種或多種:癌胚抗原(CEA)、點突變的Ras癌蛋白、短尾畸形蛋白、EGFR、BCR-Abl, MART-1, MAGE-U MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2、正常和點突變的 P53 癌蛋白、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1 (gp75)、NY-ESO-U TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤性結腸息肉病(APC)、Myc, vonHippel-Lindau 蛋白(VHL)、Rb-U Rb_2、雄激素受體(AR)、Smad4、MDRU Flt_3、BRCA-UBRCA-2、pax3-fkhr、ews-fl1-1、HERV-H, HERV-K, TWIST、間皮素、NGEP、這類抗原的修飾、這類抗原的剪接變體、和這類抗原的表位激動劑、以及這類抗原的組合、和/或其免疫原性域、其修飾、其變體、和/或其表位激動劑。
[0158]如本文中使用的，“治療”癌癥或其任意變換(例如“用于癌癥地治療”等)一般指一旦發生癌癥(例如一旦已在個體中診斷出癌癥或檢出癌癥)就施用本發明的組合物，其具有包括以下的至少一個治療的治療性目標(如相比于沒有該治療):腫瘤負擔的減輕；腫瘤生長的抑制；個體存活的增加；延遲、抑制、停滯或預防轉移性癌癥的發生或形成(如通過延遲、抑制、停滯或預防腫瘤遷移形成的發生和/或原發性癌癥之外的組織的腫瘤侵襲和/或與癌癥的轉移性進展有關的其他過程)；延遲或停滯原發性癌癥進展；改進針對腫瘤的免疫應答；改進針對腫瘤抗原的長期記憶免疫應答；和/或改進個體的一般健康。“預防”或“保護免于”癌癥，或其任意變換(例如“預防癌癥”等)一般指在發生癌癥之前，當檢測出癌癥前期的細胞時，或在特定階段的癌癥或癌癥中的腫瘤抗原表達發生之前(例如在癌癥中檢測出MUCl表達之前)，施用本發明的組合物，其具有包括以下的至少一個治療目標(如相比于沒有該治療):預防或延遲癌癥的發生或形成，或若癌癥在治療后發生，至少降低癌癥的嚴重程度(例如降低腫瘤生長水平、停滯癌癥進展、改進針對癌癥的免疫應答、抑制轉移性過程等)或改進個體中的結果(例如改進存活)。
[0159]本發明包括向受試者或個體投遞(施用、免疫、疫苗接種)本發明的酵母-MUCl免疫治療組合物。施用過程可離體或體內進行，但通常在體內進行。離體施用指在患者外實施部分調節性步驟，如對從患者取出的細胞群體(樹突細胞)在使得酵母媒介物、抗原和任意其他藥劑或組合物加載到細胞中的條件下施用本發明的組合物，并將細胞返還到患者。然后，本發明的治療性組合物可返還至患者，或通過任何適宜的施用模式對患者施用。
[0160]組合物的施用可以是系統性、經粘膜和/或在臨近靶部位的位置(例如在腫瘤部位附近)。根據要預防或治療的癌癥類型和/或靶細胞群體或組織，合適的施用路徑對于本領域技術人員將是明顯的。各種可接受的施用方法包括但不限于，靜脈內施用、腹膜內施用、肌內施用、節內施用、冠狀動脈內施用、動脈內施用(例如到頸動脈中)、皮下施用、經皮施用、氣管內施用、關節內施用、心室內施用、吸入(例如氣霧劑)、顱骨內、脊柱內、目艮內、耳、鼻內、口服、肺部施用、導管注入、和直接注射到組織中。在一個方面，施用路徑包括:靜脈內、腹膜內、皮下、皮內、節內、肌內、經皮、吸入、鼻內、口服、眼內、關節內、顱骨內、和脊柱內。胃腸外投遞可包括皮內、肌內、腹膜內、胸膜內、肺內、靜脈內、皮下、動脈導管和靜脈導管路徑。耳投遞可包括耳滴液，鼻內投遞可包括鼻滴液或鼻內注射，而眼內投遞可包括眼滴液。氣霧劑(吸入)投遞還可使用本領域種的標準方法實施(參見例如，Stribling等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA189:11277-11281，1992)。在一個方面，皮下施用本發明的酵母-MUCl免疫治療組合物。在一個方面，將酵母-MUCl免疫治療組合物直接施用到腫瘤環境中。
[0161] 一般地，適宜的單劑酵母-MUCl免疫治療組合物是當在一個適宜的時間段內施用一次或多次時，能有效向給定的細胞類型、組織或患者身體區域提供酵母媒介物和MUCl抗原的劑量，其量有效引發針對一種或多種MUCl抗原或表位的抗原特異性免疫應答。例如，在一個實施方案中，本發明的酵母-MUCl的單劑為約IxlO5至約5xl07酵母細胞等同物每千克施用該組合物的生物的體重。一個酵母單位(Y.U.)是IxlO7個酵母細胞或酵母細胞等同物。在一個方面，本發明的單劑酵母媒介物為約0.1Y.U.(IxlO6個酵母細胞或酵母細胞等同物)至約100Y.U.(IxlO9個細胞)每劑(即每生物)，包括任何中間劑量，增量為0.1xlO6個細胞(即1.1xlO6U.2χ106、1.3χ106...)。在一個實施方案中，適宜的劑量包括I Y.U.至40Y.U.的劑量且在一個方面，為10Y.U.至40Y.U或10Y.U.至80Y.U。在一個實施方案中，劑量在個體上不同部位但在同一給藥時段內施用。例如，40Y.U.劑量可通過在一個給藥階段內向個體上的4個不同部位注射10Y.U.劑量來施用。本發明包括在個體上1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10或更多個不同部位施用酵母-MUCl免疫治療組合物的量(例如1、2、3、4、5、6、
7、8、910、11、12、13、14，15、16、17、18、19、20Y.U.或更多)以形成單劑。
[0162]治療性組合物的“加強劑(booster/boost) ”在例如當針對抗原的免疫應答衰退或需要提供免疫應答或誘導針對特定抗原的記憶應答時施用。加強劑可相隔約1、2、3、4、5、6、 7、或8周施用，或每月、每兩個月、每季、每年施用、和/或在起始施用后以數年或幾年的增量施用，這根據所治療個體的狀態和施用時的治療目標(例如預防性、活性治療、維持)。在一個實施方案中，施用方案為，其中在從數周至數月、至數年的時間段內施用酵母-MUCl免疫治療組合物的劑量至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。在一個實施方案中，對于1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10劑以上的劑量，每周或每兩周施用劑量，繼之以如需要的每兩周或每月施用劑量以實現期望的對癌癥的預防性或治療性處理。然后，可以類似或更長的間期(數月或數年)給予額外的加強劑作為維持或緩解療法，如期望的。
[0163]在本發明的一個方面，一種或多種另外的治療劑或治療方案與酵母-MUCl免疫治療組合物的施用序貫和/或同時施用或進行，所述另外的治療劑或治療方案例如腫瘤的手術切除、化療的施用、放療的施用、其他免疫治療組合物或方案的施用，包括病毒載體療法和樹突細胞/腫瘤融合療法、細胞因子療法、過繼性T細胞轉移(包括已通過抗原和/或免疫治療組合物離體刺激過的T細胞的過繼性轉移)、或干細胞移植。在一個例子中，酵母-MUCl免疫治療連同利用基于病毒載體的免疫治療的療法(如記載于PCT公開文本N0.W0/00/34494) 一起施用。在另一個例子中，酵母-MUCl免疫治療連同樹突細胞/腫瘤細胞融合療法或用這類樹突細胞/腫瘤細胞融合物刺激的免疫系統細胞(例如T細胞)(如記載于PCT公開文本N0.W0/2009062001) —起施用。在這類實施方案中，非基于酵母的免疫治療可靶向MUCl或不同的腫瘤抗原，且這類療法可包括另外施用其他藥劑，如細胞因子、抗體或其他藥劑。
[0164]在一個方面，可在施用第一劑酵母-MUCl免疫治療組合物之前或之后施用針對癌癥的一種或多種療法(包括本文中描述的或本領域中已知的任意療法)。在一個實施方案中，可以與酵母-MUCl免疫治療組合物給藥交替的方式施用或實施一種或多種療法，如在一個方案中，在化療或其他療法的一劑或多劑連續劑量之間以指定的間期施用酵母-MUCl組合物。在一個實施方案中，在開始另外的療法之前的一段時間內施用一劑或多劑酵母-MUCl免疫治療組合物。換言之，在一段時間內酵母-MUCl免疫治療組合物作為單一療法施用，然后加入另外的療法(例如化療)，其要么與新的酵母-MUCl免疫治療劑量同時，要么以與酵母-MUCl免疫治療交替的方式。或者/另外地，可在開始施用酵母-MUCl免疫治療組合物之前施用另一種療法達一段時間，并可以組合概念(例如腫瘤的手術切除，繼之以使用酵母-MUCl免疫治療的單一療法達數周，繼之以交替的化療和酵母-MUCl免疫治療劑量達數周或數月，任選地之后是使用酵母-MUCl免疫治療和/或另一種療法的單一療法，或者是序貫、同時或以交替方式提供的療法的組合的新方案)。使用酵母-MUCl免疫治療來治療癌癥的各種方案均涵蓋在本發明中，且這些例子應視為對各種可能方案的非限制性例子。
[0165]基于病毒的免疫治療組合物通常包含包括病毒基因組或其部分的病毒載體(例如重組病毒)和編碼至少一種來自致病劑或疾病狀態的抗原(例如癌抗原、感染性疾病抗原、和/或其至少一個免疫原性域)的核酸序列。在一些實施方案中，基于病毒的免疫治療組合物還包含至少一種病毒載體，其包含一種或多種編碼一種或多種免疫刺激性分子的核酸序列。在一些實施方案中，將編碼免疫刺激性分子和抗原的基因插入同一個病毒載體(同一個重組病毒)。
[0166]樹突細胞/腫瘤細胞融合免疫治療組合物通常為使用本領域已知的融合方法通過樹突細胞與表達腫瘤抗原的非樹突細胞(包括腫瘤細胞)之間的融合生成的雜合細胞。融合的細胞具有樹突細胞特征且亦表達和呈現來自腫瘤細胞的腫瘤抗原。所述組合物可對個體施用，或用于離體刺激T細胞以用于T細胞轉移方法。
[0167]在本發明的一個方面，使用基于酵母的免疫治療除了靶向MUCl以外，還靶向MUCl之外的其他抗原。這類其他靶抗原可與MUCl抗原納入同一個酵母媒介物中，或者可產生靶向不同抗原的另外的基于酵母的免疫治療組合物，然后根據要治療的個體、由該癌癥類型或個體的特定腫瘤表達的抗原，和/或根據個體中癌癥的階段、或個體的治療階段，按期望的組合。例如，抗原的組合可選擇為覆蓋:(I)牽涉癌癥形成中的重要事件的抗原，如突變的Ras，(2)牽涉或與細胞過程失調有關的抗原，如CEA或MUCUP (3)短尾畸形蛋白，其涉及轉移性過程。例 如，一種或多種其他基于酵母的免疫治療組合物可表達一種或多種抗原，包括但不限于癌胚抗原(CEA)、點突變的Ras癌蛋白、短尾畸形蛋白、EGFR、BCR-Abl,MART-U MAGE-U MAGE-3、GAGE、GP-100, MUC-2、正常和點突變的 p53 癌蛋白、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ES0-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c_erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤性結腸息肉病(APC)、Myc、von Hippel-Lindau 蛋白質(VHL)、Rb_l、Rb_2、雄激素受體(AR)、Smad4、MDRU Flt_3、BRCA-U BRCA-2, pax3_fkhr、ews-fl1-1、HERV-H,HERV-K, TWIST、間皮素、NGEP、這類抗原的修飾、這類抗原的剪接變體、和這類抗原的表位激動劑、以及這類抗原的組合、和/或其免疫原性域、其修飾、其變體、和/或其表位激動劑。這些基于酵母的免疫治療組合物中的I種、2種、3種或更多種可在酵母-MUCl免疫治療組合物施用之前、與之同時或與之交替、和/或之后施用，從而優化對個體腫瘤中抗原的靶向。如上文，在這類方案中還可使用另外的療法(例如腫瘤的手術切除、化療、靶向性癌癥療法、放療等)。
[0168]在本發明的一個實施方案中，提供治療癌癥的一種方法。所述方法包括以下步驟:(a)對患有癌癥或癌癥前期腫瘤的個體施用第一免疫治療組合物，其包含如本文中描述的酵母媒介物和MUCl抗原；和(b)在第一免疫治療組合物的施用之前、同時、或之后對個體施用一種或多種另外的免疫治療組合物，其各自包含酵母媒介物且各自包含并非MUCl抗原的不同癌抗原。另外的癌抗原可以是本領域種已知或本文中描述的任一種，包括但不限于，突變的Ras、癌胚抗原(CEA)、短尾畸形蛋白、EGFR等。如需要的可重復步驟來治療特定個體的癌癥，且可在治療之前或期間修飾癌抗原以特異性地針對特定個體的癌癥。
[0169]在本發明的方法中，可對任何動物，包括任何脊椎動物，且具體地對脊椎動物哺乳綱(Mammalia)的任何成員施用組合物和治療性組合物，所述哺乳綱包括但不限于靈長類、嚙齒類、家畜和馴養寵物。家畜包括要消費的或產生可用產品的哺乳動物(例如綿羊用于羊毛生產)。要利用本發明治療或保護的哺乳動物包括人、非人靈長類、犬、貓、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬和豬。
[0170]“個體”是脊椎動物，如哺乳動物，包括但不限于人。哺乳動物包括但不限于，農場動物、運動動物、寵物、靈長類、小鼠和大鼠。術語“個體”可與術語“動物”、“受試者”或“患者”交換使用。
[0171]本發明中可用的通用技術
[0172]除非另外指示，本發明的實踐將釆用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學和免疫學的常規技術，其為本領域技術人員公知的。這類技術在文獻中得到完全解釋，如Methods of Enzymology, Vol.194, Guthrie等編,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990):Biology and activitiesof yeasts，Skinner 等編,Academic Press (1980):Methods in yeast genetics: alaboratory course manual，Rose 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；The Yeast Saccharomyces:Cell Cycle and Cell Biology，Pringle 等編，Cold SpringHarbor Laboratory Press (1997):The Yeast Saccharomyces: Gene Expression，Jones等編，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993):The Yeast Saccharomyces: GenomeDynamics，Protein Synthesis，and Energetics，Broach 等編，Cold Spring HarborLaboratory Press (1992):Molecular Cloning: A Laboratory Manual，secondedition (Sambrook 等，1989)and Molecular Cloning:A Laboratory Manual，thirdedition (Sambrook 和 Russel，2001)，(本文中統稱為 “Sambrook”):Current Protocolsin Molecular Biology (F.M.Ausubel 等編，1987，包括到 2001 年的增刊):PCR:ThePolymerase Chain Reaction, (Mullis 等編，1994):Harlow 和 Lane (1988)，Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications, New York ;Harlow和 Lane (1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor, NY (本文中統稱為“Harlow 和 Lane”)，Beaucage 等編，Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry，John Wiley&Sons, Inc., New York,2000) ;Casarett和Doull的 Toxicology The Basic Science of Poisons,C.Klaassen 編，6th edition (2001)，andVaccines,S.PlotkinjW.0renstein 和 P.0ffit 編，Fifth Edition (2008)。
[0173]通用定義
[0174]“TARMOGEN，，(Globelmmune, Inc.，Louisville, Colorado) 一般指胞外(在其表面上)、胞內(內部或胞質溶膠地)或既胞外也胞內表達一種或多種異源抗原的酵母媒介物。已一般性描述了 TARMOGEN? (參見例如美國專利N0.5，830，463)。某些基于酵母的免疫治療組合物，和制備及一般使用其的方法，亦詳細記載于例如，美國專利 N0.5，830，463、美國專利 N0.7，083，787、美國專利 N0.7，736，642、Stubbs 等，Nat.Med.7:625-629(2001)、 Lu 等，Cancer Research64:5084-5088(2004)和 Bernstein等，Vaccine2008Jan24;26(4): 509-21，其各自通過提述完整并入本文。
[0175]如本文中使用的，術語“類似物”指結構與另一種化合物類似但在組成上稍微不同的化學化合物(如在一種原子被不同元素的一種原子替換或在存在特定官能團的情況中，一種官能團被另一種官能團替換)。如此，類似物是一種相對于參照化合物在功能和表觀上類似或可比的，但具有不同結構或起源的化合物。
[0176]術語“取代的”、“經取代的衍生物”和“衍生物”，當用于描述一種化合物時，意指結合未經取代化合物的至少一個氫被不同的原子或化學模塊替換。
[0177]盡管衍生物具有與親本化合物類似的物理結構，但衍生物可具有與親本化合物不同的化學和/或生物學特性。這類特性可包括但不限于，增加或降低的親本化合物的活性，相比于親本化合物的新活性，增強或降低的生物利用度，增強或降低的功效，增強或降低的體外和/或體內穩定性，和/或增強或降低的吸收特性。
[0178]一般地，術語“生物學活性”指示化合物(包括蛋白質或肽)具有至少一種可檢測的活性，該活性對細胞、組織或生物體的代謝、生理學、化學或其他過程具有影響，如體內(即自然的生理學環境中)或體外(即實驗室條件下)測量或觀察到的。
[0179]依照本發明，術語“調控”可與“調節”交換使用且一般指特定活性的上調或下調。如本文中使用的，術語“上調”可一般用于描述以下任一種:對特定活性的引發(elicitation)、啟動(initiation)、增加、增大、加強、改進、增強、擴增、促進或提供。類似地，術語“下調”可 一般用于描述以下任一種:對特定活性的降低、減少、抑制、改善、減小、變少、阻斷或阻止。
[0180]在本發明的一個實施方案中，本文中描述的任一種氨基酸序列可產生為具有至少I個多達約20個額外的異源氨基酸，其側接指定氨基酸序列的每個C和/或N末端端。所得蛋白質或多肽可稱為“基本由”指定的氨基酸序列“組成”。依照本發明，所述異源氨基酸是非天然發現(即未在自然界中體內發現)側接指定氨基酸序列的氨基酸的序列，或不涉及指定氨基酸功能的，或不會由側接編碼指定氨基酸序列的天然存在的核酸序列的核苷酸(如其存在于基因中的)編碼的，倘若使用得到給定氨基酸序列的生物體的標準密碼子使用來翻譯該天然存在的序列中的這類核苷酸的話。類似地，術語“基本由…組成”當述及本文中的核酸序列時，指編碼指定氨基酸序列的核酸序列，在編碼指定氨基酸序列的核酸序列的每個5’和/或3’端可由至少一個，且多達約60個另外的異源核苷酸側接。所述異源核苷酸不是天然發現的(即未在自然界中體內發現)側接編碼指定氨基酸序列的核酸序列(如其存在于天然基因中的)且不編碼賦予該蛋白以任何額外功能或改變具有指定氨基酸序列的蛋白質的功能的蛋白質。
[0181]依照本發明，術語“選擇性結合”指本發明的抗體、抗原結合片段或結合伴侶優先結合指定蛋白質的能力。更具體地，術語“選擇性結合”指一種蛋白質對另一種(例如抗體、其片段或結合伴侶對抗原)的特異性結合，其中如通過任何標準測定法(例如免疫測定法)測量的結合水平統計學顯著地高于該測定法的背景對照。例如，當實施免疫測定法時，對照通常包括含有單獨的抗體或抗原結合片段(即沒有抗原)的反應孔/管，其中在缺少抗原時抗體或其抗原結合片段的反應性(例如對孔的非特異性結合)的量視為背景。結合可使用本領域中標準的多種方法測量，包括酶免疫測定法(例如ELISA、免疫印跡測定法等)。
[0182]對本發明中使用的蛋白質或多肽的一般性提述包括給定蛋白質的全長蛋白質、或任何片段、域(結構性、功能性或免疫原性)、構象表位、或同源物或變體。融合蛋白也可以一般性稱為蛋白質或多肽。依照本發明，分離的蛋白質是已從其天然環境移出(即已經過人操作)的蛋白質(包括多肽或肽)且可包括例如純化的蛋白質、部分純化的蛋白質、重組產生的蛋白質、和合成產生的蛋白質。如此，“分離的”不反映蛋白質純化的程度。優選地，本發明的分離的蛋白質是重組產生的。依照本發明，術語“修飾”和“突變”可交換使用，特別是關于本文中所述蛋白質或其部分的氨基酸序列(或核酸序列)的修飾/突變。
[0183]如本文中使用的，術語“同源物”或“變體”用于指通過對參照蛋白或肽(即“原型”或“野生型”蛋白質)的微小修飾而與參照蛋白或多肽不同，但維持了天然存在形式的基本蛋白質和側鏈結構的蛋白質或肽。這類變化包括但不限于:一個或幾個氨基酸側鏈中的變化；一個或幾個氨基酸的變化，包括缺失(例如蛋白質或肽的截短型)、插入和/或取代；一個或幾個原子的立體化學中的變化；和/或微小的衍生化，包括但不限于:甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、十四酰化、異戍二烯化(prenylation)、棕櫚化(palmitation)、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇。同源物或變體相比于參照蛋白或肽可具有增強、降低或幾乎類似的特性。同源物或變體可包括蛋白質的激動劑或蛋白質的拮抗劑。同源物或變體可使用本領域中已知的針對蛋白質生成的技術產生，包括但不限于，對分離的參照蛋白的直接修飾，直接的蛋白質合成，或對編碼蛋白質 的核酸序列的修飾，其使用例如經典的或重組DNA技術來引起隨機或靶向性誘變，導致編碼蛋白質變體。另外，可能存在參照蛋白的天然存在的變體(例如同等型、等位變體或可能在個體之間存在的其他天然變體)且可在本發明中分離、產生和/或利用。
[0184]給定的蛋白質的同源物或變體可包含與參照蛋白的氨基酸序列(例如本文中指定的氨基酸序列、或指定蛋白質的氨基酸序列)至少約45%、或至少約50%、或至少約55%、或至少約60%、或至少約65%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約86%相同、或至少約87%相同、或至少約88%相同、或至少約89%相同、或至少約90%、或至少約91%相同、或至少約92%相同、或至少約93%相同、或至少約94%相同、或至少約95%相同、或至少約96%相同、或至少約97%相同、或至少約98%相同、或至少約99%相同(或45%至99%的任何百分比同一性，以全整數增量)的氨基酸序列，基本由所述氨基酸序列組成或由其組成。在一個實施方案中，所述同源物或變體包含與參照蛋白的氨基酸序列低于100%相同、低于約99%相同、低于約98%相同、低于約97%相同、低于約96%相同、低于約95%相同，諸如此類，以1%的增量至低于約70%相同的氨基酸序列，基本由所述氨基酸序列組成或由其組成。
[0185]如本文中使用的，除非另外指定，提到百分比(%)同一性指使用如下方法進行的同源性評估:(I)Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)基礎同源性搜索,使用blastp進行氨基酸搜索而使用blastn進行核酸搜索，其中使用標準缺省參數，其中以缺省方法(by default)對檢索序列過濾低復雜性區域(如記載于Altschul, S.F.，Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, ff.&Lipman, D.J.(1997) "Gapped BLASTand PS1-BLAST: a new generation of protein database search programs.〃NucleicAcids Res.25:3389-3402，通過提述完整并入本文)；(2)兩條序列的BLAST比對(例如使用下文描述的參數)；(3)和/或使用標準缺省參數的PS1-BLAST (Position-SpecificIterated BLAST)。注意到，由于對于兩條序列Basic BLAST與BLAST之間標準參數的一些差異，在使用BLAST程序時可能將兩條特定序列認定為具有顯著同源性，而使用序列之一作為檢索序列以Basic BLAST進行的搜索可能沒有在上等匹配中鑒定到第二條序列。另外，PS1-BLAST提供了自動化的、易于使用的“序型”(profile)搜索型式，這是一種尋找序列同源物的靈敏方法。該程序首先進行帶缺口的BLAST數據庫搜索。PS1-BLAST程序利用來自任何返回的顯著比對的信息來構建位置特異性得分矩陣，它取代了檢索序列用于下一輪數據庫搜索。因此，應當理解，百分比同一性可以使用這些程序中的任一種來測定。
[0186]兩條特定序列可以使用BLAST彼此比對,如記載于Tatusova和Madden, (1999), 〃Blast2sequences_a new tool for comparing protein and nucleotide sequences' FEMSMicrobiol Lett.174:247-250，其通過提述完整并入本文。這類序列比對以blastp或blastn進行，其使用BLAST2.0算法在兩條序列之間進行Gapped BLAST搜索(BLAST2.0)，允許在所得比對中引入缺口(缺失和插入)。為了表述清楚，使用如下標準缺省參數進行兩條序列的BLAST序列比對。
[0187]對于blastn，使用 0BL0SUM62 矩陣:
[0188]匹配獎分=1
[0189]錯配罰分=_2
[0190]開放缺口(5)和延伸缺口⑵罰分
[0191]缺口x_ 落選(dropoff) (50)期望(10)詞長(11)濾器(開)
[0192]對于blastp，使用 0BL0SUM62 矩陣:
[0193]開放缺口(11)和延伸缺口(I)罰分
[0194]缺口 x_落選(50)期望(10)詞長(3)濾器(開)。
[0195]分離的核酸分子是已從其天然環境移出的(即已進行人為操作的)核酸分子，其天然環境指在自然界中發現該核酸分子所在的基因組或染色體。因此，“分離的”不必然反映該核酸分子已經純化的程度，但是指明該分子不包括在自然界中發現該核酸分子所在的整個基因組或整個染色體或含有超過一個基因的基因組區段。分離的核酸分子可以包括完整基因。包含基因的分離的核酸分子不是包含這類基因的染色體片段，而是包含與該基因有關的編碼區和調控區，但是沒有在同一染色體上天然發現的別的基因。分離的核酸分子還可以包含基因的部分。分離的核酸分子還可以包含側接(即在序列的5’和/或3’末端)別的核酸的指定核酸序列，所述別的核酸在自然界中通常不在指定核酸序列的側翼(即異源序列)。分離的核酸分子可以包括DNA、RNA (例如mRNA)、或DNA或RNA任一種的衍生物(例如cDNA)。盡管術語“核酸分子”主要指物理上的核酸分子，而術語“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，但是這兩個術語可以互換使用，尤其對于能夠編碼蛋白質或蛋白質域的核酸分子或核酸序列而言。
[0196]重組核酸分子是可包含編碼本文中描述的任意一種或多種蛋白質的任意核酸序列中的至少一種可操作地連接至能有效調節該核酸分子在要轉染的細胞中表達的任意轉錄調控序列中的至少一種的分子。盡管術語“核酸分子”主要指物理核酸分子而術語“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，但這兩個術語可交換使用，尤其是對于能編碼蛋白質的核酸分子或核酸序列而言。另外，術語“重組分子”主要指核酸分子可操作地連接至轉錄調控序列，但可與術語“核酸分子”(對動物施用的)交換使用。
[0197] 重組核酸分子包括重組載體，其是任何核酸序列(通常為異源序列)，其可操作地連接至編碼本發明融合蛋白的分離的核酸分子，其能使得能夠重組產生融合蛋白，且其能夠將核酸分子投遞到依照本發明的宿主細胞中。這類載體可含有不天然可見臨近于要插入載體中的分離的核酸分子的核酸序列。載體可以是RNA或DNA，原核或真核的，且優選在本發明中，是可用于轉染酵母的質粒。重組載體可用于克隆、測序和/或操作核酸分子，且可用于投遞這類分子(例如如在DNA組合物或基于病毒載體的組合物中)。優選地，將重組載體用于表達核酸分子，其亦可稱為表達載體。優選的重組載體能在轉染的宿主細胞如酵母中表達。
[0198]在本發明的重組分子中，核酸分子可操作地連接至含有調控性序列的表達載體，所述調控性序列如轉錄調控序列、翻譯調控序列、復制起點、和其他與宿主細胞相容且控制本發明核酸分子表達的調控性序列。具體地，本發明的重組分子包括可操作地連接至一種或多種表達調控序列的核酸分子。術語“可操作地連接”指核酸分子以在轉染(即轉化、轉導或轉染)到宿主細胞中時表達該分子的方式連接至表達調控序列。
[0199]依照本發明，術語“轉染”用于指外源核酸分子(即重組核酸分子)可插入細胞中的任何方法。當這類術語用于指核酸分子導入微生物細胞，如藻類、細菌和酵母中時，術語“轉化”可與術語“轉染”交換使用。在微生物系統中，術語“轉化”用于描述由于微生物獲得外源核酸所致的遺傳性變化，且基本與術語“轉染”同義。因此，轉染技術包括但不限于，轉化、化學處理細胞、顆粒轟擊、電穿孔、微注射、脂轉染、吸附、感染和原生質體融合。
[0200]提供以下實驗結果來例示但不意圖限制本發明的范圍。
實施例
[0201]實施例1
[0202]以下實施例描述稱為G1-6101的酵母-MUCl免疫治療組合物的產生。
[0203]在本實驗中，將酵母(釀酒酵母)工程化為在銅可誘導的啟動子CUPl或組成性啟動子TEF2的控制下表達人MUCl抗原，產生酵母-MUCl免疫治療組合物。在每一情況中，包含MUCl抗原的融合蛋白作為單一多肽產生，其具有符合閱讀框地從N至C末端融合的以下序列元件，由SEQ ID N0:15代表:⑴MUC1SEA/ED區段(SEQ ID NO: 15的位置1-59);⑵包含兩個 VNTR 域的 VNTR 區段(SEQ ID NO: 15 的位置 60-100) ; (3)MUClTM 域(SEQ ID NO: 15的位置101-128);和(4)MUClCD (SEQ ID NO: 15的位置129-200)。該融合蛋白還包含MUCl信號序列(SEQ ID N0:14的位置1_30)，其可用不同的N-末端序列取代(該末端序列設計為賦予對蛋白酶體降解的抗性和/或穩定表達)，如由SEQ ID N0:21代表的肽，或來自酵母alpha前導序列的N-末端肽如SEQ ID NO: 19或SEQ ID N0:20。包含N-末端MUCl信號序列和6組氨酸C-末端標簽以協助蛋白質的鑒定和/或純化的完整的融合蛋白是單一多肽，其具有符合閱讀框地從N至C末端融合的以下序列元件，由SEQ ID NO: 14代表= (I)MUCl信號序列(SEQ ID NO: 14 的位置 1-30) ; (2)MUC1SEA/ED 區段(SEQ ID NO: 14 的位置 31-89)；
(3)包含兩個 VNTR 域的 VNTR 區段(SEQ ID NO: 14 的位置 90-130) ; (4)MUClTM 域(SEQ IDNO: 14 的位置 131-158) ; (5)MUClCD(SEQ ID NO: 14 的位置 159-230);和(6)6肽組氨酸標簽(SEQ ID NO: 14 的位置 231-236)。SEQ ID NO: 14 由 SEQ ID NO: 13 代表的核苷酸序列(針對酵母表達優化過密碼子)編碼。
[0204]簡言之，合成編碼MUCl抗原的DNA，然后插入酵母2μπι表達載體中CUPl啟動子(載體pG1-100)或TEF2啟動子(載體pluOll)后的EcoRI和NotI克隆位點處。向質粒載體添加編碼C-末端6組氨酸肽的核苷酸序列以編碼由SEQ ID NO: 14代表的完整融合蛋白。將所得質粒轉化到DH5 α中用于質粒儲存，轉化到釀酒酵母W303 α中用于產生酵母-MUCl免疫治療組合物。
[0205]到釀酒酵母中的轉化通過醋酸鋰/聚乙二醇轉染實施，且在缺少尿嘧啶的固體最小板(UDM ;尿苷缺失培養基)上選擇初始轉染體。通過在30°C在U2 (尿苷缺失培養基)或UL2 (尿苷和亮氨酸缺失培養基)培養基中生長來選擇菌落。
[0206]所述酵母-MUCl免疫治療組合物在本文中亦稱為G1-6101，其包含在TEF2啟動子調控下的編碼由SEQ ID NO: 14代表的人MUCl融合蛋白的多核苷酸。
[0207]將缺少尿苷(U2)或缺少尿苷和亮氨酸(UL2)的液體培養物使用上文描述的板和起始培養物接種，并在30°C、250rpm生長約24h。還將含有4.2g/LBis_Tris的pH緩沖的UL2培養基(BT-UL2)從冷凍酵母庫接種以評估在中性pH生產條件下產生的酵母-MUCl免疫治療物(數據未顯示)。在PH緩沖的UL2培養基中培養暴露酵母細胞壁上的β-葡聚糖且認為改變了酵母誘導的細胞免疫應答，這是改變了與抗原提呈細胞上dectin受體相互作用的結果。其它培養條件不管使用U2、UL2還是BT-UL2均相同。使用原代培養物來接種具有相同配方的最終培養物。
[0208]U2液體培養基的配方:
[0209]15g/L 葡萄糖
[0210]6.7g/L含硫酸銨的酵母氮基 [0211]各0.04g/L的組氨酸、色氨酸、腺嘌呤和0.06g/L亮氨酸
[0212]UL2液體培養基的配方:
[0213]15g/L 葡萄糖
[0214]6.7g/L含硫酸銨的酵母氮基
[0215]各0.04g/L的組氨酸、色氨酸和腺嘌呤
[0216]在比較不同啟動子調控下酵母-MUCl免疫治療組合物的初始實驗中，在2步驟或3步驟培養中產生CUPl驅動的(可誘導的表達)酵母-MUCl表達；在起始或中間培養物達到對數中期(1.5-4Y.U./ml)之后，從中間培養物最終稀釋成0.1或0.T1.U./mL的培養物，通過添加0.375mM硫酸銅來啟動表達并持續直至培養物達到1.5-3Y.U.的密度。TEF2驅動的酵母-MUCl表達是組成性的，且這些細胞的生長持續直至培養物達到1.1至4.0Y.U./ml的密度。然后收獲來自每種培養物的細胞，在PBS中清洗并于56°C加熱殺傷I小時。
[0217]在培養物的加熱殺傷后，將細胞在PBS中清洗3次。通過TCA沉淀/硝化纖維結合測定法和通過使用抗his標簽單克隆抗體和抗MUCl (VNTR)抗體(sc_7313, Santa Cruz)的Western印跡來測量總蛋白質表達。蛋白質含量使用半定量的數字成像方法定量。預期G1-6101將MUCl融合蛋白表達為約25kDa的膜聯合蛋白。
[0218]圖2A顯示G1-6101中MUCl抗原的表達，其使用抗MUCl (VNTR)和抗His抗體來檢測。這些結果顯示MUCl蛋白的較好的表達。圖2B顯示在用EdoH或PNGaseF去糖基化后G1-6101的MUCl抗原。該圖顯示G1-6101融合蛋白表達為糖基化的產物，因為融合蛋白的大小大于在去糖基化之前評估的，但在通過EdoH或PNGaseF去糖基化后減小至預期的大小(25kDa)。[0219]將在標準培養條件下生長的G1-6101中抗原表達的定量與在中性條件下生長的G1-6101相比較，如上文描述的。使用任一過程，抗原表達水平大概相同(數據未顯示)，證明中性PH過程不改變該酵母的MUCl抗原表達的水平。實施例2
[0220]以下實施例描述了稱為G1-6104的酵母-MUCl免疫治療組合物的產生。
[0221]在本實驗中，將酵母(釀酒酵母)工程化為在銅可誘導的啟動子CUPl或組成性啟動子TEF2的控制下表達人MUCl抗原，產生酵母-MUCl免疫治療組合物。在每一情況中，包含MUCl抗原的融合蛋白作為單一多肽產生，其具有符合閱讀框地從N至C末端融合的以下序列元件，由SEQ ID N0:18代表:SEQ ID NO: 18包含以下多種MUCl抗原，其從N至C末端為以下次序:(1) H—MUCI CD (SEQ ID NO: 18 的位置 1-72) ； (2)第二 MUC1CD(SEQ ID NO: 18的位置73-144);和(3)第三MUC1CD(SEQ ID NO: 18的位置145-216)。該融合蛋白還包含設計為賦予對蛋白酶體降解的抗 性和/或穩定表達的N-末端序列(在此融合蛋白中由SEQID N0:21代表)。或者，融合蛋白可設計為使用MUCl信號序列(例如SEQ ID NO: 14的位置1-30)，其為如本文中描述的另一種合成性N-末端肽，或使用來自酵母alpha前導序列的N-末端肽如SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20。包含N-末端肽和6組氨酸C-末端標簽(以協助蛋白質的鑒定和/或純化)的完整的融合蛋白是單一多肽，其具有符合閱讀框地從N至C末端融合的以下序列元件(由SEQ ID NO: 17代表):(I)由SEQ ID NO:21代表的合成肽(SEQ ID NO: 17 的位置 1-6) ； (2)第一 MUC1CD(SEQ ID NO: 17 的位置 7-78) ； (3)第二MUC1CD(SEQ ID NO: 17 的位置 79-150) ； (4)第三 MUC1CD(SEQ ID NO: 17 的位置 151-222)；和(5)6 組氨酸標簽(SEQ ID NO: 17 的位置 223-228)。SEQ ID NO: 17 由 SEQ ID NO: 16 代表的核苷酸序列(針對酵母表達優化過密碼子)編碼。
[0222]簡言之，合成編碼MUCl抗原的DNA，然后插入酵母2μπι表達載體中CUPl啟動子(載體pG1-100)或TEF2啟動子(載體pluOll)后的EcoRI和NotI克隆位點處。向質粒載體添加編碼C-末端6組氨酸肽的核苷酸序列以編碼由SEQID NO: 17代表的完整融合蛋白。將所得質粒轉化到DH5 α中用于質粒儲存，轉化到釀酒酵母W303 α中用于產生酵母-MUCl免疫治療組合物。
[0223]到釀酒酵母中的轉化通過醋酸鋰/聚乙二醇轉染實施，且在缺少尿嘧啶的固體最小板(UDM ;尿苷缺失培養基)上選擇初始轉染體。通過在30°C在U2 (尿苷缺失培養基)或UL2 (尿苷和亮氨酸缺失培養基)培養基中生長來選擇菌落。
[0224]所述酵母-MUCl免疫治療組合物在本文中亦稱為G1-6104，其包含在CUPl啟動子調控下的編碼由SEQ ID NO: 17代表的人MUCl融合蛋白的多核苷酸。
[0225]將缺少尿苷(U2)或缺少尿苷和亮氨酸(UL2)的液體培養物(培養基配方在實施例I中提供)使用上文描述的板和起始培養物接種，并在30°C、250rpm生長約24h。還將含有4.2g/L Bis-Tris的pH緩沖的UL2培養基(BT-UL2)從冷凍酵母庫接種以評估在中性pH生產條件下產生的酵母-MUCl免疫治療物(數據未顯示)。在pH緩沖的UL2培養基中培養暴露了酵母細胞壁上的β_葡聚糖且認為改變了酵母誘導的細胞免疫應答，這是改變了與抗原提呈細胞上dectin受體相互作用的結果。其它培養條件不管使用U2、UL2還是BT-UL2均相同。使用原代培養物來接種具有相同配方的最終培養物。
[0226]在比較不同啟動子調控下的酵母-MUCl免疫治療組合物的初始實驗中，在2步驟或3步驟培養中產生CUPl驅動的(可誘導的表達)酵母-MUCl表達；在起始或中間培養物達到對數中期(1.5-4Y.U./ml)之后，從中間培養物稀釋成0.1或0.2Y.U./mL的最終培養物，通過添加0.375mM硫酸銅來啟動表達并持續直至培養物達到1.5-3Y.U.的密度。CUPl驅動的(可誘導的表達)酵母-MUCl表達也通過在最終酵母-MUCl培養物達到約2Y.U./ml的密度之后添加0.375mM硫酸銅來啟動，并誘導4_6小時。TEF2驅動的酵母-MUCl表達是組成性的，且這些細胞的生長持續直至培養物達到1.1至4.0Y.U./ml的密度。然后收獲來自每種培養物的細胞，在PBS中清洗并于56°C加熱殺傷I小時。
[0227]在培養物的加熱殺傷后，將細胞在PBS中清洗3次。通過TCA沉淀/硝化纖維結合測定法和通過使用抗his標簽單克隆抗體和抗MUCl (C末端)抗體(sc-6827, Santa Cruz)的Western印跡來測量總蛋白質表達。蛋白質含量使用半定量的數字成像方法定量。預期G1-6104將MUCl融合蛋白表達為約25kDa的胞質溶膠蛋白。
[0228]圖2C顯示G1-6104中MUCl抗原的表達，其使用抗MUC1(C末端)和抗His抗體來檢測。這些結果顯示MUCl蛋白的較好的表達。圖2B顯示在用EdoH去糖基化后G1-6104的MUCl抗原。該圖顯示G1-6104融合蛋白不表達為糖基化產物，因為在用EdoH去糖基化之前和之后融合蛋白的大小相同。
[0229]將在標準培養條件下生長的G1-6104中抗原表達的定量與在中性條件下生長的G1-6104相比較，如上文描述的。使用任一過程，抗原表達水平大致相同(數據未顯示)，證明中性PH過程不改變該酵母的MUCl抗原表達的水平。實施例3
[0230]以下實施例描述了稱為G1-6105的酵母-MUCl免疫治療組合物的產生。 [0231]在本實驗中，將酵母(釀酒酵母)工程化為在銅可誘導的啟動子CUPl的控制下表達人MUCl抗原，產生酵母-MUCl免疫治療組合物。使用來自G1-6101的酵母-MUCl免疫治療組合物的抗原(見實施例1)作為模板來設計MUCl激動劑抗原。簡言之，包含MUCl激動劑抗原的融合蛋白作為單一多肽產生，其具有符合閱讀框地從N至C末端融合的以下序列元件，由 SEQ ID NO:23代表:(I)MUCl 信號序列(SEQ ID NO:23 的位置 1-30) ； (2)MUCISEA/ED 區段(SEQ ID NO: 23 的位置 31-89) ； (3)包含兩個 VNTR 域的 VNTR 區段(SEQ ID NO: 23的位置 90-130) ; (4)MUClTM 域(SEQ ID NO: 23 的位置 131-158) ; (5)MUClCD (SEQ ID NO: 23的位置159-230) ； (6)MUCI激動劑表位(SEQ ID NO: 23的位置231-246)和(7) 6肽組氨酸標簽(SEQ ID NO: 23的位置247-252)。SEQ ID NO: 23由SEQ ID NO: 22代表的核苷酸序列(針對酵母表達優化過密碼子)編碼。MUCl信號序列(SEQ ID NO:23的位置1_30)可用設計為賦予對蛋白酶體降解的抗性和/或穩定表達的不同N-末端序列取代，如由SEQ IDNO: 21代表的肽，或來自酵母alpha前導序列的N-末端肽如SEQ ID NO: 19或SEQ ID N0:20。6組氨酸C-末端標簽是任選的，且有助于蛋白質的鑒定和/或純化。與G1-6101中的抗原(例如SEQ ID NO: 14或15)相比，G1-6105中的序列含有以下氨基酸取代以創建多種激動劑表位(取代位置參照SEQ ID N0:23給出，進一步參照由登錄號NP_001191214代表的野生型MUCl中取代的位置):A96Y(野生型MUCl中的位置161)、P97L (野生型MUCl中的位置162)、G104V(野生型MUCl中的位置169)、S105Y (野生型MUCl中的位置170)、T106L (野生型MUCl中的位置171)、A147Y(野生型MUCl中的位置392)、C161V (野生型MUCl中的位置406)、T199L(野生型MUCl中的位置444)、D200F(野生型MUCl中的位置445)、S215Y (野生型MUCl中的位置460)和T239L(野生型MUCl中的位置93)。
[0232]將含有G1-6105的MUCl激動劑抗原(SEQ ID NO: 23)的質粒轉染到W303 α酵母中，并在尿苷缺失瓊脂(UDA)上于30°C生長3天后選擇轉化體。將單一菌落重劃線到尿苷和亮氨酸缺失瓊脂(ULDA)板上，并在30°C再溫育4天來選擇具有增加的質粒拷貝數的細胞。
[0233]從ULDA板取出G1-6105的單個菌落并用于接種25mL的UL2液體培養基(起始培養物)。將起始培養物在30°C伴隨搖動溫育至3.7YU/mL的密度，然后用于接種中間培養物至0.3YU/mL。中間培養物生長至3.0YU/mL的密度，然后用于接種最終培養物至密度為
0.04YU/mL。將最終培養物生長至3.6YU/mL的密度，然后用0.5mM硫酸銅在30°C處理3h以誘導Mucl激動劑vl.0抗原表達。
[0234]將誘導的細胞用PBS清洗I次，在56°C加熱殺傷lh，然后在PBS中清洗3次。通過Amidoschwarz測定法測量熱殺傷細胞的總蛋白質含量,并通過western印跡測量抗原含量，其使用識別C-末端6組氨酸表位標簽的單克隆抗體。通過對由帶his標簽的HCVNS3蛋白構成的標準曲線內插來測定抗原量。如圖3中顯示的，酵母表達該抗原，且經評估G1-6105的抗原含量為約2801Ng/YU。
[0235]實施例4
[0236]以下實施例描述了稱為G1-6106的酵母-MUCl激動劑免疫治療組合物的產生。
[0237]在本實驗中，將酵母(釀酒酵母)工程化為在銅可誘導的啟動子CUPl的控制下表達人MUCl激動劑抗原，產生酵母-MUCl激動劑免疫治療組合物。使用具有登錄號NP_001191214的全長野生型MUCl抗原來設計MUCl激動劑抗原，盡管也可利用其他野生型MUCl蛋白來設計類似的激動劑。簡言之，包含MUCl激動劑抗原的融合蛋白作為單一多肽產生，其具有符合閱讀框 地從N至C末端融合的以下序列元件，由SEQ ID NO: 25代表:(I)本文中別處通過SEQ ID NO: 19公開的alpha因子前導序列(SEQ ID N0:25的位置1_89)；
(2)Thr-Ser的接頭序列(SEQ ID NO:25的位置90-91) ； (3)除了引入11個激動劑表位以外對應于野生型蛋白質的全長MUCl激動劑蛋白質(SEQ ID NO:25的位置92-566)和(7)6肽組氨酸標簽(SEQ ID NO:25 的位置 567-572)。SEQ ID N0:25 由 SEQ ID N0:24 代表的核苷酸序列(針對酵母表達優化過密碼子)編碼。alpha前導序列(SEQ ID NO: 25的位置1-89)可用設計為賦予對蛋白酶體降解的抗性和/或穩定表達的不同N-末端序列取代，如由SEQ ID NO: 21，或來自不同酵母alpha前導序列的N末端肽如SEQ ID NO: 20，或MUCl信號序列代表的肽。6組氨酸C-末端標簽是任選的，且有助于蛋白質的鑒定和/或純化。與用作模板的野生型MUCl蛋白相比，G1-6106中的序列含有以下氨基酸取代以創建多種激動劑表位(取代位置參照SEQ ID N0:25給出，進一步參照由登錄號NP_001191214代表的野生型MUCl中取代的位置):T184L(野生型MUCl中的位置93)、A232Y (野生型MUCl中的位置161)、P233L(野生型MUCl中的位置162)、G240V (野生型MUCl中的位置169)、S241Y (野生型MUCl中的位置170)、T242L(野生型MUCl中的位置171)、A483Y (野生型MUCl中的位置392)、C497V(野生型MUCl中的位置406)、T535L(野生型MUCl中的位置444)、D536F (野生型MUCl中的位置445)和S551Y(野生型MUCl中的位置460)。
[0238]將含有G1-6106的MUCl激動劑抗原的質粒轉染到W303 α酵母中，并在尿苷缺失瓊脂(UDA)上于30°C生長3天后選擇轉化體。將單一菌落重劃線到尿苷和亮氨酸缺失瓊脂(ULDA)板上，并在30°C再溫育4天來選擇具有增加的質粒拷貝數的細胞。
[0239]從ULDA板取出G1-6106的單個菌落并用于接種25mL的UL2液體培養基(起始培養物)。將起始培養物在30°C伴隨搖動溫育至~3YU/mL的密度，然后用于接種中間培養物至0.3YU/mL。中間培養物生長至3YU/mL的密度，然后用于接種最終培養物至0.04YU/mL的密度。將最終培養物生長至3YU/mL的密度，然后用0.5mM硫酸銅在30°C處理3h以誘導Mucl激動劑v2.0抗原表達。
[0240]將誘導的細胞用PBS清洗I次，在56°C加熱殺傷lh，然后在PBS中清洗3次。通過Amidoschwarz測定法測量熱殺傷細胞的總蛋白質含量,并通過western印跡測量激動劑抗原含量，其使用識別C-末端6組氨酸表位標簽的單克隆抗體。通過對由帶his標簽的HCVNS3蛋白構成的標準曲線內插來測定抗原量。結果顯示，G1-6106酵母表達抗原(數據未顯示)；經評估G1-6106的抗原含量為約2940Ng/YU。
[0241]實施例5
[0242]以下實施例描述了酵母-MUCl免疫治療組合物對人樹突細胞影響的表型和功能分析。
[0243]為了評估實施例1和2中描述的酵母-MUCl免疫治療組合物對樹突細胞表型和功能的影響，實施以下實驗。
[0244]在第一項實驗中，將人樹突細胞(DC)與以下培養48小時:(I)僅培養基(未處理)，(2)CD40L(lμg/ml)加上配體的增強劑(I μ g/ml)作為陽性對照；(3)對照酵母(對照酵母；包含空載體(無MUCl抗原插入)的酵母);(4)稱為G1-6101的酵母-MUCl免疫治療組合物，在如實施例1中描述的標準生長條件下生長(G1-6101) ；(5)稱為G1-6101的酵母-MUCl免 疫治療組合物，在如實施例1中描述的中性pH生長條件下生長(G1-6101(DEC)) ；(6)稱為G1-6104 (G1-6104)的酵母-MUCl免疫治療組合物，在如實施例2中描述的標準生長條件下生長；或(7)稱為G1-6104的酵母-MUCl免疫治療組合物，在如實施例2中描述的中性pH生長條件下生長(G1-6104(DEC))。樹突細胞和酵母以1:10 (DC:酵母)的比率混合。收獲DC并通過流式細胞術分析DC表面標志物表達。結果在下表1中顯示為陽性細胞的百分比和MFI (括號)。
[0245]表1
[0246]
【權利要求】
1.一種酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述免疫治療組合物包含: a)—種酵母媒介物；和 b)由所述酵母媒介物表達且包含至少一種MUCl抗原的融合蛋白，其中所述MUCl抗原從N至C末端的次序組成為:MUC1SEA/胞外域(ED)，其中所述MUC1SEA/ED域包含MUC1ED，該MUClED在N末端側翼為來自MUC1SEA域非ED部分的一個或多個氨基酸；至少兩個可變數目的串聯重復(VNTR)域；MUC1跨膜(TM)域；和MUCl細胞質域(⑶)。
2.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述抗原包含兩個VNTR域。
3.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl抗原具有與SEQID NO: 15至少95%相同的氨基酸序列。
4.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUClED具有與選自下組的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列:SEQ ID N0:15的位置2-59 ;SEQ ID NO: 14的位置32-89 ;SEQ ID NO:2 的位置 116-173 ;SEQ ID NO:4 的位置 107-164 ;SEQ ID NO:6 的位置107-164 ；SEQ ID NO:8 的位置98-155 ;SEQ ID NO: 11 的位置 1098-1155 ;和來自不同人MUCl蛋白的相應序列。
5.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUClED具有與SEQID NO: 15的位置2-59或SEQ ID NO: 14的位置32-89至少95%相同的氨基酸序列。
6.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUClED具有SEQID NO: 15位置2-59或SEQ ID NO: 14位置32-89的氨基酸序列。
7.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUC1SEA/ED具有與選自下組的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:15的位置1-59 ;SEQ ID NO: 14的位置 31-89 ；SEQ ID NO:2 的位置 115-173 ；SEQ ID NO:4 的位置 106-164 ；SEQ ID NO:6 的位置 106-164 ；SEQ ID NO:8 的位置 97-155 ；SEQ ID NO: 11 的位置 1097-1155 ;和來自不同人MUCl蛋白的相應序列。
8.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUC1SEA/ED具有SEQID NO: 15位置1-59或SEQ ID NO: 14位置31-89的氨基酸序列。
9.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述VNTR域具有與以下序列至少95%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 15位置60至100之間的任何連續的20個氨基酸；SEQID NO: 14位置90至130之間的任何連續的20個氨基酸；SEQ ID NO: 11的位置126-145 ；SEQ ID NO: 11位置61至1020之間的任何連續的20個氨基酸；SEQ ID NO: 11位置126至965之間的任何連續的20個氨基酸；SEQ ID NO: 12 ;和來自不同人MUCl蛋白的相應序列。
10.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述VNTR域具有與以下序列至少95%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 15位置60至100之間的任何連續的20個氨基酸或SEQID NO: 14位置90至130之間的任何連續的20個氨基酸。
11.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述融合蛋白具有兩個VNTR域，而且其中所述兩個VNTR域的氨基酸序列是SEQ ID NO: 15的位置60至100或SEQ ID NO: 14的位置90至130。
12.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUClTM域具有與選自下組的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO: 15的位置101-128、SEQ ID NO: 14的位置 131-158、SEQ ID NO:2 的位置 174_201、SEQ ID NO:4 的位置 165_192、SEQ ID NO:6 的位置 165-192,SEQ ID NO:8 的位置 156-183,SEQ ID NO: 11 的位置 1156-1183、和來自不同人MUCl蛋白的相應序列。
13.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUClTM域具有與SEQIDNO: 15的位置101-128或SEQ ID NO: 14的位置131-158至少95%相同的氨基酸序列。
14.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUClTM域具有SEQID NO: 15位置101-128或SEQ ID NO: 14位置131-158的氨基酸序列。
15.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl⑶域具有與選自下組的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列:SEQ ID N0:15的位置129-200、SEQ ID NO: 14的位置 159-230、SEQ ID NO:2 的位置 202_273、SEQ ID NO:4 的位置 193_264、SEQ ID NO:6 的位置 193-264,SEQ ID NO:8 的位置 184-255,SEQ ID NO: 11 的位置 1184-1255,SEQ ID NO: 17的位置 7-78、SEQ ID NO: 17 的位置 79-150、SEQ ID NO: 17 的位置 151-222、SEQ ID NO: 18的位置1-72、SEQ ID NO: 18的位置73-144、SEQ ID NO: 18的位置145-216、和來自不同人MUCl蛋白的相應序列。
16.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl⑶域具有與SEQIDNO: 15位置129-200或SEQ ID NO: 14位置159-230的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
17.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl⑶域具有SEQID NO: 15的位置129-200或SEQ ID NO: 14的位置159-230的氨基酸序列。
18.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl抗原包含SEQID NO: 15或與SEQ ID NO: 15至少99%相同的氨基酸序列。
19.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl抗原具有SEQID NO: 15的氨基酸序列。
20.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述融合蛋白還包含附接于MUC1SEA/ED N末端的MUCl信號序列。
21.權利要求20的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl信號序列具有與選自下組的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:2的位置1-27、SEQ ID N0:4的位置 1-32、SEQ ID NO:6 的位置 1-32、SEQ ID NO:8 的位置 1-27、SEQ ID NO: 11 的位置 1-23、SEQ ID N0:14的位置1_30、和來自不同人MUCl蛋白的相應序列。
22.權利要求20的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl信號序列具有與SEQIDNO: 14位置1-30的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
23.權利要求20的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl信號序列具有SEQIDNO: 14位置1-30的氨基酸序列。
24.權利要求1至23中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述融合蛋白具有與SEQ ID NO: 14至少95%相同的氨基酸序列。
25.權利要求1至23中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO: 14或與SEQ ID NO: 14至少99%相同的氨基酸序列。
26.權利要求1至23中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。
27.權利要求1的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl抗原包含I至11個氨基酸取代以創建MUCl激動劑抗原。
28.權利要求27的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中對于SEQID N0:23而言所述氨基酸取代選自以下:A96Y、P97L、G104V、S105Y、T106L、A147Y、C161V、T199L、D200F、S215Y 和T239L。
29.權利要求27的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl激動劑抗原包含與SEQID NO: 23至少95%相同的氨基酸序列。
30.權利要求27的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl激動劑抗原包含SEQIDNO: 23或與SEQ ID NO: 23至少99%相同的氨基酸序列。
31.一種酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述免疫治療組合物包含: a)—種酵母媒介物；和 b)由所述酵母媒介物表達且包含至少一種MUCl激動劑抗原的融合蛋白，其中所述MUCl激動劑抗原包含與SEQ ID NO: 25至少95%相同的氨基酸序列。
32.權利要求31的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl激動劑抗原包含與SEQID NO:25至少99%相同的氨基酸序列。
33.權利要求31的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl激動劑抗原包含SEQIDNO:25的氨基酸序列。
34.一種酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述免疫治療組合物包含: a)—種酵母媒介物；和 b)由所述酵母媒介物表達且包含至少一種MUCl抗原的融合蛋白，其中所述MUCl抗原由MUCl的兩個或更多個細胞質域(⑶)組成。
35.權利要求34的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl抗原由MUCl的3個細胞質域(⑶)組成。
36.權利要求34的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述3個CD來自相同的MUCl蛋白。
37.權利要求34的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述每個⑶域包含與選自下組的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:18的位置1-72、SEQ ID NO: 18的位置73-144、SEQ ID NO: 18 的位置 145-216、SEQ ID NO: 17 的位置 7-78, SEQ ID NO: 17 的位置79-150,SEQ ID NO: 17 的位置 151_222、SEQ ID NO:2 的位置 202_273、SEQ ID NO:4 的位置193-264、SEQ ID NO:6 的位置 193-264、SEQ ID NO:8 的位置 184-255、SEQ ID NO: 11 的位置 1184-1255、SEQ ID NO: 14 的位置 159-230、SEQ ID NO: 15 的位置 129-200、和來自不同人MUCl蛋白的相應序列。
38.權利要求34的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述每個⑶域包含與選自下組的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列:SEQ ID NO:18的位置1-72、SEQ ID NO: 18的位置 73-144 和 SEQ ID NO: 18 的位置 145-216、SEQ ID NO: 17 的位置 7-78, SEQ ID NO: 17 的位置 79-150、SEQ ID NO: 17 的位置 151-222 和 SEQ ID NO: 15 的位置 129-200。
39.權利要求34至38中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl抗原具有與SEQ ID NO: 18至少95%相同的氨基酸序列。
40.權利要求34至38中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl抗原具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 18至少99%相同的氨基酸序列。
41.權利要求34至38中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl抗原具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。
42.權利要求34至41中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述融合蛋白具有與SEQ ID NO: 17至少95%相同的氨基酸序列。
43.權利要求34至41中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 17至少99%相同的氨基酸序列。
44.權利要求34至41中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。
45.權利要求1至44中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述酵母媒介物是整個酵母。
46.權利要求1至44中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述酵母媒介物經過加熱失活。
47.權利要求1至44中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述酵母媒介物來自突變的酵母菌株，其相比于野生型酵母菌株產生低糖基化的蛋白質。
48.權利要求1至44中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl抗原在所述酵母媒介物的細胞壁上表達。
49.權利要求1至44中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述MUCl抗原在所述酵母媒介物的周質或細 胞質中表達。
50.權利要求1至49中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述酵母媒介物來自酵母屬(Saccharomyces)。
51.權利要求中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物I至49，其中所述酵母媒介物來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
52.權利要求1至51中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中通過在維持于pH水平5.5至8的培養基中培養能表達所述MUCl抗原的整個酵母，來產生所述免疫治療組合物。
53.權利要求52的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中所述培養基用緩沖劑緩沖。
54.權利要求52的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中在維持于pH水平6至8的培養基中培養所述酵母。
55.權利要求1至54中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其還包含至少一種生物反應修飾劑。
56.權利要求1至54中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其還包含藥學可接受的賦形劑。
57.權利要求1至56中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物，其中已配制所述免疫治療組合物用于注射。
58.一種減少腫瘤負荷、抑制腫瘤生長和/或增加患有表達MUCl的癌癥的個體存活的方法,包括對所述個體施用權利要求1至57中任一項的免疫治療組合物。
59.權利要求58的方法，其中在首次施用所述組合物時在所述個體的癌癥中檢測到MUCl表達。
60.權利要求58的方法，其中所述個體患有I期癌癥。
61.權利要求58的方法，其中所述個體患有II期癌癥。
62.權利要求58的方法，其中所述個體患有III期癌癥。
63.權利要求58的方法，其中所述個體患有IV期癌癥。
64.權利要求58至63中任一項的方法，其中所述個體正接受或已接受針對癌癥的另一種療法治療。
65.權利要求64的方法，其中所述療法是化療。
66.權利要求64的方法，其中所述療法是靶向性癌癥療法。
67.權利要求64的方法，其中所述療法是放射療法。
68.權利要求64的方法，其中所述療法是過繼性T細胞轉移。
69.權利要求64的方法，其中所述療法是施用一種或多種另外的免疫治療組合物。
70.權利要求69的方法，其中所述另外的免疫治療組合物包含第二癌抗原，該第二癌抗原是MUCl抗原或不是MUCl抗原。
71.權利要求69的方法，其中所述另外的免疫治療組合物包含酵母媒介物和不包括MUCl抗原在內的第二癌抗原。
72.權利要求70或71的方法，其中所述第二癌抗原選自下組:突變的Ras、癌胚抗原(CEA)、短尾畸形蛋白、EGFR、BCR-Abl、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2、PSMA、酪氨酸酶、TRP-1 (gp75)、NY-ESO-U TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、腺瘤性結腸息肉病(APC)、Myc, von Hippel-Lindau 蛋白(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受體(AR)、Smad4、MDRl、Flt_3、BRCA-1、BRCA-2、pax3_fkhr、ews-fl1-1、HERV-H、HERV-K, TWIST、間皮素和 NGEP。
73.權利要求70或71的方法，其中所述第二癌抗原選自下組:突變的Ras、癌胚抗原(CEA)和短尾畸形蛋白。
74.權利要求69的方法，其中所述另外的免疫治療組合物是病毒載體疫苗。
75.權利要求69的方法，其中所述另外的免疫治療組合物是樹突細胞/腫瘤細胞融合物。
76.權利要求58至75中任一項的方法，其中所述方法還包括從所述個體經手術切除腫瘤。
77.一種預防或延遲表達MUCl的癌癥發生的方法，包括對個體施用權利要求1至57中任一項的免疫治療組合物。
78.權利要求77的方法，其中尚未在個體中檢測到所述癌癥。
79.權利要求78的方法，其中所述個體有形成癌癥的高風險。
80.權利要求77的方法，其中所述個體具有癌前期損傷。
81.權利要求77的方法，其中所述個體患有癌癥，但在所述癌癥中尚未檢測到表達MUCl的癌細胞。
82.權利要求58至81中任一項的方法，其中所述癌癥具有上皮細胞起源。
83.權利要求58至81中任一項的方法，其中所述癌癥選自下組:乳腺癌、小腸癌、胃癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、黑素瘤、多髓細胞性白血病(MML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性髓細胞樣白血病(AML)、伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin，s lymphoma)、分泌組織的癌癥、及其轉移性癌。
84.權利要求77至81中任一項的方法，其中所述癌癥選自下組:乳腺癌和結腸癌。
85.權利要求58至75中任一項的方法，其中所述癌癥選自下組:乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌和AML。
86.權利要求58至75中任一項的方法，其中所述癌癥是AML，且其中對骨髓移植(BMT)療法的供體和受體兩者施用所述酵母-MUCl免疫治療組合物。
87.權利要求58至75中任一項的方法，其中所述癌癥是AML，且其中對所述個體施用所述酵母-MUCl免疫治療組合物連同阿糖胞苷和蒽環類抗生素療法。
88.權利要求1至57中任一項的酵母-MUCl免疫治療組合物治療疾病的用途。
89.權利要求88的用途,其中所述疾病是癌癥。
90.權利要求1至57中任一項的免疫治療組合物在患有癌癥的個體中減少、停滯、逆轉或預防癌癥的轉移性進展的用途。
91.權利要求1至57中任一項的免疫治療組合物預防或延遲表達MUCl的癌癥發生的用途。
92.多種免疫治療組合物的組合在治療癌癥中的用途,所述免疫治療組合物包含: a)依照權利要求1至57中任一項的第一免疫治療組合物；和 b)至少一種另外的免疫治療組合物，其包含酵母媒介物和并非MUCl抗原的抗原。
93.權利要求92的用途，其中所述并非MUCl抗原的抗原選自突變的Ras、癌胚抗原(CEA)、和/或短尾畸形蛋白。
【文檔編號】A61P35/00GK104024429SQ201280051154
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年8月17日 優先權日:2011年8月17日
【發明者】A.弗蘭祖索夫, 郭志敏, J.施洛姆, K-Y.桑 申請人:全球免疫股份有限公司, 美利堅合眾國, 由健康及人類服務部部長代表