光敏抗體-熒光團綴合物的制作方法

光敏抗體-熒光團綴合物的制作方法
【專利摘要】本公開涉及殺死細胞的組合物和方法。在具體實例中，所述方法包括使具有細胞表面蛋白的細胞與治療有效量的抗體-IR700分子接觸，其中所述抗體特異性結合所述細胞表面蛋白，例如腫瘤細胞表面上的腫瘤特異性抗原。隨后照射所述細胞，例如在660-740nm的波長下劑量為至少1Jcm-2。在照射所述細胞之后例如約0-8小時，還使所述細胞與一種或多種治療劑（例如抗癌劑）接觸，從而殺死所述細胞。還提供了使用熒光壽命成像對細胞殺死進行實時成像的方法。還提供了可與本公開的方法一起使用的可穿戴裝置，其包括衣服、珠寶或覆蓋物；和被納入到所述物品中的NIR?LED。
【專利說明】光敏抗體-熒光團綴合物
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請是2011年7月11日提交的美國申請N0.13/180，111的部分繼續申請，其要求2010年7月9日提交的美國臨時申請N0.61/363，079的優先權，兩者均以引用的方式納入本文。
【技術領域】
[0003]本申請涉及抗體-1R700綴合物以及用紅外(NIR)光照射后使用抗體-1R700綴合物殺死與所述抗體特異性結合的細胞的方法。還提供了也可與本公開的綴合物和方法一起使用的納入NIR發光二極管(LED)的裝置。
【背景技術】
[0004]2007年，約13%的所有人類死亡是由癌癥引起的。雖然有一些針對癌癥的療法，但是仍然需要有效殺死腫瘤細胞同時不損傷非癌細胞的療法。
[0005]為了使常規癌癥療法一包括外科手術、輻射和化學療法一的副作用最小，已經開發了分子靶向的癌癥療法。在現有的靶向療法中，單克隆抗體(MAb)療法歷史最悠久，到目前為止，美國食品和藥物管理局(FDA)已經批準了超過 25 種治療性的 MAb (ffaldmann, Nat Med9:269-277，2003) ;Reichert et al., NatBiotechnol23:1073-1078, 2005)。有效的MAb療法傳統上依賴于三種機制:抗體依賴的細胞的細胞毒性(ADCC)、補體依賴的細胞毒性(CDC)和受體封閉，并且需要多個高劑量的所述MAb。還已經將MAb作為載體以較低的劑量使用以遞送治療物例如放射性核素(Goldenberg et al., J Clin 0ncol24,` 823-834，2006)或化學毒素或生物毒素(Pastan etal., Nat Rev Cancer6:559-565，2006)。然而，劑量限制性毒性最終與抗體綴合物的生物分布和分解代謝有關。
[0006]結合光增敏劑與非電離光的物理能來殺死細胞的常規光動力學療法(PDT)，已經不常用作癌癥療法，因為目前的非靶向光敏劑也會被正常組織吸收，從而引起嚴重的副作用，雖然激發光本身在近紅外線(NIR)的范圍內是無害的(圖9)。

【發明內容】

[0007]本文提供了抗體-1R700分子和用其殺死靶細胞例如腫瘤細胞的方法。在具體的實例中，所述方法的特點在于，不會以顯著的數量殺死非靶細胞例如正常細胞(例如，殺死少于1%的正常細胞)，而以顯著的數量殺死靶細胞。在具體實例中，所述方法包括使具有細胞表面蛋白的細胞與治療有效量的抗體-1R700分子接觸，其中所述抗體(或其他特異性的結合劑)特異性結合所述細胞表面蛋白。抗體-1R700分子的具體非限制性實例包括帕尼單抗(Panitumumab)_IR700、曲妥單抗(Trastuzumab)_IR700 和 HuJ591_IR700。在 660_740nm例如660-710nm (例如680nm)的波光下以至少IJ cm—2 (例如至少50J cm—2)的劑量照射所述細胞。所述方法還包括在照射所述細胞后例如約8小時內，使所述細胞與一種或多種治療劑(例如抗癌劑)接觸，從而殺死所述細胞。這種方法還可包括在照射所述細胞后例如約0-48小時，用熒光壽命成像(FLT)檢測所述細胞，從而容許實時檢測細胞殺死。
[0008]還提供了實時檢測細胞殺死的方法。這種方法可包括使含細胞表面蛋白的細胞與治療有效量的一種或多種如上所述的抗體-1R700分子接觸，在660-740nm的波長下以至少30J cm—2的劑量(例如足以使IR700FLT縮短至少25%的劑量，例如30-50J cm—2)照射所述細胞，并在照射所述細胞后約0-48小時(例如至少6小時)，用熒光壽命成像檢測所述細胞，從而實時檢測所述細胞殺死。
[0009]可以用本公開的抗體-1R700分子和方法殺死任何靶細胞(并且在一些實例中進行實時檢測)，例如通過使用一種或多種與靶細胞表面上一種或多種蛋白(例如受體)結合的抗體，其中所述靶細胞表面上的一種或多種蛋白不會大量地存在于非靶細胞(例如正常的健康細胞)上，因此所述抗體不會與所述非靶細胞大量結合。在一個實例中，所述細胞表面蛋白是腫瘤特異性蛋白，例如HER1、HER2或PSMA。
[0010]在一些實例中，待殺死的所述細胞存在于受試者中。在這類實例中，所述方法可包括給予所述受試者治療有效量的所述抗體-1R700分子并照射所述受試者，例如照射所述受試者的腫瘤。在一些實例中，所述方法還可包括選擇具有表達可特異性結合所述抗體-1R700分子的細胞表面蛋白的腫瘤的受試者。
[0011]還提供了裝置，例如可被患者穿戴的那些。這類裝置可包括衣服、珠寶或覆蓋物和被納入到所述衣服、珠寶或覆蓋物中的近紅外(NIR)發光二極管(LED)。這類裝置還可包括動力源和/或冷卻源。這使得所述患者長時間穿戴所述裝置(或被所述裝置覆蓋)，從而容許治療存在于血液或循環系統中的腫瘤細胞。還提供了使用所述裝置的方法。
[0012]從以下參照附圖進行的對若干實施方案的詳細描述中，本公開的上述和其他特征會變得更加清楚。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1a的數字圖像示出了用曲妥單抗-1R700綴合物(Tra_IR700)標記細胞，在4°C持續I小時或在37°C持續6小時。還示出了光圖像。比例尺，30 μ m。
[0014]圖1b的數字圖像示出了孵育后6小時Tra-1R700的溶酶體定位。比例尺，50 μ m。
[0015]圖1c的數字圖像示出了用Tra_IR700在37°C孵育6小時然后進行光免疫療法(PIT)，在這之前和之后的數字圖像。比例尺，50 μ m。
[0016]圖1d的柱狀圖示出了響應Tra-1R700介導的PIT的照射劑量依賴性和靶特異性的細胞死亡。數據是均值 土平均數標準差(η=至少4，* * *相對于無處理對照Ρ〈0.001，Student’ s t 檢驗)。
[0017]圖1e的柱狀圖示出了響應Tra-1R700介導的PIT的長期生長抑制。數據是均值土平均數標準差(n=3，* *相對于無處理對照P〈0.01，Student’ s t檢驗)。
[0018]圖1f的數字圖像示出了響應TraIR700介導的PIT的生長抑制的顯微鏡觀察結果。比例尺，100 μ m。
[0019]圖1g的柱狀圖示出了光毒性細胞死亡不需要Tra-1R700的內化。數據是均值土平均數標準差(n=3)。
[0020]圖1h的柱狀圖示出了 Tra-1R700的靶特異性膜結合僅誘導光毒性細胞死亡。數據是均值土平均數標準差(n=3)。
[0021]圖1i示出了用Tra-1R700介導的PIT時陰性表達HER2的A431細胞未顯示出光毒性效應(n=3)。
[0022]圖1j的柱狀圖示出了疊氮化鈉(NaN3)濃度依賴性抑制Tra-1R700介導的PIT誘導的光毒性細胞死亡。數據是均值土平均數標準差(n=3，相對于無NaN3的2.0J cm_2PIT處理的對照，* * * P<0.001, * * Ρ〈0.01, Student’s t 檢驗)。DIC:微分干涉相差。PanIR:Pan_lR700o
[0023]圖2a的曲線圖示出了在用Tra-lR700(Tra_IR)處理并暴露于光的Balb/3T3(HER2陰性)細胞中沒有觀察到長期生長抑制。數據是均值土平均數標準差(n=3)。
[0024]圖2b的數字圖像示出了游離的IR700染料不會納入到3T3/HER2細胞中。在不洗滌所述細胞的情況下拍攝熒光圖像。細胞比含游離IR700染料的培養基更暗。比例尺，50 μ m0
[0025]圖2c的曲線圖示出了過量的未綴合的曲妥單抗(Tra)劑量依賴性地阻斷TraIR700介導的光毒性。數據是均值土平均數標準差(n=3)。
[0026]圖2d的曲線圖示出了未綴合的曲妥單抗以劑量依賴的方式阻斷Tra-1R700結合3T3/HER2細胞(n=3)。DIC:微分干涉相差。
[0027]圖3a的數字圖像示出了誘導靶特異性光免疫療法(PIT)導致HER2表達細胞特異性的壞死性細胞死亡。比例尺，50 μ m。
[0028]圖3b的數字圖像示出了用LIVE/DEAD綠染色進行的熒光顯微術證實了 HER2特異性細胞死亡。比例尺，100 μ m。
[0029]圖3c的圖表示出了用于檢測由Tra-1R700(TraIR)介導的PIT誘導的HER2特異性細胞死亡的流式細胞檢測分析。左上象限:TraIR700陽性、活細胞；右上象限:Tra_lR700陽性、死細胞；左下象限:Tra-lR700陰性、活細胞；右下象限:Tra_lR700陰性、死細胞(n=3)。DIC:微分干涉相差。
[0030]圖4a的數字圖像示出了 Tra-1R700的生物分布。早在注射Tra_IR700 (300 μ g)一天后，用IR700熒光使3T3/HER2腫瘤(背部兩側)可見。在第I天用近紅外(NIR)光照射所述腫瘤的右側，同時，用黑帶覆蓋腫瘤的左側。在第7天確認腫瘤縮小。虛線:被照射的腫瘤；實線:未被照射的腫瘤。除了由于未結合的染料的排泄而在第一天膀胱累積IR700外，1R700沒有其他特異性的定位。
[0031]圖4b的曲線圖示出了體內給予Tra_IR700或僅給予載體然后進行PIT(50J cm_2)之后的平均腫瘤體積。數據是均值土平均數標準差(每組至少n=12只小鼠，相對于無處理對照，* * * P〈0.001, 〃P〈0.01,具有事后檢驗的Kruskal一Wallis檢驗)。Tra:曲妥單抗。
[0032]圖5a的數字圖像示出了進行Pan-1R700介導的PIT之前和之后的顯微鏡觀察結果。比例尺，50um。
[0033]圖5b示出了響應Pan-1R700 (PanIR)介導的PIT的照射劑量依賴性和靶特異性的細胞死亡。數據是均值土平均數標準差(η=至少4，相對于無處理對照，~k ~k ~k P〈0.001，Student’ s t 檢驗)。
[0034]圖5d的數字圖像示出了 Pan-1R700介導的PIT誘導了表達EGFR的細胞特異性的壞死性細胞死亡。比例尺，50 μ m。DIC:微分干涉相差。[0035]圖6a的數字圖像示出了在之前給予了 A431細胞的小鼠中帕尼單抗-1R700綴合物(Pan-1R700)的特異性定位。早在Pan_lR700 (50 μ g)注射后I天，HERl陽性A431腫瘤(左背部)選擇性地可見。HERl陰性3T3/HER2腫瘤(右背部)沒有顯示出可檢測到的熒光(n=5只小鼠)。
[0036]圖6b的曲線圖示出了在注射兩種不同劑量(50μ g和300μ g)的Pan_IR700后，隨著時間的推移A431腫瘤中的IR700信號強度。數據是均值土平均數標準差(η=每組4只小鼠)。
[0037]圖6c的曲線圖示出了在注射兩種不同劑量的(50 μ g和300 μ g)的Pan_IR700后，隨著時間的推移A431腫瘤中IR700熒光強度的腫瘤/背景比率。數據是均值土平均數標準差(η=每組4只小鼠)。
[0038]圖6d的數字圖像示出了 Pan-1R700的生物分布。早在Pan_lR700 (300 μ g)注射后I天，用IR700熒光使A431腫瘤(兩側背部)選擇性地可見。在第I天用近紅外(NIR)光照射所述腫瘤的右側，同時用黑帶覆蓋所述腫瘤的左側。在第7天證實了腫瘤縮小。虛線:經照射的腫瘤，實線:未經照射的腫瘤。
[0039]圖6e的曲線圖示出了體內給予Pan_IR700或僅給予載體然后進行PIT(30J cm_2)之后的平均腫瘤體積。Pan-1R700注射后第I天(在腫瘤接種后第5天)進行PIT。數據是均值土平均數標準差(每組至少n=12只小鼠，相對其他對照組，* * * P〈0.001，具有事后檢驗的 Kruskal—Wallis 檢驗)。
[0040]圖6f的曲線圖示出了體內給予Pan_IR700或僅給予載體然后進行PIT(30J cm—2)之后的存活率(每組至少n=12只小鼠,相對其他對照組，-k -k -k P<0.001,具有Bonferroni多重校正的時序檢驗)。
[0041]圖6g的數字圖像示出了用PIT處理(右側)和未處理(左側)腫瘤后4天，蘇木精和伊紅染色的組織學圖像(X40和X200)。n=5只小鼠；比例尺，lOOum。Pan:帕尼單抗。
[0042]圖6h示出了高劑量給予Pan-1R700在體內導致Pan-1R700介導的PIT對A431腫瘤的抗腫瘤效能更高。觀察到，由Pan-1R700介導的PIT引起的腫瘤生長抑制是Pan_lR700劑量依賴性的。數據是均值土平均數標準差(每組至少n=12只小鼠)。
[0043]圖1的數字圖像示出了 J591-1R700的生物分布。在J591-1R700 (ΙΟΟμ g)注射后，用IR700熒光使PC3-PIP腫瘤選擇地可見。在第4、12和13天用近紅外(NIR)光照射所述腫瘤的右側，同時用黑帶覆蓋所述腫瘤的左側。在第5天證實了腫瘤縮小。
[0044]圖8的數字圖像示出了在Tra-1R700 (用于HER2+細胞)，Pan_lR700 (用于HERl+細胞)和huJ591-lR700 (用于PSMA+細胞)的存在下，各種細胞PIT之前和之后的顯微鏡觀察結果。比例尺，50 μ m。DIC:微分干涉相差。
[0045]圖9a的示意圖示出的圖解用于解釋在用其他采用電磁波照射的物理癌癥療法的情況下使用PIT的選擇性癌癥療法。雖然其他物理癌癥療法在正常組織中誘導不同類型的損傷，但是PIT專門損傷癌細胞而不損傷正常細胞或組織。
[0046]圖9b的示意圖示出了 用于解釋PIT的光物理學、化學和生物學基礎的圖解。采用人源化抗體作為遞送載體，因為人源化抗體在臨床可用的靶向試劑中結合特異性最高、體內靶向遞送能力最強、免疫原性低。采用了親水性的酞菁作為可激活的細胞毒性“納米-炸藥”試劑，因為對700nm的近紅外光的吸收強且僅在與細胞膜結合時誘導強的細胞毒性。采用700nm的近紅外光作為引發劑用于激活細胞毒性，因為在無害的非電離光子中其能量高并且體內組織透過力強。
[0047]圖10A-D。濃度為 2.5、5、20 和 40jag/mL 的 1R700 綴合的帕尼單抗(Pan_lR700)的樣品用PBS稀釋制備。(A)Pan-1R700溶液的熒光強度圖像:熒光強度隨著Pan_lR700濃度的減小而降低。(B)Pan-1R700的熒光壽命(FLT)圖像:不同濃度的Pan_lR700溶液的FLT的值幾乎相同，3.56+/-0.081ns ；3.62 (2.5pg/mL)，3.58 (5pg/mL)，3.44 (20pg/mL), 3.60ns(40pg/mL)。(C)對A431細胞片狀沉淀物進行LED光照射改變了 FLT。用劑量為0、8、15和30J/cm2的PIT處理與Pan-1R700孵育24小時的A431細胞系。與光暴露前的3.28ns相比，FLT縮短至3.09、2.94和2.85ns。這些表示分別縮短了 9.1,10.1和13.1%。(D)A431片狀沉淀物的FLT依賴于與Pan-1R700孵育的時間。隨著與Pan_IR700孵育的時間的推移，FLT值放大。FLT從2.98ns (I小時)變為3.42ns (24小時)。
[0048]圖11的數字圖像示出了用Pan-1R700 (10jig/m0)在37°C預孵育24小時的A431細胞在開始暴露于NIR光后5、15、60和90秒的連續熒光(下圖)和微分干涉相差(DIC)顯微鏡圖像(上圖)。Pan-1R700在與細胞膜結合后逐漸內化到A431細胞的細胞質中，直至注射后24小時。DIC上的形態改變因暴露于更大劑量的NIR光而變得更嚴重。比例尺，50pm。
[0049]圖12A-D.經照射的腫瘤(暗灰色柱)和未經照射的腫瘤(亮灰色柱)的FLT的比較。(A)在小鼠背部兩側接種A431細胞的同一小鼠中，進行劑量為10、30、50J/cm2的PIT之前或之后的FLT圖像。右側腫瘤用PIT處理而左側腫瘤被覆蓋。將用50J/cm2 (B)、30J/cm2 (C)和10J/cm2(D)的PIT處理的A431腫瘤的FLT繪圖。與未經照射的腫瘤相比，證明了 NIR光劑量為30和50J/cm2的PIT使FLT立即顯著(P〈0.05)縮短。然而，在10J/cm2的低劑量下，FLT不會顯著縮短。在PIT后6小時觀察到FLT的短暫延長，這可能是由于被活性巨噬細胞攝取。使用Mann-Whitney U檢驗進行統計分析。
[0050]圖13A-C.(A)與無處理對照(OJ/cm2)(對照)相比，用50和30J/cm2的PIT處理的腫瘤中的FLT顯著縮短(P < 0.01)。50和30J/cm2的PIT使FLT分別立即縮短至69.1+/-10.9%和61.5+15.1%。沒有立即觀察到僅用10J/cm2照射的A431腫瘤顯示出顯著的FLT縮短。與無處理對照相比，PIT后48小時，FLT僅縮短了 7.7%。(B)隨著時間的推移，在PIT處理的小鼠中未經照射的腫瘤的FLT比未處理的小鼠中的FLT縮短得稍多，但是這些改變是不顯著的。使用Student’ s t檢驗進行統計分析。(C)示出了用0、10、30和50J/cm2的PIT處理的A431腫瘤的組織學樣本。所有樣本用蘇木精和伊紅染色。對處理的腫瘤進行的顯微鏡評估表明，PIT后健康的或受損的腫瘤細胞簇有不同程度的壞死和微出血。當給予30和50J/cm2的NIR光時，壞死性損傷是彌散且強烈的并且可見到的存活的腫瘤細胞更少。相反，當僅給予10J/cm2的NIR光時，僅在所述腫瘤內的有限區域中存在壞死性細胞損傷，而仍然存在大量的健康的癌病灶。比例尺指示50 μ m。
[0051]圖14A-C。k.在 PIT 后 PEG 化的 Qdot800 的動態圖像。用 Pan_IR700 注射 A431小鼠，24小時后，NIR光(50J/cm2)照射右側腫瘤。在PIT處理后I小時給予QdotSOO。在10分鐘內僅右側腫瘤清晰地顯示出來。B.PIT處理的腫瘤(綠色；上)、對照腫瘤(藍色；中間)和背景(黑色；下)的時間-信號強度曲線。C.熒光顯微術。IR700信號顯示出存活的A431細胞。Qdot800在PIT處理的腫瘤組織中廣泛分布，并部分地觀察到IR700和Qdot800共定位，然而，在對照腫瘤中，Qdot800的信號位于主血管的附近。[0052]圖15A-15B.A.PIT后SPIO的動態圖像。用Pan_IR700注射A431小鼠，24小時后，NIR光(50J/cm2)照射右側腫瘤。在PIT處理后I小時給予SP10。在5分鐘內僅右側腫瘤清楚地顯示出來。B.普魯士藍染色和HE染色。
[0053]圖16A-16D.A.PIT 后 Pan-1R800 的動態圖像。用 Pan_IR700 注射 A431 小鼠，24 小時后，NIR光(50J/cm2)照射右側腫瘤。在PIT處理后I小時給予Pan_IR800。在10分鐘內僅右側腫瘤清楚地顯示出來。B.Pan-1RSOO在PIT處理的腫瘤中可以以依賴于照射的光劑量的方式快速累積。在對照腫瘤中沒有觀察到信號。C和D。PIT后24小時，Pan-1R800不能被所述腫瘤吸收，可能是因為修復了血管的基底(間質壓恢復)或血流停止。
[0054]圖17A-F.A-C PIT后含有柔紅霉素的脂質體的動態圖像。用Pan_IR700注射A431小鼠，24小時后，NIR光(50J/cm2)照射右側腫瘤。在PIT處理后I小時給予含有柔紅霉素的脂質體。在30分鐘內僅右側腫瘤清楚地顯示出來。D.熒光顯微鏡研究。IR700信號顯示存活的A431細胞。含柔紅霉素的脂質體在PIT處理的腫瘤組織中廣泛分布并部分地觀察到IR700與Qdot800的共定位，然而，對照腫瘤中Qdot800的信號位于主血管的附近。E.PIT與含柔紅霉素的脂質體結合的聯合療法顯著地抑制了腫瘤生長和(F)延長了荷A431小鼠的存活時間。
[0055]圖18提供的示意圖示出了使用PIT和化學療法治療腫瘤的示例性方法，所述方法可包括對腫瘤進行成像。
[0056]圖19A-19B.A.PIT 后 Tra_IR800 的動態圖像。用 Tra_IR700 注射 3T3/HER2 小鼠，24小時后，NIR光(50J/cm2)照射右側腫瘤。在PIT處理后I小時給予Tra_IR800。在10分鐘內僅右側腫瘤清楚地顯示出來。白色箭頭示出光不充足地照射3T3HER2腫瘤的位置。Tra-1R800僅在所述腫瘤暴露于NIR光的區域累積。B.PIT后Pan_IR800的動態圖像。用Pan-1R700注射荷MDA-MB-468的小鼠，24小時后，NIR光(50J/cm2)照射右側腫瘤。在PIT處理后I小時給予Pan-1R800。在10分鐘內僅右側腫瘤清楚地顯示出來。
[0057]圖20A-20C.A.PIT后USPIO的動態圖像。用Pan_IR700注射A431小鼠，24小時后，NIR光(50J/cm2)照射右側腫瘤。在PIT處理后I小時給予USP10。在5分鐘內僅右側腫瘤清楚地顯示出來。B.普魯士藍染色和HE染色。C.PIT后G6-Gd的動態圖像。用Pan-1R700注射A431小鼠，24小時后，NIR光(50J/cm2)照射右側腫瘤。在PIT處理后I小時給予G6-Gd。在5分鐘內僅右側腫瘤清楚地顯示出來。
[0058]圖21A-21B.A.腫瘤邊緣區域和核心區域的熒光顯微鏡研究。IR700信號顯示存活的A431細胞。含有柔紅霉素的脂質體在PIT處理的腫瘤組織中廣泛分布，并且部分地觀察到IR700和含有柔紅霉素的脂質體的共定位。尤其是在核心區域中，DX可在局部壞死的區域中被吸收。B.治療后的體重變化。在組之間沒有明顯的差異。
【具體實施方式】
[0059]除非另有說明，否則本文所用的所有技術和科學術語的含義與本公開發明所屬【技術領域】的普通技術人員通常所理解的相同。除非上下文另有明確說明，否則單數術語“一”、“一個”和“所述”包括復數指代物。類似地，除非上下文另有明確說明，否則詞語“或”意欲包括“和”。“包含”意指“包括”。因此“包含A或B”意指“包括A”或“包括B”或“包括A和B”。[0060]下文描述了適合用于實踐和/或測試本公開實施方案的方法和材料。這些方法和材料僅僅是例證性的并不意欲是限制性的。可以使用其他與本文描述的那些相類似或等價的方法和材料。例如，本公開的發明所屬【技術領域】中熟知的常規方法記載于多種一般性和更具體的參考文獻中，包括例如Sambrook et al., Molecular Cloning:ALaboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ；Sambrooket al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring HarborPress,2001 ；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates, 1992 (和 2000 年增刊)；Ausubel et al., Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology, 4th ed.,ffiley&Sons, 1999 ；Harlow and Lane, Antibodies:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990 ；和 Harlow and Lane, UsingAntibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999。
[0061]對于在2010年7月9日犾得的序列，與本文參考的所有GenBank登錄號相關的序列以引用的方式納入本文。
[0062]為方便閱讀本公開的各種實施方案，提供了以下對具體術語的解釋:
[0063]給藥:通過任何有效的途徑提供或給予受試者試劑，例如抗體-1R700分子。示例性的給藥途徑包括但不限于局部、注射(例如皮下、肌肉內、真皮內、腹膜內、腫瘤內和靜脈內)、口腔、眼睛、舌下、直腸、經皮、鼻內、陰道和吸入途徑。
[0064]抗體:包含至少輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區的多肽配體，其特異性識別并結合抗原(例如腫瘤特異性蛋白)的表位。抗體由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈和輕鏈各自具有可變區，稱為重鏈可變區(Vh)和輕鏈可變區(')。所述Vh區和\區一起負責結合被抗體識別的抗原。
[0065]抗體包括完整的免疫球蛋白以及本領域熟知的抗體的變體和部分，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab) ’ 2片段、單鏈Fv蛋白(“scFv”)和二硫鍵穩定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是融合蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可變區和免疫球蛋白的重鏈可變區通過接頭結合，而在dsFv中，所述鏈已被突變以引入二硫鍵來穩定所述鏈的連接。所述術語還包括遺傳工程形式例如嵌合抗體(例如人源化鼠抗體)、異綴合抗體(heteroconjugate antibody)(例如雙特異性抗體)。還見于Pierce Catalog and Handbook, 1994_1995(Pierce ChemicalC0., Rockford, IL) ；Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., ff.H.Freeman&C0., New York, 1997。
[0066]通常,天然的免疫球蛋白具有通過二硫鍵互相連接的重鏈(H)和輕鏈(L)。有兩種類型的輕鏈:λ和κ。有5種決定抗體分子功能活性的主要重鏈類型(或同種型):IgM、IgD、IgG、IgA 和 IgE。
[0067]每條重鏈 和輕鏈均含有恒定區和可變區(所述區域還稱為“結構域”)。重鏈可變區與輕鏈可變區結合，特異性地結合抗原。輕鏈和重鏈可變區含有被三個高變區(也稱為“互補決定區”或“⑶R”)隔開的“框架”區。已經確定了框架區和⑶R的范圍(見Kabat etal., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S.Department of Healthand Human Services, 1991,其以引用的方式納入本文)。Kabat數據庫目前在線維持。不同的輕鏈或重鏈的框架區的序列在同一物種例如人內是相對保守的。抗體的框架區，也就是組成性輕鏈和重鏈的結合框架區，用于在三維空間中安置和排列CDR。[0068]⑶R主要負責與抗原的表位結合。每條鏈的⑶R —般稱為⑶R1、⑶R2和⑶R3，從N端開始順序編號，一般還通過所述具體⑶R所在的鏈來鑒定。因此，Vh⑶R3位于其所在抗體的重鏈的可變結構域，而' CDRl是來自其所在抗體的輕鏈的可變結構域的CDR1。具有不同特異性的抗體(即，對不同的抗原有不同的結合位點)具有不同的CDR。雖然抗體與抗體之間的CDR不同，但是CDR內僅有限數量的氨基酸位置直接參與抗原結合。CDR內的這些位置被稱為特異性決定殘基(SDR)。
[0069]提及“VH ”或“VH”時，是指免疫球蛋白重鏈的可變區，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的重鏈可變區。提及或“VL”時，是指免疫球蛋白輕鏈的可變區，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的輕鏈可變區。
[0070]“單克隆抗體”是由B-淋巴細胞的單個克隆或由其中已經轉染了單個抗體的輕鏈和重鏈基因的細胞產生的抗體。單克隆抗體通過本領域技術人員所知曉的方法產生，例如通過將骨髓瘤細胞和免疫脾細胞融合制備雜合的抗體形成細胞。單克隆抗體包括人源化單克隆抗體。
[0071]“嵌合抗體”具有來自一個物種例如人的框架殘基和來自另一物種的CDR (其一般賦予抗原結合能力)例如特異性結合間皮素的鼠抗體。
[0072]“人源化”免疫球蛋白是包括人框架區和一個或多個來自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被稱為“供體”，提供所述框架的人免疫球蛋白被稱為“受體”。在一個實施方案中，人源化免疫球蛋白中的所有CDR均來自供體免疫球蛋白。恒定區不一定存在，但是如果存在則必須與人免疫球蛋白恒定區基本相同，即，具有至少約85-90%，例如約95%或更高的同一性。因此，可能除了⑶R外，人源化免疫球蛋白的所有部分均與天然人免疫球蛋白序列的相應部分基本相同。“人源化抗體”是包含人源化輕鏈和人源化重鏈免疫球蛋白的抗體。人源化抗體與提供CDR的供體抗體結合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗體的受體框架可有有限數量的氨基酸被取自供體框架的氨基酸置換。人源化或其他單克隆抗體可以具有額外的保守性氨基酸置換，所述置換對抗原結合或其他免疫球蛋白功能基本沒有影響。人源化免疫球蛋白可以通過遺傳工程方法構建(參見例如，美國專利N0.5，585，089)。
[0073]“人”抗體(也稱為“全人”抗體)是包括人框架區和全部來自人免疫球蛋白的⑶R的抗體。在一個實例中，框架和CDR來自相同來源的人重鏈和/或輕鏈氨基酸序列。然而，可以將來自一種人抗體的框架設計成包括來自不同人抗體的CDR。人免疫球蛋白的所有部分均與天然人免疫球蛋白序列的相應部分基本相同。
[0074]“特異性結合”是指相對于與無關蛋白例如非腫瘤蛋白例如β肌動蛋白結合，單個抗體特異性地與抗原例如腫瘤特異性抗原發生免疫反應的能力。例如，HER2特異性結合劑在體外或體內基本上只結合HER-2蛋白。本文使用的術語“腫瘤特異性結合劑”包括腫瘤特異性抗體和在該制劑中基本上只結合腫瘤特異性蛋白的其他試劑。
[0075]所述結合是抗體分子和T細胞表面分子的抗原決定簇之間的非隨機結合反應。所需的結合特異性一般是由抗體對T細胞表面分子和無關抗原的不同結合能力的參考點來決定的，并因此區別兩種不同的抗原，尤其是當兩種抗原具有獨特的表位時。特異性結合特定表位的抗體被稱為“特異性抗體”。
[0076]在一些實例中， 抗體(例如抗體-1R700分子)特異性結合靶(例如細胞表面蛋白)的結合常數比對于樣品或受試者中的其他分子的結合常數高至少IO3Jr1UO4Ir1或ιο5μ'在一些實例中，抗體(例如單克隆抗體)或其片段的平衡常數(Kd)為InM或更低。例如，抗體結合靶例如腫瘤特異性蛋白的親和力為至少約0.1Χ10_8Μ、至少約0.3Χ10_8Μ、至少約0.5Χ10-8Μ、至少約 0.75Χ10-8Μ、至少約 1.0X 10-8Μ、至少約 1.3Χ10-8Μ、至少約 1.5 X KT8M或至少約2.0Χ10_8Μ。例如，Kd值可通過競爭ELISA (酶聯免疫吸附測定)或使用表面等離子共振設備例如可購自Biacore, Inc., Piscataway, NJ的Biacore TlOO確定。
[0077]抗體-1R700分子或抗體-1R700綴合物:包括與IR700綴合的抗體例如腫瘤特異性抗體的分子。在一些實例中，所述抗體是特異性結合癌細胞上的表面蛋白的人源化抗體(例如人源化單克隆抗體)。
[0078]抗原(Ag):可在動物體內刺激抗體產生或T細胞應答的化合物、組合物或物質，包括被注射或吸收進入動物體內的組合物(例如包括腫瘤特異性蛋白的組合物)。抗原與特異性體液免疫或細胞免疫的產物反應，所述產物包括由異源抗原例如本公開的抗原誘導的那些。“表位”或“抗原決定簇”是指B和/或T細胞對其作出應答的抗原區域。在一個實施方案中，當表位與MHC分子一同呈遞時，T細胞對表位作出應答。表位可以由相鄰氨基酸或由因蛋白質的三級折疊并列的非相鄰氨基酸形成。由相鄰氨基酸形成的表位暴露通常在變性溶劑后仍然存在，而三級折疊形成的表位通常在用變性溶劑處理后丟失。表位在獨特的空間構象中一般包括至少3個并且更常見地至少5個、約9個或約8-10個氨基酸。確定表位空間構象的方法包括，例如X-射線晶體法和核磁共振。
[0079]抗原的實例包括但不限于含有抗原決定簇的肽、脂質、多糖和核酸，例如被免疫細胞識別的那些。在一些實例中，抗原包括腫瘤特異性肽(例如出現在癌細胞表面上的肽)或其免疫原性片段。
[0080]癌癥:特征為 異常或不受控的細胞生長的惡性腫瘤。常常與癌癥相關的其他特征包括轉移，干擾鄰近細胞的正常功能，以異常水平釋放細胞因子或其他分泌產物以及抑制或加重炎癥應答或免疫應答，侵入周圍或遠處的組織或器官，例如淋巴結等。“轉移性疾病”是指已經離開最初的腫瘤部位并例如經血流或淋巴系統移行至身體其他部位的癌細胞。在一個實例中，通過本公開的方法殺死的細胞是癌細胞。
[0081]接觸:以直接物理聯系的方式包括固體和液體形式放置。接觸可在體外(例如與分離的細胞例如腫瘤細胞)或在體內(通過給予受試者(例如有腫瘤的受試者))發生。
[0082]減少:使某物的質量、數量或強度減少。在一個實例中，例如與沒有抗體-1R700分子時的應答相比，包括一種或多種抗體-1R700分子的治療性組合物，在用NIR(例如波長為約680nm)以至少IJ cm2_的劑量照射后，可使得所述抗體-1R700分子特異性結合的細胞的活力減少。在一些實例中，這種減少通過殺死所述細胞來證明。在一些實例中，相對于用不包含抗體-1R700分子的組合物所觀察到的活力，所述細胞的活力減少至少20%、至少50%、至少75%或甚至至少90%。在其他實例中，減少以倍數變化來表示，例如，相對于用不包含抗體-1R700分子的組合物所觀察到的活力,所述細胞活力減少了至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少8倍、至少10倍或甚至至少15或20倍。這種減少可使用本文公開的方法測量。
[0083]IR700 (IRDye? 700DX):具有下式的染料:
[0084]
【權利要求】
1.一種殺死細胞的方法，包括: 使含細胞表面蛋白的細胞與治療有效量的一種或多種抗體-1R700分子接觸，其中所述抗體特異性結合所述細胞表面蛋白； 在660-740nm的波長下以至少IJ cm—2的劑量照射所述細胞；和 在照射所述細胞之后約0-8小時，使所述細胞與一種或多種治療劑接觸，從而殺死所述細胞。
2.一種實時檢測細胞殺死的方法，包括: 使含細胞表面蛋白的細胞與治療有效量的一種或多種抗體-1R700分子接觸，其中所述抗體特異性結合所述細胞表面蛋白； 在660-740nm的波長下以至少30J cm—2的劑量照射所述細胞； 在照射所述細胞后約0-48小時，用熒光壽命成像檢測所述細胞，從而實時檢測所述細胞殺死。
3.權利要求1的方法，還包括: 在照射所述細胞后約0-48小時， 用熒光壽命成像檢測所述細胞。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述細胞是腫瘤細胞。
5.權利要求3的方法，其中所述腫瘤細胞是癌細胞。
6.權利要求5的方法，其中所述癌細胞是乳房、肝、結腸、卵巢、前列腺、胰、腦、子宮頸、骨、皮膚或肺的癌細胞。
7.權利要求5的方法，其中所述癌細胞是血液的癌細胞。
8.權利要求1-7任一項的方法，其中所述細胞表面蛋白是腫瘤特異性蛋白。
9.權利要求8的方法，其中所述腫瘤特異性蛋白包括HER1、HER2、⑶20、⑶25、⑶33、⑶52、⑶44、⑶133、Louis Y、間皮素、CEA或前列腺特異性膜抗原(PSMA)。
10.權利要求1-9任一項的方法，其中所述抗體-1R700分子包括帕尼單抗-1R700分子、曲妥單抗-1R700 分子、Basilitumab-1R700 分子、賽尼哌-1R700 分子、Simitect_IR700分子或J591-1R700分子。
11.權利要求1-10任一項的方法，其中在680nm的波長下照射所述細胞。
12.權利要求1-11任一項的方法，其中所述一種或多種抗體-1R700分子包括至少兩種不同的抗體-1R700分子，其中第一抗體-1R700分子對第一抗原特異，第二抗體-1R700分子對所述第一抗原的不同表位特異或者對第二抗原特異。
13.權利要求1-12任一項的方法，其中所述細胞在受試者中，并且使所述細胞與所述一種或多種抗體-1R700分子和所述一種或多種治療劑接觸，包括給予所述受試者治療有效量的所述一種或多種抗體-1R700分子和所述一種或多種治療劑。
14.權利要求1-13任一項的方法，其中所述細胞在受試者中，并且照射所述細胞包括: 照射所述受試者；和/或 照射所述受試者中的腫瘤。
15.權利要求1-14任一項的方法，其中所述細胞在受試者的血液中，并且其中照射所述細胞包括通過使用所述受試者穿戴的裝置來照射所述血液，其中所述裝置包含近紅外(NIR)發光二極管(LED)。
16.權利要求1-15任一項的方法，其中所述細胞在受試者中，并且所述方法還包括:選擇具有表達可特異性結合抗體-1R700分子的細胞表面蛋白的腫瘤的受試者。
17.權利要求1-16任一項的方法，其中所述方法使所述腫瘤的體積或尺寸相對于沒有治療減少達至少25%。
18.權利要求13-17任一項的方法，其中相對于沒有給予所述抗體-1R700分子和照射，所述方法使所述受試者的存活時間增加。
19.權利要求1或3-18任一項的方法,還包括: 使所述細胞與低于治療有效量的量的一種或多種抗體-1R700分子接觸；和在660-740nm的波長下以至少0.0OlJ cm—2的劑量照射所述細胞，從而容許對所述細胞進行檢測。
20.一種組合物，包含帕尼單抗-1R700分子、曲妥單抗-1R700分子或J591-1R700分子。
21.一種可穿戴裝置，包含: 衣服、珠寶或覆蓋物；和 被納入到所述衣服、珠寶或覆蓋物中的NIR LED。
22.權利要求21的可穿戴裝置，還包含被納入到所述衣服、珠寶或覆蓋物中的電源和/或冷源。
23.—種殺死受試者血`液中的腫瘤細胞的方法，包括: 給予所述受試者治療有效量的一種或多種抗體-1R700分子，其中所述抗體特異性結合所述腫瘤細胞上的細胞表面蛋白；和 用NIR LED以660-740nm的波長和以至少20Jcm_2的劑量照射所述腫瘤細胞，從而殺死所述細胞，其中所述NIR LED存在于所述受試者穿戴的權利要求21-22任一項的可穿戴裝置中。
【文檔編號】A61K41/00GK103781495SQ201280043973
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年6月27日 優先權日:2011年7月11日
【發明者】小林久隆, P·庫伊克, M·博納多 申請人:美國政府(由衛生和人類服務部的部長所代表)