用于提高細胞表面的etec cs6抗原呈遞的方法及可由其獲得的產物的制作方法
【專利摘要】用于提高細胞表面的ETEC?CS6抗原呈遞的方法，其包括以下步驟：將表達所述抗原的細胞與包含按重量計0.6％至2.2％苯酚的水溶液接觸，使得所述抗原的呈遞提高至少100％。用于制造全細胞死疫苗的方法，所述疫苗用于針對表達CS6之ETEC進行免疫接種。可通過以上方法獲得的細胞和疫苗。
【專利說明】用于提高細胞表面的ETEC CS6抗原呈遞的方法及可由其獲得的產物
發明領域
[0001]本發明涉及可用于制備ETEC CS6抗原的方法，特別是用于制造疫苗，以及可通過所述方法獲得的細胞和疫苗。
【背景技術】
[0002]大腸菌表面抗原6 (Coli surface antigen6, CS6)是腸產毒性大腸桿菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)細菌的最普遍非菌毛定植因子(colonization factor,CF)之一,腸產毒性大腸桿菌細菌是發展中國家的嬰兒和兒童以及這些地區的旅行者中的痢疾的最常見病因。
[0003]由于針對ETEC的免疫保護主要通過在腸部局部產生的IgA抗體介導，因而很多的努力集中在開發基于CF的口服疫苗。已經開發了誘導抗CF免疫應答的ETEC候選疫苗，例如以CF-ETEC+CTB聯合口服疫苗的形式，其包含表達最常遇到的幾種CF(即CFA / 1、CSl、CS2、CS3、CS4和CS5)的5種死ETEC菌株和重組霍亂毒素B亞單位(cholera toxinB subunit, CTB,其與 ETEC LT 的 B 亞單位高度同源)(Levine MM, Giron JA, NoriegaF.Fimbrial vaccines.1n:P.Klemm 編輯.Fimbriae:adhesion, biogenics, geneticsand vaccines, CRC Press, Boca Raton, Fla.1994,55-70 頁；Svennerholm A-M, TobiasJ.Vaccines against enterotoxigenic Escherichia col1.Expert Rev Vaccines2008 ；7:795-804.)
[0004]之前的工作已經描述了表達致免疫量的菌毛CF抗原(例如CFA/I和CS2)(其在福爾馬林處理后保留)的候選大腸桿菌疫苗菌株的制備。然而，產生表達致免疫量的CS6的大腸桿菌并且在全細胞死疫苗中保留CS6蛋白的免疫活性的嘗試到現在都是失敗的。
[0005]本文描述了具有非抗生素選擇標記thyA的重組非產毒大腸桿菌菌株的構建，其在細菌表面表達大量的CS6抗原，并且表現為細菌的苯酚滅活不破壞CS6抗原性質。相反，出乎意料地發現苯酚處理顯著提高在細胞表面呈遞的抗原量。這一提高非常有價值，因為在口服全細胞疫苗中可包含的細胞數目是疫苗開發的主要限制因素，這是由于以下事實，即口服給予太大數目的細菌產生副作用例如嘔吐，特別是在嬰兒對象中。通過提高每個細胞呈遞的抗原量，可以提高疫苗中的抗原量而不提高疫苗中細胞的總數目。
[0006]用這種苯酚殺死的CS6過表達大腸桿菌細菌口服免疫接種的小鼠誘導強的應答于CS6的糞便和腸IgA以及血清IgG+lgM抗體,其超過了由天然表達CS6且之前被用作疫苗菌株的ETEC參照菌株所誘導的應答。數據表明，所述非產毒且過表達CS6的苯酚滅活大腸桿菌菌株在口服ETEC疫苗中是有用的成分。
[0007]定義
[0008]在本公開內容的上下文中，下面的術語具有以下含義。
[0009]縮寫ETEC指腸產毒性大腸桿菌(Escherichia coli)細菌。 [0010]術語CS6抗原意指 大腸菌表面抗原6，其為ETEC細菌的最普遍非菌毛定植因子之一。術語ETEC CS6抗原同義地使用。
[0011]術語全細胞死疫苗(killed whole cell vaccine)是指包含完全(完整)但死的(非活的)細菌的疫苗。
[0012]術語非抗生素選擇標記指在選擇過程中不需要使用抗生素的用于選擇質粒的遺傳選擇標記。實例包括thyA(胸苷酸合成酶，thymidinylate synthetase)回補。
[0013]附圖簡述
[0014]圖1:用于表達CS6的pJT-CS6_thyA構建體。首先構建質粒pJT-CFA / 1-ThyA(A)，然后用完整擴增的CS6操縱子替代CFA / I操縱子產生pJT-CS6-thyA(B)。
[0015]圖2:通過斑點印跡(A)和抑制ELISA⑶檢測的C600-CS6重組菌株和CS6參照菌株E11881 / 23上的CS6表面表達。兩種菌株均在液體CFA培養基中培養，用IPTG誘導重組菌株，均被洗滌并且在以IO9細菌/ ml為初始密度的連續稀釋下進行測試。**P〈0.01，通過Student’s t檢驗,雙尾。
[0016]圖3:用相同數量的苯酚殺死的C600-CS6細菌和E11881 / 23細菌口服免疫接種C57B1 / 6小鼠后(n=5只小鼠/組)，針對CS6的血清IgG+lgM以及糞便提取物和腸提取物ELISA IgA效價。對于每個組中的小鼠，效價表示為幾何平均數(GM) +標準誤(SE);對于糞便和腸提取物，根據提取物中的總IgA水平調整水平。對照指在免疫接種前小鼠中的抗體水平。**Ρ〈0.01, ***Ρ〈0.001,通過 Student’s t 檢驗,雙尾。
[0017]發明概述
[0018]在第一方面中，公開了用于提高細胞表面上的ETEC CS6抗原呈遞的方法，其包括以下步驟:將表達所述抗原的細胞與包含按重量計0.6%至2.2%苯酚的水溶液接觸，使得所述抗原的呈遞提高至少100%，優選至少200%，更優選至少300%。
[0019]優選地，所述接觸步驟的持續時間為I小時至72小時。更優選地，所述接觸步驟的持續時間為1.5小時至42小時。
[0020]優選地，所述接觸步驟期間的溫度為18°C至42°C，更優選地18°C至38°C，甚至更優選地18°C至22°C或36°C至38 °C。
[0021]優選地，苯酚濃度為按重量計0.8%至2.0%，更優選地按重量計1.0%至2.0%。
[0022]優選地，所述細胞包括大腸桿菌細胞。優選地，所述抗原為通過所述細胞重組過表達的。
[0023]優選地,第一方面的方法還包括以下步驟:通過抑制ELISA(inhibition ELISA)或斑點印跡(優選抑制ELISA)對所述細胞的抗原呈遞和未經處理但在其他方面可比較的細胞的CS6抗原呈遞進行比較。
[0024]在第二方面中，還公開了用于制造全細胞死疫苗的方法，所述疫苗用于針對表達CS6之ETEC進行免疫接種，所述方法包括根據前述權利要求中任一項的方法，其中苯酚濃度，接觸溫度和接觸時間的選擇使得發生伴隨CS6抗原呈遞提高的至少IO7倍的細胞滅活。
[0025]優選地，在第二方面的方法中，苯酚濃度為按重量計0.6%至2.0 %，接觸時間為6小時至72小時，接觸溫度為18°C至22°C。更優選地，苯酚濃度為按重量計0.75%至
0.85 %，接觸時間為40 ± 2小時，接觸溫度為20 ± I °C。
[0026]在第三方面中，公開了可通過根據第一或第二方面的方法獲得的細胞。
[0027]在第四方方面中，公開了用于針對表達CS6之ETEC進行免疫接種的疫苗，其包含第三方面的細胞。
[0028]發明詳述
[0029]用于提高CS6抗原呈遞的方法
[0030]在第一方面中，本發明提供了用于提高細胞表面上的ETEC CS6抗原呈遞的方法，其特征在于其包括以下步驟:在合適的溫度下將表達所述抗原的一種或更多種細胞與包含按重量計0.6%至2.2%苯酚的水溶液接觸合適的時間，使得所述抗原的呈遞提高至少20%。抗原的呈遞提高至少20%意指，與沒有經歷所述方法但是在其他方面可比較的細胞相比，細胞表面的并且通過合適的方法(詳細參見下文)可檢測的抗原呈遞的量至少翻倍。優選地，抗原呈遞的提高為至少30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %，更優選地至少100%,125%,150%,175%,200%,250%^； 300%。最優選地，提高至少 100%。
[0031]所述水溶液可以是例如添加苯酚的磷酸緩沖鹽水(PBS)，但是許多不同的水緩沖液是合適的。優選的是，緩沖液的pH為5至9，更優選6至8，最優選6.5至7.5。所述緩沖液的鹽濃度優選為50至200mM，更優選100至150mM，最優選約137mM。合適的PBS緩沖液可以為如下:在 I 升中，8g NaCU0.2g KCl、1.44g Na2HP04、0.24g KH2PO4, pH7.4。
[0032]苯酚濃度、溫度和時間這些變量表現出某些程度的相互依賴性。如果溫度升高，則需要較低的苯酚濃度和/或較短的時間以實現呈遞的提高(反之亦然)。如果處理時間延長，則可以利用較低的苯酚濃度和/或較低的溫度(反之亦然)。借助于本文教導的指引，技術人員將能夠使用常規試驗(而無顯著負擔)來根據手頭的需要調整苯酚濃度、時間和溫度的組合。
[0033]處理的合適持續時間可以為0.1小時至240小時或I小時至240小時。優選地，處理時間可以為I小時至72小時。更優選地，處理時間可以為1.5小時至42.0小時，最優選地，處理時間為2.0小時至40.0小時。
[0034]處理的合適溫度范圍為1°C至45°C或者4°C至45°C。優選地，所述溫度可以為18°C至42°C。從實用的角度看，可優選的是在環境溫度(室溫)進行所述方法以避免需要專門的設備來維持溫度。因而一個優選的溫度范圍是18°C至25°C，甚至更優選18°C至22°C，最優選約20°C。可優選的還有在升高的溫度進行所述方法以縮短過程的持續時間和/或以降低所需的苯酚濃度。因而另一個優選的溫度范圍是35°C至42°C，甚至更優選36°C至38 °C，最優選約37 °C。
[0035]苯酚濃度范圍可優選地為按重量計0.7%至2.0%，更優選按重量計0.75%至2.0%,還更優選按重量計0.8 %至2.0 %，仍更優選按重量計0.85 %至2.0 %，甚至更優選按重量計0.9%至2.0%，以及最優選按重量計1.0%至2.0%。在一個優選的實施方案中，苯酚濃度為按重量計為0.6%至2.0%，接觸時間為6小時至72小時，接觸溫度為18°C至22°C。在另一個優選的實施方案中，苯酚濃度為按重量計0.6%至2.0%，接觸時間為2小時至4小時，接觸溫度為36°C至38°C。
[0036]以上方法中的細胞可以是大腸桿菌細胞。從實用的角度看這可以是有利的，因為大腸桿菌容易在實驗室中生長和進 行遺傳操作。此外，所述方法的主要目的是提供針對ETEC的疫苗，從而可有利的是使用抗原的大腸桿菌宿主以為被呈遞的抗原提供更天然的環境。優選地，所述細胞為非產毒大腸桿菌細胞。但是，應當理解所述方法也可以用其他表達CS6的細胞。[0037]在合理的限制內細胞濃度不是至關重要的。認為任何多達IO12個細胞/ ml的濃度是可行的。實用的優選細胞濃度范圍可以是IO8-1O12個細胞/ ml。最優選的范圍是IO9至2-101°個細胞/ ml。
[0038]ETEC CS6抗原產生可以通過遺傳改造在細胞中重組地誘導(參見實施例1)。這便于每個細胞產生高水平的抗原，有利于將疫苗劑量所需的細胞數目最小化，導致副作用的最小化。然而，所述方法也可以使用天然地(即沒有任何遺傳改造地)表達CS6抗原的細胞。然而優選地，所述方法的細胞是非產毒大腸桿菌宿主細胞，其由于用表達CS6的質粒轉化而過表達CS6抗原。優選地，所述質粒具有非抗生素選擇標記，即發揮作用不需要使用抗生素的選擇標記。最優選地，宿主細胞是胸苷營養缺陷的并且CS6過表達質粒攜帶胸苷酸合成酶(ThyA)回補因子，從而選擇可以使用缺乏胸苷的培養基進行。優選地，CS6過表達通過tac啟動子或本領域公知的類似強誘導型啟動子驅動。
[0039]對于測量因本發明方法引起的CS6抗原呈遞提高，本文公開了可用的方法，并且這些方法也可以從文獻中知曉。優選地，使用如本文公開的抑制ELISA測定(參見實施例2和相關的材料和方法)或通過也在本文中公開的斑點印跡(參見實施例2)進行測定。優選地，第一方面的方法包括另外的步驟:分析由細胞呈遞的CS6抗原量(例如使用以上技術)，以及將所述呈遞的量與由未經歷使用包含苯酚之水溶液的處理但是在其他方面可比較的細胞所呈遞的CS6抗原量進行比較。合適地，在接觸步驟之前將部分細胞取出并儲存以這樣作為對照樣品。
[0040]用于制造疫苗的方法
[0041]在第二方面中，本公開內容提供了用于制造全細胞死疫苗的方法，所述疫苗用于針對表達CS6之ETEC進行免疫接種，所述方法包括根據第一方面的方法，其中選擇苯酚濃度、接觸溫度和接觸時間以使得發生伴隨CS6抗原呈遞提高的至少IO7倍的細胞滅活。優選地，滅活的程度為至少IO8倍，更優選IO9倍，還更優選IOltl倍，并且最優選在處理之后沒有有活力的細胞。可以通過本領域公知的任何普通方法確定細胞滅活。本文在題為材料和方法的章節中公開了合適的方法。
[0042]利用苯酚滅活細胞并提高抗原呈遞可以是有利的，因為這減少了疫苗制造中加工步驟的數目。苯酚滅活還解決了由CS6抗原被正常情況下優選的滅活方法(福爾馬林處理)破壞的傾向所導致的問題(參見實施例2)。
[0043]優選地，在第二方面的方法中，苯酚濃度為按重量計0.6%至2.0%，接觸時間為6小時至72小時，接觸溫度為18°C至22°C。可替換的優選條件組為其中苯酚濃度為按重量計0.6%至2.0%，接觸時間為2小時至4小時并且接觸溫度為36°C至38°C。另一個優選的條件組為其中苯酚濃度為按重量計1.1%至1.3%，接觸時間為16±3小時并且接觸溫度為20±2°C。另一個優選的條件組為其中苯酚濃度為按重量計1.1%至1.3%，接觸時間為40±8小時并且接觸溫度為20±2°C。還優選條件組為其中苯酚濃度為按重量計1.4%至1.6%，接觸時間為6±2小時并且 接觸溫度為20±21:。仍然還優選的條件組為其中苯酚濃度為按重量計0.75 %至0.85 %，接觸時間為40 ± 2小時并且接觸溫度為20 ± I °C。
[0044]可通過本發明方法獲得的細胞和疫苗
[0045]在第三方面中，提供了可通過根據第一方面或第二方面的方法獲得的細胞。苯酚處理導致抗原和/或細胞壁結構的明顯改變，使得更多的抗原更能夠被檢測到(無論在體外例如通過抗體還是在體內通過免疫系統)。換言之，這樣處理的細菌細胞已經通過第一或第二方面的方法獲得了新的結構(盡管不可用結構術語描述結構的改變)。
[0046]在第四方面中，提供了用于針對表達CS6之ETEC進行免疫接種的疫苗，其包含根據第三方面的細胞。
實施例
[0047]對于與實施例相關的實驗流程的細節，讀者可以參照題為材料和方法的章節。
[0048]實施例1:在大腸桿菌C600-CS6中表達CS6
[0049]如圖1A和IB中描述的，通過PCR擴增從具有CS6表面表達的野生型ETEC菌株制備的攜帶CS6結構基因(cssA、cssB、cssC、cssD)的DNA片段,并克隆以構建表達載體pJT-CS6-ThyA。隨后該質粒被電穿孔至胸腺嘧啶依賴的、非產毒大腸桿菌C600- Δ thyA菌株，并且通過向生長培養基添加IPTG誘導CS6表面表達(如在免疫斑點印跡測定中所示)(圖2A)。在缺乏誘導物的情況下未觀察到CS6表達(未顯示數據)。當使用斑點印跡測定檢測由重組C600-CS6菌株的CS6表達時，我們發現與CS6參照菌株E11881 / 23 (其之前在CF-CTB-ETEC疫苗中被用作CS4+CS6疫苗菌株)相比，該菌株表達提高至少8倍的CS6水平(圖2A)。同樣地，當使用抑制ELISA測定來特異性確定CS6之表面表達時，也發現與參照菌株相比，在重組菌株上CS6的量約增大為10倍(圖2B)。
[0050]實施例2:滅活細菌而不破壞CS6抗原性質
[0051]為了殺死表達CS6的細菌同時保留在其表面上的CS6抗原性質，比較了甲醛和苯酚的效果。初步的研究顯示用0.3%或0.6%甲醛處理細菌盡管安全地殺死細菌但導致可檢測CS6抗原的完全喪失(數據未顯示)。相反，用0.5%苯酚處理細菌不僅殺死了測試的細菌，還保留了 CS6抗原(數據未顯示)；另一方面，更低測試濃度(0.25%)的苯酚未導致細菌的完全殺死。這些結果表明，苯酚處理可以用于滅活細菌同時保留CS6抗原。為了制定出最優的滅活方法，因此針對重組C600-CS6菌株和用于比較的另一 CS6過表達菌株(T0P10-CS6-Amp) 二者的滅活測試了不同濃度的苯酚。如在表2中所示，如通過抑制ELISA測試的，對于用0.5%、0.8%、1%和1.6% (不是用0.25%)的苯酚測試兩種菌株，滅活了細菌并且還保留了表面CS6。當細菌用0.8%苯酚滅活時發現了 CS6的最高水平，與未處理的細菌相比，該處理實際上的確可重現地提高了 CS6抗原表面的估計量(表2)。基于這些結果，因此使用濃度為0.8%的苯酚滅活C600-CS6和參照菌株El 1881 / 23 二者，如通過抑制ELISA測試的，與對照菌株的相比，其在重組菌株中導致死細菌具有量提高6倍的CS6。這些滅活的細菌隨后用于小鼠的口服免疫接種。
[0052]表2-用不同濃度的苯酚滅活之后，C600-CS6和T0P10-CS6-Amp菌株的表面CS6水
平和生長的缺乏
[0053]
【權利要求】
1.用于提高細胞表面上的ETECCS6抗原呈遞的方法，其包括以下步驟:將表達所述抗原的細胞與包含按重量計0.6%至2.2%苯酚的水溶液相接觸，使得所述抗原的呈遞提高至少100%。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述抗原的呈遞提高至少200%，優選至少300 %。
3.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中接觸步驟的持續時間為I小時至72小時。
4.根據權利要求3所述的方法，其中接觸步驟的持續時間為1.5小時至42小時。
5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中接觸步驟期間的溫度為18°C至42°C。
6.根據權利要求5所述的方法，其中接觸步驟期間的溫度為18°C至38°C，優選18°C至22°C或 36°C至 38°C。
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中苯酚濃度為按重量計0.8%至2.0%,優選為按重量計1.0%至2.0%。
8.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞包括大腸桿菌(Escherichiacoli)細胞。
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞重組過表達所述抗原。
10.根據前述權利要求 中任一項所述的方法，其還包括以下步驟:通過抑制ELISA或斑點印跡，優選抑制ELISA，比較所述細胞的抗原呈遞和未經處理但在其他方面可比較之細胞的CS6抗原呈遞。
11.用于制造針對表達CS6之ETEC進行免疫接種的全細胞死疫苗的方法，其包括根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中選擇苯酚濃度、接觸溫度和接觸時間以使得伴隨CS6抗原呈遞的提高發生至少IO7倍的細胞滅活。
12.根據權利要求11所述的方法，其中苯酚濃度為按重量計0.6%至2.0%，接觸時間為6小時至72小時并且接觸溫度為18°C至22°C。
13.根據權利要求12所述的方法，其中苯酚濃度為按重量計0.75%至0.85%，接觸時間為40 ±2小時并且接觸溫度為20±1°C。
14.細胞，其可通過根據前述權利要求中任一項所述的方法獲得。
15.用于針對表達CS6之ETEC進行免疫接種的疫苗，其包含根據權利要求14所述的細胞。
【文檔編號】A61K39/02GK103917244SQ201280043926
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年9月10日 優先權日:2011年9月12日
【發明者】尼爾斯·卡林, 安-瑪麗·斯文納霍爾姆, 喬舒亞·托比亞斯 申請人:斯堪的納維亞生物制藥控股公司