藻類的培養方法與含有藻酸的組合物的制備方法

藻類的培養方法與含有藻酸的組合物的制備方法
【專利摘要】本發明的目的是提供工業上高效地培養具有藻酸產生能力的藻類的方法，以及工業上有利的制備含有藻酸的組合物的方法。根據本發明的藻類的培養方法，其包括將屬于擬小球藻屬(Parachlorella)且具有藻酸產生能力的藻類進行異養(Heterotrophic)培養的步驟。另外，根據本發明的含有藻酸的組合物的制備方法，其包括從根據所述培養方法所得到的藻類的培養物中取得含有藻酸的組合物的步驟。
【專利說明】藻類的培養方法與含有藻酸的組合物的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及屬于擬小球藻屬(Parachlorella),并且具有藻酸產生能力的藻類的培養方法。另外，本發明涉及工業上有利的制備含有藻酸的組合物的方法。進一步地本發明涉及:從根據該制備方法所得到的含有藻酸的組合物中得到的藻體干燥物、包含該含有藻酸的組合物的污泥減少劑、有害物質吸附劑、飼料、食品和醫藥品。
【背景技術】
[0002]藻酸是褐藻類或一部分紅藻的細胞間及細胞壁中所含有的粘性多糖類，是2種糖醛酸(Uronic acid)，即D-甘露糖醛酸與L-古洛糖醛酸以各種比例進行結合的多糖醛酸苷(Polyuronides)多糖。藻酸或其鹽，作為增稠穩定劑、膠凝劑，不僅廣泛利用于食品添加物、醫藥品、化妝品、牙科用材料等，并且由于其為食物纖維中的一種，因而作為功能性食品也受到注目。進一步地，已報道藻酸中特別是被稱作藻酸低聚物的低分子量藻酸具有各種生理活性(非專利文獻I)。
[0003]現有技術中，藻酸或其鹽是通過從海帶、裙帶菜等褐藻類中進行提取、精制來進行工業制備的。但是，在以上述等褐藻類為原料的制法中，存在原料的穩定供給的問題。另外，作為藻酸低聚物的制法，已知的有以從褐藻類中得到的高分子量的藻酸為原料，使具有藻酸分解能力的酶或者細菌進行作用從而使其低分子量化的方法(專利文獻1、2);在加壓下對該高分子量的藻酸進行熱處理后使其低分子量化的方法(專利文獻3、4)等。但是，前者的方法由于使用酶或者細菌，不僅需要花費龐大的成本，而且需要在低濃度的水溶液中長時間進行反應，因此不利于工業化。此外，后者的加壓熱處理法也需要昂貴的壓力容器，也存在設備上的問題。
[0004]最近，公開了具有藻酸、特別是具有較低分子量藻酸產生能力的新型擬小球藻屬(Parachlorella)的藻類，通過培養該藻類，從其培養液中取得藻酸的方法(專利文獻5)。進一步地，也公開了使用含有該藻酸的藻類的藻體干燥物減少污泥方法(專利文獻6)。在上述專利文獻中，記載了該新型藻類的光要求性，實際上，所公開的該藻類的培養方法中，每一個都是利用該藻類的光合性能的自養培養。
[0005]藻類通常都可以利用其光合性能進行自養培養。自養培養可以利用日光等自然光，具有不需要對培養基添加碳源、能量源等優點。另一方面，根據天氣、季節等，光的照射量會產生變化，另外在設備方面也存在培養液容易受到微生物等污染的問題。為了解決上述的問題，雖然也有在完全封閉體系中用電照明等人工光進行照射培養的方法，但這不僅需要昂貴的設備，還需要大量的電能。
[0006]現有技術文獻
[0007]專利文獻
[0008]專利文獻1:日本特開平2-303468號公報
[0009]專利文獻2:日本特開平5-15387號公報
[0010]專利文獻3:日本特開平6-7093號公報[0011]專利文獻4:日本特開2006-320320號公報
[0012]專利文獻5:W02010_024367號公報
[0013]專利文獻6:日本專利第4573187號公報
[0014]非專利文獻
[0015]非專利文獻1:日本食品化學學會志17卷27-35頁(2010年)

【發明內容】

[0016]發明要解決的問題
[0017]鑒于上述狀況，本發明的要解決的問題是提供工業上且有效地培養具有藻酸產生能力的藻類的方法。進一步地，要解決的問題是提供含有藻酸的組合物的工業上有利的制法。
[0018]解決問題的手段
[0019]本發明的發明人發現，現有技術中對具有藻酸產生能力的屬于擬小球藻屬(Parachlorella)的藻類只知道需要光的自養性培養方法。意外地，異養地培養可以以高效率進行培養，進一步地，進行異養性培養的該藻類的培養物還比自養培養時蓄積更大量的藻酸，進而完成了本發明。
[0020]本發明如以下所示。
[0021][I]藻類的培養方法，其特征為包括將屬于擬小球藻屬(Parachlorella)且具有藻酸產生能力的藻類進行異 養培養的步驟。
[0022][2]根據上述[I]所述的方法，其中，屬于擬小球藻屬(Parachlorella)的藻類為Parachlorella sp.Binos FERM BP-10969。
[0023][3]根據上述[I]或[2]所述的方法，其中，在平均照度為小于700LUX的暗黑條件
下培養藻類。
[0024][4]根據上述[I]~[3]中任一項所述的方法，其中，用液體培養基培養藻類，并且，相對于培養開始時的該液體培養基量1L，該液體培養基中的有機化合物的總使用量換算為碳原子的重量為2.5g以上。
[0025][5]含有藻酸的組合物的制備方法，其包括從根據上述[I]~[4]中任一項所述的方法得到的藻類的培養物中取得含有藻酸的組合物的步驟。
[0026][6]藻體干燥物，其為將根據上述[5]所述的制備方法所得到的含有藻酸的組合物進行干燥后的物質而得，且每Ikg中的藻酸含量為40g以上。
[0027][7]污泥減少劑，其中含有根據上述[5]所述的制備方法得到的含有藻酸的組合物。
[0028][8]有害物質吸附劑，其中含有根據上述[5]所述的制備方法得到的含有藻酸的組合物。
[0029][9]飼料，其含有根據上述[5]所述的制備方法得到的含有藻酸的組合物。
[0030][10]食品，其含有根據上述[5]所述的制備方法得到的含有藻酸的組合物。
[0031][11]藥品，其含有根據上述[5]所述的制備方法所得到的含有藻酸的組合物。
[0032]發明效果
[0033]根據本發明，在培 養中不供給光，而使用通用的微生物培養槽，使具有藻酸產生能力的藻類高效地增殖成為可能，進一步地，可以提供工業化的且高效地制備含有藻酸的組合物的方法。用本發明的方法得到的含有藻酸的組合物，含有大量藻酸，且作為污泥減少劑、有害物質吸附劑、飼料、食品或者醫藥品的原料是有用的。
【具體實施方式】
[0034]本發明的藻類的培養方法，其包括將具有藻酸產生能力的藻類進行異養培養的步驟。
[0035]本發明中所使用的藻類為具有藻酸產生能力，且屬于擬小球藻屬(Parachlorella)的藻類。
[0036]擬小球藻屬(Parachlorella)藻類曾經被分類為共球藻綱(Trebouxiophyceae)的小球藻屬，但根據利用了 18S rDNA和16S rDNA的分子系統發生學的解析，其形成了屬于共球藻綱且和其它小球藻屬藻類相區別的組，因此其作為與小球藻屬藻類不同的獨立屬而被認可。
[0037]作為屬于擬小球藻屬(Parachlorella)的藻類，列舉例如Parachlorellasp.binos、凱氏擬小球藻屬(Parachlorella kessleri)、拜氏擬小球藻屬(Parachlorellabeijerinckii)等藻類，但不限定于此，即使對于生物學上種類未經鑒別的藻類，只要其屬于擬小球藻屬(Parachlorella)或其親緣屬且具有藻酸產生能力，都可以在本發明中使用。
[0038]在此，屬于擬小球藻屬(Parachlorella)的親緣的藻類，是指在根據利用了 18SrDNA和16S rDNA的分子系統發生學的解析所得到的分子系統樹中，屬于擬小球藻屬(Parachlorella)的相鄰屬的藻類。即，只要其為具有藻酸產生能力且被分類為擬新月藻屬(Closteriopsis)、雙月藻屬(Dicloster)、海水小球藻屬(Marinichlorella)的藻類，都可以在本發明中使用。`
[0039]另外，在本發明使用的藻類可以是能夠進行異養培養藻類，但這一點目前為止不為人所知。即，具有光合性能，即使目前為止其為自養培養的藻類，但只要可以進行異養培養且具有藻酸產生能力，都可以在本發明中使用。
[0040]通常，擬小球藻屬(Parachlorella)藻類可以通過以下方式獲得:從野外采取的淡水樣品中，使用通常的培養基通過傳代培養分離藻類的群落，最終通過分子系統發生學進行解析從而確定種屬。
[0041]本發明中所使用的藻類具有產生藻酸的能力。藻酸可以為從擬小球藻屬(Parachlorella)藻類向細胞外分泌的藻酸，也可以為細胞內所蓄積的藻酸。在從擬小球藻屬(Parachlorella)藻類的培養液或該培養液的均漿中檢出藻酸的情況下，即判斷該擬小球藻屬(Parachlorella)藻類為具有藻酸產生能力的藻類。
[0042]藻酸為D-甘露糖醛酸與L-古洛糖醛酸任意進行聚合的物質。通常，其聚合度，即構成藻酸的單糖單元的數量為80以上，1100以下左右，分子量為15000以上，200000以下左右。但是，在本發明中，更低分子量的所謂藻酸低聚物也視為含有藻酸的物質。藻酸低聚物的聚合度為3以上，10以下左右，分子量為500以上，2000以下左右。
[0043]在本發明中，所謂藻酸，不僅包括游離的藻酸也包括其鹽(鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽、銨鹽等)。根據本發明的培養方法生產的藻酸可以利用例如間萘二酚顯色反應法(食品衛生學雜志第39卷5號297頁(1998年))進行定量。另外，在本發明中，作為藻酸的定量值，以換算為藻酸鈉量的量來表示。
[0044]作為本發明中所使用的藻類，優選具體例可以列舉Parachlorella sp.binosFERM BP-10969株。FERM BP-10969株保藏在下述保藏機構。
[0045](i)保藏機構的名稱和地址
[0046]名稱:獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心
[0047]地址:日本國茨城縣筑波市I 丁目I番地I中央第6
[0048](ii)保藏日:2008年2月28日
[0049](iii)保藏號:FERM P-21513
[0050](iv)國際保藏號:FERM BP-10969
[0051](V)從國內保藏到國際保藏的移交日:2008年5月23日
[0052]作為本發明中的具有藻酸產生能力且屬于擬小球藻屬(Parachlorella)的藻類，除了上述Parachlorella sp.binos FERM BP-10969株以外,還可以適當地利用其變異株或雜交株。
[0053]本發明中可以使用的FERM BP-10969株的變異株，是指表現出一些變異的FERMBP-10969株，但保持藻酸產生能力的株。另外，本發明中可以使用的FERM BP-10969株的雜交株，是指與FERM BP-1`0969株在分類上是同種，且為親緣關系比較遠的株與FERMBP-10969株進行交配而得到的，并保持藻酸產生能力的株。
[0054]需要說明的是，與通常的小球藻屬藻類相比，FERM BP-10969株含有每干燥重量2倍以上的葉綠素，光合能力非常高，因此一直以來，當然是進行自養培養。但是本發明的發明人發現，通過對FERM BP-10969株特意地進行異養培養，可以極有效地產生藻酸。
[0055]在本發明中，所謂進行異養培養，是指在黑暗條件下，使用含有作為能量源和/或碳源有機化合物的培養基進行培養。但是，在培養基中含有作為能量源和/或碳源利用充分量的有機化合物，不需要光和作用的條件下，則可以在明亮條件下進行培養。
[0056]本發明中的所謂黑暗條件下，是指不對培養液照射對于藻類細胞的增殖所必須量的光的條件。具體而言，培養液中的平均照度為低于700LuX，優選低于300LuX，更優選為低于IOOLux,進一步優選為低于IOLux,再進一步優選為低于ILux以下的條件。另外，也可以通過利用通常所使用的避光手段、或使用異養培養中通常所使用的培養槽，在實質上滿足上述平均照度的條件下實施培養。需要說明的是，由于培養基以及增殖的藻類細胞使光衰減，因此培養液中的照度根據光源的距離、藻類細胞的密度等而變化，培養液中的平均照度可以通過例如對放置在與培養中同樣環境中的培養液中的多個位置的照度進行測定，并以其平均值來計算。照度的測定，優選通過至少包括培養基的表面與最深處的2個以上位置，且12個以下位置來進行測定。
[0057]在本發明中，在異養培養具有藻酸產生能力的藻類時，作為能量源和/或碳源所使用的有機化合物只要為使該藻類可以進行同化作用的有機化合物即可，沒有特別限定，列舉例如葡萄糖、半乳糖、鹿糖、木糖、麥芽糖、纖維二糖、海藻糖、乳糖、甘露醇、各種低聚糖、淀粉等碳水化合物類；甲醇、乙醇、甘油、乙二醇、丙二醇等醇類；檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、丁酸、丙酸、乙酸等有機酸類；谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、賴氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、組氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、色氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸等氨基酸類；其他植物油脂或脂肪酸等油脂類等。上述等有機化合物，可以單獨使用也可以任意組合使用。另外，上述等的有機化合物不需要一定使用經精制后的物質，糖蜜、乳清、淀粉水解物等未精制原料也可以作為能量源和/或碳源來使用。
[0058]在本發明中，對具有藻酸產生能力的藻類進行異養培養時，作為能量源和/或碳源，向培養基添加的有機化合物的總量(在培養中對培養基進行補加或流加時為其合計量)，只要其為可以進行異養培養的量即可，沒有特別限制，但換算為該有機化合物中所含有的碳原子的重量，相對于培養開始時刻的IL的培養基液量，有機化合物的總量例如為2.5g以上，優選3g以上，更優選5g以上，進一步優選Sg以上，進一步更優選IOg以上，特別優選50g以上。
[0059]在本發明中，對具有藻酸產生能力的藻類進行異養培養時所使用的培養基，只要其可以使具有藻酸產生能力的藻類進行異養增殖，則沒有特別限制。但除了作為能量源和/或碳源所使用的上述有機化合物以外，也可以為例如由氮源、磷源、礦物質類等構成的物質，進一步可包含維生素類或消泡劑、pH調節劑等。作為上述氮源，例如可列舉氨和其鹽、尿素、硝酸和其鹽、氨基酸類等。作為上述磷源，例如可列舉磷酸和其鹽、多聚磷酸等。作為上述礦物質類，可列舉例如錳、鋅、銅、鈉、鉀、鐵、鈣和鑰等金屬的鹽，還有硼酸等。作為上述維生素類，例如可列舉維生素々、81、82、86、812、(:、0 3、1(、煙酸、泛酸、葉酸、生物素以及上述物質的前體或衍生物。氮源、磷源、礦物質類、維生素類以及其他的培養基成分不需要一定使用經精制后的物質，也可以利用例如酵母提取物、蛋白胨等天然成分。另外，上述成分可以任意組合使用。
[0060]在本發明中，具有藻酸產生能力的藻類的異養培養，可以通過在加入包含上述成為能量源和/或碳源的有機化合物、氮源、礦物質類、維生素類、以及其它成分的培養基的容器中，對具有藻酸產生能力的藻類進行接種，優選地一邊通氣和/或攪拌一邊培養來實施。培養溫度優選10°C~50°C的范圍，更優選20°C~40°C的范圍，進一步優選25°C~30°C的范圍。在培養溫度為小于10°C或者超過50°C的條件下，具有藻酸產生能力的藻類的增殖速度顯著降低，因此，作為工業化培養不適合。培養中的PH優選3.0~10.0的范圍，更優選4.0~9.0的范圍，進一步優選5.0~8.0的范圍。在培養中的pH為小于3.0，或pH超過10.0的條件下，具有藻酸產生能力的藻類的增殖速度顯著降低，因此，作為工業化培養不適合。
[0061 ] 在本發明中，對具有藻酸產生能力的藻類進行異養培養時所用的上述培養基的成分，可以在培養開始前一次性添加，也可以在培養中分批和/或連續地進行添加。然而，為了提高培養液中的藻類細胞密度，需要大量的作為能量源和/或碳源的有機化合物，優選分批和/或連續地進行添加。此時，培養液中的作為能量源和/或碳源而使用的有機化合物的濃度，換算為該有機化合物中所包含的碳原子的重量，優選維持在32g/L以下，更優選為16g/L以下，進一步優選為8g/L以下，更進一步優選為4g/L以下。
[0062]按照本發明的方法所得到的具有藻酸產生能力的藻類的培養液，根據需要，也可以繼續用不含有作為能量源和/或碳源的有機化合物的培養基進行培養。此時，在黑暗條件或在明亮條件任一條件下都可以進行。經過該2階段培養的培養物，特別地，可以適宜用作污泥減少劑或者有害物質吸附劑的原料。[0063]另外，為了確保本發明中所用的藻類的量，可以對該藻類進行前培養。相關的前培養在黑暗條件或在明亮條件任一條件下都可以進行。
[0064]根據本發明的培養方法，與現有的自養培養法相比，可以大幅提高每份培養液的藻體產量，也可以提高藻酸的產量。按照本發明的方法所得到的具有藻酸產生能力的藻類培養液，在培養結束時，每IL培養液能夠含有的藻體干燥物優選2g以上,更優選3g以上，進一步優選5g以上,進一步更優選IOg以上,特別優選50g以上。[0065]需要說明的是，培養液中的藻體干燥物濃度，例如可以用以下的方法進行測定。采集一定量的培養液，進行離心分離且去除培養上清液。用與培養液等量的水將得到的藻體再混懸，再次進行離心分離后去除洗滌液。經水洗的藻體干燥至恒重，計算重量。干燥藻體的恒重重量除以采集了的培養液量，從而計算出藻體干燥物濃度。
[0066]此外，令人驚訝的是，根據本發明的培養方法，也可以提高每份藻體的藻酸生產性能。根據本發明的培養方法，每Ikg藻體干燥物的生產性能換算為藻酸鈉量通常為40g以上，優選50g以上，更優選100g以上，特別優選150g以上。
[0067]根據本發明的培養方法，上述每份培養液的藻體產量的提高與每份藻體的藻酸生產性能的提高是相輔相成的，與現有的自養培養法相比，顯著地提高了每份培養液的藻酸生產性能。在本發明的培養方法中，在培養結束時，每IL培養液可以蓄積的藻酸，換算為藻酸鈉量優選為IOmg以上，更優選IOOmg以上,進一步優選500mg以上,進一步更優選1000mg以上，特別優選5000mg以上。
[0068]另外，本發明還包括含有藻酸的組合物的制備方法，其特征在于，從通過上述本發明的培養方法得到的培養物制得含有藻酸的組合物的步驟。換言之，對屬于擬小球藻屬(Parachlorella)且具有藻酸產生能力的藻類進行異養培養，利用所得到的培養物來制備含有藻酸的組合物的方法都屬于本發明的范疇。
[0069]本發明中的含有藻酸的組合物，只要其為含有藻酸和/或其鹽的組合物即可，沒有特別限制，可以是除了藻酸以外還含有來自藻類的成分、以及藻體或其破碎物等的組合物，也可以是去除藻體等后含有高純度藻酸本身的組合物。即，作為用本發明的制備方法得到的含有藻酸的組合物，以下任意物質都符合:例如培養具有藻酸產生能力的藻類而得到的培養液其本身、從該培養液中得到的藻體、提高了培養液中的藻體濃度的濃縮培養液、和/或從該培養液中去除藻體后的培養上清等。另外，根據需要通過對該培養液、藻體、濃縮培養液和/或培養上清進行干燥、純化等處理，提高了藻酸和/或其鹽的含有量，該處理物也包含在通過本發明的制備方法所得到的含有藻酸的組合物中。需要說明的是，作為后述的污泥減少劑或有害物質吸附劑利用含有藻酸的組合物時，作為含有藻酸的組合物，優選除了藻酸以外還含有藻體或其破碎物等的組合物。
[0070]在本發明中，從對具有藻酸產生能力的藻類進行異養培養所得到的培養物中取得含有藻酸的組合物的方法并沒有特別限制，例如通過用上述本發明的培養方法進行培養，從而得到含有藻酸的培養液，通過對該培養液實施離心分離、過濾等操作可以分別分離出含有藻酸的培養上清液、濃縮培養液、和/或藻體。根據需要，也可以對上述等的培養液、培養上清液、濃縮培養液、和/或藻體通過冷凍干燥、噴霧干燥、轉鼓式干燥、減壓干燥等手法進行干燥。進一步地，通過單獨或者組合使用公知的手法，可以從培養液、培養上清液、濃縮培養液、藻體、和/或上述等的干燥物中，制備更高濃度的含有藻酸的組合物。例如可以使用下列方法:向培養上清液中添加硫酸等酸，通過離心分離、過濾等手法分取不溶解的藻酸的方法；向培養上清液添加氯化鈣等金屬鹽，通過離心分離、過濾等手法分取凝膠化的藻酸的方法；向培養上清液中添加乙醇、丙酮、異丙醇等水溶性有機溶劑，通過離心分離、過濾等手法分取不溶解的藻酸的方法等。另外，例如通過用碳酸鈉水溶液等堿性水溶液對藻體進行洗滌和/或提取，并用離心分離、過濾等手法去除不溶物，可以從藻體中分取到藻酸鈉等藻酸鹽。進一步地，例如，對經分取的藻酸鹽的水溶液進行與前述培養上清液相同的處理，可以制備更高濃度的含有藻酸的組合物。
[0071]進一步地，本發明也涉及含有通過上述本發明的制備方法所得到的含有藻酸的組合物的污泥減少劑或有害物質吸附劑。
[0072]在本發明中，所謂污泥減少劑是指組合物，其在通過活性污泥法對有機排水的處理中，通過向活性污泥添加的操作，具有降低最終產生的剩余污泥量效果。
[0073]根據本發明的污泥減少劑的使用條件可以適宜進行調整，例如，相對于I噸污泥，本發明的污泥減少劑換算為干燥狀態可以以20g以上、200g以下左右進行添加。在添加后，為了確保充分的溶液含氧量可以對混合物進行攪拌或鼓泡。處理溫度可以為常溫。處理時間根據應處理的污泥的量等，可以設為10小時以上、10日以下。
[0074]所謂有害物質吸附劑，是指通過使其與污染物接觸從而吸附污染物中的有害物質，之后，通過從污染物中進行分離，去除污染物中一部分或者全部的有害物質而使用的組合物。作為有害物質，可以列舉例如銫-137、銫-134、鍶-89、鍶-90、鍶-91、碘-131、碘-133等放射性元素；鉛、銅、鎘、砷等重金屬類；含有上述的化合物等，但并不限定于此。本發明的有害物質吸附劑的使用條件，可以按照上述污泥減少劑的使用條件來調整。
`[0075]在本發明中，制備包含有含有藻酸的組合物的污泥減少劑或有害物質吸附劑的方法并沒有特別限制，例如對通過本發明的培養方法得到的培養物，根據需要進一步在不含有作為能量源和/或碳源的有機化合物的培養基中進行培養，之后通過濃縮、干燥，得到按照本發明的制備方法的含有藻酸的組合物，可以將上述組合物直接利用或者適宜進行加工后再利用。`
[0076]另外，本發明也涉及包含有按照上述本發明的制備方法得到的含有藻酸的組合物的飼料、食品或藥品。
[0077]在本發明中，所謂食品，是指人類以營養素的攝取、喜好為目的而攝取的物質，除了日常飲食的通常食品以外，還包括營養補充食品，例如營養輔助劑或特定保健用食品等，還包括食品添加物等。
[0078]本發明中的所謂飼料，是指除人類以外的生物以營養元素的攝取為主要目的而攝取的物質。例如指給予魚類、甲殼類、貝類等水產動物；雞、鵪鶉、鴨等家禽類；牛、豬、羊等畜產動物；狗、貓等玩賞動物等的飼料、飼料添加物、或者營養補充食品等，但并不限定于此。
[0079]本發明中的所謂醫藥品，是指用于預防或者治療人或其他動物的疾病、癥狀的物
品O
[0080]按照本發明的制備方法而得到的含有藻酸的組合物，可以適宜加工成粉末劑、片劑、膠囊劑等，或通過與食品原料、飼料原料混合，用作上述等的飼料、食品、醫藥品。本發明的包含有含有藻酸的組合物的飼料、食品或醫藥品利用藻酸的物理性質可以用于對食品、藥劑增加粘性或增稠感，或作為含有食物纖維的組合物進行利用，此外，也可以以高血壓的預防/治療、血液中膽固醇的抑制作用或血糖值的上升抑制作用、消除便秘、動脈硬化的預防/治療等為目的而進行利用。進一步地，對由于攝取藻酸而產生鍶的體外排泄作用進行利用，從而可以作為鍶-89、鍶-90、鍶-91等放射性鍶的體內殘留防止劑而進行利用。
[0081]本申請基于2011年9月9日所申請的第2011-197212號日本專利申請，要求優先權的利益。2011年9月9日所申請的第2011-197212號日本專利申請的說明書的全部內容，為參考援用于本發明。
[0082]實施例
[0083]以下，通過實施例對本發明進行更詳細說明。需要說明的是，在本實施例中，培養液的藻體干燥物含量以及藻酸濃度，沒有特別說明時，如下測定。
[0084]培養液的藻體干燥物含量
[0085]對一定量的培養液以3000XG進行離心分離后去除上清液。接著，用5mL水將沉淀的藻體再混懸，同樣進行離心分離后去除上清液。進一步地，使水洗后的藻體在110°C干燥8小時使其恒重后進行稱量，計算出每IL培養液中所含有的藻體干燥物的重量。
[0086]培養液中的藻酸濃素
[0087]用水將培養液進行適度稀釋，取該稀釋培養液ImL加入銅-鹽酸試劑2mL及間萘二酚試劑lmL，在沸騰水浴中加熱65分鐘。該銅-鹽酸試劑為向40mL濃鹽酸中加入2.5%硫酸銅水溶液ImL及9mL水配制而成。另外，該間萘二酚試劑為將1，3- 二羥基萘IOOmg用25mL水進行溶解配制而成。將上述培養液在冰水混合液中冷卻，加入4mL乙酸丁酯進行攪拌后，進行離心分離。乙酸`丁酯層用孔徑0.45 μ m的過濾器(Cosmonice Filter S ；NACALAITESQUE株式會社生產)過濾，在566nm下進行比色定量。使用以藻酸鈉300~400cP (和光純藥工業株式會社生產)作為標準品制成的標準曲線，將樣品中的藻酸濃度換算為藻酸鈉來計算。
[0088]實施例1
[0089]將由葡萄糖20g/L、磷酸二氫鉀lg/L、七水合硫酸鎂lg/L、氯化鈣0.01g/L、尿素2g/L、七水合硫酸鐵5mg/L、ArnonJ s A5溶液lmL/L(Arnon，s A5溶液的組成:硼酸2.86g/L、四水合氯化錳1.81g/L、四水合硫酸銅0.08g/L、七水合硫酸鋅0.22g/L、四水合鑰酸銨0.17lg/L)所組成的培養基(pH6.5) IOOmL放入搖瓶中殺菌后，接種Parachlorellasp.binos FERM BP-10969，用鋁箔避光后，在30°C振蕩培養72小時。培養結束后，測定該培養液的藻體干燥物含量為9.0g/L。另外，測定該培養液中的藻酸濃度時，換算為藻酸鈉為
0.52g/L。即，每Ikg藻體干燥物的藻酸產量為58g。
[0090]實施例2
[0091]將與實施例1相同組成的培養基IOOmL放入搖瓶中殺菌后，接種Parachlorellasp.binos FERM BP-10969，用鋁箔避光后，在暗處、30°C振蕩72小時，進行前培養。接著，將由葡萄糖10g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、七水合硫酸鎂1.5g/L、氯化鈣20mg/L、尿素3.5g/L、七水合硫酸鐵10mg/L、檸檬酸0.lg/L、Arnon’ s A5溶液(Arnon，s A5溶液的組成與實施例1相同)lmL/L、Adekanol LG109 (株式會社ADEKA生產)0.lg/L所組成的培養基2000mL放入5L容量的發酵罐殺菌后，接種上述前培養液200mL，用鋁箔避光后，在內溫30°C、通氣量2L/分、攪拌數450rpm、pH6~7下培養143小時。使用30% (w/w)的氫氧化鈉水溶液控制pH下限，使用15% (w/w)的硫酸水溶液控制pH上限。另外，從培養開始的23小時后開始，將經殺菌的流加用培養基流加到培養液中。適宜調節流加用培養基的添加速度，以使培養液中的葡萄糖濃度不超過20g/L，到培養結束后共計添加了 560mL培養液。流加用培養基的組成是:葡萄糖570g/L、磷酸二氫鉀20g/L、七水合硫酸鎂12g/L、氯化鈣1.25g/L、尿素42g/L、七水合硫酸鐵700mg/L、Arnon’ s A5溶液10mL/L、梓檬酸4.5g/L。
[0092]培養結束后，測定該培養液的藻體干燥物含量為54.3g/L。另外，測定該培養液中的藻酸濃度時，換算為藻酸鈉為3.4g/L。即，每Ikg藻體干燥物的藻酸產量為63g。
[0093]實施例3
[0094]將由葡萄糖lllmM(20g/L)、硝酸鉀50mM、磷酸二氫鉀9.2mM、磷酸氫二鉀0.57mM、硫酸續 10mM、氯化鈉 31mM、EDTA0.14mM、硫酸鐵 0.llmM、Arnon’ s A5 溶液(Arnon，s A5溶液的組成與實施例1相同)lmL/L所組成的培養基IOOmL放入搖瓶進行殺菌后，接種Parachlorella sp.binos FERM BP-10969，用鋁箔避光后，在30°C振蕩培養72小時。離心分離該培養液，去除上清液后，加入無機鹽培養基(硝酸鉀2.5mM、磷酸二氫鉀1.3mM、硫酸鎂 0.3mM、氯化鈉 0.43mM、氯化鈣 0.23mM、磷酸二氫銨 1.7mM、氯化鐵 0.047mM、Arnon’ s A5溶液2mL/L) IOOmL進行再混懸，進一步在30°C振蕩16小時。培養結束后，測定該培養液的藻體干燥物含量為3.5g/L。另外，測定該培養液中的藻酸濃度時，換算為藻酸鈉為0.Hg/L0 即，每Ikg藻體干燥物的藻酸產量為40g。
[0095]比較例1:自養培養
[0096]將由硝酸鉀2.5g/L、磷酸二氫鉀17.5g/L、七水合硫酸鎂7.5g/L、氯化鈣2.5g/L、氯化鈉 2.5g/L、磷 酸二氫銨 20g/L、氯化鐵 6.5mg/L、Arnon’ s A5 溶液 2mL/L(Arnon，s A5溶液的組成與實施例1相同)所組成的培養基(PH6.5) 1000mL加入燒瓶進行殺菌后，接種Parachlorella sp.binos FERM BP-10969，在約 7000Lux 的照度下，于 25°C振蕩培養 9 天。培養結束后，測定該培養液的藻體干燥物含量為67mg/L。另外，測定該培養液中的藻酸濃度時，換算為藻酸鈉為2.3mg/L。即，每Ikg藻體干燥物的藻酸產量為34g。
[0097]實施例4
[0098]將由葡萄糖20g/L、磷酸二氫鉀lg/L、七水合硫酸鎂lg/L、氯化鈣0.01g/L、尿素2g/L、七水合硫酸鐵5mg/L、Arnon’ s A5溶液lmL/L (Arnon，s A5溶液的組成:硼酸
2.86g/L、四水合氯化錳1.81g/L、四水合硫酸銅0.08g/L、七水合硫酸鋅0.22g/L、四水合鑰酸銨0.17lg/L)所組成的培養基(pH6.5)400mL放入2L容量的搖瓶進行殺菌后，接種Parachlorella sp.binos FERM BP-10969，用鋁箔避光后，在30°C振蕩培養48小時，得到前培養液。
[0099]將由酵母提取液3g/L、磷酸二氫鉀11.5g/L、七水合硫酸鎂7.5g/L、氯化鈣0.65g/L、檸檬酸2.4g/L、七水合硫酸鐵0.36g/L、Arnon’ s A5溶液lmL/L (Arnon，s A5溶液的組成:硼酸2.86g/L、四水合氯化錳1.81g/L、四水合硫酸銅0.08g/L、七水合硫酸鋅0.22g/L、四水合鑰酸銨0.17lg/L)所組成的培養基(pH6.0) 10L，放入30L容量的發酵罐中進行蒸煮殺菌。對該溶液接種上述前培養液，在通氣量18 L /分、30°C、pH6.0的條件下培養120小時。在培養中，連續地添加經殺菌的55重量％葡萄糖水溶液合計5.4kg，調整攪拌數以使培養液的溶解氧濃度為0.1ppm以上。另外,使用25重量％的氨水對培養液的pH進行調整。
[0100]培養結束后，測定該培養液的藻體干燥物含量時為93.0g/Lo另外，測定該培養液中的藻酸濃度時，換算為藻酸鈉為15.8g/L。即，每Ikg藻體干燥物的藻酸產量為170g。
[0101]實施例5
[0102]對實施例2中得到的Parachlorella sp.binos FERM BP-10969的培養液進行冷凍干燥、噴霧干燥或轉鼓式干燥，得到含有藻酸的組合物。冷凍干燥使用冷凍干燥機FD-1型(東京理化器械株式會社)，噴霧干燥使用Mini SprayDryer B-290型(Buchi公司)、轉鼓式干燥使用Double drum型干燥機(Φ 400 X L500mm ;Katsuragi工業株式會社)分別實施。對得到的干燥物中的藻酸含量進行測定的結果是，冷凍干燥品為16.4重量％，噴霧干燥品為15.7重量％,轉鼓式干燥品為15.2重量％。
[0103]比較例2:自養培養
[0104]將由磷酸二氫鉀175mg/L、磷酸二氫銨200mg/L、七水合硫酸鎂75mg/L、氯化鈣25mg/L、氯化鈉25mg/L、硝酸鉀250mg/L、七水合硫酸鐵5mg/L、Arnon’ s A5溶液ImL/L (ArnonJ s A5溶液的組成:硼酸2.86g/L、四水合氯化猛1.81g/L、四水合硫酸銅0.08g/L、七水合硫酸鋅0.22g/L、四水合鑰酸銨0.17lg/L)所組成的培養基(pH7.0)500mL放入IL容量的三角燒瓶中，接種Parachlorella sp.binos FERM BP-10969后，在約7000Lux的照度、25°C，利用二氧化碳進行鼓泡從而進行培養10天。培養結束后，測定該培養液的藻體干燥物含量時為850mg/L。另外,測定該培養液中的藻酸濃度時,換算為藻酸鈉為26.lmg/L。即，每Ikg藻體干燥物的藻酸產量為31g。
[0105]根據以上實施例和參考例的結果，與具有藻酸產生能力的屬于擬小球藻屬(Parachlorella)的藻類進行自養培養時進行比較，可知通過異養培養具有藻酸產生能力的屬于擬小球藻屬 的藻類，其每份培養容積的藻酸的產量大大地提高了。另外，同時也可知，相對于培養中所生產的藻體干燥物重量，藻酸的產量也提高了。
【權利要求】
1.藻類的培養方法，其包括將屬于擬小球藻屬(Parachlorella)且具有藻酸產生能力的藻類進行異養培養的步驟。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，屬于擬小球藻屬(Parachlorella)的藻類為Parachlorella sp.Binos FERM BP-10969。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，在平均照度小于700LUX的黑暗條件下培養藻類。
4.根據權利要求1~3中任一項所述的方法，其中，用液體培養基培養藻類，并且，相對于培養開始時的該液體培養基量1L，該液體培養基中的有機化合物的總使用量換算為碳原子的重量為2.5g以上。
5.含有藻酸的組合物的制備方法，其包括從根據權利要求1~4中任一項所述的方法得到的藻類的培養物中取得含有藻酸的組合物的步驟。
6.藻體干燥物，其為將根據權利要求5所述的制備方法得到的含有藻酸的組合物進行干燥而得，且每Ikg中的藻酸含量為40g以上。
7.污泥減少劑，其含有根據權利要求5所述的制備方法得到的含有藻酸的組合物。
8.有害物質吸附劑，其含有根據權利要求5所述的制備方法得到的含有藻酸的組合物。
9.飼料，其含有根據權利要求5所述的制備方法得到的含有藻酸的組合物。
10.食品，其含有根據權利要求5所述的制備方法得到的含有藻酸的組合物。
11.藥品，其含有根據權利要求5`所述的制備方法得到的含有藻酸的組合物。
【文檔編號】A61P9/12GK103827288SQ201280043904
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年9月6日 優先權日:2011年9月9日
【發明者】木崎憲之, 古田武, 毛利拓, 田岡直明 申請人:株式會社鐘化