抗淀粉樣蛋白的ɑ-螺旋阻斷超小肽療法

抗淀粉樣蛋白的ɑ-螺旋阻斷超小肽療法
【專利摘要】本發明提供了能夠阻止淀粉樣蛋白形成/淀粉樣變性的超小肽抑制劑。
【專利說明】抗淀粉樣蛋白的α-螺旋阻斷超小肽療法
[0001]本發明提供了能夠阻止淀粉樣蛋白形成(amyloid formation)/淀粉樣變性(amyloidosis)的超小肽抑制劑。
[0002]發明人最近發現一種系統性設計的超小肽可以逐步形成淀粉樣結構。該啟動步驟通過關鍵的α-螺旋中間結構發生，而該α-螺旋中間結構在最終的β_型淀粉樣蛋白結構形成前建立。抗淀粉樣蛋白肽療法的基本原理因此是基于使用阻止α-螺旋中間結構形成的抑制性肽這樣的理念。
[0003]淀粉樣蛋白是不可溶的、富含交叉折疊片結構的蛋白質原纖維的組織沉積物。淀粉樣原纖維的形成過程在多種多樣且與結構上無關的病理過程中均為關鍵事件。這包括許多慢性的、衰竭性的及日漸流行的疾病，可以大致分為:1)神經退行性疾病，例如:阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏病；2)非神經性的局限性淀粉樣變性，例如2型糖尿病；以及3)發生在多種組織中的系統性淀粉樣變性。盡管與這些蛋白質錯折疊疾病(PMDs)相關的癥狀和蛋白質單體存在差異，似乎存在一種分子水平上蛋白質聚集的共同機制。淀粉樣原纖維的形成是通過分子識別和自組裝過程，該自組裝過程通常肇始于一段熱力學意義上不利的停滯期，目的是為了形成“核或種子”。隨之而來的則是一段熱力學意義上有利的指數生長期，在此期間單體/寡聚物被加到成長的核上。蛋白質的構象轉變從可溶的無規卷曲形式經由具α-螺旋的中間物形成為不可溶的交叉β-折疊纖維聚合物，這被認為是淀粉樣蛋白生成(amyloidogenesis)的重要事件。
[0004]為了抑制這一過程，最近的科學研究集中在更深入地了解淀粉樣變性的分子識別和自組裝的機制，尚沒有針對上述任一種疾病的有效的預防和治療。因此急需可安全地拮抗和阻止淀粉樣蛋白生成的小分子作為治療藥物。抗淀粉樣蛋白候選物也需能夠滿足嚴格的要求，例如高效和易于攝取，在體內有足夠長的半衰期和循環時間，無毒性，且具有治療神經退行性疾病所需的通過血腦屏障(BBB)的通透性。此外，由于新增證據表明前原纖維寡聚中間物可能比成熟的淀粉樣纖維毒性更高，所以在早期阻斷或逆轉自組裝過程變得非常重要。
[0005]因此，本發明的目的是提供一種具有上述特性的新型化合物。
[0006]本發明的目的是通過分離的α -螺旋阻斷肽來解決，該分離的α _螺旋阻斷肽具有通式
[0007]Z-(X)m-Proline-(X)n,
[0008]其中
[0009]Z為N端保護基團；
[0010]X在每次出現時為獨立地選自氨基酸和氨基酸衍生物；以及
[0011]m和η表示氨基酸和氨基酸衍生物的數量，并為獨立地選自I到5之間的整數，且m+n ^ 6。
[0012]脯氨酸使用三字母 密碼子(Pro)或單字母密碼子(P)來縮寫。
[0013]在一個實施方案中，m+n ( 5,優選地< 4,更優選地< 3。
[0014]“氨基酸和氨基酸衍生物”包括:天然和非天然存在的L-型和D-型氨基酸和氨基酸衍生物、模擬肽氨基酸和非標準氨基酸；該非標準氨基酸不是由標準細胞內機制產生的，是僅存在于經翻譯后修飾的蛋白質中，或是代謝中間產物，例如羥脯氨酸、硒代甲硫氨酸、肉毒堿、2-氨基異丁酸、脫氫丙氨酸、羊毛硫氨酸、GABA和β -丙氨酸。
[0015]在一個實施方案中，X在每次出現時均獨立地選自天然氨基酸。
[0016]在一個實施方案中，至少一個X為D-型氨基酸或模擬肽氨基酸。
[0017]在一個實施方案中，X在每次出現時均獨立地選自非芳香族氨基酸和氨基酸衍生物。
[0018]在一個實施方案中，所述非芳香族氨基酸選自異亮氨酸(He，I)、亮氨酸(1^11，0、纈氨酸(￥&1，￥)、丙氨酸(41&^)、甘氨酸(617，6)、天冬氨酸(4鄧，0)、天冬酰胺(八811，幻、谷氨酸(61113)、谷氨酰胺(6111，0)、絲氨酸(5#，5)、蘇氨酸(1111.，!')和賴氨酸(Lys, K)。
[0019]在一個實施方案中，所述肽的N端氨基酸的疏水性比所述肽的C端氨基酸更強。在一個實施方案中，疏水性由N端向C端減弱。
[0020]在一個實施方案中，m和η是1，即，所述肽具有通式
[0021]Z~K_Proline~K。
[0022]在一個實施方案中，所述N端保護基團具有通式-C(O) -R，其中R選自氫、烷基和取代烷基。在一個實施方案中，R選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基和異丁基。
[0023]在一個優選實施方案中，所述N端保護基團為乙酰基(R為甲基)。
[0024]在一個實施方案中，所述肽的C末端酰胺化或酯化，其中，優選地，C末端具有通式-C0NHR，且R選自氫、烷基和取代烷基，或通式-C00R，其中R選自烷基和取代烷基。
[0025]在一個實施方案中，在水溶液中準備所述肽，所述水溶液可選擇地包括生理緩沖液。
[0026]在一個實施方案中，所述肽基于下述肽發展而來:Z-LIVAGDD (SEQ ID N0:1)、Z-LIVAGEE (SEQ ID NO:2),Z-LIVAGD (SEQ ID NO:3),Z-1LVAGD (SEQ ID NO:4),Z-LIVAAD(SEQ ID NO:5)、Z-LAVAGD (SEQ ID NO:6)、Z-AIVAGD (SEQ ID NO:7)、Z-LIVAGE (SEQ IDNO:8)、Z-LIVAGK (SEQ ID NO:9)、Z-LIVAGS (SEQ ID NO:10),Z-1LVAGS (SEQ ID NO:11)、Z-AIVAGS (SEQ ID NO: 12),Z-LIVAGT (SEQ ID NO: 13),Z-AIVAGT (SEQ ID NO: 14),Z-LIVAD(SEQ ID NO: 15)、Z-LIVGD (SEQ ID NO: 16), Z-1VAD (SEQ ID NO: 17), Z-1IID (SEQ IDNO: 18)、Z-1IIK (SEQ ID NO: 19)和 Z-1VD (SEQ ID NO:20);這些作為基礎的肽中，除了 N端或C端之外的一個氨基酸被替換為脯氨酸(Pro, P)。例如，根據本發明的分離α-螺旋阻斷肽可能以上述列表中的肽Z-LIVAGD (SEQ ID NO:3)為基礎，因此從Z-LPVAGD (SEQID NO:21)、Z-LIPAGD (SEQ ID NO:22)、Z-LIVPGD (SEQ ID NO:23)和 Z-LIVAPD (SEQ IDNO:24)中選擇。
[0027]在一個實施方案中，所述肽選自Z-LPVAGD (SEQ ID NO:21), Z-LIPAGD (SEQ IDNO:22)、Z-LIVP⑶(SEQ ID NO:23)、Z-LIVAPD (SEQ ID NO:24), Z-1PD (SEQ ID NO:25)、Z-NPI (SEQ ID NO:26), Z-1PN (SEQ ID N0:27)、Z_IPI (SEQ ID NO:28), Z-APA (SEQ IDNO:29), Z-LPI (SEQ ID NO:30), Z-1PL (SEQ ID NO:31), Z-LPL (SEQ ID NO:32), Z-APF(SEQ ID NO:33)、Z-KPA-CONH2 (SEQ ID NO:34), Z-LPD (SEQ ID NO:35), Z-LPE (SEQ IDNO:36)、Z-1PK-CONH2 (SEQ ID NO:37), Z-APD (SEQ ID NO:38), Z-1PF (SEQ ID NO:39)、Z-1PS (SEQ ID NO:40)、Z-1PW (SEQ ID NO:41),Z-APS (SEQ ID NO:42)、Z-NPK-CONH2 (SEQID N0:43)和Z-LPG (SEQ ID N0:44)。SEQ ID N0s45至60代表上述序列的具體實施例。
[0028]本發明的目的也通過如上定義的用作為藥物的分離α -螺旋阻斷肽來解決。
[0029]本發明的目的還通過如上定義的用于治療與淀粉樣變性相關的疾病的分離α -螺旋阻斷肽來解決。
[0030]在一個實施方案中，所述與淀粉樣變性相關的疾病選自下列疾病:神經退行性疾病例如阿爾海默茨病、帕金森病、亨廷頓氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS),朊病毒相關或海綿狀腦病例如克雅二氏病(Creutzfeld-Jacob)、路易體癡呆(Dementia with Lewy bodies)、伴有帕金森病的額顳葉癡呆、脊髓小腦共濟失調、17型脊髓小腦共濟失調、脊髓延髓肌肉萎縮癥、遺傳性齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(Hereditary dentatorubral-pallidoluysian atrophy)、家族性英國型癡呆、家族性丹麥型癡呆，非神經性局限性疾病(Non-neuropathic localizeddiseases)例如II型糖尿病、甲狀腺髓樣癌、心房性淀粉樣變性、遺傳性淀粉樣變性腦溢血、垂體泌乳素瘤、注射局部淀粉樣變性(injection-localized amyloidosis)、主動脈中膜淀粉樣變性、遺傳性格子狀角膜營養不良、與倒睫相關的角膜淀粉樣變性、白內障、牙源性鈣化上皮瘤、肺泡蛋白沉積癥、包涵體肌炎、皮膚淀粉樣變性苔蘚，非神經性系統性淀粉樣變性例如AL型淀粉樣變性、AA型淀粉樣變性、家族性地中海熱、老年系統性淀粉樣變性、家族性淀粉樣多神經病、血透相關的淀粉樣變性、ApoAI淀粉樣變性、ApoAII淀粉樣變性、ApoAIV淀粉樣變性、芬蘭遺傳性淀粉樣變性、溶菌酶淀粉樣變性、纖維蛋白原淀粉樣變性、冰島遺傳性腦淀粉樣血管病、家族性淀粉樣變性，以及發生在多種組織中的系統性淀粉樣變性例如輕鏈淀粉樣變性。 [0031 ] 在一個實施方案中，所述肽為口服施用。
[0032]本發明的目的還通過包含了如上定義的分離α -螺旋阻斷肽的藥物組合物來解決。
[0033]在一個實施方案中，所述藥物組合物還包括至少一種藥學上可以接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑。
[0034]在一個實施方案中，所述藥物組合物還包括一價或二價金屬鹽，優選地為二價金屬鹽。
[0035]在一個實施方案中,所述金屬選自鈉、鎂、和鋅。
[0036]本發明的目的還通過如上定義的分離α -螺旋阻斷肽在制備治療與淀粉樣變性相關的疾病的藥物中的用途來解決。
[0037]本發明的目的還通過治療與淀粉樣蛋白變性相關疾病的方法來解決，所述方法包括將如上定義的分離α-螺旋阻斷肽或如上定義的藥物組合物給藥于所需要的人的步驟。優選地，所述分離α-螺旋阻斷肽或所述藥物組合物為口服施用。
[0038]本發明的目的還通過解聚淀粉樣蛋白斑或阻止其形成的方法來解決，所述方法包括將如上定義的分離α -螺旋阻斷肽與所述淀粉樣蛋白斑接觸，從而解聚所述淀粉樣蛋白斑或阻止其形成。
[0039]在一個實施方案中，該方法還包括將所述淀粉樣蛋白斑與一價或二價金屬鹽接觸，優選為二價金屬鹽，其中，優選地，所述金屬選自鈉、鎂、鈣和鋅。[0040]發明人令人驚訝地發現特異性的、合理設計的超小肽可以抑制淀粉樣蛋白形成。這些抑制肽由可以干擾和阻止α-螺旋中間結構的3-7個天然氨基酸組成。這些中間結構被認為在驅動淀粉樣蛋白聚集并因此導致淀粉樣蛋白形成的構象轉變階段中非常重要。特別地，發明人相信蛋白質從無規卷曲到α-螺旋的構象改變在分子自我識別中起到了重要的作用。通過阻斷或抑制到α-螺旋的轉變，可以在極早期(g卩，立刻或在幾分鐘內)中止/逆轉淀粉樣蛋白聚集過程。因此，這些抗淀粉樣蛋白肽也可以被視為α-螺旋阻斷物。抗淀粉樣蛋白肽能夠識別錯誤折疊蛋白質的短淀粉樣蛋白識別基序并與所述基序相互作用，而其自身具有非常低的自組裝成為有序超分子結構的傾向。由于抗淀粉樣蛋白肽的長度短，特別是3聚體(3-mers)，其在有利于口服送藥和血腦屏障通透性的同時，有可能避開蛋白酶識別和分解。另外，由于該些超小肽由無毒的氨基酸和氨基酸衍生物制成，優選地天然氨基酸，因此所述超小肽是無毒的。此外，為了幫助已存在的淀粉樣蛋白的解聚，優選存在一價或二價金屬鹽。
[0041]總而言之，這些超短肽的小尺寸使其易于且有效地口服吸收，這是在給藥方面的核心優勢。此外，這些超短肽的小尺寸保證了以低成本來簡單批量合成。在一個優選實施例中，因為基于肽的療法是由天然氨基酸制成，所以其是無毒性的、無免疫原性的且有生物相容性的。長度上僅為3個氨基酸的超短肽還能夠跨越血腦屏障，這是靶向抗神經退行性疾病治療的核心要求。最后，該短肽基序有可能逃避內源性蛋白酶的識別和分解，因此提供了在生物體液和組織中更長的半衰期和生物有效性。
[0042]開發一種抑制淀粉樣蛋白生成的有效小分子藥物具有巨大且有吸引力的市場潛力，特別是由于存在 表明在大范圍的疾病中存在淀粉樣蛋白聚集的共同分子基礎的大量證據。例如，僅僅是與淀粉樣變性相關的眾多疾病中的一種的阿爾茨海默病，是發達國家中老年癡呆(50-70%)最常見的成因和導致死亡的主要原因。在2010年，估計有3560萬人患有癡呆，這一數字預期將在2030年近乎翻倍達到6570萬以及在2050年達到11540萬。另一個實例是11型糖尿病，這占了成人確診糖尿病病例總數的90-95%。因為現有可用的口服藥物旨在維持血糖達標，所以存在開發阻止引起胰臟細胞死亡的胰島淀粉樣蛋白形成的口服治療的需求。一些現有藥物還具有嚴重的副作用將被使用天然生物大分子所克服。就此，根據本發明的超小抑制肽在嘗試克服現有藥物的問題和局限性的同時，有望解決現有治療需求。
[0043]對附圖做出說明，其中
[0044]圖1示出肽Ac-LD6, Ac-NL6和Ac-1D3在溶液形式(以較低濃度)和水凝膠形式(以較高濃度)中的圓二色性(CD)波譜；
[0045]圖2示出硫黃素T (ThT)結合到阿爾茨海默病的核心序列KE7隨著時間推移與熒光增強的相關聯(=陽性對照；100 μ M)。在每個時間點測量9個獨立樣品(實驗增益值設定:55)；
[0046]圖3到17示出硫黃素T (ThT)結合到阿爾茨海默病的核心序列KE7在不存在和存在抑制肽I至5和7至16的情況。在每個時間點測量9個獨立樣品(實驗增益值設定:55)；
[0047]圖18示出對照值的分布(水加ThT染料)；
[0048]圖19和20示出抑制肽自身沒有增強ThT熒光；[0049]圖21概述了用于本發明的抑制肽的篩選步驟；
[0050]圖22示出使用場發射掃描電鏡(FESEM)對本發明的抑制肽進行形態學研究；
[0051]圖23示出溶血實驗測試本發明的抑制肽的生物相容性；
[0052]圖24示出在不同的NaCl濃度下，來源自10mg/mL Ac-LD6 (L)的水凝膠的作為角頻率(rad/sec)的函數的儲能模量G V機械強度；
[0053]圖25示出肽Ac-NL6在三種不同濃度的圓二色性(⑶)波譜(A)和肽Ac_NL6&Ac-LD6的水凝膠(B)；
[0054]圖26示出由1.5mM的Ac-KE7 (綠色)形成的水凝膠和1.5mM的Ac-KE7按1:20的摩爾比例與Ac-LPE (酒紅色)和Ac-LPG (紅色)相混合時的肽抑制劑溶液(非凝膠化)的流變學數據。圖表顯示儲能模量(G’以Pa表示)(A)在1%應變(strain)時作為角頻率(rad/sec)的函數,和(B)在室溫25°C角頻率為lrad/sec時的振蕩應變(oscillation strain)；
[0055]圖27示出使用U87人類膠質母細胞瘤細胞在不同濃度及存在或不存在抑制劑溶液中和的情況下抑制肽Ac-LG3和Ac-LE3的活/死細胞毒性檢測的結果；
[0056]圖28示出抑制肽Ac-LG3和Ac-LE3在不同濃度及存在或不存在抑制劑溶液中和的情況下WST-1檢測的結果；
[0057]圖29示出使用HeLa和SHSY5Y神經母細胞瘤細胞在不同濃度及存在或不存在抑制劑溶液中和的情況下對本發明的抑制肽進行活/死細胞毒性檢測的結果。以mg/ml表示的數值指示在96孔板的每個孔中抑制劑的終濃度；
[0058]圖30示出抑制肽Ac-LPG和Ac-LPE的IC5tlS型曲線；
[0059]圖31示出用于制備本發明抑制肽的固相肽合成示意圖及用1H NMR和LC-MS描述其特性的實例；以及
[0060]圖32示出在不存在和存在抑制肽I和2的情況下對肽Ac-KE7和Ac-NL6的凝膠化研究的結果(A)和根據本發明的抑制劑的FESEM圖像。
[0061]現在借助于下述實施例對本發明進行進一步地描述，下述實施例是為了說明，而不是為了限制本發明。
[0062]實驗步驟
[0063]基于肽的水凝膠制備。所有肽(純度≥95%)均購自American PeptideCompany, Sunnyvale ;伴有嚴格的質量控制措施和氨基酸分析。所有肽在N末端處乙酰化以抑制末端電荷的影響。所述肽通過漩渦振蕩5分鐘來溶于熱的milliQ水(60-70°C)中，并在室溫靜置以形成水凝膠。依據肽的濃度，在幾小時內或甚至幾天內(凝膠化的實驗時間框架)，自組裝過程立即發生。
[0064]圓二色性(⑶)研究。用裝配有Peltier控溫儀的Aviv410⑶分光光度計采集⑶波譜，使用有配套蓋子的矩形石英比色杯和對肽樣品濃度來說的最佳光程(例如0.1_)。對高的肽濃度(10-20mg/ml)來說，使用光程為0.01mm的石英比色杯。用光譜帶寬1.0nm以
0.5nm或1.0nm在波長范圍180_260nm進行數據采集。為了確保⑶光譜的再現性，分別測量每種肽的3個樣品，但光譜沒有取平均。所有光譜用milliQ水作為參照進行基線校準。
[0065]場發射掃描電鏡(FESEM)研究。水凝膠樣品在_20°C或更好_80°C冷凍。然后凍干冷凍樣品。凍干樣品用導電膠帶固定在樣品架上，并用JEOL JFC-1600高精度鍍膜儀從頂部和邊側兩方濺射鉬金。使用的鍍膜電流為30mA，且過程持續60秒。然后使用JEOLJSM-7400F場發射掃描電鏡系統以5-10kV的加速電壓對感興趣的表面進行檢測。
[0066]流變學。為了測定粘彈性質/行為，使用ARES-G2流變儀(TAInstrume nts, Piscataway, NJ)以直徑為25.0mm的不銹鋼或鈦的平行板幾何工具(parallel plate geometry)和0.8mm或l_2mm的間隙距離對基于肽的水凝膠進行了動態時間(dynamic time)、應變和頻率掃描實驗。為了確保完全凝膠化和考慮到不同肽在不同濃度下的不同凝膠化速率，在制備樣品兩個月后進行流變學測量。在0.l-100rad/s和1%應變下進行振蕩頻率掃描研究(測量儲能模量(G’ )對角速率(ω ))。在0.01-100%應變及恒定角頻率為lrad/s下進行振蕩幅度掃描研究(測量儲能模量(G’)對振蕩應變％ ( Y ))。所有測量都在25°C下進行。
[0067]生物相容性:細胞毒性/存活檢測。對哺乳動物細胞的抑制肽溶液的生物相容性不僅定性也定量地進行了測定。關于定性檢測，采用活/死細胞毒性檢測對在該肽溶液中孵育48-96小時后的存活和死亡細胞進行染色。采用Roche的WST-1試劑對細胞存活的定量測定。特意選用諸如U87膠質母細胞瘤細胞和SHSY5Y神經母細胞瘤細胞的細胞系，因為其為與設計用來治療阿爾海默茨病淀粉樣蛋白斑塊藥物候選者更為相關的神經元細胞系。WST-1是一種穩定的四唑鹽，其通過復雜的細胞機制來切割成可溶的甲臘(有色產物)。由于在活細胞中WST-1的減少主要取決于生成NAD (P)H的糖酵解，在培養體系中甲臘染料形成的數量與代謝活躍細胞的數量直接相關。關于定量檢測，將5，000細胞/孔的HeLa和U87細胞及20，000細胞/孔的SHSY5Y神經母細胞瘤細胞接種到96孔板。在抑制肽中孵育48或72小時后，進行活/死細胞毒性檢測。所有抑制劑溶液在無血清或其他添加劑/生長因子的普通培養基中準備。使用5M的NaOH直到pH達到中性范圍進行抑制劑溶液的中和。
[0068]生物相容性:溶血檢測。取Iml新鮮兔血，并用冷PBS (pH~7.3)溶液清洗3遍。最終丸狀(pelleted)紅細胞(RBCs)在4ml冷PBS中重懸并用于檢測。Ix PBS (pH~7.3)用作陰性對照，并加入l%Triton-X的PBS用作陽性對照。160 μ I的抑制肽溶液與40 μ I新鮮RBC溶液混合并在37°C下孵育I小時。每個樣品進行5次重復。然后，樣品離心以使完整的RBCs沉降在底部處，用酶標儀測量100 μ I上清567nm下的吸光度。
[0069]測定IC50數值。含有ThT的溶液，自組裝肽和抑制劑(總體積為100 μ L/孔)加入到Greiner96孔板(GRE96ft)的孔中，并用熒光酶標儀(Tecan Safire2)以I分鐘間隔測定熒光強度。優化的測定參數為:激發波長為452nm ;激發帶寬為9nm;發射波長為485nm ;發射帶寬為20nm ;增益值為45 ;溫度為26到28°C。將不同摩爾的過量抑制劑加入到100 μ MKE7中。IC5tl的S型曲線由5個獨立檢測的結果繪制且每個檢測至少有5個重復。在特定的時間點(在差異最大處)測定的ThT熒光強度比抑制劑濃度的對數值來繪制S型曲線。
[0070]凝膠化研究。天然核心淀粉樣蛋白序列NL6 (來自人源胰淀素)和KE7 (來自阿爾茨海默病淀粉樣蛋白)與抑制肽混合。1.5mM的核心序列(終濃度)與10和20摩爾的過量抑制劑混合。在室溫下將Mill1-Q水用于溶解這些肽，之后靜置3個月。
[0071]抑制劑:合成和表征。根據Kirin等人(2007)J.Chem.Educ.84:108-111來進行固相肽合成。所有反應在手持注射器上完成。合成產物(原材料~Ig樹脂；粗肽的毛重量~170mg)在水中高度可溶，通過標準質譜(MS)和核磁共振(在D2O中1H NMR)技術進行表征(見圖31)。
[0072]結果[0073]三肽和六肽(hexapeptides)形成的水凝膠的⑶波譜及流變學數據
[0074]Ac-LD6 是指六肽 Ac-LIVA⑶(參見 SEQ ID NO: 3), Ac-NL6 是指六肽 Ac_NFGAIL(SEQID NO:61)，以及Ac-1D3是指三肽Ac-1VD(見SEQ ID NO: 20)。肽NFGAIL是與II型糖尿病相關的的人源胰淀素的天然核心序列，而肽LIVAGD和IVD為合理設計的肽。
[0075]圖1 不出 1.2mg/ml Ac-LD6 (Α)、0.5mg/ml Ac-NL6 (C)和 5mg/ml Ac-1D3 (E)的CD波譜，其演示了超小肽從無規卷曲構象到亞穩定、暫時的α -螺旋狀態(最小值在222nm)的轉變過程。在 2.5mg/ml Ac-LD6 (B)、L2mg/ml Ac-NL6 (D)和 7.5mg/ml Ac-1D3 (F)的較高濃度下，觀察到了 β_型結構(最小值大約在220nm;因為芳香族肽序列有輕微地藍移)。在室溫25°C的條件下測量所有波譜。在(F)中，觀察到了從α-螺旋中間物到β-型結構的平衡轉變過程(肩為208nm)。
[0076]圖25A還示出了天然核心序列NL6顯示出α -螺旋中間物。天然核心序列NL6和設計的肽LD6兩者都在不同濃度下形成了水凝膠(參見圖25Β)。
[0077]圖26示出了由1.5mM的Ac-KE7形成的水凝膠(綠色)和當1.5mM的Ac-KE7與Ac-LPE (酒紅色)和Ac-LPG (紅色)按1:20的摩爾比混合的肽抑制劑溶液(非凝膠化)的流變學數據。圖表顯示了室溫25°C時作為(A) 1%應變下的角頻率(rad/sec)和(B) lrad/sec角頻率下的振蕩應變(％)的函數的儲能模量(G’以Pa表示)。Ac-KE7對照沒有添加形成水凝膠的抑制劑表示出振幅掃描的線性粘彈性范圍和頻率掃描測量的線性圖譜；這是該類自組裝肽的特性。然而，同樣濃度的Ac-KE7當與抑制劑按1:20摩爾比混合時不形成水凝膠。這可從流變學數據中看出，肽抑制劑溶液在振幅和頻率掃描測量中均表現出高波動曲線，因為它們是溶液形式而不是凝膠形式。
[0078]抗淀粉樣蛋白肽療法(用于口服吸收的超小肽抑制劑)
[0079]硫黃素T(Basic Yellowl或CI49005)是一種苯并噻唑鹽，由脫氫硫甲苯胺與甲醇在鹽酸條件下甲基化來獲得(參見圖21B)。該染料在體外和體內均被廣泛用于顯現及量化稱為淀粉樣蛋白的錯誤折疊的蛋白質聚合物的存在(例如由在阿爾茨海默病患者的的腦中發現的由淀粉樣蛋白β組成的斑塊)。當其結合到富含β折疊的結構，例如淀粉樣蛋白聚合物中的這些，該染料顯示出增強的熒光。在下述實驗中，肽KE7，一種形成淀粉樣蛋白聚合物的淀粉樣蛋白β的天然核心序列(1-42)，被用作模式系統和陽性對照(參見圖2和18)。
[0080]關于抑制研究，KE7與抑制肽按1:10的摩爾比混合(參見圖21C)。加入的染料的濃度與陽性對照相同，并對熒光信號進行一小時的監測。
[0081]圖3到17以及圖21Ε和F清楚地示出了通過抑制肽I到5及7到16的例證，本發明的抑制肽抑制了 KE7聚集。而不含抑制肽的ΚΕ7由于形成了淀粉樣纖維而顯示出熒光增強，當添加了抑制肽后熒光信號顯著減少。抑制劑I到16對應于附加序列表中SEQ IDNOs: 21到44的各個抑制肽。
[0082]此外，肽Ac-KE7和Ac-NL6在不存在和存在抑制肽I和2時的凝膠化研究表現了與抑制肽混合阻止/抑制了肽Ac-KE7和Ac-NL6水凝膠的形成(圖32Α)。
[0083]半抑制濃度(halfmaximal inhibitory concentraiton) (IC5tl)用以測量抑制特定生物學過程中 化合物的有效性。該定量測量指示為了有效地阻止給出的過程需要多少特定的藥物或其它底物(抑制劑)，在這里是淀粉樣蛋白聚集。肽Ac-LPE和Ac-LPG (抑制肽3和5，對應于SEQ ID NOs:47和49;也被稱為Ac-LE3和Ac-LG3)的IC50S型曲線在圖30中示出。
[0084]圖19、20和21D示出當抑制肽單獨(濃度為8 μ m和100 μ m)與染料混合，不存在熒光增強(使用PMT增益為131的與由水+染料獲得的陰性對照范圍相似的數值)。
[0085]圖21A中所描繪的小瓶示出根據本發明的包含脯氨酸的抑制肽溶于水。對于藥物開發應用而言；在水溶液中有良好溶解度是一個優點，特別是當與芳香族化合物相比時，后者需要有機溶劑以完全溶解。
[0086]圖22A和B示出根據本發明的抑制肽使用場發射掃描電鏡(FESEM)在不同的放大倍數下的典型形態。將抑制妝在水中完全溶解，制備10mg/ml妝溶液。然后將溶液沖擊冷凍、凍干及鍍層有鉬金薄層以使樣品具有用于電子顯微鏡的導電性。通常，淀粉樣纖維甚至在正常光學顯微鏡下可被觀測到，在淀粉樣蛋白核心序列形成水凝膠的情況下，纖維結構在從~3000x的放大倍數下清晰可見。對于抑制肽1，甚至在高達37，OOOx以上的放大倍數下沒有觀測到纖維(也參見圖32B)。為了用作對淀粉樣蛋白有效的抑制藥物的肽，有必要確保抑制劑可以有效的識別和結合天然淀粉樣蛋白/生長的淀粉樣纖維，而自身不形成纖維。
[0087]圖23示出測試了抑制劑生物相容的溶血檢測的結果。任一藥物候選者必須首先用血液和生物組織測試生物相容性。在此，進行溶血檢測來測定抑制肽是否對紅細胞有任何副作用。使用了在水中的濃度為2.5、5和10mg/ml的3種抑制肽。測量了這些溶液的pH值，發現較高肽濃度的樣品呈酸性(pH < 4)。因此，制備了一組同樣濃度的中性肽溶液(用l%w/v NaOH中和)作為對比。在有抑制肽的中性溶液和低肽濃度(2.5mg/ml)下沒有觀測到細胞裂解，表明了 在5和10mg/ml的高濃度下觀測到的25%細胞裂解是由于酸性pH而不是由于肽本身。
[0088]在WST-1檢測和活/死細胞毒性檢測中使用不同的細胞系獲得了相似的結果(參見圖27至29)。
[0089]鹽濃度影響肽來源的水凝膠的機械穩定性
[0090]圖24示出增加NaCl的濃度減少源自10mg/mL的Ac-LD6 (L)的水凝膠的儲能模量G ‘/機械強度。
[0091]本發明的在說明書、權利要求和/或在附圖中公開的特征，單獨地和其任意組合地，是以各種形式實現本發明的材料。
【權利要求】
1.一種分離的α螺旋阻斷肽，其具有通式
Z-(X)m-Proline-(X)n, 其中 Z為N端保護基團； X在每次出現時均為獨立地選自氨基酸和氨基酸衍生物；以及 m和η表示氨基酸和氨基酸衍生物的數量，并為獨立地選自I到5之間的整數，且m+n ^ 60
2.根據權利要求1中所述的分離α螺旋阻斷肽，其中，X在每次出現時均為獨立地選自天然氨基酸。
3.根據權利要求1或2中所述的分離α螺旋阻斷肽，其中，至少一個X為D-氨基酸或模擬肽氨基酸。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的分離α螺旋阻斷肽，其中，X在每次出現時均為獨立地選自非芳香族氨基酸和氨基酸衍生物。
5.根據權利要求4所述的分離α螺旋阻斷肽，其中，所述非芳香族氨基酸選自異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨 酸、甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和賴氨酸。
6.根據上述任一項權利要求所述的分離α螺旋阻斷肽，其中，所述肽的N端氨基酸的疏水性比所述肽的C端氨基酸更強。
7.根據上述任一項權利要求所述的分離α螺旋阻斷肽，其中，m+n<5，優選地<4，更優選地< 3。
8.根據上述任一項權利要求所述的分離α螺旋阻斷肽，其中，m和η是I。
9.根據上述任一項權利要求所述的分離α螺旋阻斷肽，其中，所述N端保護基團具有通式-C(O) -R，其中R選自氫、烷基和取代烷基。
10.根據權利要求9所述的分離α螺旋阻斷肽，其中，所述N端保護基團為乙酰基。
11.根據上述任一項權利要求所述的分離α螺旋阻斷肽，其中，所述肽的C末端酰胺化或酯化，其中，優選地，所述C末端具有通式-C0NHR，且R選自氫、烷基和取代烷基，或通式-C00R，且R選自烷基和取代烷基。
12.根據權利要求4-11中任一項所述的分離α螺旋阻斷肽，其中，所述肽在水溶液中制備，所述水溶液可選擇地包括生理緩沖液。
13.根據權利要求1-12中任一項所述的分離α螺旋阻斷肽，用于作為藥物。
14.根據權利要求1-12中任一項所述的分離α螺旋阻斷肽，用于治療與淀粉樣變性相關的疾病。
15.根據權利要求14所述的分離α螺旋阻斷肽，其中，所述與淀粉樣變性相關的疾病選自神經退行性疾病例如阿爾海默茨病、帕金森病、亨廷頓氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)，朊病毒相關或海綿狀腦病例如克雅二氏病、路易體癡呆、伴有帕金森病的額顳葉癡呆、脊髓小腦共濟失調、17型脊髓小腦共濟失調、脊髓延髓肌肉萎縮癥、遺傳性齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥、家族性英國型癡呆、家族性丹麥型癡呆，非神經性局限性疾病例如11型糖尿病、甲狀腺髓樣癌、心房性淀粉樣變性、遺傳性淀粉樣變性腦溢血、垂體泌乳素瘤、注射局部淀粉樣變性、主動脈中膜淀粉樣變性、遺傳性格子狀角膜營養不良、與倒睫相關的角膜淀粉樣變性、白內障、牙源性鈣化上皮瘤、肺泡蛋白沉積癥、包涵體肌炎、皮膚淀粉樣變性苔蘚，非神經性系統性淀粉樣變性例如AL型淀粉樣變性、AA型淀粉樣變性、家族性地中海熱、老年系統性淀粉樣變性、家族性淀粉樣多神經病、血透相關的淀粉樣變性、ApoAI淀粉樣變性、ApoAI I淀粉樣變性、ApoAIV淀粉樣變性、芬蘭遺傳性淀粉樣變性、溶菌酶淀粉樣變性、纖維蛋白原淀粉樣變性、冰島遺傳性腦淀粉樣血管病、家族性淀粉樣變性，以及發生在多種組織中的系統性淀粉樣變性例如輕鏈淀粉樣變性。
16.根據權利 要求13-15中任一項所述的分離α螺旋阻斷肽，其中，所述肽為口服施用。
17.一種藥物組合物，包含根據權利要求1-12中任一項所述的分離α螺旋阻斷肽。
18.根據權利要求17所述的藥物組合物，還包含至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑。
19.根據權利要求17或18所述的藥物組合物，還包含一種一價或二價金屬鹽。
20.根據權利要求19所述的藥物組合物，其中，所述金屬選自鈉、鎂、鈣和鋅。
【文檔編號】A61K38/06GK103946232SQ201280043772
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年7月9日 優先權日:2011年7月7日
【發明者】夏洛特·霍瑟, 阿努潘·拉克什曼 申請人:新加坡科技研究局