抑制包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17(zD17)和C-JUN N-末端激酶(JNK)之間 ...的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種分離的多肽，所述分離的多肽與SEQ?ID?NO∶1；SEQ?ID?NO∶2；或SEQ?ID?NO∶3的任一個有至少90％的同一性，其中所述分離的多肽抑制包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17(zD17)和c-jun?N-末端激酶(JNK)之間的相互作用。分離的多肽可以與送遞和靶向部分結合，例如HIV-1Tat蛋白質的細胞-膜轉導結構域。還提供了治療與神經毒性或興奮性神經毒性相關疾病的方法。
【專利說明】抑制包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17 (zD17)
和C-JUN N-末端激酶(JNK)之間相互作用的神經保護肽
[0001]相關申請
[0002]本申請要求2011年7月12日遞交的美國臨時專利申請61 / 507，060的優先權。【技術領域】
[0003]本發明涉及通過靶向抑制-誘導的蛋白質-蛋白質相互作用的神經保護，例如包含鋒指DHHC型的十六燒酸基酸基轉移酶17 (palmitoyl acyl transferase zinc-f ingerDHHC type containingl7) (zD17)和c-jun N-末端激酶(JNK)之間的相互作用。特別地，本發明涉及使用分離的多肽通過抑制zD17和JNK相互作用來減小細胞毒性或興奮性神經毒性應激的神經保護。
【背景技術】
[0004]興奮性神經毒性是一種病理過程，谷氨酸酯和類似物質可以通過這種病理過程來損傷或殺死神經細胞。興奮性神經毒性可能在脊髓損傷、中風、外傷腦損傷和中樞神經系統(CNS)神經退行性疾病中涉及，例如多發性硬化，阿爾茨海默病，肌萎縮性側索硬化(ALS)，帕金森病，酒精中毒或戒酒，和亨廷頓病。引起神經細胞周圍谷氨酸酯濃度過高的其它常見癥狀是低血糖癥和癲癇持續狀態(status epilepticus)。
[0005]中風可能由于多種機理產生。腦血栓癥和腦栓塞可能由阻塞供應大腦的動脈的血凝塊產生，這是大多數中風的原因。當血管在大腦之中或周圍破裂時會發生蛛網膜下出血和大腦內出血。因此，中風可能是缺血(即腦血栓或腦栓塞)或自然出血(即蛛網膜下出血和大腦內出血)。
[0006]血液凝塊或血栓形成經常是腦動脈動脈硬化癥的結果。短暫性腦缺血發作(TIA)也稱作微型中風(min1-stiOke)，并且特征在于暫時血流中斷并且經常是在中風之前。
[0007]當血液凝塊在循環系統中從遠的位置變為被驅逐并且接著變為在供應腦的動脈中(例如，在腦中或頸中)停滯時發生栓塞。腦栓塞經常在心室纖維顫動患者中發生，其心臟上心房(前室)博動弱而快并且前室中的血液不完全排盡。停滯的血液更容易形成凝塊。
[0008]當血管破裂時發生出血或流血。血管破裂可能是外傷或內壓過高的結果。最可能破裂的血管是已經存在缺陷的那些血管，例如動脈瘤。
[0009]大腦內出血在腦血管中發生，而蛛網膜下出血影響大腦表面(即保護性蛛網膜)的動脈。
[0010]上述所有中風機理都可能導致腦細胞的死亡，其接著觸發一種鏈反應，其中細胞死亡產生的毒性化學物質可以損傷鄰近細胞。大腦的受影響區域中的細胞經常死亡，因為它們不再從血液接受氧和營養，而且由于谷氨酸酯濃度過高，導致中風患者的癥狀和能力喪失。中風是北美死亡的第二致因，并且引起能力喪失。
【發明內容】
[0011]本發明部分基于這樣的發現，即這里所描述的分離的多肽選擇性抑制包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17 (zD17)和c-jun N-末端激酶(JNK)之間的相互作用。而且，如這里所公開的，zD17和JNK之間的相互作用的選擇性抑制可以用于減小細胞中興奮性神經毒性應激。細胞中興奮性神經毒性應激可能與某種疾病相關，這些疾病可以選自但不限于下面的:脊髓損傷、中風、外傷腦損傷和中樞神經系統(CNS)神經退行性疾病中涉及，例如多發性硬化、阿爾茨海默病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森病、酒精中毒或戒酒、和亨廷頓病。引起神經細胞周圍谷氨酸酯濃度過高的其它常見癥狀是低血糖癥和癲癇持續狀態(status epilepticus)。
[0012]這里所描述的化合物可以用于體內或體外研究應用(即非臨床)來研究興奮性神經毒性應激或細胞毒性應激的可供選擇的治療。此外，這些分離的多肽可以單獨使用或者作為體內或體外研究的包的部分來使用，使用重組蛋白質、編碼分離的多肽的核苷酸、培養基中供養的和/或動物模型中的細胞，來研究興奮性神經毒性應激或細胞毒性應激的的機理。
[0013]一方面，提供了一種分離的多肽，與SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2或SEQ IDNO: 3任一個有至少80%同一性。或者，提供了一種分離的多肽，與SEQ ID NO: I或SEQID NO: 2或SEQ ID NO: 3任一個有至少85%同一性。或者，提供了一種分離的多肽，與SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3任一個有至少90%同一性。或者，提供了一種分離的多肽，與SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3任一個有至少95%同一性。或者，提供了一種分離的多肽，包含SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3 的任一個。
[0014]另一方面，提供了一種分離的多肽，與SEQ ID NO: I ；SEQ ID NO: 2 ;或SEQ IDNO: 3的任一個有至少90%同一性，其中同一性可以通過序列的長度計算，而且其中分離的多肽抑制包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17 (zD17)和c-jun N-末端激酶(JNK)之間的相互作用。
[0015]另一方面，提供了一種分離的多肽，與SEQ ID NO: I ；SEQ ID NO: 2 ;或SEQ IDNO: 3的任一個有至少90%同一性，其中分離的多肽抑制包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17(zD17)和c-jun N-末端激酶(JNK)之間的相互作用。
[0016]另一方面，提供了一種分離的多肽，與SEQ ID NO: I ；SEQ ID NO: 2 ;或SEQ IDNO: 3的任一個有至少95%同一性，其中分離的多肽抑制包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17(zD17)和c-jun N-末端激酶(JNK)之間的相互作用。
[0017]另一方面，提供了一種包含SEQ ID NO: I ；SEQ ID NO: 2;或 SEQ ID NO: 3 的任一個的分離的多肽。
[0018]分離的多肽可以抑制包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17(zD17)和c-junN-末端激酶(JNK)之間的相互作用。分離的多肽可以進一步包括與所述分離的多肽結合的遞送和靶向部分。所述遞送和靶向部分可以選自下面的一種或多種:配體；蛋白質轉導結構域；或抗體。蛋白質轉導結構域可以是HIV-1Tat蛋白質的細胞-膜轉導結構域。
[0019]另一方面，提供了一種分離的多核苷酸，包括編碼這里所描述的多肽的核苷酸序列。
[0020]另一方面，提供了包含這里所描述的多肽和載體的組合物。[0021]所述載體可以是藥學上可接受載體。
[0022]另一方面，提供了包含這里所描述的分離的多核苷酸的載體。
[0023]另一方面，提供了包含這里所描述的載體的細胞。
[0024]另一方面,提供了包含這里所描述的多核苷酸的細胞，其中該多核苷酸可以與表達調控序列操作性連接。
[0025]另一方面，提供了保護細胞免受興奮性神經毒性應激的方法，該方法包括向細胞遞送這里所描述的分離的多肽。
[0026]另一方面，提供了保護細胞免受興奮性神經毒性應激的方法，該方法包括:(a)向細胞遞送這里所描述的載體；和(b)表 達載體所攜帶的多核苷酸。
[0027]另一方面，提供了表達多肽的方法，該方法包括:(a)向細胞遞送這里所描述的載體；和(b)在允許載體所攜帶的多核苷酸表達的條件下培養細胞。
[0028]可以體內將載體遞送給細胞。可以離體將載體遞送給細胞。可以體外將載體遞送給細胞。
[0029]另一方面，提供一種治療與興奮性神經毒性相關疾病的方法，所述方法包括:向需要的被試者施用生物學有效量的這里所描述的多肽。
[0030]生物學有效量可以是足以防止興奮性神經毒性-誘導的細胞死亡的量。興奮性神經毒性相關疾病可以選自脊髓損傷、中風、腦損傷、多發性硬化、阿爾茨海默病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森病、酒精中毒或戒酒、和亨廷頓病。興奮性神經毒性相關疾病可以是中風。
[0031]另一方面，提供一種治療與興奮性神經毒性相關疾病的藥物組合物，所述方法，所述組合物包含這里所描述的分離的多肽和藥學可是接受載體。
[0032]興奮性神經毒性相關疾病可以選自脊髓損傷、中風、腦損傷、多發性硬化、阿爾茨海默病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森病、酒精中毒或戒酒、和亨廷頓病。興奮性神經毒性相關疾病可以是中風。
[0033]另一方面，提供這里所描述的分離的多肽治療與細胞毒性或興奮性神經毒性相關疾病的用途。
[0034]另一方面，提供這里所描述的分離的多肽制備用于治療與細胞毒性或興奮性神經毒性相關疾病的藥物的用途。
[0035]興奮性神經毒性相關疾病可以選自脊髓損傷、中風、腦損傷、多發性硬化、阿爾茨海默病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森病、酒精中毒或戒酒、和亨廷頓病。興奮性神經毒性相關疾病可以是中風。
[0036]另一方面，提供用于治療與細胞毒性或興奮性神經毒性相關疾病的這里所描述的分離的多肽。
[0037]興奮性神經毒性相關疾病可以選自脊髓損傷、中風、腦損傷、多發性硬化、阿爾茨海默病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森病、酒精中毒或戒酒、和亨廷頓病。興奮性神經毒性相關疾病可以是中風。
[0038]另一方面，提供了商用包，包括:(a)這里所描述的分離的多肽；和(b)其治療與細胞毒性或興奮性神經毒性相關疾病的用途說明書。
[0039]另一方面，提供了商用包，包括:(a)這里所描述的分離的多肽和藥學可接受載體；和(b)其治療與細胞毒性或興奮性神經毒性相關疾病的用途說明書。
[0040]另一方面，提供了商用包，包括:(a)這里所描述的藥物組合物；和(b)其治療與細胞毒性或興奮性神經毒性相關疾病的用途說明書。
[0041]興奮性神經毒性相關疾病可以選自脊髓損傷、中風、腦損傷、多發性硬化、阿爾茨海默病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森病、酒精中毒或戒酒、和亨廷頓病。興奮性神經毒性相關疾病可以是中風。
[0042]另一方面，提供了一種藥物組合物，包含:(a)與SEQ ID NO: I ；SEQ ID NO: 2 ；或SEQ ID NO: 3的任一個有至少90%同一性的分離的多肽，其中同一性可以通過序列的長度計算，而且其中分離的多肽抑制包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17 (zD17)和c-jun N-末端激酶(JNK)之間的相互作用；和(b)藥學上可接受賦形劑。
[0043]所述賦形劑可以是等張注射液。組合物可適于對人施用。分離的多肽可以以包含HIV-1Tat蛋白質的細胞膜轉導結構域的融合蛋白形式存在。藥物組合物可以在消毒容器中。容器可以是注射器。無菌容器可以在試劑盒或商用包中提供。
[0044]另一方面，提供了這里所描述的分離的多肽，其中所述分離的多肽抑制應激誘導的蛋白質-蛋白質相互作用(例如包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17 (zD17)和c-jun N-末端激酶(JNK)之間的相互作用)。另一方面，提供了這里所描述的分離的多肽，其中所述分離的多肽保護細胞免于細胞素素應激。所述細胞素素應激。可以是興奮性神經毒素應激。另一方面，所述分離的多肽可以進一步包括與分離的多肽結合的遞送和靶向部分。任選地，所述遞送和靶向部分可以選自下面的一種或多種:配體；蛋白質轉導結構域；或抗體。任選地，蛋 白質轉導結構域可以是HIV-1Tat蛋白質的細胞-膜轉導結構域(例如，見 SEQ ID NOs: 4-9)。
[0045]本發明的其它方面和特征對于本領域技術人員在參見下面的與附圖一起的本發明【具體實施方式】下而變得一目了然。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0046]圖1顯示細胞因子TNF- α和兒-1 β增強神經細胞培養物中zD17_JNK3相互作用的條線圖，其中 TNF-a (50ng / ml，6h)和兒_1β (IOng / ml，16h)處理分別誘導 zD17_JNK3相互作用增加1.53±0.11和1.88±0.23倍。
[0047]圖2顯示谷氨酸和NMDA增強zD17與JNK同種型2和3相互作用的條線圖，其中對JNK2 (與對照物相比增強的倍數；谷氨酸，1.7 ±0.2 ；NMDA, 2.1 ±0.4)和JNK3 (谷氨酸，2.6±0.2 ;NMDA，2.5±0.3)的增強作用高于對JNKl的(谷氨酸，1.4±0.1 ；NMDA,
1.4±0.I)。
[0048]圖3顯示潛在的JNK-相互作用基序對ZD17N-末端胞質域的體外肽掃描，圖中劃線的相互作用-正向區顯示zD17的N-末端部分，有標記(A-F)的黑粗體線表示肽掃描的潛在的JNK-相互作用基序，它們在zD17上的位置在線旁邊標記。還有，蛋白質相互作用的錨蛋白結構域在所指位置以圓矩形劃出。
[0049]圖4顯示位于不同錨蛋白結構域中的兩個基序，它們對于ZD17-JNK相互作用是重要的。下面指示的是Myc-觸發的全長zD17 (FL)和帶有按種類劃分的缺失的zD17片段，標出了內含的潛在的相互作用基序(A-F)。劃出了這些構建體的相互作用能力(+或_)。[0050]圖5顯示JNK3結合zD17上的基序-D和基序_E。基序_D，基序-E和之間的第三錨蛋白重復結構與GST融合并純化。與JNK3孵育之后只有與JNK3結合的基序-D和基序_E。
[0051]圖6顯示肽NMoD，NIMoE和NMoEsh從中衍生的zD17上的位置，如zD17錨蛋白重復結構的模擬結構中所示。從國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information) (PDB: 3EU9)獲得 3D 結構數據并且用 PyMOL 軟件(vl.3)處理。
[0052]圖7顯示多肽對JNK3基礎活性的作用。從細胞溶胞產物將JNK3免疫沉淀，接著用激酶測定(KA)檢測激酶活性。用已知的JNK抑制劑3Ρ600125(10μΜ)或NMoD(IyM)預處理細胞2h，分別引發JNK3基礎活性顯著(相對于對照物變化的倍數，0.56 ± 0.06)或部分(0.72±0.07)減小。NIMoEd μ Μ)對JNK3的基礎活性沒有明顯影響(0.89±0.10，P=0.33)。
[0053]圖8顯示肽NMoE對zD17_JNKl /2/3相互作用的影響。
[0054]圖9顯示NMoE去除了 JNK2和JNK3的NMDA-誘導的活性，但是對JNKl沒有作用。
[0055]從細胞溶胞產物將JNK免疫沉淀，接著用激酶測定(KA)檢測JNK活性(相對O小時規一化。JNK1(.): 0.5h，61.0±5.4%，lh，137.8±20.8%;JNKl+NMoE(〇):0.5h,104.3±2.6，lh, 168.5±3.3 % ；JNK2( ? ): 0.5h, 164.3±11.5 % ；lh, 179.2±11.2 % ；JNK2+NIMoE( O ): 0.5h，103.7±5.0 % ;lh，90.9± 10.9 % ；JNK3( ): 0.5h,141.7±7.8 % ;lh，172.1±18.9 % ；JNK3+NIMoE( □ ): 0.5h，90.6±5.3 % ；lh,47.0± 17.6% )。t-test.** 表不 Ρ〈0.01。線條圖表不平均值土s.e.m。
[0056]圖10顯示施用肽的軸突發育。A，與SP600125孵育影響起始和延伸。對軸突用軸突標記物Tau-1標記。顯示軸突起始速度(相對對照物歸一化，SP600125,18.2±4.1%,η=3)和軸突長度(對照物，161.2±3.9 ;SP600125，84.9±1.6%，n = 4)。B，NMoE 不阻斷軸突起始(相對對照物歸一化，NIMoE,98.6±0.2%, η = 3, P = 0.69)或延伸(對照物，160.0±8.9 ;ΝΜοΕ，161.1±13.6，n = 3 ;Ρ = 0.96)。t-test。** 表示 P〈0.01。誤差柱表示平均值土 s.e.m。
[0057]圖11顯示以LDH測定為基礎的興奮性神經毒性-誘導的神經細胞死亡百分率NMDA的條形圖，顯示NMoE的作用，其中相對照，PI著色和核Hoechst著色對神經突的完整性和核的形狀打分(沒有顯示)。
[0058]圖12A顯示NMoEsh保護培養基中代表細胞死亡的定量釋放LDH的條形圖。
[0059]圖12B顯示如所示劑量NMoE不同劑量時加NMDA的神經細胞培養物中定量釋放LDH的條形圖(量化細胞死亡)。
[0060]圖12C顯示NMoE處理細胞(+NMoE空白柱狀)和NMoE未處理細胞(-NMoE實心柱狀)不同NMDA濃度下細胞死亡百分率，其中如圖所示NMoE在一定范圍的NMDA濃度下保護神經細胞培養物。t-test.*和**分別表示P〈0.05和P〈0.01。誤差柱表示平均值+ s.e.nio
[0061]圖13顯示c-Jun磷酸化作用線形圖(左圖)和C中ρ17型的量化(右圖)C，NMoE阻斷NMDA-誘導的半胱氨酸蛋白水解酶-3裂解(One-way ANOVA-試驗。*和**分別表示P〈0.05和P〈0.01。誤差柱表示平均值土 s.e.m)。[0062]圖14顯示局部缺血發作之前或之后在指定時間一次靜脈內注射接受假品(對照物)，鹽水，NIMoEscr,或NMoEsh的SD大鼠的MCAo實驗的流程圖。
[0063]圖15顯示總的梗塞大小和體積的兩個量化曲線圖(插入柱狀圖)，其中NMoEsh處理(-0.5h，43.43±9.82，η = 7 ；+2h,41.95±8.22，η = 10 ；+4h,78.74±28.50，η =6 ；F = 20.71，Ρ〈0.01，與對照組相比)大大減小了總的梗塞體積，而鹽水或NMoEscr幾乎沒有作用(對照物，240.70±35.67，η = 9 ;鹽水，268.89±40.47，η = 4 ；NIMoEscr,212.60±37.6，η = 5 ;F = 0.38，P = 0.69) (One-way ANOVA-試驗。.[0064]圖16顯示代表指示用NMoEsh處理的缺血大鼠改善動作的結果的神經學評分的柱狀圖。在MCAo開始22小時后檢查神經學功能。鹽水或NMoEscr處理組顯示相似的不足(對照物，16.43±0.95，n = 7 ;鹽水，18.00±1.35，n = 4 ；NIMoEscr, 18.60±1.24，η =5 ；F = 1.65，P = 0.23)。施用 NIMoEsh 顯著降低神經學評分(-0.5h，8.00±0.72，η = 7 ;+2h，8.50±0.75,η = 10 ；+4h, 11.20±1.49,η = 6 ；F = 21.98,P < 0.01，與對照組相比)。One-way ANOVA-試驗。
[0065]圖17顯示 用附著去除試驗(adhesive removal test) (ART)評價體覺功能的柱狀圖，并且顯示NMoE處理改善了 ART評分。在對照組，鹽水處理組和NMoEscr-處理動物組中，MCAo去除了對側面的反應(對照物，13.57±4.30see，n = 7 ;鹽水，7.42±3.21sec，n =4 ；NIMoEscr, 10.80±2.06see, η = 5 ；F = 0.64, P = 0.54)。預處理或處理后灌輸 NMoE導致體覺功能的改善(-0.5h，48.62±8.24sec, η = 7 ；+2h,62.1±8.60sec, η = 10 ；+4h,60.83±8.13sec, η = 6 ；F = 11.28, Ρ〈0.01)。One-wayANOVA-試驗。
[0066]圖18和19顯示功能試驗曲線圖，并且顯示改善MCAo損傷后NMoEsh-處理動物的動作結果。MCAo開始后4h給與NIMoEscr或NIMoEsh0神經學評分(NIMoEscr, η = 8 ；天-1，19.25±0.80 ;天_3，13.63±1.03 ;天_7，7.13±0.58 ;天_14，4.38±0.50 ；NIMoEsh,η = 7 ;天-1，11.43±1.96 ；天-3,5.86±1.14 ；天-7，1.71±0.47 ；天-14,0.85±0.34)和 ART(NIMoEscr, η = 8 ;天-1，12.63±3.14 ；天-3,34.13±6.88 ；天-7,59.13±5.67 ；天-14,81.88±4.44 ；NIMoEsh, η = 7 ;天-1,52.57±6.82 ；天-3,73.86±9.63 ；天 ~7,94.86±7.33 ;天-14，101.43±3.35)。t-test。# 指示 P <0.01。誤差柱表示平均值+ s.e.m) ο
【具體實施方式】
[0067]這里使用的術語“同一性”指兩個肽之間或兩個核酸分子之間序列的同一性的量度。通過比較為了比較目的而排列的各序列中的位置能測定同一性。如果共有至少大約80%序列同一性，或者至少大約81%序列同一性，至少大約82%序列同一性，至少大約83%序列同一性，至少大約84%序列同一性，至少大約85%序列同一性，至少大約86%序列同一性，至少大約87%序列同一性，至少大約88%序列同一性，至少大約89%序列同一性，至少大約90%序列同一性，則兩個氨基酸序列或核酸序列被認為是基本上同一的。或者，如果共有至少大約91%序列同一性，至少大約92%序列同一性，至少大約93%序列同一性，至少大約94%序列同一性，至少大約95%序列同一性，至少大約96%序列同一性，至少大約97%序列同一性，至少大約98%序列同一性，至少大約99%序列同一性，則兩個氨基酸序列或核酸序列被認為是基本上同一的。[0068]通過目前應用的并且最初在Altschul等(1990) J.Mol.Biol.215: 403-410中描述的BLAST運算法則可以來測定序列同一性。BLAST運算法則可以與公開的設置默認值使用。當比較序列中的一個位置被相同堿基或氨基酸占據時，該分子被認為在那個位置共有同一性。序列之間的同一性程度是序列所共有的匹配位置數目和序列之間重疊程度的函數。此外，當考慮與SEQ ID NOs: I~3的序列同一性程度時，是想要分別與SEQIDNOs: I~3比較氨基酸等同數目。當確定與SEQ ID NOs: I~3的同一性程度是不是要考慮另外的序列(即除了分別對應于SEQ ID NOs: I~3的20，10，或15氨基酸的那些)。給定序列的序列同一性可以通過參考序列(即SEQ ID NOs:1~3)的長度來計算。
[0069]在一些實施方案中，提供了具有與SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2或SEQ IDNO: 3實質相同的氨基酸成份的分離的多肽組合物。其中所述實質相同的意思是包括當比較等同區域(即分別是~20或10或15個氨基酸)時序列同一性的程度。此外，實質相同意思是包括前提是保持細胞保護活性或這里所描述的其它活性的保守取代和修飾的氨基酸。
[0070]如這里所使用的，“肽”或“多肽”可以互換使用，并且一股指由通過肽鍵或修飾的肽鍵共價連接的至少兩個氨基酸殘基構成的化合物。但是當參照具體的SEQ ID NO具體使用時，它意思是指包括SEQ ID NOs: I~3所代表的NMo的氨基酸序列(即MTPLMWAAYRTHSVDPTRLL (NIMoE) ；WAAYRTHSVD (NIMoEsh) ；TPLHWATRGGHLSMV (NIMoD)),其中多肽具有細胞保護活性。修飾的肽鍵可以包括，例如，可以對肽提供另外的期望的性質的肽電子等排物(修飾的肽鍵)。肽可以包括至少兩個氨基酸。這里所描述的肽或多肽所包含的氨基酸也可以或者通過天然過程修飾，例如翻譯后處理，或者通過本領域公知的化學修飾技術來修飾。修飾能發生在肽中的任何位置，包括肽主鏈，氨基酸側鏈和氨基或羧基末端。要明白相同類型的修飾作用可以在給定肽中的幾個位點以相同或不同程度存在。
[0071]氨基酸是包含氨基，羧基和不同氨基酸之間不同的側鏈的分子。氨基酸可以是其自然形式或者其可以是合成的氨基酸。氨基酸可以被描述為，例如，極性，非極性，酸性的，堿性的，芳香的或中性的。極性氨基酸是在生物學或接近中性pH下可以通過氫鍵與水相互作用的氨基酸。氨基酸的極性是生物學或接近中性PH下氫鍵合程度的指征。極性氨基酸的例子包括絲氨酸，脯氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，賴氨酸，組氨酸，精氨酸，天冬氨酸，酪氨酸和谷氨酸。非極性氨基酸的例子包括甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，和色氨酸。酸性氨基酸在中性PH下具有凈負電荷。酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸和谷氨酸。堿性氨基酸在中性pH下具有凈正電荷。堿性氨基酸的例子包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸。芳香性氨基酸一股是非極性的，并且可以參與疏水作用。芳香性氨基酸的例子包括苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。酪氨酸還可以通過芳香側鏈上的羥基參與氫鍵鍵合。中性脂肪族氨基酸一股是非極性和疏水性的。中性氨基酸的例子包括丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸和蛋氨酸。一種氨基酸可以一種以上描述類別來描述。相同描述類別中的氨基酸彼此可以替代肽中的另一個。氨基酸殘基一股可以根據下面表A，對應于氨基酸的俗名，用單字母或三字母名稱來表示。這里所描述的肽所包含的氨基酸要理解是L-或D-構型。這里所描述的氨基酸可以被可以改變肽的循環半衰期但是不副作用地影響它們的生物學活性的甲基化作用，氨基化作用，酰基化作用或者其它化學基團的取代作用所修飾。另外，本發明的肽中可以存在或不存在二硫鍵。自然界可能存在不標準的氨基酸，可以或者可以不被基因編碼。基因編碼的非標準氨基酸的例子包括硒代半胱氨酸，有時由UGA密碼子帶到一些蛋白質中，這個密碼子一股是終止密碼子。不被基因編碼的一些非標準氨基酸可以從已經存在于肽中的標準氨基酸的修飾而產生，或者，例如，可以是代謝中間產物或母體。非標準氨基酸的例子包括4-羥基脯氨酸，5-羥基賴氨酸，6-N-甲基賴氨酸，Y -羧基谷氨酸，鎖鏈素，硒代半胱氨酸，鳥氨酸，瓜氨酸，羊毛硫氨酸，1-氨基環丙基-1-羧酸，Y-氨基丁酸，肉堿，肌氨酸，或N-甲酰甲硫氨酸。標準和非標準氨基酸的合成變體也是已知的并且可以包括化學衍生的氨基酸，用于鑒定或跟蹤的標記的氨基酸，或者在α碳上帶有各種側鏈基團的氨基酸。這樣的側鏈基團的例子是本領域公知的并且包括包括脂肪族，單環芳香族，多環芳香族，雜環的，異核的，氨基，烷基氨基，羧基，羧酰基，羧酷基，狐，脈，羥基，烷氧基，疏基，烷基疏基，或者包含其它雜原子的側鏈。其它合成的氣基酸可以包括α-氨基酸，非α氨基酸，例如氨基酸，去-羧基或去-氨基酸。氨基酸的合成變體可以用本領域公知的一股方法來合成，或者可以從供應商購買，例如RSP AminoAcids LLC(Shirley, MA)?
[0072]本領域熟練人員公知這里所描述的肽或多肽中各個氨基酸可以被取代。氨基酸序列同一性可以通過使用BLAST (基礎局部排列檢索工具)2.0預算法則中使用的BLASTP和TBLASTN程序計算。計算氨基酸序列相似性或同一性的技術是本領域熟練人員公知的，BLAST 運算法則的使用描述于 ALTSCHUL 等，1990，J Mol.Biol.215: 403-410 和 ALTSCHUL等(1997)，Nucleic Acids Res.25: 3389-3402。
[0073]此外，本領域熟練人員公知某些取代作用更可能導致活性的保持。例如，氨基酸可以被描述為，例如，極性，非極性，酸性的，堿性的，芳香的或中性的。極性氨基酸是在生物學或接近中性pH下可以 通過氫鍵與水相互作用的氨基酸。氨基酸的極性是生物學或接近中性PH下氫鍵合程度的指征。極性氨基酸的例子包括絲氨酸，脯氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，賴氨酸，組氨酸，精氨酸，天冬氨酸，酪氨酸和谷氨酸。非極性氨基酸的例子包括甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，和色氨酸。酸性氨基酸在中性PH下具有凈負電荷。酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸和谷氨酸。堿性氨基酸在中性PH下具有凈正電荷。堿性氨基酸的例子包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸。
[0074]芳香性氨基酸一股是非極性的，并且可以參與疏水作用。芳香性氨基酸的例子包括苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。酪氨酸還可以通過芳香側鏈上的羥基參與氫鍵鍵合。中性脂肪族氨基酸一股是非極性和疏水性的。中性氨基酸的例子包括丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸和蛋氨酸。一種氨基酸可以一種以上描述類別來描述。相同描述類別中的氨基酸彼此可以替代肽中的另一個。
[0075]此外，包含SEQ ID NO: I或者與SEQ ID NO: I有至少90%同一性的20個氨基酸的序列的分離的多肽可以具有與SEQ ID NO: I相同的18個氨基酸。此外，包含SEQID NO: 2或者與SEQ ID NO: 2有至少90%同一性的10個氨基酸的序列的分離的多肽可以具有與SEQ ID NO: 2相同的9個氨基酸。此外，包含SEQ ID NO: 3或者與SEQ IDNO: 3有至少90%同一性的15個氨基酸的序列的分離的多肽可以具有與SEQ ID NO: 3相同的14個氨基酸。
[0076]或者，分離的多肽可以具有55個氨基酸，或者分離的多肽可以具有54個氨基酸，或者分離的多肽可以具有53個氨基酸，或者分離的多肽可以具有52個氨基酸，或者分離的多肽可以具有51個氨基酸，或者分離的多肽可以具有50個氨基酸，或者分離的多肽可以具有49個氨基酸，或者分離的多肽可以具有48個氨基酸，或者分離的多肽可以具有47個氨基酸，或者分離的多肽可以具有46個氨基酸，或者分離的多肽可以具有45個氨基酸，或者分離的多肽可以具有44個氨基酸，或者分離的多肽可以具有43個氨基酸，或者分離的多肽可以具有42個氨基酸，或者分離的多肽可以具有41個氨基酸，或者分離的多肽可以具有40個氨基酸，或者分離的多肽可以具有39個氨基酸，或者分離的多肽可以具有38個氨基酸，或者分離的多肽可以具有37個氨基酸，或者分離的多肽可以具有36個氨基酸，或者分離的多肽可以具有35個氨基酸，或者分離的多肽可以具有34個氨基酸，或者分離的多肽可以具有33個氨基酸，或者分離的多肽可以具有32個氨基酸，或者分離的多肽可以具有31個氨基酸，或者分離的多肽可以具有30個氨基酸，或者分離的多肽可以具有29個氨基酸，或者分離的多肽可以具有28個氨基酸，或者分離的多肽可以具有27個氨基酸，或者分離的多肽可以具有26個氨基酸，或者分離的多肽可以具有25個氨基酸，或者分離的多肽可以具有24個氨基酸，或者分離的多肽可以具有23個氨基酸，或者分離的多肽可以具有22個氨基酸，或者分離的多肽可以具有21個氨基酸，或者分離的多肽可以具有20個氨基酸，或者分離的多肽可以具有19個氨基酸，或者分離的多肽可以具有18個氨基酸，或者分離的多肽可以具有17個氨基酸，或者分離的多肽可以具有16個氨基酸，或者分離的多肽可以具有15個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14個氨基酸，或者分離的多肽可以具有13個氨基酸，或者分離的多肽可以具有12個氨基酸，或者分離的多肽可以具有11個氨基酸，或者分離的多肽可以具有10個氨基酸，或者分離的多肽可以具有9個氨基酸，或者分離的多肽可以具有8個氨基酸，或者分離的多肽可以具有7個氨基酸，或者分離的多肽可以具有6個氨基酸，或者分離的多肽可以具有5個氨基酸。或者，分離的多肽可以具有10-50個氨基酸，或者分離的多肽可以具有11-50個氨基酸，或者分離的多肽可以具有12-50個氨基酸，或者分離的多肽可以具有13-50個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-50個氨基酸，或者分離的多肽可以具有13-45個氨基酸，或者分離的多肽可以具有13-40個氨基酸，或者分離的多肽可以具有13-35個氨基酸，或者分離的多肽可以具有13-30個氨基酸，或者分離的多肽可以具有13-25個氨基酸，或者分離的多肽可以具有13-20個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-50個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-35個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-30個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-29個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-28個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-27個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-26個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-25個氨基酸，14-24個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-23個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-22個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-21個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-20個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-19個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-18個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-17個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-16個氨基酸，或者分離的多肽可以具有14-15個氨基酸。
[0077] 用來描述肽或多肽的命名法可以根據下面的常規實際操作，其中各氨基酸殘基中氨基在左邊而羧基在右邊。在代表本發明具體實施方案的序列中，雖然沒有具體說明，但是要明白氨基-和羧基-末端基團是設定在生理PH值下的形式，除非另有說明。在氨基酸結構式中，每個殘基一股可用通過單字母或三字母名稱表示，對應于表A中氨基酸名稱。
[0078]表A.自然界存在的肽中通常發現的20種標準L-氨基酸的命名法和縮寫
[0079]
【權利要求】
1.一種與 SEQ ID NO:1 ；SEQ ID NO: 2 ;*SEQ ID NO: 3 的任一個有至少 90% 同一性的分離的多肽，其特征在于，所述分離的多肽抑制包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17(zD17)和c-jun N-末端激酶(JNK)之間的相互作用。
2.一種與 SEQ ID NO:1 ；SEQ ID NO:2;或 SEQ ID NO:3 的任一個有至少 95% 同一性的分離的多肽，其特征在于，所述分離的多肽抑制包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17(zD17)和c-jun N-末端激酶(JNK)之間的相互作用。
3.一種分離的多肽，包含SEQ ID NO:1 ；SEQ ID NO:2 ;或SEQ ID NO:3中任一個序列。
4.如權利要求3的分離的多肽，其特征在于，所述分離的多肽抑制包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17(zD17)和c-jun N-末端激酶(JNK)之間的相互作用。
5.如權利要求1~4任一項所述的分離的多肽，其中所述分離的多肽進一步包括與所述分離的多肽結合的送遞和靶向部分。
6.如權利要 求5所述的分離的多肽，其中所述所述遞送和靶向部分選自下面的一種或多種:配體，蛋白質轉導結構域，或抗體。
7.如權利要求6所述的分離的多肽，其中所述蛋白質轉導結構域是HIV-1Tat蛋白質的細胞一膜轉導結構域。
8.—種分離的多核苷酸,包括編碼權利要求1~7任一項所述的多肽的核苷酸序列。
9.一種組合物，包含權利要求1~7任一項所述的多肽以及載體。
10.如權利要求9所述的組合物，其中所述載體是藥學可接受載體。
11.一種載體，包含權利要求8的分離的多核苷酸。
12.—種細胞，包含權利要求11的載體。
13.—種細胞,包含權利要求8的多核苷酸,其中所述多核苷酸與表達調控序列操作連接。
14.一種保護細胞免受興奮性神經毒素應激的方法，所述方法包括向細胞送遞權利要求I~7任一項所述的分離的多肽。
15.一種保護細胞免受興奮性神經毒素應激的方法，所述方法包括:(a)向細胞遞送權利要求11的載體；和(b)表達載體所攜帶的多核苷酸。
16.一種表達多肽的方法，所述方法包括:(a)向細胞遞送權利要求11的載體；和(b)在允許載體所攜帶的多核苷酸表達的條件下維持細胞。
17.如權利要求15~16任一項所述的方法，其中向細胞遞送載體在體內進行。
18.如權利要求15~16任一項所述的方法,其中向細胞遞送載體在離體進行。
19.如權利要求15~16任一項所述的方法,其中向細胞遞送載體在體外進行。
20.一種治療與興奮性神經毒性相關疾病的方法，所述方法包括:向需要的被試者施用生物學有效量的權利要求1~7任一項所述的多肽。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述生物學有效量是足以防止興奮性神經毒性誘導的細胞死亡的量。
22.如權利要求20或21所述的方法，其中所述與興奮性神經毒性相關疾病選自脊髓損傷、中風、腦損傷、多發性硬化、阿爾茨海默病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森病、酒精中毒或戒酒、和亨廷頓病。
23.如權利要求22所述的方法，其中所述與興奮性神經毒性相關疾病是中風。
24.一種治療與興奮性神經毒性相關疾病的藥物組合物，所述組合物包含權利要求1~7任一項所述的多肽和藥學可是接受載體。
25.如權利要求24所述的藥物組合物，其中所述與興奮性神經毒性相關疾病選自脊髓損傷、中風、腦損傷、多發性硬化、阿爾茨海默病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森病、酒精中毒或戒酒、和亨廷頓病。
26.如權利要求25所述的藥物組合物，其中所述與興奮性神經毒性相關疾病是中風。
27.如權利要求1~7任一項所述的多肽治療與神經毒性或興奮性神經毒性相關疾病的用途。
28.如權利要求1~7任一項所述的多肽在制備治療與神經毒性或興奮性神經毒性相關疾病的藥物中的用途。
29.如權利要求27或28所述的用途，其中所述與興奮性神經毒性相關疾病選自脊髓損傷、中風、腦損傷、多發性硬化、阿爾茨海默病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森病、酒精中毒或戒酒、和亨廷頓病。
30.如權利要求29所述的用途，其中所述與興奮性神經毒性相關疾病是中風。
31.一種用于治療與神經毒性或興奮性神經毒性相關疾病的權利要求1~7任一項所述的分離的多肽。
32.如權利要求31所述的多肽，其中所述與興奮性神經毒性相關疾病選自脊髓損傷、中風、腦損傷、多發性 硬化、阿爾茨海默病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森病、酒精中毒或戒酒、和亨廷頓病。
33.如權利要求32所述的多肽，其中所述與興奮性神經毒性相關疾病是中風。
34.一種商用包,包括:(a)權利要求1~7任一項所述的多肽；和(b)治療與細胞毒性或興奮性神經毒性相關疾病的其用途說明書。
35.一種商用包，包括:(a)權利要求1~7任一項所述的多肽和藥學可接受載體；和(b)治療與細胞毒性或興奮性神經毒性相關疾病的其用途說明書。
36.一種商用包，包括:(a)權利要求24~26任一項所述的藥物組合物；和(b)治療與細胞毒性或興奮性神經毒性相關疾病的其用途說明書。
37.如權利要求34~36任一項所述的商用包,其中所述與興奮性神經毒性相關疾病選自脊髓損傷、中風、腦損傷、多發性硬化、阿爾茨海默病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森病、酒精中毒或戒酒、和亨廷頓病。
38.如權利要求37所述的商用包，其中所述與興奮性神經毒性相關疾病是中風。
39.一種藥物組合物，包含: (a)與SEQ ID NO:1 ；SEQ ID NO:2;或 SEQ ID NO:3 的任一個有至少 90% 同一性的分離的多肽，其中同一性通過序列的長度計算，而且其中分離的多肽抑制包含鋅指DHHC型的十六烷酰基酰基轉移酶17(zD17)和c-jun N-末端激酶(JNK)之間的相互作用；和 (b)藥學上可接受賦形劑。
40.如權利要求39所述的組合物，其中所述賦形劑是等張注射液。
41.如權利要求39或40所述的組合物，其中所述組合物適合對人給藥。
42.如權利要求39、40或41所述的組合物，其中所述分離的多肽以包含HIV-1Tat蛋白質的細胞膜轉導結構域的融合蛋白中存在。
43.一種消毒容器，包含權利要求39~42任一項所述的組合物。
44.如權利要求43所述的容器，其中所述容器是注射器。
45.一種試劑盒，包含權利要求43的消毒容器。
【文檔編號】A61P25/28GK103998602SQ201280043513
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年7月12日 優先權日:2011年7月12日
【發明者】馬克斯·S·西納德, 楊光 申請人:英屬哥倫比亞大學