抗體變體及其用途

            文檔序號:1249245閱讀:604來源:國知局
            抗體變體及其用途
            【專利摘要】本發明描述了包含變體Fc域的多肽和相關抗體。當多肽、抗體或多種抗體連接到細胞表面的其靶標、抗原或多種抗原上時,變體Fc域提供穩定化的Fc:Fc相互作用,由此提供改進的效應子作用,如CDC應答。
            【專利說明】抗體變體及其用途 發明領域
            [0001] 本發明涉及包含變體Fc域的多肽及相關抗體。更具體地,本發明涉及包含Fc域 的抗體或多肽,其具有由Fc域中一個或多個氨基酸修飾帶來的修飾的效應子作用。
            [0002] 發明背景
            [0003] 由抗體Fc域介導的效應子作用允許破壞外來實體,如殺滅病原體以及清除和降 解抗原。抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)和抗體依賴性細胞介導吞噬(ADCP)由Fc區 與具有Fc受體(FcR)的細胞的結合起始,而補體依賴性細胞毒性(CDC)由Fc區與Clq的 結合起始,這起始補體激活的經典途徑。
            [0004] 每個IgG抗體包含兩個Clq結合位點,每個重鏈恒定(Fe)區中各一個。然而,由于 單體IgG對Clq的親和力非常弱(K d?I(T4M),溶液中的單個IgG分子不激活補體(Sledge 等,1973J. Biol. Chem. 248, 2818-13 ;Hughes-Jones 等,1979Mol. Immunol. 16, 697-701)。 抗原驅動的IgG關聯可導致多價Clq分子更緊密結合(Kd?I(T8M)和補體激活(Burton 等,1990M〇1. Immunol. 22, 161-206)。相比之下,IgM以共價連接的五或六聚體天然存在,與 細胞表達或固定的抗原結合后,IgM五聚體和六聚體可以有效的引起CDC。抗原結合是誘導 IgM構象變化以暴露Clq結合位點必需條件(Feinstein等,1986, ImmunologyToday, 169-17 4)。
            [0005] 已經提出通過Fc區CH2/CH3域的相互作用形成六聚體環結構,IgG也能 完成補體激活(Burton 等,1990Trends in Biochem. Sci. 15, 64-69)。支持此六聚 體 IgG 結構存在的證據已經在二維(Reidler 等,1986IHandbook of Experimental Immunology 第 4 版·(Weir, D. M.編),ρρ17. 1-17. 5. Blackwell, Edinburgh ;Pinteric 等,1971Immunochem. 8, 1041-5)和三維晶體中,以及對溶液中的IgGl、IgG2a和IgG4和 人 Fe 找到(Kuznetsov 等,2000J Struct. Biol. 131,108-115)。六聚體環的形成也在針 對抗HIV-lgpl20的bl2人IgGl κ抗體的晶體結構(PDB中的1HZH)中觀察到(Saphire 等,Science2001Augl0;293(5532),1155-9)。在bl2六聚體環中,六個易接近的Clq結合 位點位于六聚體表面,一個來自于六個抗體中的每個抗體,而其他六個結合位點面向下。
            [0006] Clq類似六球頭的郁金香束,包含系于六個膠原桿上的抗體結合區[Perkins 等,1985BiochemJ. 228, 13-26 ;Poon 等,1983JMolBiol. 168, 563-77 ;Reid 等,1983Biochem Soc Transl 1,1-12 ;Weiss 等,1986J. Mol. Biol. 189, 573-81]。發現 Clq 與 IHZH 晶體結 構的bl2六聚體組裝配合,以使六個球頭中每一個與六個Clq結合位點中的一個相接觸 (Parren, FASEB Summer Research Conference, Snowmass, Co.,5_10July2010 ;''Crystal Structure of an intact human IgG:implications for HIV-Ineutralization and effector Function",Erica Ollmann Saphire 著,the Scripps Research Institute, La Jolla, California. November2000)。晶體結構中對稱相關的bl2抗體之間觀察到的Fe界 面中所選氨基酸的突變被發現降低Clq結合親和力,表明了這些氨基酸對分子間Fc:Fc相 互作用的貢獻。
            [0007] US2011/0123440描述了改變的抗體Fc區及其用途。改變的Fc區有一個或多個氨 基酸取代。
            [0008] US2008/0089892描述了多肽Fe區變體及包含這些Fe區變體的組合物。
            [0009] US2010/0184959描述了提供有改變的Fe配體識別和/或效應子作用的Fe多肽變 體的方法。
            [0010] US2010/015133描述了通過調節多肽關聯來生產多肽的方法。
            [0011] US2010/105873描述了生成多域蛋白療法的綜合方法。
            [0012] US6, 737, 056描述了有改變的效應子作用的多肽變體。
            [0013] 之前已做出努力以識別具有增強的效應子作用或其他修飾特性的抗體 Fe變體。這樣的研究集中于,如,在IgG同種型之間交換片段以產生嵌合IgG分 子(Natsume 等,2008Cancer Res68(10) ,3863-72),或者在絞鏈區(Dall'Acqua 等,2006J Immunol 177, 1129-1138)或在CH2域的Clq結合位點處或其附近,圍繞殘 基 D270、K322、P329 和 P331 (Idusogie 等,2001J Immunoll66, 2571-2575 ;Michaelsen 等,2009Scand J Immunol70, 553-564 和 W099/51642)的氨基酸取代。例如,Moore 等(2010mAbs2(2), 181-189)描述 了檢測 S267E、H268F、S324T、S239D、I332E、G236A 和I332E的各種組合的通過⑶C或ADCC的增強的效應子作用。影響與Fe受體結合 (W02006/105062, W000/42072,美國專利6, 737, 056和美國專利7, 083, 784)或抗體物理特 性(W02007/005612A1)的其他Fe突變也已經提出。
            [0014] 盡管本領域中有這些和其他進步,然而,仍然有對新的和改進的基于抗體療法的 需求。
            [0015] 發明概述
            [0016] 本發明提供了相比其親本多肽/抗體其具有增強的效應子作用的多肽和抗體變 體。不限于理論,認為變體能在兩個多肽/抗體分子Fe區之間有更穩定的連接相互作用, 由此提供更親和的表面,其能導致增強的效應子作用,如提高的或更特異的CDC應答。特定 變體的特征也在于改進的ADCC應答、ADCP應答、和/或其他增強的效應子作用。如本發明 所述,多肽/抗體工程的這種微妙機制可以被應用于,例如提高基于抗體療法的效力或特 異性。
            [0017] 因此本發明的一個方面涉及包含免疫球蛋白的Fe域和結合區的親本多肽的變 體,其中變體在選自對應人IgGl重鏈Fe區中的E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、 Q311、D/E356、T359、E382、Y436和K447的那些氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基處包含突 變,條件是在S440的突變為S440Y或S440W。
            [0018] 本發明也提供至少一個這樣的突變的用途,當多肽或抗體結合于例如抗原表達細 胞、細胞膜或病毒粒子表面上的其抗原上時,提高由多肽或抗體介導的效應子作用。
            [0019] 在一個本發明中被稱為"單突變體"的方面,該變體相比親本多肽或抗體具有提高 的效應子作用。
            [0020] 在一個本發明中被稱為"雙突變體"的方面,該變體在所述片段中包含至少兩個 突變,并相比僅包含兩個突變中一個的變體、親本多肽或抗體,或兩者具有改進的效應子作 用。
            [0021] 在一個本發明中被稱為"混合突變體"的方面,該變體在與相同或不同多肽或抗體 在所述區段的不同氨基酸殘基處包含突變的第二變體組合使用時,相比一種或多種變體、 第二變體和單獨親本多肽或抗體提供提高的效應子作用。
            [0022] 通常,突變是氨基酸取代,如突變將親本氨基酸殘基交換為具有不同大小和/或 促進新分子間Fc:Fc鍵形成或提高現存對相互作用強度的物理化學特性的氨基酸。對于根 據本發明的突變的示例性氨基酸殘基,連同示例性氨基酸取代示于表1和2A和B中。本發 明不同方面的非限制性展示在圖1中提供。
            [0023] 本發明的這些和其他方面,具體是抗體變體的多種用途和治療應用,在下面更詳 細地描述。
            [0024] 附圖簡述
            [0025] 圖I :(A)六聚體形式IgG分子的示意性展示。虛線圈顯示了兩個相鄰IgG分子的 兩個接近的Fc:Fc相互作用對。框中的箭頭顯示了觀看B、C和D中圖示的方向:兩個鄰近 的Fc分子旋轉90° (在圖的平面中)并從CH3域方向的Fab臂觀看。(B)觀察到的寡聚 增強突變對CDC的效果。示意性展示顯示了根據本發明單突變體和雙突變體方面具有增強 效力的Fc:Fc相互作用對。(C)觀察到的寡聚抑制突變對CDC的效果。示意性展示顯示了 根據本發明雙突變體和混合突變體方面,相互補償的至少兩個寡聚抑制突變怎樣組合入一 個分子(雙突變體方面)或者在兩個分子上分離(混合突變體方面),以恢復或提高Fe:Fc 相互作用。混合突變體實現依賴于兩個抗體結合的特定效應子作用,這可以識別不同的靶 標。(D)Clq結合抑制突變對⑶C的理論效果。Fc:Clq相互作用的示意性展示顯示了由于 Clq不能補償引入抗體的缺陷,如果突變抑制Clq結合,其不能組合或混合以恢復CDC活性。
            [0026] 圖 2 :對應 IgGl 重鏈中殘基 P247 到 K447 的人 IgGl,IgGlf,IgG2, IgG3 和 IgG4Fc 片段的比對,使用Clustel2. I軟件,按Kabat中所列EU索引編號。顯示的序列代表人IgGl 重鏈恒定區域(SEQIDN0:1 ;UniProt獲取號P01857)和IgGlm(f)的同種異型變體的殘基 130 到 330 ;IgG2 重鏈恒定區域的殘基 126 到 326(SEQIDN0:2 ;UniProt 獲取號 P01859); IgG3重鏈恒定區域的殘基177到377 (SEQIDN0:2 ;UniProt獲取號P01860);和IgG4重鏈恒 定區域的殘基 127 到 327(SEQIDN0:4 ;UniProt 獲取號 P01861)。
            [0027] 圖 3A 和 B :IgGl(SEQIDN0:3)、IgG4(SEQIDN0:5)和(部分)IgG3(SEQIDN0:6)骨 架中的抗EGFr抗體2F8的序列比對。描述了按照Kabat和按照EU索引的氨基酸編號(兩 者都在 Kabat 等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版,Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,MD. (1991)中描述)。
            [0028] 圖4 :多聚體(如六聚體)排布中鄰近分子(分別為Fe和Fc')Fc之間K439/S440 相互作用詳細視圖,顯示了野生型、未修飾的Fc和Fc'分子之間的相互作用。
            [0029] 圖5 :多聚體(如六聚體)排布中鄰近分子(分別為Fc和Fc')Fc之間K439/S440 相互作用詳細視圖,顯示了包含K439E和S440K突變的變體Fc和Fc '分子之間的相互作用。
            [0030] 圖6 :用7D8Fc:Fc突變體的Clq結合ELISA。系列濃度的所示抗體被涂覆到微量 滴定板孔上并與固定濃度的Clq溫育。除了 I253D,所有包被的變體與Clq結合的效率可與 野生型7D8相比。顯示了至少3個實驗的示意。
            [0031] 圖7 :7D8變體介導的對CD20陽性Raji細胞的CDC15Raji細胞與7D8變體(K439E, S440K,K439E/S440K雙突變體,K439E+S440K混合)和系列濃度的Clq溫育以通過測量細胞 裂解測試CDC效力。顯示了重復實驗的示意圖。
            [0032] 圖 8: 7D8 變體(7D8-WT,K439E,S440K,K439E/S440K 雙突變體,K439E+S440K 混合) 介導的對⑶20陽性Daudi細胞的⑶C。測試了系列濃度的7D8變體的誘導⑶C的效力。
            [0033] 圖9 :⑶38抗體HuMAb005突變體介導的對⑶38陽性細胞的⑶C。(A) 005突變體 系列濃度對Daudi細胞的⑶C效力。(B) HuMAb005突變體系列濃度對Raji細胞的⑶C效 力。(C)具有20 %或50 % NHS的HuMAb005的E345R突變體對Wienl33細胞的CDC效力。 (D)具有20%或50%NHS的HuMAb005 和7D8的E345R突變體對Raji細胞的CDC效力。
            [0034] 測試從瞬時轉染中分離的未純化抗體樣品。使用模擬轉染細胞的上清作為陰性對 照。
            [0035] 圖10 :與Fc結合肽的競爭性實驗中,⑶38抗體HuMAb005 (A)和⑶20抗體 HuMAb7D8 (B)的野生型和E345R突變體的CDC。CDC后對與系列濃度Fc結合DCAWHLGELVWCT 肽(SEQIDN0:7)溫育的抗體調理的Daudi細胞測量細胞裂解。使用從瞬時轉染中分離的未 純化抗體樣品。使用模擬轉染細胞的上清作為陰性對照。
            [0036] 圖 11 :野生型 CD38 抗體 HuMAb005 和突變體 IgGl-005-E345R 的 CD38 表達 Daudi 細胞的ADCC。表示為%裂解,顯示了一個供體PBMC的ADCC。
            [0037] 圖12 :在pH6,如通過ELISA確定的,野生型的IgGl-7D8和變體IgGl-7D8-E345R 與人、猴和小鼠FcRN的結合。
            [0038] 圖13 :在SCID小鼠中靜脈注射后,野生型IgGl-7D8和-E354R,-S440K和K322A 變體的血漿濃度。
            [0039] 圖 14A、B、C 和 D :對 CD20 和 CD38 陽性 Wienl33 細胞的 CDC。
            [0040] 圖15A和B :在使用Raji-luc#2Dl細胞的皮下移植腫瘤模型中IgGl-7D8-E345R的 體內效力的評價。
            [0041] 圖16A和B :在使用Raji-luc#2Dl細胞的皮下移植腫瘤模型中IgGl-005-E345R的 體內效力的評價。
            [0042] 圖17 :具有E345R突變的CD38/EGFR雙特異性抗體對CD38陽性、EGFR陰性 Wienl33 細胞的 CDC。
            [0043] 圖18A和B :具有或沒有E345R突變的CD20/CD38雙特異性抗體對CD20陽性、CD38 陰性的Wienl33細胞或Raji細胞的CDC。
            [0044] 圖19 :具有E345R突變的EGFR抗體2F8對EGFR陽性A431細胞的CDC。
            [0045] 圖20A和B :E345R突變體抗體介導的CDC。
            [0046] 圖21 :具有溶酶體標記LAMPl (APC)的TF抗體(FITC)的共定位分析。
            [0047] 圖22A-D :引入E345R突變導致與在不同B細胞系中測試的野生型利妥昔單抗相 t匕,⑶C介導的殺傷增強。
            [0048] 圖22E :引入E345R導致與野生型利妥昔單抗相比最大⑶C介導的殺傷提高,其 獨立于具有可比較⑶20表達水平的不同B細胞系中補體調節蛋白⑶46(A)、⑶55 (B)或 ⑶59 (C)的表達水平。
            [0049] 圖23 :⑶C動力學。相比野生型抗體,E345R抗體導致更迅速和更大量的由⑶C所 致的靶細胞裂解。
            [0050] 圖24 :⑶C動力學。在雙特異性⑶38x⑶20抗體中引入E345R突變導致更迅速和 更大量的CDC介導的靶細胞裂解。
            [0051] 圖25A-B :⑶C動力學。在單價結合EGFR陰性Ra j i細胞的雙特異性抗體 CD38xEGFR(A)和CD20xEGFR(B)中引入E345R突變導致更迅速和更大量的CDC介導的靶細 胞裂解。
            [0052] 圖 26A-F :野生型抗體與含(A-C)E345R 和 Q386K 或(D-F)E345R、E430G 和 Q386K 的突變體抗體的組合對Wienl33細胞的CDC。IgGl-bl2突變體不結合Wienl33細胞并被用 作陰性對照抗體。
            [0053] 圖27 :含E345R突變的IgGl、IgG2、IgG3和IgG4同種型抗體的CDC效力。
            [0054] 圖28 :在野生型⑶38抗體005中引入Fc-Fc穩定E345R突變導致離體⑶C測定 法中原代CLL細胞殺傷增強(平均土均值的標準偏差)。
            [0055] 發明詳述
            [0056] 如本發明中所述,令人驚奇地,不直接參與Fe:Clq結合的氨基酸中的突變仍然能 提高抗體的CDC,并也能改進抗體的其他Fc介導的效應子作用。這支持了抗體分子如IgGl 抗體能形成隨后被Clq連接的寡聚結構的假設。此外,盡管發現某些突變降低CDC誘導,相 同或不同抗體分子中這樣突變的某些組合導致CDC誘導的恢復,并顯示對抗體寡聚的更多 特異性,并由此促進更特異的CDC誘導。如實施例中所示,提高CDC應答的特定突變特征也 在于改進的ADCC應答,提商的未和力,提商的內化和在鼠腫瘤I旲型系統中的體內效力。這 些發現允許有增強CDC誘導能力,更有選擇性的CDC誘導,和/或其他改進的效應子作用的 新的基于抗體的療法。
            [0057] 本發明的抗體變體全包含抗原結合區以及全長或部分Fc區,其在對應IgGl中氨 基酸殘基P247到K447的區段中包含至少一個突變。不限于理論,基于圖1中示意性展示 并在本發明中被稱為"單突變體"、"雙突變體"和"混合突變體"的三個不同的原理,認為識 別的突變導致更有效和/或更特異的CDC誘導。
            [0058] 來自本發明變體的改進的Clq和/或CDC效應主要僅是在允許抗體寡聚體形成的 檢測中,如在抗原沒有固定但位于流體膜上的基于細胞的檢測中能檢測到。此外,從更穩定 的抗體寡聚體得到而不是從Clq直接結合位點的修飾得到的這些效應可以根據圖IC所示 的原理驗證。
            [0059] 定義
            [0060] 術語"單突變體"應理解為相比親本多肽或抗體具有提高的效應子作用的本發明 變體。
            [0061] 術語"雙突變體"應理解為變體,其在所述片段中包含至少兩個突變,并相比僅包 含兩個突變中一個的變體、親本多肽或抗體或兩者具有改進的效應子作用。
            [0062] 術語"混合突變體"應理解為變體,其在與相同或不同多肽或抗體的包含所述區段 的不同氨基酸殘基處的突變的第二突變體組合使用時,相比一種或多種變體、第二變體和 單獨親本多肽或抗體提供提高的效應子作用。
            [0063] 術語"包含免疫球蛋白Fc域和結合區的多肽"在本發明上下文中是指包含免疫球 蛋白Fc域和結合區的多肽,其能與例如位于細胞,細菌,或病毒粒子上任何分子,如多肽結 合。免疫球蛋白的Fc域定義為通常在用木瓜蛋白酶消化抗體后生成的抗體片段(這對本 領域技術人員已知),其包括免疫球蛋白的兩個CH2-CH3區和連接區,例如鉸鏈區。抗體重 鏈恒定區定義抗體同種型,例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgE。Fc域介導抗體 與被稱為Fe受體的細胞表面受體和補體系統蛋白的效應子作用。結合區可以是能連接到 細胞、細菌、病毒粒子的多肽序列,如蛋白、蛋白配體、受體、抗原結合區或配體結合區。如果 結合區是例如受體,"包含免疫球蛋白Fc域和結合區的多肽"可以作為免疫球蛋白Fc域和 所述結合區的融合蛋白來被制備。如果結合區是抗原結合區,"包含免疫球蛋白Fc域和結 合區的多肽"可以是抗體,像人抗體或僅有重鏈的抗體或ScFv-Fc-融合體。包含免疫球蛋 白Fc域和結合區的多肽通常包括連接區,例如鉸鏈區,和免疫球蛋白重鏈的兩個CH2-CH3 區,因此"包含免疫球蛋白Fc域和結合區的多肽"可以是"包含至少免疫球蛋白Fc域和結 合區的多肽"。術語"免疫球蛋白Fc域"在本發明上下文中意指取決于抗體亞型的連接區, 例如鉸鏈,以及免疫球蛋白CH2和CH3區存在,例如人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgAU IgGA2 或 IgE。
            [0064] 本發明中使用的術語"CH2區"或"CH2域"意指免疫球蛋白的CH2區。因此例如 人IgGl抗體的CH2區對應于根據EU編號系統的氨基酸228-340。然而,CH2區也可以是本 發明所述的任何其他亞型。
            [0065] 本發明中使用的術語"CH3區"或"CH3域"意指免疫球蛋白的CH3區。因此例如 人IgGl抗體的CH3區對應于根據EU編號系統的氨基酸341-447。然而,CH3區也可以是本 發明所述的任何其他亞型。
            [0066] 術語"免疫球蛋白"是指一類結構上相關的糖蛋白,其由兩對多肽鏈,一對輕 (L)低分子量鏈和一對重(H)鏈組成,所有四條之間通過二硫鍵內在相連。免疫球蛋 白的結構已經被充分表征。見例如Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W·,編第二 版.RavenPresS,N.Y. (1989))。簡而言之,每條重鏈通常由重鏈可變區(本發明中縮寫為 VH)和重鏈恒定區組成。重鏈恒定區通常由三個域,CH1,CH2,和CH3組成。重鏈之間通過 所謂"鉸鏈區"中的二硫鍵相連。每條輕鏈通常由輕鏈可變區(本發明中縮寫為VL)和輕 鏈恒定區組成。輕鏈恒定區通常由一個域,CL組成。VH和VL區可以被進一步再劃分為高 可變性區(或在序列和/或結構限定環形式中高度可變的高可變區),也被稱為互補決定區 (CDRs),其散布有更保守的區域,被稱為框架區(FRs)。每條VH和VL通常由三個CDRs和四 個FRs組成,其從氨基末端到羧基末端以以下順序排列:FR1,CDR1,FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(也見Chothia和LeskJ. Mol. Biol. 196, 901917(1987))。除非另有說明或上下文相矛 盾,本發明中恒定區序列的氨基酸根據EU-索引編號(在Kabat, E.A.等,Sequences of proteins of immunological interest.第五版-US Department of Health and Human S ervices, NIHpublicationNo. 91-3242, pp662, 680, 689 (1991)中描述)。
            [0067] 本發明上下文中術語"抗體"(Ab)是指免疫球蛋白分子,免疫球蛋白分子片段, 或兩者的衍生物,其具有在典型生理條件下特異性結合抗原的能力,有顯著時間段的半衰 期,如至少約30分鐘,至少約45分鐘,至少約1小時,至少約2小時,至少約4小時,至少 約8小時,至少約12小時,約24小時,約48小時,約3,4, 5,6, 7或更多天等,后任何其他 相關功能限定時段(如足以誘導、促進、增強和/或調節與抗體結合抗原相關的生理應答 的時間,和/或足以使抗體募集效應活性的時間)。本發明的抗體包含免疫球蛋白Fc域和 結合區。抗體通常含有兩個CH2-CH3區和連接區,例如鉸鏈區,例如至少Fc域。因此本發 明的抗體可以包含Fc區和抗原結合區。免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈可變區包含與抗原 相互作用的結合域。抗體的恒定或"Fc"域可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合, 包括免疫系統各種細胞(如效應細胞)和補體系統的組分如Clq,補體激活經典途徑的第 一組分。抗體也可以是多特異性抗體,如雙特異性抗體或類似分子。術語"雙特異性抗體" 是指具有對至少兩種不同,通常是不重疊表位的特異性的抗體。這樣的表位可以在相同或 不同的靶標上。如果表位在不同的靶標位上,這樣的靶標可以在相同細胞或不同細胞或細 胞類型上。如上所述,除非另有說明或者明顯與上下文相矛盾,在本發明中術語抗體包括 抗體片段,其包含至少部分Fc區并保持特異性結合抗原的能力。這樣的片段可以通過任 何已知技術提供,如酶切、肽合成和重組表達技術。已經顯示了抗體的抗原結合功能可以 由全長抗體的片段來進行。涵蓋在術語"Ab"或"抗體"中的結合片段實例包括,不限于, 單價抗體(在W02007059782中由Genmab描述);重鏈抗體,其僅由兩條重鏈組成并在例 如胳馬它中天然存在(例如,Hamers_Casterman(1993)Nature363:446) ;ThioMabs(Roche, W02011069104),鏈交換工程域(SEED或Seed體),其是不對稱的和雙特異性的抗體樣分 子(Merck, W02007110205) ;Triomab(Fresenius,Lindhofer 等(1995JImmunoll55:219)); FeΔAdp (Regeneron, W02010151792), Azymetric Scaffold(Zymeworks/Merck, W02012/058768),mAb-FV (Xencor,W02011/028952),雙可變域免疫球蛋白(Abbott, DVD-Ig, 美國專利7,612,181);雙域雙頭抗體出11丨16¥61';5311(^4¥611衍8,恥20100226923),二 雙抗體(ImClone/Eli Lilly),鈕-入-孔(knob-into-holes)抗體形式(Genentech, W09850431) ;DuoBody(Genmab,TO2011/131746);靜電駕馭抗體形式(Amgen,EP1870459 和 TO2009089004;Chugai,US201000155133;0ncomed,W02010129304A2) ;雙特異性 IgGl 和 IgG2(Rinat neurosciences Corporation, WOlI143545), CrossMAbs(Roche, W02011117329),LUZ-Y(Genentech),Biclonic (Merus),雙祀向域抗體(GSK/Domantis), 識別兩個祀標的二合一抗體(Genentech,Novlmmune),交聯 Mbs (Karmanos Cancer Center), CovX 體(CovX/Pfizer), IgG 樣雙特異性(ImClone/EliLilly,Shen,J·,等 JI mmunol Methods, 2007. 318(1-2):ρ· 65-74),和 DIG 體和 PIG 體(Pharmabcine), 以及雙親和性再靶向分子(Macrogenics 的 Fc-DART 或 Ig-DART,W0/2008/157379, TO/2〇10/〇8〇538),Zybodies (Zyngenia),普通輕鏈(Crucell/Merus,US7262O28)或普 通重鏈(Novlmmune的κ λ體)的方法,以及融合蛋白,其包含多肽序列,所述多肽序 列融合于含Fc域的抗體片段,像scFv融合體,像ZymoGenetics/BMS的BsAb, Biogen Idec 的 HERCULES(US007951918), Emergent BioSolutions/Trubion 的 S⑶RPI0NS, Ts2Ab(Medlmmune/AZDimasi,N·,等 J Mol Biol,2009.393(3):p. 672-92),Novartis 的 scFv 融合體,Changzhou Adam Biotech Inc 的 scFv 融合體(CN102250246), Roche 的 TvAb(W02012025525,TO2012025530), f-Star 的 mAb2(W02008/003116)和雙 scFv-融合 體。還應當理解,術語抗體,除另有指明外,也包括多克隆抗體、單克隆抗體(如人單克隆抗 體)、抗體混合物(重組多克隆)例如,通過Symphogen和Merus (Oligoclonics)開發的技 術生成的,和抗體樣多肽,如嵌合抗體和人源化抗體。生成的抗體可潛在地具有任何同種 型。
            [0068] 術語"全長抗體",當在本發明中使用時是指抗體(如親本或變體抗體),其包含對 應通常在該同種型野生型抗體中發現的那些域的所有重和輕鏈恒定和可變域。
            [0069] 本發明中所用的術語"人抗體"是包括抗體,其具有源自人種系免疫球蛋白序列的 可變區和恒定區。本發明的人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼氨基酸殘基 (例如,通過體外隨機或點特異突變或者通過體內體細胞突變引入的突變、插入或缺失), 然而,本發明中所用的術語"人抗體"不意欲包括其中源自另一哺乳動物種類種系,如小鼠 的CDR序列已經被移植到人骨架序列的抗體。
            [0070] 本發明中所用術語"單克隆抗體"、"單克隆Ab"、"單克隆抗體組成","mAb"或類似 是指單分子組成的抗體分子制劑。單克隆抗體組成顯示對特定表位的單結合特異性和親和 力。因此,術語"單克隆抗體"是指顯示單結合特異性的抗體,其具有源自人種系免疫球蛋 白序列的可變和恒定區。人mAbs可以由雜交瘤細胞生成,雜交瘤細胞包括從轉基因或轉染 色體非人動物,如轉基因小鼠中獲得的B細胞,B細胞包含重排以產生功能性人抗體的人重 鏈轉基因部分和輕鏈轉基因部分并與永生細胞融合。
            [0071] 本發明中所用的"同種型"是指按重鏈恒定區基因編碼的免疫球蛋白類(例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgAl、IgGA2、IgE 或 IgM 或者其任何同種異型類型如 IgGlm(za) 和IgGlm(f))。此外,每種重鏈同種異型可與κ或λ輕鏈組合。
            [0072] 術語"單價抗體"在本發明上下文中意為抗體分子,其僅能夠僅以一個抗體結合域 與抗原結合,例如具有單抗原-抗體相互作用,并因此不能抗原交聯。
            [0073] 本發明中所用的術語"靶標"在本發明上下文中應理解為包含Fc域和結合區的 多肽的結合區結合到的分子,當用于抗體結合的上下文中時包括所提出抗體導向的任何抗 原。術語"抗原"和"靶標"關于抗體時可以互換使用,并對本發明任何方面或實施方案構 成相同的含義或目的。
            [0074] 本發明中所用的術語"結合"在抗體結合到預定抗原的上下文中通常是結合,當使 用抗原作為配體和抗體作為分析物,通過例如表面等離子共振(SPR)技術在BIAcore3000 儀器中測定時,結合有對應約KT 6M或更小,例如KT7M或更小,如KT8M或更小,如KT9M或 更小,約KT kiM或更小,或約KT11M或甚至更小的Kd的親和力,并且以對應于與結合到非 預定抗原或密切相關抗原的非特異性抗原(例如BSA,酪蛋白)時其親和力相比為至多 1/10 (at least ten-fold lower),如至多 1/100,例如至多 1/1000,如至多 1/10000,例如至 多1/100000的Kd的親和力與預定抗原結合。親和力較低時的量取決于抗體的K D,這樣當 抗體的Kd非常低(即抗體高度特異)時,則對抗原親和力相比對非特異性抗原親和力較低 的量可以是至少10000倍。本發明中所用的術語"K D"(M)是指特定抗體-抗原相互作用的 解離平衡常數。
            [0075] 本發明的"變體"或"抗體變體"或"親本抗體變體"是相比"親本抗體"包含一個 或多個突變的抗體分子。類似的,本發明"變體"或"包含免疫球蛋白Fc域和結合區的多肽 的變體"或"包含免疫球蛋白Fc域和結合區的親本多肽的變體"是相比"包含免疫球蛋白 Fc域和結合區的親本多肽",包含一個或多個突變的"包含免疫球蛋白Fc域和結合區的多 肽"。不同的術語可以互換使用,并對本發明任何方面或實施方案構成相同的含義或目的。 示例性的親本抗體形式包括,不限于,野生型抗體,全長抗體或含Fc的抗體片段,雙特異性 抗體,人抗體,或其任意組合。示例性的突變包括親本氨基酸序列中的氨基酸缺失、插入或 氨基酸取代。氨基酸取代可將天然氨基酸替換為另一種天然存在的氨基酸,或者非天然存 在的氨基酸衍生物。氨基酸取代可以是保守或非保守的。在本發明上下文中,保守取代由 下面三個表的一個或多個中反映的氨基酸類型之間的取代所定義:
            [0076] 保守取代的氨基酸殘基類型
            [0077]
            【權利要求】
            1. 一種提高包含免疫球蛋白Fe域和結合區的親本多肽的效應子作用的方法,該方法 包括在親本多肽中選自對應于人IgGl重鏈Fe區中的E345、E430、S440、Q386、P247、I253、 3254、〇311、0/^356、了3593382、¥436和1(447的那些氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基中 引入突變,條件是S440中的突變是S440Y或S440W。
            2. 根據權利要求1的提高親本抗體的效應子作用的方法,包括在親本抗體中選自對應 于人 IgGl 重鏈 Fe 區中的 E345、E430、S440、Q386、P247、1253、S254、Q311、D/E356、T359、 E382、Y436和K447的那些氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基中引入突變,條件是S440中 的突變是S440Y或S440W。
            3. -種降低包含免疫球蛋白Fe域和結合區的親本多肽的效應子作用的方法,該方法 包括在親本多肽中選自對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439和S440的那些氨基酸殘基的 一個氨基酸殘基中引入突變,條件是S440中的突變不是S440Y或S440W,如其中對應于人 IgGl重鏈Fe區中的K439的位置的突變是K439D/E,和/或對應于人IgGl重鏈Fe區中的 S440位置的突變是S440K/H/R。
            4. 根據權利要求3的降低親本抗體的效應子作用的方法,包括在親本抗體中選自對應 于人IgGl重鏈Fe區中的K439和S440的那些氨基酸殘基的一個氨基酸殘基中引入突變, 條件是S440的突變不是S440Y或S440W,如其中對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439位置的 突變是K439D/E,和/或對應于人IgGl重鏈Fe區的S440位置的突變是S440K/H/R。
            5. 根據權利要求2或4中任一項的方法,其中親本抗體是單特異性、雙特異性或多特異 性抗體。
            6. 根據權利要求5的方法,其中親本抗體為包含第一多肽和第二多肽的雙特異性抗 體,所述第一多肽包含免疫球蛋白的第一 CH2-CH3區和第一抗原結合區,所述第二多肽包 含免疫球蛋白的第二CH2-CH3區和第二抗體結合區,其中所述第一和第二抗原結合區結合 相同抗原或不同抗原上的不同表位,而且其中所述第一 CH2-CH3區在選自對應于人IgGl重 鏈Fe區中的1(409、了366、1^368、1(370、0399、?405和¥407的那些的位置包含另外的氨基酸取 代;其中所述第二CH2-CH3區在選自對應于人IgGl重鏈Fe區中的F405、T366、L368、K370、 D399、Y407和K409的那些的位置包含另外的氨基酸取代,而且其中第一 CH2-CH3區中的所 述另外的氨基酸取代不同于第二CH2-CH3區中的所述另外的氨基酸取代。
            7. 根據權利要求5或6的方法,其中親本抗體為雙特異性抗體并包含第一多肽和第 二多肽,其中所述第一多肽包含免疫球蛋白的第一 CH2-CH3區和第一抗原結合區,所述第 二多肽包含免疫球蛋白的第二CH2-CH3區和第二抗原結合區,其中第一和第二抗原結合區 結合相同抗原或不同抗原上的不同表位,所述方法包括在每個第一和第二CH2-CH3區中在 選自對應于人 IgGl 重鏈 Fe 區的 E345、E430、S440、Q386、P247、1253、S254、Q311、D/E356、 T359、E382、Y436和K447的那些氨基酸殘基中的至少一個氨基酸殘基中引入突變,條件是 S440的突變是S440Y或S440W。
            8. 根據權利要求1至2和5至7中任一項所述的方法,所述方法包括在除S440和K447 之外的一個或更多個位置上引入突變,以及進一步在如下位置引入突變: (i) 在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439和S440的氨基酸殘基的每一個中,條件是 S440的突變不是S440Y或S440W, (ii) 在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447和448的氨基酸殘基的每一個中,如人IgGl 重鏈Fe區中的K447K/R/H和448E/D,優選人IgGl重鏈Fe區中的K447K和448E,或者 (iii)在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447、448和449的氨基酸殘基的每一個中,例 如人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E和448K/R/H和449Ρ,優選人IgGl重鏈Fe區中的Κ447Ε、 448K 和 449P。
            9. 根據權利要求8的方法,所述方法包括在除S440之外的一個或更多個位置中引入突 變,以及進一步在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439和S440的氨基酸殘基的每一個中引 入突變,條件是S440的突變不是S440Y或S440W。
            10. 根據權利要求9的方法,其中對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439的位置中的突變 為K439D/E,和/或對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440的位置中的突變為S440K/H/R。
            11. 一種提高至少第一和第二親本多肽的組合的效應子作用的方法,其中至少第一和 第二親本多肽中的每個都包含免疫球蛋白的Fe域和結合區,其中所述方法包括 (i)向至少第一和/或第二親本多肽的選自下組的一個或更多個氨基酸殘基中引入突 變: (a) CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3 β -鏈內的氨基酸殘基,條件是在對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440突 變的情況下,突變是S440Y或S440W,和 (e) 對應于人IgGl重鏈Fe區中的E345、E382或Q386的氨基酸殘基。
            12. 根據權利要求11的提高至少第一和第二親本抗體的組合的效應子作用的方法,其 中至少第一和第二親本多肽中的每個都包含免疫球蛋白的Fe域和結合區,其中所述方法 包括 (i)向至少第一和/或第二親本多肽的選自下組的一個或更多個氨基酸殘基中引入突 變: (a) CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3 β -鏈內的氨基酸殘基,條件是在對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440突 變的情況下,突變是S440Y或S440W,和 (e) 對應于人IgGl重鏈Fe區中的E345、E382或Q386的氨基酸殘基。
            13. 根據權利要求12的方法,其中至少第一和/或第二親本抗體中的突變在選自對應 于人 IgGl 重鏈 Fe 區中的 E345、E430、S440、Q386、P247、1253、S254、Q311、D/E356、T359、 E382、Y436和K447的那些氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基中,條件是S440的突變是 S440Y 或 S440W。
            14. 根據權利要求12至13的方法,其中所述方法包括在第一和第二親本抗體兩者中都 引入突變。
            15. 根據權利要求12的方法,其中所述方法包括 ⑴在第一親本抗體的選自對應于人IgGl重鏈Fe區中的E345、E430、S440、Q386、 P247、1253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436 和 K447 的那些氨基酸殘基中的至少一個 氨基酸殘基中引入突變,條件是S440的突變是S440Y或S440W, (ii)提供第二親本抗體,其在選自對應于人IgGl重鏈Fc區中的E345、E430、S440、 Q386、P247、1253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436 和 K447 的那些氨基酸殘基中的氨 基酸殘基中不包含突變。
            16. 根據權利要求12至15中任一項的方法,其中所述方法包括在除S440之外的一個 或更多個位置中引入突變,其中所述方法進一步包括如下步驟: (i) 在第一親本抗體的對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439位置的氨基酸殘基中引入第 二突變,以及 (ii) 在第二親本抗體的對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440位置的氨基酸殘基中引入 第二突變,條件是S440的突變不是S440Y或S440W,其中步驟(ii)和步驟(iii)可替換地 可以是: (i) 在第一親本抗體的對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440位置的氨基酸殘基中引入第 二突變,條件是S440的突變不是S440Y或S440W ;以及 (ii) 在第二親本抗體的對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439位置的氨基酸殘基中引入 第二突變。
            17. 根據權利要求16的方法,其中在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439的位置中的突 變是K439D/E,并且在對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440的位置中的突變是S440K/H/R。
            18. 根據權利要求12至17中任一項的方法,其中所述至少第一和第二親本抗體中的每 個都可以選自下組:單特異性、雙特異性和多特異性抗體。
            19. 根據權利要求18的方法,其中所述至少第一和第二親本抗體是結合相同抗原或不 同抗原上的不同表位的雙特異性或多特異性抗體。
            20. 根據權利要求18或19的方法,其中所述至少第一和第二親本抗體每個都是包含第 一多肽和第二多肽的雙特異性抗體,所述第一多肽包含免疫球蛋白的第一 CH2-CH3區和第 一抗原結合區,第二多肽包含免疫球蛋白的第二CH2-CH3區和第二抗原結合區,其中第一 和第二抗原結合區結合相同抗原或不同抗原上的不同表位,而且其中所述第一 CH2-CH3區 在選自對應于人IgGl重鏈Fe區中的1(4093366、1^368、1(370、03994405和¥407的那些位 置的位置處包含另外的氨基酸取代,其中所述第二CH2-CH3區在選自對應于人IgGl重鏈Fe 區中的F405、T366、L368、K370、D399、Y407和K409的那些位置的位置處包含另外的氨基酸 取代,而且其中第一 CH2-CH3區中的所述另外的氨基酸取代不同于第二CH2-CH3區中的所 述另外的氨基酸取代。
            21. 根據權利要求1至2、5至7、11至15以及18至20中任一項的方法,其中所述突變 是在選自對應于人IgGl重鏈Fe區中的E345、E430、S440至Y或W、及Q386的那些氨基酸 殘基的至少一個氨基酸殘基中,優選其中所述突變是至少一個如下的氨基酸取代:E345至 R、Q、N 或 K,E430 至 T、S 或 G,S440 至 Y 或 W,或者 Q386 至 K。
            22. 根據權利要求1至2、5至7、11至15以及18至20中任一項的方法,包括在親本 抗體的選自對應于人 IgGl 重鏈 Fe 區中的 E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、 D/E356、T359、E382、Y436和K447的那些氨基酸殘基的至少兩個氨基酸殘基中引入突變,條 件是S440的突變是S440Y或S440W。
            23. 根據權利要求22的方法,包括在親本抗體的選自對應于人IgGl重鏈Fe區中的 E345、E430、Q386和S440的那些氨基酸殘基的至少兩個氨基酸殘基中引入突變,條件是 S440的突變是S440Y或S440W,例如其中在至少兩個氨基酸中的突變選自如下:E345至R、 Q、N 或 K,E430 至 T、S 或 G,S440 至 Y 或 W,或者 Q386 至 K。
            24. 根據權利要求1至23中任一項的方法,其中所述效應子作用為Fc-介導的效應子 作用,其選自選自如下的Fc-介導的效應子作用:Clq結合、補體激活、補體依賴性細胞毒性 (⑶C)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、FcRn-結合、Fc-受體結合包括Fe-γ受體 結合、蛋白A-結合、蛋白G-結合、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、補體依賴性細胞的細胞毒 性(CDCC)、補體增強型細胞毒性、調理作用、包含Fc的多肽內化作用、靶標下調、ADC攝取、 細胞凋亡誘導、細胞死亡、細胞周期停滯及其任何組合。
            25. 根據權利要求1至2以及5至24中任一項的方法,其中當抗體與其抗原結合時,效 應子作用提高。
            26. 根據權利要求25的方法,其中抗原位于抗原表達細胞、細胞膜或病毒粒子上。
            27. -種誘導針對細胞、細胞膜或病毒粒子的效應應答的方法,所述細胞、細胞膜或病 毒粒子表達包含免疫球蛋白Fc域和結合區的親本多肽所結合的靶標,所述方法包括 (i) 提供已根據權利要求1至24中任一項進行了突變的親本多肽或至少第一親本多肽 和第二親本多肽的組合;和 (ii) 將步驟(i)中的突變親本多肽或者步驟(i)中的至少第一親本多肽和第二親本多 肽的突變組合的制劑在存在人補體或效應細胞的情況下與表達抗原的細胞、細胞膜或病毒 粒子相接觸。
            28. 根據權利要求27的誘導針對表達親本抗體所結合的抗原的細胞、細胞膜或病毒粒 子的效應應答的方法,所述方法包括 (i) 提供已根據權利要求1至24中任一項進行了突變的親本抗體或至少第一親本抗體 和第二親本抗體的組合;和 (ii) 將步驟(i)中突變的親本抗體或者步驟(i)中的至少第一親本抗體和第二親本抗 體突變組合的制劑在存在人補體或效應子細胞的情況下,與表達抗原的細胞、細胞膜或病 毒粒子相接觸。
            29. 根據權利要求27或28的方法,其中效應應答是補體依賴性細胞毒性(CDC),Fc介 導的效應應答,其選自選自如下的Fc介導的效應應答:Clq-結合、補體激活、補體依賴性 細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、FcRn-結合、Fc-受體結合包括 Fe- γ受體結合、蛋白A-結合、蛋白G-結合、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、補體依賴性細胞 的細胞毒性(CDCC)、補體增強型細胞毒性、調理作用、包含Fc的多肽內化作用、靶標下調、 ADC攝取、細胞凋亡誘導、細胞死亡、細胞周期停滯及其任何組合。
            30. -種提高至少第一和第二親本多肽組合的特異性的方法,其中所述第一和第二親 本多肽包含免疫球蛋白的Fc域和結合區,所述方法包括 A) (i) 在第一親本多肽的對應于人IgGl重鏈Fc區中的K439位置的氨基酸殘基中引入突 變,以及 (ii) 在第二親本多肽的對應于人IgGl重鏈Fc區中的S440位置的氨基酸殘基中引入 突變,條件是S440的突變不是S440Y或S440W, B) (i) 在第一親本多肽的對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E位置的氨基酸殘基中引 入突變,以及 (ii) 在第二親本多肽的對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447K/R/H和448P位置的氨基 酸殘基中引入突變;或者 C) (i) 在第一親本多肽的對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E位置的氨基酸殘基中引 入突變,以及 (ii) 在第二親本多肽的對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447K/R/H、448K/R/H和449P位 置的氨基酸殘基中引入突變。
            31. 根據權利要求30的提高至少第一和第二親本抗體的組合的特異性的方法,其包括 (i) 在第一親本抗體的對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439位置的氨基酸殘基中引入突 變,以及 (ii) 在第二親本抗體的對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440位置的氨基酸殘基中引入 突變,條件是S440的突變不是S440Y或S440W。
            32. 根據權利要求31的方法,其中在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439的位置中的突 變是K439D/E,并且在對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440的位置中的突變是S440K/H/R。
            33. 根據權利要求1至32中任一項的方法,其中親本抗體或第一親本抗體和第二親本 抗體的組合是人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD或IgE,任選的人全長抗體,例如 人全長IgGl抗體。
            34. -種包含免疫球蛋白Fe域和結合區的親本多肽的變體,其中該變體在對應于人 IgGl 重鏈 Fe 區中的 E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、 Y436和K447的那些氨基酸殘基中的至少一個氨基酸殘基中包含突變,條件是S440的突變 是 S440Y 或 S440W。
            35. 根據權利要求34的包含抗原結合區和Fe域的親本抗體的變體,其中該變體在對應 于人IgGl重鏈Fc區中的E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、 E382、Y436和K447的那些氨基酸殘基中的至少一個氨基酸殘基中包含突變,條件是S440的 突變是S440Y或S440W。
            36. 根據權利要求35的變體,其中在至少一個氨基酸殘基中的突變選自對應于人IgGl 重鏈 Fe 區中的 E345X、E430X、S440W/Y、Q386K、P247G、I253V、S254L、Q311L/W、D/E356R、 E382V和Y436I的那些突變,其中X是任意氨基酸,如天然存在的氨基酸。
            37. 根據權利要求36的變體,其中在至少一個氨基酸殘基中的突變選自對應于人IgGl 重鏈Fe區中的E345X、E430X、S440W/Y、Q386K的那些突變,其中X是任意氨基酸,如天然存 在的氨基酸。
            38. 根據權利要求37的變體,其中在至少一個氨基酸殘基中的突變選自對應于人IgGl 重鏈Fe區中的 E345R/Q/N/K/A/C/D/F/G/H/1/L/M/P/S/T/V/W/Y、 E430T/S/G/A/C/D/F/H/1/L/K/M/N/P/Q/R/V/W/Y、 S440W/Y和Q386K的那些突變。
            39. 根據權利要求38的變體,其中在至少一個氨基酸殘基中的突變選自對應于人IgGl 重鏈 Fc 區中的 E345R/Q/N/K、E430T/S/G、S440Y/W 和 Q386K 的那些突變。
            40. -種包含免疫球蛋白Fc域和結合區的親本多肽的變體,其中該變體在選自下組的 至少兩個氨基酸殘基中包含突變: (a) CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3 β -鏈內的氨基酸殘基,條件是在對應于人IgGl重鏈Fc區中的S440突 變的情況下,所述突變是S440Y或S440W,以及 (e) 對應于人IgGl重鏈Fc區中的Ε345、Ε382或Q386的氨基酸殘基, 其中該至少兩個氨基酸突變是不同的。
            41. 根據權利要求40的包含抗原結合區和Fc域的親本抗體的變體,其中該變體在選自 下組的至少兩個氨基酸殘基中包含突變: (a) CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3 β -鏈內的氨基酸殘基,條件是在對應于人IgGl重鏈Fc區中的S440突 變的情況下,所述突變是S440Y或S440W,以及 (e) 對應于人IgGl重鏈Fc區中的Ε345、Ε382或Q386的氨基酸殘基, 其中該至少兩個氨基酸突變是不同的。
            42. 根據權利要求41的變體,其中該變體在選自對應于人IgGl重鏈Fc區中的E345、 E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436 和 K447 的那些氨基酸 殘基中的至少兩個氨基酸殘基中包含突變,條件是S440的突變是S440Y或S440W。
            43. 根據權利要求42的變體,其中該變體在選自對應于人IgGl重鏈Fc區中的E345X、 E430X、S440W/Y、Q386K、P247G、I253V、S254L、Q311L/W、D/E356R、E382V 和 Y436I 的那些氨 基酸殘基中的至少兩個氨基酸殘基中包含突變,其中X是任意氨基酸,如天然存在的氨基 酸。
            44. 根據權利要求43的變體,其中該變體在選自對應于人IgGl重鏈Fc區中的E345X、 E430X、S440W/Y和Q386K的組的至少兩個氨基酸殘基中包含突變,其中X是任意氨基酸,如 天然存在的氨基酸。
            45. 根據權利要求44的變體,其中變體在選自對應于人IgGl重鏈Fc區中的E345R/Q/ N/K/A/C/D/F/G/H/1/L/M/P/S/T/V/W/Y、E430T/S/G/A/C/D/F/H/1 /L/K/M/N/P/Q/R/V/W/Y、 S440W/Y和Q386K的那些氨基酸殘基的至少兩個氨基酸殘基中包含突變。
            46. 根據權利要求45的變體,其中在至少兩個氨基酸殘基中的突變選自對應于人IgGl 重鏈 Fc 區中的 E345R/Q/N/K、E430T/S/G、S440Y/W 和 Q386K 的那些突變。
            47. 根據權利要求34至46中任一項的變體,其中突變位于除S440和K447之外的位置 上,并且其中所述變體進一步在如下氨基酸殘基中包含突變: (i)在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439或S440的至少一個氨基酸殘基中,條件是 S440的突變不是S440W或S440Y ; (ii) 在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E或對應于K447K/R/H和448P的至少一 個氨基酸殘基中;或 (iii) 在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E或對應于K447K/R/H和448K/R/H和 449P的至少一個氨基酸殘基中。
            48. 根據權利要求47的變體,其中突變位于除S440之外的位置上,并且其中所述變體 進一步在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439或S440的至少一個氨基酸殘基中包含突變, 條件是S440的突變不是S440W或S440Y。
            49. 一種包含免疫球蛋白Fe域和結合區的親本多肽的變體,其中該變體在選自下組的 至少一個氨基酸殘基中包含突變: (a) CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3i3-鏈內的氨基酸殘基,條件是其不包含對應于人IgGl重鏈Fe區中的 S440的突變,以及 (e) 對應于人IgGl重鏈Fe區中的E345、E382或Q386的氨基酸殘基,且 其中變體在如下氨基酸殘基中包含另外的突變: (i) 在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439或S440的至少一個氨基酸殘基中,條件是 S440的突變不是S440W或S440Y ; (ii) 在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E或對應于K447K/R/H和448P的至少一 個氨基酸殘基中;或 (iii) 在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E或對應于K447K/R/H和448K/R/H和 449P的至少一個氨基酸殘基中。
            50. 根據權利要求49的包含抗原結合區和免疫球蛋白的Fe域的親本抗體的變體,其中 該變體在選自下組的至少一個氨基酸殘基中包含突變: (a) CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3 β -鏈內的氨基酸殘基,條件是其不包含對應于人IgGl重鏈的Fe區中的 S440的突變,以及 (e) 對應于人IgGl重鏈Fe區中的E345、E382或Q386的氨基酸殘基,且 其中所述變體在如下氨基酸殘基上包含另外的突變: (i) 在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439或S440的至少一個氨基酸殘基中,條件是 S440的突變不是S440W或S440Y ; (ii) 在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E或對應于K447K/R/H和448P的至少一 個氨基酸殘基中;或 (iii) 在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E或對應于K447K/R/H和448K/R/H和 449P的至少一個氨基酸殘基中。
            51. 根據權利要求49或50的變體,其中該變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439 和S440的兩個位置上都包含氨基酸突變,條件是S440的突變不是S440Y或S440W。
            52. 根據權利要求47至51中任一項的變體,其中在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439 的位置中的突變是K439D/E,和/或在對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440的位置中的突變 是 S440K/H/R。
            53. -種包含免疫球蛋白Fe域和結合區的親本多肽的變體,其中變體在如下氨基酸殘 基中包含突變: (i) 在選自對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439和S440的那些氨基酸殘基的至少一個 氨基酸殘基中,條件是S440的突變不是S440Y或S440W,如其中在對應于人IgGl重鏈Fe區 中的K439的位置中的突變是K439D/E,和/或在對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440的位置 中的突變是S440K/H/R; (ii) 在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E或對應于K447K/R/H和448P的至少一 個氨基酸殘基中;或 (iii) 在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E或對應于K447K/R/H和448K/R/H和 449P的至少一個氨基酸殘基中。
            54. 根據權利要求53的包含抗原結合區和免疫球蛋白Fe域的變體,其中該變體在選 自對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439和S440的那些氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基中 包含突變,條件是S440的突變不是S440Y或S440W,如其中在對應于人IgGl重鏈Fe區中的 K439的位置中的突變是K439D/E,和/或在對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440的位置中的 突變是 S440K/H/R。
            55. 根據權利要求34至54中任一項的變體,其中所述變體選自單特異性抗體、雙特異 性抗體或多特異性抗體。
            56. 根據權利要求55的變體,其為包含第一多肽和第二多肽的雙特異性抗體,所述第 一多肽包含免疫球蛋白的第一 CH2-CH3區和第一抗原結合區,第二多肽包含免疫球蛋白的 第二CH2-CH3區和第二抗原結合區,其中第一和第二抗原結合區結合相同抗原或不同抗原 上的不同表位,并且其中 第一和第二CH2-CH3區每個在選自對應于人IgGl重鏈Fe區中的E345、E430、S440、 Q386、P247、1253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436 和 K447 的那些氨基酸殘基的至少 一個氨基酸殘基中包括第一突變,條件是S440的突變是S440Y或S440W。
            57. 根據權利要求56的作為雙特異性抗體的變體,其中第一多肽在選自對應于人IgGl 重鏈Fe區中的K409、T366、L368、K370、D399、F405和Y407的那些氨基酸殘基的氨基酸殘 基中包含另外的突變;以及 第二多肽在選自對應于人IgGl重鏈Fe區的?405、了366、1^368、1(370、0399、¥407和1(409 的那些氨基酸殘基的氨基酸殘基中包含另外的突變,并且其中第一多肽中的所述另外的突 變與第二多肽中的所述另外的突變不同。
            58. 根據權利要求34至57中任一項的變體,其中所述變體與藥物、毒素或放射性標記 綴合,如其中所述變體通過連接子與毒素相綴合。
            59. 根據權利要求34至57中任一項的變體,其中所述變體是融合蛋白的一部分。
            60. 根據權利要求34至59中任一項的變體,其中該變體是人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAl、IgA2、IgD或IgE抗體,任選人全長抗體,如人全長IgGl抗體。
            61. -種包含親本多肽第一變體和親本多肽第二變體的組合物,其中第一變體包含免 疫球蛋白的第一 Fe域和結合區,其中第二變體包含免疫球蛋白的第二Fe域和結合區,并且 其中 (i) 所述第一變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439的位置中包含突變,其中所述 第二變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440的位置中包含突變,條件是S440的突變不 是 S440Y 或 S440W, (ii) 所述第一變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E的位置中包含突變;其中 所述第二變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447K/R/H和448P的位置中包含突變,或 (iii) 所述第一變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E的位置中包含突變;其 中所述第二變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447K/R/H、448K/R/H和449P的位置中包 含突變。
            62. 根據權利要求61的包含親本抗體的第一變體和親本抗體的第二變體的組合物,其 中第一變體包含免疫球蛋白的第一 Fe域和抗原結合區,其中第二變體包含免疫球蛋白的 第二Fe域和抗原結合區,并且其中 (i) 所述第一變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439的位置中包含突變,其中所述 第二變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440的位置中包含突變,條件是S440的突變不 是 S440Y 或 S440W, (ii) 所述第一變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E的位置中包含突變;其中 所述第二變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447K/R/H和448P的位置中包含突變,或 (iii) 所述第一變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447D/E的位置中包含突變;其 中所述第二變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K447K/R/H、448K/R/H和449P的位置中包 含突變。
            63. 根據權利要求62的包含親本抗體的第一變體和親本抗體的第二變體的組合物,其 中第一變體包含免疫球蛋白的第一 Fe域和抗原結合區,其中第二變體包含免疫球蛋白的 第二Fe域和抗原結合區,并且其中所述第一變體在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439的 位置中包含突變,其中第二變體在對應于S440的位置中包含突變,條件是S440的突變不是 S440Y 或 S440W。
            64. 根據權利要求63的組合物,其中第一變體包括免疫球蛋白的第一 Fe域和抗原結合 區,其中所述第一變體包含(i)在除K439中的突變之外的選自下組的至少一個氨基酸殘基 中的第一突變: (a) CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3 β -鏈內的氨基酸殘基,條件是在對應于人IgGl重鏈Fe區的S440的突 變的情況下,所述突變是S440Y或S440W,以及 (e) 對應于人IgGl重鏈Fe區中的E345、E382或Q386的氨基酸殘基,以及 (ii)在對應于人IgGl重鏈Fe區中的K439的位置中的第二突變;并且 其中第二變體包含免疫球蛋白的第二Fe域和抗原結合區,其中所述第二變體包括(i) 在除S440的突變之外選自下組的至少一個氨基酸殘基中的第一突變: (a)CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3 β -鏈內的氨基酸殘基,以及 (e) 對應于人IgGl重鏈Fc區中的Ε345、Ε382或Q386的氨基酸殘基,以及 (ii)在對應于IgGl重鏈Fc區中的S440的位置中的第二突變,條件是S440的突變不 是 S440Y 或 S440W。
            65. 根據權利要求63的組合物,其中第一變體包含⑴在除K439中的突變之外的選自 下組的至少一個氨基酸殘基中的第一突變: (a) CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3 β -鏈內的氨基酸殘基,條件是在對應于人IgGl重鏈Fc區中的S440的 突變的情況下,所述突變是S440Y或S440W,以及 (e) 對應于人IgGl重鏈Fc區中的Ε345、Ε382或Q386的氨基酸殘基,以及 (ii)在對應于人IgGl重鏈Fc區中的Κ439的位置中的第二突變,并且 其中第二變體在對應于人IgGl重鏈Fc區中的S440的位置中包含突變,其不是不是 S440Y 或 S440W。
            66. 根據權利要求63的組合物,其中第一變體在對應于人IgGl重鏈Fc區中的K439的 位置中包含突變;并且 其中第二變體包含免疫球蛋白第二Fc域和抗原結合區,其中所述第二變體包含(i)在 除S440的突變之外的選自下組的至少一個氨基酸殘基中的第一突變: (a) CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3 β -鏈內的氨基酸殘基,以及 (e) 對應于人IgGl重鏈Fc區中的Ε345、Ε382或Q386的氨基酸殘基,以及 (ii)在對應于IgGl重鏈Fc區中的S440的位置中的第二突變,條件是S440的突變不 是 S440Y 或 S440W。
            67. 根據權利要求61至66中任一項的組合物,其中在對應于人IgGl重鏈Fc區中的 K439的位置中的突變是K439D/E,和/或在對應于人IgGl重鏈Fc區中的S440的位置中的 突變是 S440K/H/R。
            68. -種包含免疫球蛋白Fc域和結合區的親本多肽的第一變體和包含免疫球蛋白Fc 域和結合區的親本多肽的第二變體的組合物,其中第一變體包含免疫球蛋白第一 Fc域和 第一抗原結合區,其中第一變體在選自下組的至少一個氨基酸殘基中包含第一突變: (a) CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3 β -鏈內的氨基酸殘基,條件是在對應于人IgGl重鏈Fc區中的S440的 突變的情況下,所述突變是S440Y或S440W,以及 (e)對應于人IgGl重鏈Fe區中的E345、E382或Q386的氨基酸殘基,且其中 第二變體在選自下組的氨基酸殘基中不包含突變: (a) CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3 β -鏈內的氨基酸殘基,條件是在對應于人IgGl重鏈Fe區的S440的突 變的情況下,所述突變是S440Y或S440W,以及 (e) 對應于人IgGl重鏈Fe區中的E345、E382或Q386的氨基酸殘基。
            69. 根據權利要求68的包括抗體的第一變體和親本抗體的第二變體的組合物,其中第 一變體包含免疫球蛋白的第一 Fe域和第一抗原結合區,其中第一變體在選自下組的至少 一個氨基酸殘基中包含第一突變: (a) CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3 β -鏈內的氨基酸殘基,條件是在對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440的 突變的情況下,所述突變是S440Y或S440W,以及 (e) 對應于人IgGl重鏈Fe區中的E345、E382或Q386的氨基酸殘基,以及 其中第二變體包含免疫球蛋白第二Fe域和第二抗原結合區,其中所述第二變體在選 自下組的氨基酸殘基中不包含突變: (a) CH2-CH3區內提供變構突變的氨基酸殘基, (b) CH2-CH3區的疏水鈕內的氨基酸殘基, (c) N末端CH3螺旋內的氨基酸殘基, (d) C末端CH3 β -鏈內的氨基酸殘基,條件是在對應于人IgGl重鏈Fe區中的S440的 突變的情況下,所述突變是S440Y或S440W,以及 (e) 對應于人IgGl重鏈Fe區中的E345、E382或Q386的氨基酸殘基。
            70. 根據權利要求61至67中任一項的組合物,其中第一和第二變體在選自對應于人 IgGl 重鏈 Fe 區中的 E345、E430、Q386、P247、1253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436 和K447的那些氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基中包含突變。
            71. 根據權利要求70的組合物,其中在第一和第二變體中的突變是不同的。
            72. 根據權利要求68或69的組合物,其中第一變體在選自對應于人IgGl重鏈Fe區中 的 E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436 和 K447 的那 些氨基酸殘基的至少一個氨基酸殘基中包含突變,條件是S440的突變是S440Y或S440W。
            73. 根據權利要求61至72中任一項的組合物,其中第一變體和第二變體各為人IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD或IgE抗體,任選各為人全長抗體,如各為人全長IgGl抗 體。
            74. 根據權利要求61至73中任一項的組合物,其中第一變體和第二變體選自單特異性 抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。
            75. 根據權利要求61至74中任一項的組合物,其中第一和第二變體結合相同抗原或不 同抗原上的不同表位。
            76. 根據權利要求61至75中任一項的組合物,其中第一變體和第二變體中的一個或兩 者都與藥物、毒素或放射性標記相綴合,如其中第一變體和第二變體中的一個或兩者通過 連接子與毒素相綴合。
            77. 根據權利要求61至75中任一項的組合物,其中第一變體和第二變體中的一個或兩 者是融合蛋白的一部分。
            78. -種組合物,包括根據權利要求34至60中任一項的變體或者根據權利要求61至 77中任一項的組合物以及藥學上可接受的載體。
            79. -種在治療中同時、單獨或順序使用的套組,包括如權利要求34至60中任一項所 定義的第一變體和第二變體。
            80. 根據權利要求34至79中任一項的變體、組合物或套組,其用于治療疾病,如癌癥。
            81. -種治療人的方法,其包括施用根據權利要求34至79中任一項的變體、組合物或 套組。
            82. -種在人中治療癌癥的方法,其包括施用根據權利要求34至79中任一項的變體、 組合物或套組。
            【文檔編號】A61P35/00GK104220093SQ201280043485
            【公開日】2014年12月17日 申請日期:2012年7月6日 優先權日:2011年7月6日
            【發明者】P·帕倫, F·比爾斯肯斯, R·N·德瓊, A·F·拉布里恩, J·舒爾曼 申請人:根馬布私人有限公司
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