口腔用組合物的制作方法
【專利摘要】本發明提供具有生物膜形成抑制作用的口腔用組合物。包含植物提取物的口腔用組合物，所述植物提取物為小松菜、日本蕪菁、壬生菜、辣味蘿卜、水芹、莢果蕨、遼東楤木或冰葉日中花的熱水提取物。
【專利說明】口腔用組合物
【技術領域】
[0001]本發明涉及具有基于植物提取物的內氏放線菌(Actinomyces naeslundii)生物膜的形成抑制作用的口腔用組合物。
【背景技術】
[0002]附著于物體表面的微生物并不是單獨存在，在具有特征的結構中與其它微生物一起形成生物膜。欲通過研究探討該生物膜是否如可用于固定化微生物所示的那樣對人類有益，結果卻發現反而是引發齲齒和食品污染的原因，近年來進行了大量研究。
[0003]口腔生物膜由700種以上的細菌構成，Img中存在IO8個以上的菌。其中，內氏放線菌作為從初期菌斑(齲齒菌斑)發展為后期菌斑(牙周病菌斑)方面的關鍵性微生物在近年來受到矚目。
[0004]以往的牙周病預防中,通過殺滅牙銀卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)等牙周病病原菌來抑制牙周病是主流的想法，但實際的牙周病病灶與生物膜一起存在于牙周袋的深處，阻礙了抗菌物質的滲透，所以大多無法獲得預期的效果，而且經常伴隨出現耐藥菌的危險。因此，希望有更安全且有效的預防方法。
[0005]此外，生物膜的抑制方法中，刷牙和洗牙等機械除去被認為是最有效的，但對于需要看護的高齡老人等難以進行這樣的機械方式的口腔生物膜控制的人們，通過目前的方法，很難實施適當的口腔護理，需要開發基于與以往不同的切入口的生物膜去除方法。
[0006]已知丁酸等短鏈脂肪酸(SCFA)在牙周袋和牙周病患者的牙菌斑中以高濃度存在，顯示參與到牙周病的發病和發展。近年來，確認牙齦卟啉單胞菌等牙周病病原菌產生的SCFA等酸具有內氏放線菌的生物膜形成促進效果，進行著以該現象為目標的機理的闡明和病原性的表現控制研究(日本大學齒學部，國立傳染病研究所)。
[0007]本發明中，著眼于內氏放線菌的生物膜形成中酸的影響，探詢通過抑制丁酸等酸依賴性的生物膜形成來實現牙周病生物膜形成抑制的物質，嘗試了作為新的牙周病生物膜抑制原材料的開發。
[0008]作為涉及顯示口腔生物膜的抗菌效果和牙齦炎改善效果的口腔用組合物的發明，可例舉專利文獻I。專利文獻I揭示了以包含(A)N-酰基肌氨酸或其鹽和(B)異硫氰酸芐酯且(A)/(B)的質量比為0.5~20為特征的口腔用組合物，揭示了該口腔用組合物對作為口腔疾病原因的口腔生物膜的抗菌效果和牙齦炎改善效果良好。然而，未揭示或提示對于牙周病的效果。
[0009]現有技術文獻
[0010]專利文獻
[0011]專利文獻1:日本專利特開2008 - 174542號公報
[0012]發明的概要
[0013]發明所要解決的技術問題
[0014]一直以來，使用某種抗菌劑的牙周病抑制法中，口腔生物膜阻礙抗菌劑的滲透，難以發揮所設想的牙周病抑制效果。此外，出現抗藥菌的危險性高，抗菌劑的使用不理想。因此，與控制牙周病的病原菌相比，進行初期牙周病病原菌的生物膜控制被認為是更安全且有效的牙周病預防法。
[0015]解決技術問題所采用的技術方案
[0016]進行了認真研究后發現，作為十字花科植物的日本蕪菁(Brassica rapa var.nipposinica)、小松菜(Brassica rapa var.perviridis)、辣味蘿卜、水芳:和作為五加科植物的遼東惚木、番杏科的冰葉日中花的提取物分別具有由酸誘導的內氏放線菌的生物膜形成抑制效果，從而完成了本發明。
[0017]內氏放線菌的生物膜形成因酸刺激而增加，但發現如果在培養體系中添加1000ppm上述植物，則生物膜形成降低至約30%左右。這時，各植物提取物對內氏放線菌的生長繁殖不產生影響，因此該生物膜形成抑制效果被認為機理與抗菌作用不同。
[0018]內氏放線菌是從牙齦炎和根面齲部位被發現的革蘭氏陽性桿菌，被認為是初期牙周病的病原細菌。由于與鏈球菌和牙周病病原菌共凝集，因此認為是向牙周病菌斑的菌群遷移的關鍵細菌，被認為可實現有效控制內氏放線菌的牙周病預防。
[0019]本發明人確認生物膜形成因口腔細菌產生的酸而增加。
[0020]發明的效果
[0021]本發明是基于新著眼點的牙周病預防劑，與已有的抗菌劑等相比，可具有耐藥菌出現危險低等優點。
[0022]附圖的簡單說明
[0023]圖1是表示基于酸添加的內氏放線菌的生物膜形成的圖表。
[0024]圖2是表示辣味蘿卜的基于不同提取溶劑的生物膜形成抑制活性的差異的圖表。
[0025]實施發明的方式
[0026]本發明是通過抑制初期牙周病病原菌內氏放線菌形成的牙周病生物膜來預防牙周病的發明，在日本蕪菁、小松菜、辣味蘿卜等部分十字花科植物和遼東惚木、冰葉日中花的提取物中發現了該牙周病生物膜抑制劑。
[0027]與以往的牙周病病原菌的抗菌劑不同，抑制作為牙周病病原菌的聚集場所的生物膜的形成，認為有效且安全。
[0028]作為新的口腔用組合物，還可應用于口香糖和糖果。
[0029]即，本發明涉及包含植物提取物的口腔用組合物，該植物提取物為小松菜、日本蕪菁、壬生菜(Brassica campestris var laciniifolia)、辣味蘿卜、水芳:(夕^義)、莢果蕨(Matteuccia struthiopteris)、遼東惚木或冰葉日中花的熱水提取物。
[0030]另外，本發明還涉及包含植物提取物的酸誘導生物膜形成抑制劑，該植物提取物為小松菜、日本蕪菁、壬生菜、辣味蘿卜、水芹、莢果蕨、遼東惚木或冰葉日中花的熱水提取物。
[0031]此外，本發明還涉及由包含植物提取物的口腔用組合物形成的漱口劑、牙膏劑、吸入劑、含片劑和包括口香糖、糖果、壓片糖等的食品，所述植物提取物為小松菜、日本蕪菁、壬生菜、辣味蘿卜、水芹、莢果蕨、遼東惚木或冰葉日中花的熱水提取物。
實施例[0032][實施例1]
[0033](提取物制備)
[0034]各植物樣品在購入后冷凍干燥，再用粉碎機將Ig粉碎，用50ml水在70°C提取2小時。所得的提取液以3000rpm、10分鐘進行離心分離，過濾上清后冷凍干燥，將所得的樣品作為各植物熱水提取物供于試驗。
[0035][實施例2]
[0036](生物膜形成抑制活性評價)
[0037]1.生物膜形成
[0038]將內氏放線菌ATCC19039株在5ml的腦心浸液(Brain Heart Infusion, BHI)液體培養基中于37°C進行10小時的厭氧培養，以3000rpm、10分鐘進行離心分離，將所收集的細菌用PBS配制為OD55tol=0.5，將其作為供試菌懸浮液。
[0039]用96孔板進行生物膜形成試驗。向各孔中添加60μ I生物膜形成抑制樣品、20μ I丁酸、20 μ I內氏放線菌供試菌懸浮液、100 μ I加有0.5%蔗糖的胰蛋白胨大豆肉湯培養基，在37°C、5% C02的條件下進行16小時的培養。
[0040]2.生物膜定量
[0041]去除上述的培養后的上清，用PBS進行2次各孔的清洗。清洗后，向各孔中添加
0.25%番紅溶液，靜置15分鐘后去除剩余番紅溶液，用PBS進行2次各孔的清洗。清洗后，向各孔中添加乙醇，振蕩30分鐘而使染色了的番紅溶出，用微孔板閱讀儀測定492nm的吸光度，對生物膜形成量進行定量。
[0042]生物膜形成量以將未添加樣品的情況下的形成量設為100時的比例表示。
[0043](結果)
[0044]1.天然提取物的生物膜形成抑制效果
[0045]在丁酸添加體系中，研究各種天然物的提取物是否可見生物膜形成抑制活性。制備各種植物的熱水提取物，對生物膜形成抑制活性進行了測定，結果確認如果向試驗體系中添加小松菜、日本蕪菁、壬生菜、辣味蘿卜、水芳\莢果蕨、遼東惚木、冰葉日中花的熱水提取物，則在未添加丁酸的體系中生物膜形成量未見大的變化，但添加了丁酸的體系中生物膜形成量下降50~90%。該效果在十字花科植物的熱水提取物中特別顯著(表1)。
[0046]接著，考察了在添加丁酸以外的酸的情況下內氏放線菌的生物膜形成是否增加以及日本蕪菁提取物是否抑制酸誘導生物膜形成。其結果是，確認即使是丁酸以外的酸(乙酸、乳酸、鹽酸)，內氏放線菌的生物膜形成也增加，日本蕪菁提取物也抑制這些生物膜。
[0047]將確認具有活性的辣味蘿卜用不同的提取溶劑(熱水、50%乙醇、100%乙醇)進行提取，確認了各提取物的生物膜形成抑制活性，結果確認提取物均具有依賴于濃度的生物膜形成抑制活性(圖2)。由此提示，辣味蘿卜中同時含有水溶性的活性物質和脂溶性的活性物質的可能性高。
[0048]為了開發以與以往的原材料不同的機理發揮作用的牙周病預防原材料，著眼于內氏放線菌的生物膜形成因丁酸而增加的現象，進行了丁酸誘導生物膜形成抑制物質的開發。
[0049]考慮到在食品中的使用，以平時經常食用的植物為中心進行了探索，結果在數種植物提取物中發現較強的活性。這 些提取物在未添加丁酸的體系中沒有使生物膜形成量有大的變化，但在添加了丁酸的體系中使生物膜形成量大幅下降，因此認為可能僅在與丁酸相關的體系中產生影響。此次的試驗中，確認十字花科植物具有活性，但同樣是十字花科植物，也存在不具有生物膜形成抑制活性的植物，不是所有十字花科植物共通的效果。
[0050]此外，稱為冰葉日中花的番杏科植物的提取物中也發現顯著的生物膜形成抑制活性。冰葉日中花(學名:Mesembryanthemum crystalIinum)是原產于歐洲、西亞、非洲的耐鹽性高的鹽生植物之一，是在與海水同等程度的氯化鈉水溶液中也可水耕栽培的植物。近年來，在百貨商店和超市的蔬菜柜臺有售，是受到矚目的植物，但如果能夠發掘牙周病生物膜預防效果等附加值，今后應該會更加受關注。
[0051]使用抗菌劑、殺菌劑等的微生物控制和傳染病的克服是與耐藥菌出現之間的戰爭，處于新抗生素開發與其耐藥菌的出現僵持不下的狀態。但是，此次獲得的植物的熱水提取物的生物膜形成抑制活性僅在添加酸時得到確認，因此從出現耐藥菌的角度來看，可以說安全性高。
[0052]希望能夠以此次獲得的結果為基礎，進行作用機理的闡明和活性成分的鑒定、人體藥效試驗，進而實現新的牙周病生物膜形成抑制原材料的開發和對于口腔護理產品的應用。
[0053]對通過添加丁酸誘導的內氏放線菌的生物膜形成抑制物質進行了探索，結果發現小松菜、日本蕪菁等5種十字花科植物和冰葉日中花的熱水提取物具有使生物膜量下降50~90%的活性。此外，還提示了十字花科植物的活性成分同時包含水溶性物質和脂溶性物質的可能性。
[0054]【表1-1】
[0055]表1.天然物熱水提取物的生物膜形成抑制效果
[0056]`
【權利要求】
1.口腔用組合物，其特征在于，包含植物提取物。
2.如權利要求1所述的口腔用組合物，其特征在于，所述植物提取物為小松菜、日本蕪菁、壬生菜、辣味蘿卜、水芹、莢果蕨、遼東惚木或冰葉日中花的熱水提取物。
3.酸誘導生物膜形成抑制劑，其特征在于，包含植物提取物。
4.如權利要求3所述的酸誘導生物膜形成抑制劑，其特征在于，所述植物提取物為小松菜、日本蕪菁、壬生菜、辣味蘿卜、水芹、莢果蕨、遼東惚木或冰葉日中花的熱水提取物。
5.漱口劑，其特征在于，含有權利要求1或2所述的口腔用組合物。
6.牙膏劑，其特征在于，含有權利要求1或2所述的口腔用組合物。
7.吸入劑，其特征在于，含有權利要求1或2所述的口腔用組合物。
8.含片劑，其特征在于，含有權利要求1或2所述的口腔用組合物。
9.食品，其特征在于，包含權利`要求1或2所述的口腔用組合物。
【文檔編號】A61K36/18GK103781466SQ201280043403
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年9月6日 優先權日:2011年9月8日
【發明者】津金貴則, 毛利彰太, 佐伯洋二 申請人:羅蒂株式會社