在治療神經變性性疾病中使用的藥物組合物的制作方法

在治療神經變性性疾病中使用的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及在治療神經變性性疾病中使用的藥物組合物。
【專利說明】在治療神經變性性疾病中使用的藥物組合物
[0001]描述
[0002]本發明的主題是在預防或/和治療神經變性性疾病中使用的藥物組合物，該組合物包含desPro36Exendin-4 (1-39) -Lys6-NH2或/和其藥學可接受鹽,和任選地藥學可接受載體、佐劑、或/和輔助物質。
[0003]阿耳茨海默氏病
[0004]阿耳茨海默氏病(AD)是一種神經變性性病癥，其導致皮層神經元損失，尤其是在聯想新皮質和海馬中，這繼而導致認知功能的緩慢且進行性喪失，最終導致癡呆和死亡。疾病的主要標志是錯折疊的蛋白質的聚集和沉積(Bertram等，2010;Mancuso等，2010): (I)作為胞外老年或神經炎性“斑”的聚集的β_淀粉狀蛋白(Αβ)肽，和(2)作為胞內神經原纖維“纏結”(NFT)的超磷酸化τ蛋白。
[0005]在遺傳上，AD分成兩種形式:(I)早期發作家族性AD (小于60歲)，和(2)晚期發作散發性AD (大于60歲)。已知淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)、早老蛋白I (PSENl)、和早老蛋白2(PSEN2)基因中罕見的、引起疾病的突變導致早期發作家族性AD，而APOE(等位基因4)是晚期發作AD的單一的最重要的風險因素(Bertram等，2010)。
[0006]由蛋白質氧化和脂質過氧化表明的線粒體功能障礙和氧化應激是AD腦的特征。反應性氧類別(ROS)的生成與抗氧化劑對化學反應性類別的分解之間的不平衡導致氧化應激。Αβ具有直接的氧化效果，但是它也可以破壞線粒體氧化還原活性，導致自由基的增加。神經元不太能夠防御ROS的增加，因為它們相對于其它哺乳動物細胞類型具有較低的抗氧化劑水平，并且如此認為對氧化應激是高度易感的。對原代神經元培養物添加Αβ導致對ATP酶的抑制、細胞電位變化、和Ca2+流入(Varadarajan等，2000;Higginsa等，2010)。
`[0007]目前沒有針對此破壞性疾病的治愈，并且得到美國食品和藥品管理局(FDA)批準的少數治療沒有停止AD的進展，而是僅部分有效改善癥狀(Wollen，2010; Aderinwale等，2010)。目前，得到許可的針對AD的藥用療法是乙酰膽堿酯酶抑制劑諸如他克林(Tacrine)、多奈哌齊(Donepizil)、利凡斯的明(Rivastigmine)、加蘭他敏(Galantamine)和NMDA受體拮抗劑美金剛(memantine)。這些藥物的效果是非常有限的，且主要作用同樣是減少/減輕癥狀而不是預防疾病形成。可以在“標簽外(off label)”給予其它藥物，諸如他汀類(statins)(膽固醇水平降低劑)、抗高血壓藥、抗炎藥,等等。這些藥物無一已經證明為降低AD的進展(Kaduszkiewicz等,2005; Holscher, 2005)。用于治療AD的其它策略在調查下。已經發現了神經元生長因子a (NGF)可以減少老年斑，并且改善認知功能(De Rosa等，2005)。由于現在已知胰島素抗性為AD中的主要問題之一(Η?丨Scher和Li, 2010)，代替胰島素自身，其它生長因子諸如腸降血糖素激素胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)在臨床前研究中顯示良好的效果。GLP-1腸降血糖素類似物利拉魯肽(Iiraglutide)在轉基因小鼠AD模型的腦中減少淀粉狀蛋白斑的數目，降低β -淀粉狀蛋白水平，預防認知損傷和突觸功能障礙，降低炎癥應答，并且增強突觸生長和神經發生(McClean等，2011)。腦中的淀粉狀蛋白斑及關聯的炎癥應答是AD的關鍵標志。在轉基因小鼠AD模型中用另一種GLP-1類似物受體激動劑發現類似的保護效果(Li等，2010)。[0008]帕金森氏病
[0009]帕金森氏病(PD)是一種慢性神經變性性肌肉運動病癥，其通常以黑質紋狀體神經元的選擇性變性、大大降低的多巴胺合成能力和隨后不能銜接紋狀體多巴胺受體為特征(Gandhi等，2005)。在疾病在臨床上呈現前，黑質紋狀體神經元的死亡在黑質密部(SNc)中默默發生，這可能是由于并發的凋亡事件、興奮性毒性事件、自由基介導的神經炎性事件的發生。提供治愈ro病理學的治療性策略或阻滯ro病理學的手段仍然是難以捉摸的。建立的藥物療法基本上是姑息的且并不在所有患者中有效。由于凋亡性細胞死亡是選擇性黑質紋狀體神經元死亡中的中心組分之一(Schapira，2001)，未來的治療性策略可以牽涉靶向使用具有抗凋亡特性的生物分子。或者，可以通過具有神經營養性特性或刺激具有多巴胺能表型的細胞神經發生的能力的分子產生積極的治療效果。最近已經觀察到胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1)激動劑毒蜥外泌肽-4(exendin-4)在受到興奮性毒性應激的PC12細胞培養物中顯示神經營養性(Perry等，2002)和神經保護性(Perry等，2002)特性。最近，顯示了(Harkavyi等，2008) —旦在兩種H)小鼠模型中建立，毒蜥外泌肽_4阻滯黑質損傷的進展，或甚至反轉黑質損傷。另外，已經在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)小鼠H)模型中顯示了毒蜥外泌肽-4處理保護多巴胺能神經元免于變性，保持多巴胺水平，并且改善運動功能(Li等，2009)。
[0010]亨廷頓氏病
[0011]亨廷頓氏病(HD)是一種遺傳性神經變性性病癥，其以不隨意身體運動，及精神病學和認知異常為典型。HD根本的遺傳缺陷牽涉HD基因外顯子I中CAG三核苷酸重復的擴充，這導致亨廷頓(htt)蛋白中多谷氨酰胺擴充。這導致異常的加工和有害的胞內聚集。最近，已經顯示了毒蜥外泌肽-4處理阻抑胰和腦中的突變體htt內含物的形成，改善代謝效果和運動功能障礙，并且延長HD小鼠的存活(Martin等，2009)。
[0012]中風
[0013]中風的病理生理學包括皮層和紋狀體神經元經由凋亡的死亡(Mattson，2007)。
[0014]最近，已經顯示了毒蜥外`泌肽-4的施用在短暫大腦中動脈阻塞中風小鼠模型中降低腦損傷并且改善功能性結果(Li等，2009)。在沙鼠的大腦缺血模型中，進一步顯示了用毒蜥外泌肽-4刺激GLP-1受體通過干擾小神經膠質活化免于短暫的大腦缺血性損傷來減弱缺血相關神經元死亡(Lee等，2011)。Teramoto等(2011)顯示了毒蜥外泌肽_4在大腦缺血-再灌注損傷小鼠模型中是有效的。毒蜥外泌肽-4處理顯著降低梗死體積，并且改善功能缺陷。
[0015]周圍感覺神經病
[0016]約60-70%的患有糖尿病的個體具有一定程度的神經病學損傷，具體是引起手和/或腳的感覺受損，減緩的胃能動性或腕管綜合征的神經病。目前沒有證明反轉由延長的高血糖及關聯的代謝擾亂引起的神經病學損傷的療法。已經在結狀神經節的神經元中鑒定出GLP-1表達，這提示了 GLP-1在周圍神經傳遞中的作用(Nakagawa，2004)。在非糖尿病嚙齒類中的吡哆醇誘發的周圍神經病的嚙齒類模型中，顯示了 GLP-1和s.c.毒蜥外泌肽-4部分提供保護免于幾種吡哆醇誘發的功能和形態缺陷，并且促進軸突大小的正常化(Perry等，2007)。
[0017]認知功能、情緒和記憶:[0018]GLP-1受體激動劑能夠在嚙齒類中增強認知功能，如在Morris水迷宮中測量的；GLP-1受體敲除小鼠具有以學習缺陷為特征的表型，所述學習缺陷在海馬GLP-1受體基因轉基因后恢復(During等，2003)。最近，Isacson等(2010)在成年嚙齒類中顯示了長期毒蜥外泌肽-4處理對海馬關聯認知和情緒相關行為的影響。在另一項研究中，通過毒蜥外泌肽-4反轉糖尿病小鼠模型的背根神經節中找到的多神經病(Himeno等，2011)。已經顯示了另一種GLP-1類似物利拉魯肽在高脂肪飲食誘發性肥胖和胰島素抗性的小鼠中對認知功能和海馬突觸可塑性施加有益影響(Porter等，2010)。
[0019]胰高血糖素樣肽I
[0020]胰高血糖素樣肽1、GLP-1或GLP-1 (7-36)是一種在胰高血糖素原基因中編碼的30個氨基酸的肽激素。它主要在腸的腸內分泌L細胞中生成，并且在含有脂肪、蛋白質水解物、和/或葡萄糖的食物進入十二指腸時分泌入血流中。最廣泛研究的由GLP-1活化的細胞是胰腺中的胰島素分泌β細胞，在那里其限定作用是提升葡萄糖誘導的胰島素分泌。在β細胞中的GLP-1受體(GLP-1R)活化后，腺苷酰環化酶(AC)被活化，并且生成cAMP，這繼而導致第二信使途徑諸如蛋白質激酶A(PKA)和Epac途徑的cAMP依賴性活化。與增強葡萄糖誘導的胰島素分泌的短期效果一樣，連續的GLP-1R活化也提高胰島素合成、β細胞增殖和新生(Doyle等，2007)。此外，GLP-1 一般調節胰高血糖素的濃度，減緩胃排空，刺激胰島素(原)生物合成，提高對胰島素的敏感性，并且刺激不依賴于胰島素的糖原生物合成(Holst (1999) Curr.Med.Chem6:1005; Nauck 等(1997) Exp Clin EndocrinolDiabetesl05:187;Lopez-Delgado 等(1998)EndocrinologyI39:281I)。
[0021]GLP-1對胰島素和胰高血糖素分泌的特殊影響在過去20年里已經產生研究活動，其以現在用于治療2型糖尿病(T2DM)的天然存在的GLP-1受體(GLP-1R)激動劑毒蜥外泌肽-4為頂峰(Doyle等， 2007)。
[0022]在與胰腺不同的組織(腦、腎、肺、心、和主要血管)中，GLP-1可以活化特定的鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白)偶聯受體。
[0023]GLP-1已經顯示了生長因子樣及神經保護特性(McClean等，2010)。GLP-1還降低海馬神經元的凋亡誘導，并且改善空間和聯想學習(During等，2003)。Perry等(2002)報告了 GLP-1可以完全保護培養的大鼠海馬神經元免于谷氨酸誘導的凋亡。GLP-1類似物(Val8)GLP-1和N-乙酰基-GLP-1已經對海馬中突觸傳遞的長時程增強效應(LTP)顯示主要影響(McClean等，2010)。GLP-1類似物利拉魯肽在轉基因小鼠AD模型的海馬中減少淀粉狀蛋白斑的數目，降低β -淀粉狀蛋白水平，阻止認知損傷和LTP抑制，降低炎癥應答，并且增強突觸生長和神經發生(McClean等，2011)。
[0024]已經顯示了 GLP-1、利拉魯肽和毒蜥外泌肽-4穿過血腦屏障(BBB) (Kastin等，2001;McClean等，2011)。Perry等(2003)發現了 GLP-1和毒蜥外泌肽-4降低腦中β淀粉狀蛋白和神經元中淀粉狀蛋白前體蛋白的水平。用毒蜥外泌肽-4或利拉魯肽的長期處理影響成年小鼠海馬齒狀回中的細胞增殖和成神經細胞分化(Li等，2010;Hamilton等，2011)。
[0025]利拉魯肽是一種GLP-1類似物，具有式Arg34，Lys26(NE U-谷氨酰基(Na-十六酰基)))GLP-1 (7-37)。通常胃腸外施用利拉魯肽。
[0026]化合物desPro36Exendin_4(1-39)-Lys6-NH2(AVEC)OlO,利西拉來(Iixisenatide))是毒蜥外泌肽-4的類似物。利西拉來在WO 01/04156中以SEQ ID N0:93披露:
[0027]SEQ ID NO:1:利西拉來(44AS)
[0028]H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-1-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
[0029]SEQ ID NO:2:毒蜥外泌肽 _4(39AS)
[0030]H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-1-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-P-S-NH2
[0031]SEQ ID NO:3:GLP-1(7-36)(30AS)
[0032]H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A-K-E-F-1-A-W-L-V-K-G-R
[0033]毒蜥外泌肽是一組可以降低血液葡萄糖濃度的肽。毒蜥外泌肽與GLP-1 (7-36)具有僅約50%的氨基酸序列同一性。因此，一般不認為毒蜥外泌肽是GLP-1類似物。
[0034]利西拉來以天然毒蜥外泌肽-4序列的C端截短為特征。利西拉來包含毒蜥外泌肽-4中不存在的6個C端賴氨酸殘基。直到現在，尚不認為利西拉來是適合于治療CNS病癥(特別是神經變性性疾病)的藥物，因為C端賴氨酸殘基可以阻止藥物通過血腦屏障。目前，沒有指示可以通過特定或/和受到調節的機制將利西拉來轉運通過血腦屏障。
[0035]在本發明的實施例1中，已經證明了利西拉來與GLP-1類似物利拉魯肽和毒蜥外泌肽-4 (這兩者目前用作2型糖尿病的治療)相比具有優越的特性:
[0036](a)令人驚訝地，`利西拉來可以穿過血腦屏障。本發明的數據指示轉運受到調節，因為高濃度的轉運速率限于最大水平。此外，與利拉魯肽相比，利西拉來在更低的胃腸外劑量時被攝取入腦中。
[0037](b)利西拉來活化腦中的GLP-1受體，并且誘導cAMP生成。令人驚訝地，利西拉來比利拉魯肽產生更高的cAMP水平，這證明了在相同劑量時在活化GLP-1受體方面的更高效率。
[0038](c)利西拉來可以誘導齒狀回中祖細胞的增殖。與毒蜥外泌肽-4或利拉魯肽相t匕，利西拉來在以相同劑量施用時提供增強的效果。在神經變性性疾病中，這些效果可以構成疾病緩解效果。
[0039](d)在與利拉魯肽相比時，利西拉來在齒狀回中顯示優越的神經保護效果(針對細胞應激)。
[0040](e)令人驚訝地，用IOnM劑量利西拉來的預處理足以保護SH-SY5Y成神經細胞瘤細胞免于1200 μ M甲基乙二醛應激。200ηΜ劑量利拉魯肽在保護細胞免于1200 μ M甲基乙二醛應激中是必需的，這指示較低劑量的利西拉來足以誘導保護(還可見通過用GLP-1激動劑的預處理獲得的實施例2數據)。
[0041]實施例2證明了用利西拉來的后處理足以保護SH-SY5Y成神經細胞瘤細胞免于2mM甲基乙二醛應激或ImM H2O2應激。比較而言，利拉魯肽沒有保護細胞免于MG或H2O2的應激。
[0042]在實施例3中，利西拉來在經魚藤酮(rotenone)處理的LUHMES細胞中針對神經變性展現出顯著的神經保護效果。與其它GLP-1受體(GLP-1R)激動劑相比，利西拉來提供優點。在經魚藤酮處理的LUHMES細胞中，利西拉來在比利拉魯肽低3倍的濃度時顯著有活性，該結果支持實施例1的甲基乙二醛模型中看到的出乎意料的卓越活性效果。艾塞那肽(Exenatide)在0.3和I μ M的濃度不引發顯著效果。比較而言，利西拉來在這些濃度提供劑量依賴性存活力改善。
[0043]在實施例4中，證明了體內利西拉來處理導致轉基因小鼠阿耳茨海默氏病模型的腦中淀粉狀蛋白斑負荷的降低。因此，在其神經保護特性外，利西拉來還可以降低腦病理學損傷，諸如淀粉狀蛋白斑，并且因此代表一種針對阿耳茨海默氏病的有吸引力的預防或/和治療。在比由McLean等(2011)先前對利拉魯肽描述的劑量(25nmolm/kg)更低的劑量(IOnmoI/kg)觀察到活性。
[0044]因此，利西拉來適合于治療或/和預防如本文中描述的神經變性性疾病，例如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病或/和中風。
[0045]本發明的第一個方面是在預防或/和治療神經變性性疾病中使用的藥物組合物，該組合物包含desPro36Exendin-4 (1-39) -Lys6-NH2或/和其藥學可接受鹽,和任選地藥學可接受載體、佐劑、或/和輔助物質。
[0046]本發明的另一個方面是在治療神經變性性疾病中使用的藥物組合物，該組合物包含desPro36Exendin-4 (1-39)-Lys6-NH2或/和其藥學可接受鹽,和任選地藥學可接受載體、佐劑、或/和輔助物質。
[0047]神經變性性疾病可以是任何神經變性性疾病，特別是與氧化應激、神經突完整性損失、凋亡、神經元損失或/和炎癥應答有關的神經變性性疾病。
[0048]在本發明中，神經突完整性損失包括樹突棘損失、突觸可塑性損失、或/和新代償性神經突發芽損失(loss of new compensatory neurite sprouting)。
[0049]神經變性性疾病可以與認知損傷有關。
[0050]特別地，神經變性性疾病選自下組:阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、進行性核上性麻痹(PSP)、多系統萎縮(MSA)、路易`體癡呆、帕金森氏病癡呆、癲癇、中風、亨廷頓氏舞蹈癥、大腦缺氧、多發性硬化、和周圍神經病。周圍神經病可以與糖尿病有關。
[0051]優選的是，神經變性性疾病選自下組:阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、和中風。
[0052]也優選的是，神經變性性疾病選自下組:進行性核上性麻痹、多系統萎縮、路易體癡呆、帕金森氏病、和帕金森氏病癡呆。這些疾病中任何一種可以與帕金森綜合征(Parkinsonism)有關。
[0053]進行性核上性麻痹和多系統萎縮統稱為帕金森疊加綜合征(Parkinson-plussyndrome)。
[0054]在本發明中，帕金森綜合征是一種以特定癥狀組合諸如震顫、運動減少、強直或/和姿勢不穩定性為特征的神經病學綜合征。
[0055]在一個實施方案中，神經變性性疾病是阿耳茨海默氏病。阿耳茨海默氏病可以與氧化應激和神經元損失有關。
[0056]在另一個實施方案中，神經變性性疾病是帕金森氏病。帕金森氏病可以與氧化應激、炎性應答、凋亡、神經元損失(特別是多巴胺能神經元損失，例如導致多巴胺缺乏的黑質中神經元損失)有關。
[0057]神經元損失可以由凋亡引起。
[0058]在另一個實施方案中，神經變性性疾病是進行性核上性麻痹。進行性核上性麻痹可以與神經元損失(特別是多巴胺能神經元損失)有關。[0059]在另一個實施方案中，神經變性性疾病是多系統萎縮。多系統萎縮可以與神經元損失(特別是多巴胺能神經元損失)有關。
[0060]在另一個實施方案中，神經變性性疾病是路易體癡呆。路易體癡呆可以與神經元損失(特別是多巴胺能神經元損失)有關。路易體癡呆可以與帕金森氏病有關。
[0061]在另一個實施方案中，神經變性性疾病是帕金森氏病癡呆。帕金森氏病癡呆可以與神經元損失(特別是多巴胺能神經元損失)有關。特別地，帕金森氏病癡呆與帕金森氏病有關。
[0062]在又一個實施方案中，神經變性性疾病是中風。中風可以與由缺血引起的神經元損失有關，其中缺血可以由阻塞(諸如血栓形成或動脈栓塞)或出血引起。
[0063]在又一個實施方案中，神經變性性疾病是多發性硬化，其可以與CNS中的炎性過程有關。
[0064]本發明的數據證明了(a)利西拉來提供神經保護或/和神經生成效果，和(b)與其它GLP-1激動劑諸如毒蜥外泌肽-4或利拉魯肽相比，利西拉來是卓越的。如此，利西拉來可以在神經變性性疾病(諸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、和中風)中提供疾病緩解效果。特別地，利西拉來的施用適合于神經變性性疾病的早期階段中的治療，因為神經保護和神經生成可以減緩疾病的進展，且由此改善生命質量。
[0065]因此，在本發明的一個方面，神經變性性疾病在早期階段中。例如，阿耳茨海默氏病可以是早期階段阿耳茨海默氏病。早期階段阿耳茨海默氏病(AD)又稱作前驅阿耳茨海默氏病或癡呆前阿耳茨海默氏病(Dubois等，2010)。早期階段阿耳茨海默氏病可以定義為:患者表現出與支持性 生物標志數據或阿耳茨海默氏病病理學有關的客觀記憶抱怨:在腦脊液(CSF)中，發現低水平的β_淀粉狀蛋白42(Ab42)肽比τ蛋白比率，或者通過淀粉狀蛋白PET (正電子發射斷層成像術)劑諸如來自Ε.Lilly (Avid)的AmyVid?檢出腦中的淀粉狀蛋白斑。
[0066]在另一個例子中，帕金森氏病可以是早期階段帕金森氏病。在又一個例子中，進行性核上性麻痹可以是早期階段進行性核上性麻痹。在又一個例子中，多系統萎縮可以是早期階段多系統萎縮。在另一個例子中，路易體癡呆可以是早期階段路易體癡呆。在一個別的例子中，帕金森氏病癡呆可以是早期階段帕金森氏病癡呆。
[0067]此外，利西拉來在預防神經變性性疾病中是合適的，特別是在那些懷疑患有神經變性性疾病且沒有明確診斷的患者中。在本發明的另一個方面，如本文中描述的藥物組合物用于預防神經變性性疾病。
[0068]在本發明的上下文中，desPro36Exendin_4(1-39)-Lys6-NH2 (利西拉來)包括其藥學可接受鹽。本領域技術人員知道利西拉來的藥學可接受鹽。本發明中采用的一種優選的利西拉來藥學可接受鹽是乙酸鹽。
[0069]在本發明中，可以以足以誘導治療效果的量對有此需要的患者施用desPro36Exendin_4 (1-39)-Lys6-NH2 或 / 和其藥學可接受鹽。
[0070]在本發明中，可以用合適的藥學可接受載體、佐劑、或/和輔助物質配制desPro36Exendin_4 (1-39)-Lys6-NH2 或 / 和其藥學可接受鹽。
[0071]本發明的藥物組合物通過如本文中描述的其神經保護和神經再生效果在如本文中描述的神經變性性疾病中提供疾病緩解效果。特別地，可以在治療如本文中描述的神經變性性疾病中，例如如本文中描述的阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、進行性核上性麻痹、多系統萎縮、路易體癡呆、帕金森氏病癡呆、癲癇、中風、亨廷頓氏舞蹈癥、大腦缺氧、多發性硬化、和周圍神經病中獲得疾病緩解應答。
[0072]本發明的藥物組合物可以胃腸外施用，例如通過注射，諸如通過肌肉內或通過皮下注射。合適的注射裝置是已知的，例如所謂的“筆”，其包括裝有活性成分的藥筒和注射針。可以以合適的量(例如以范圍為每劑I至50 μ g，每劑5至40 μ g，每劑10至30 μ g，每劑 10 至 15 μ g 或每劑 15 至 20 μ g 的量)施用化合物 desPro36Exendin_4 (1-39) -Lys6-NH2 或/和其藥學可接受鹽。
[0073]在本發明中，可以以范圍為I至50 μ g，范圍為5至40 μ g，范圍為10至30 μ g，范圍為10至20 μ g，范圍為10至15 μ g，或范圍為15至20yg的日劑量施用化合物desPro36Exendin-4 (1-39)-Lys6-NH2或/和其藥學可接受鹽。可以通過每日一次注射施用本發明的組合物。
[0074]在本發明中，本發明的組合物可以以液體組合物提供。技術人員已知適合于胃腸外施用的利西拉來液體組合物。本發明的液體組合物可以具有酸性或生理學pH。優選地，酸性pH在ρΗΙ-6.8，ρΗ3.5-6.8，或ρΗ3.5-5的范圍中。優選地，生理學pH在ρΗ2.5-8.5，pH4.0-8.5，或ρΗ6.0-8.5的范圍中。可以通過藥學可接受稀釋酸(通常為HCl)或藥學可接受稀釋堿(通常為NaOH)調節pH。
[0075]本發明的液體組合物可以包含合適的防腐劑。合適的防腐劑可以選自:酹、間甲酚、苯甲醇和對羥基苯甲酸酯。一種優選的防腐劑是間甲酚。
[0076]本發明的液體組合物可以包含張度劑。合適的張度劑可以選自:甘油、乳糖、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、NaCl、含有鈣或鎂的化合物諸如CaCl2。甘油、乳糖、山梨糖醇、甘露醇和葡萄糖的濃度可以在100-250mM的范圍內。NaCl的濃度可以高達150mM。一種優選的張度劑是甘油。
`[0077]本發明的液體組合物可以包含0.5 μ g/mL至20 μ g/mL,優選I μ g/ml至5 μ g/ml的甲硫氨酸。優選地，液體組合物包含L-甲硫氨酸。
[0078]本發明的又一個方面涉及用于預防或/和治療如本文中描述的醫學適應癥的方法。例如，所述方法可以包括施用如本文中描述的藥物組合物。所述方法可以是用于預防或/和治療如本文中描述的神經變性性疾病的方法。
[0079]特別地，如本文中描述的方法例如通過神經保護或/和神經生成引發疾病緩解應答。
[0080]在本發明的方法中，通過施用如本文中描述的藥物組合物在如本文中描述的神經變性性疾病中提供通過其神經保護和神經再生效果的疾病緩解療法。特別地，可以在治療如本文中描述的神經變性性疾病中，例如在如本文中描述的阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、進行性核上性麻痹、多系統萎縮、路易體癡呆、帕金森氏病癡呆、癲癇、中風、亨廷頓氏舞蹈癥、大腦缺氧、多發性硬化、和周圍神經病中獲得疾病緩解應答。
[0081]在本發明的方法中，施用治療有效量的如本文中描述的藥物組合物。
[0082]本發明的又一個方面涉及如本文中描述的組合物用于制造供治療如本文中描述的醫學適應癥用的藥物的用途。例如，本發明的組合物可以用于制造藥物，該藥物用于預防或/和治療如本文中描述的神經變性性疾病。[0083]本發明通過以下實施例和圖進一步例示。
[0084]附圖簡述
[0085]圖1。(A)在1.p.鹽水媒介物(0.9%w, v NaCl)或1.p.利西拉來(2.5，25或250nmol/kg體重)注射后30分鐘時在野生型雌性小鼠(n=5，平均年齡24周)的腦中測量的總利西拉來濃度(pmol/L)。數值是均值土S.E.M。*p<0.05,**p<0.010 (B)在1.p.鹽水媒介物(0.9%w, V NaCl)或1.p.利西拉來(2.5，25或250nmol/kg體重)注射后3小時時在野生型雌性小鼠(n=5，平均年齡24周)的腦中測量的總利西拉來濃度(pmol/L)。數值是均值土S.E.M。*ρ〈0.05。
[0086]圖2。(A)在1.ρ.鹽水媒介物(0.9%w, v NaCl)或1.p.利拉魯肽(2.5，25或250nmol/kg體重)注射后30分鐘時在野生型雌性小鼠(n=5)的腦中測量的總利拉魯肽濃度(pmol/L)。數值是均值土S.E.M0 *p<0.05，**ρ〈0.01。(B)在 1.p.鹽水媒介物(0.9%w, vNaCl)或1.p.利拉魯肽(2.5，25或250nmol/kg體重)注射后3小時時在野生型雌性小鼠的腦中測量的總利拉魯肽濃度(pmol/L)。數值是均值土S.E.M。*p〈0.05。
[0087]圖3。(A)與對照相比,分析前30分鐘注射25nmol/kg bw利拉魯肽ip.顯示腦中cAMP的顯著增加(p〈0.05 ;t檢驗)。(B)與對照相比,分析前30分鐘注射25nmol/kg bw利西拉來ip.顯示腦中cAMP的顯著增加(p〈0.01;t檢驗)。(C)在直接比較利拉魯肽與利西拉來的效果時，發現藥物間的顯著差異(p〈0.05 ;t檢驗)。
[0088]圖4。毒蜥外泌肽-4、利拉魯肽或利西拉來25nmol/kg bw.每日一次注射3周對齒狀回中細胞增殖(BrdU染色)的影響。數值是均值土S.E.M。*p<0.05,**p<0.010與毒蜥外泌肽-4和利拉魯肽(p〈0.05) 及對照(p〈0.01)相比，利西拉來顯示升高的細胞增殖活性。
[0089]圖5。對利西拉來ip.每日一次持續3周(25nmol/kg bw ip.)的長期注射的組織學分析。在BrdU免疫組織學分析中，在齒狀回腦區中發現較多的新細胞。還有，發現較多的幼神經元(雙重皮質激素(cortin)染料)。數值是均值土S.E.M。*=ρ〈0.05廣=ρ〈0.01。
[0090]圖6。(A)LDH測定法。用利西拉來預處理SH-SY5Y細胞，接著是甲基乙二醛應激(_〈0.0001)。IOnM劑量利西拉來在保護細胞免于1200 μ M甲基乙二醛應激中是足夠的。(B)LDH測定法。用利拉魯肽預處理SH-SY5Y細胞，接著是甲基乙二醛應激rρ〈0.05，**ρ<0.001,***ρ<0.0001)。200ηΜ劑量利拉魯肽在保護細胞免于1200 μ M甲基乙二醛應激中是足夠的。較低劑量IOnM或IOOnM顯示沒有效果。
[0091]圖7。在甲基乙二醛(MG)和過氧化氫(H2O2)處理后用利西拉來或利拉魯肽的應激后處理。X軸指各種測定條件，而Y軸代表吸光度。*=p〈0.05，#=p〈0.()l。(A)利西拉來后處理，(B)利拉魯肽后處理。
[0092]圖8。用利西拉來或利拉魯肽預處理，接著是甲基乙二醛(MG)應激。X指各種測定條件，而Y軸代表吸光度。*=p〈0.()5，m=p〈().(K)l。(A)利西拉來、⑶利拉魯肽和(C)毒蜥外泌肽-4的預處理效果。
[0093]圖9。在存在多個濃度的利西拉來的情況中LUHMES細胞的神經保護(表示為通過魚藤酮暴露誘導的標準化細胞存活力降低的百分比反轉)。Rot.=魚藤酮。NS=不顯著；*=ρ〈0.05 ;***=ρ〈0.001。
[0094]圖10。在存在多個濃度的毒蜥外泌肽-4/艾塞那肽的情況中LUHMES細胞的神經保護(表示為通過魚藤酮暴露誘導的標準化細胞存活力降低的百分比反轉)。Rot.=魚藤酮。NS=不顯著。*=ρ<0.05 ο
[0095]圖11。在存在多個濃度的利拉魯肽的情況中LUHMES細胞的神經保護(表示為通過魚藤酮暴露誘導的標準化細胞存活力降低的百分比反轉)。Rot.=魚藤酮。NS=不顯著；***=ρ〈0.001。
[0096]圖12。利西拉來處理降低阿耳茨海默氏病轉基因小鼠的腦中的淀粉狀蛋白斑負荷。7月齡APP/PS1轉基因小鼠中持續70天的利西拉來處理(lOnmol/kg，1.p.，每日)降低腦中的β淀粉狀蛋白斑負荷，如通過β淀粉狀蛋白免疫組織化學及測定腦皮層的橫截面中對β淀粉狀蛋白呈陽性的％面積量化的。數值是均值+/-SEMfSK0.01)。
[0097]圖13。利西拉來處理降低阿耳茨海默氏病轉基因小鼠的腦中的淀粉狀蛋白斑負荷。7月齡APP/PS1轉基因小鼠(阿耳茨海默氏病模型)中持續70天的利西拉來處理(10nmol/kg，1.p.，每日)降低腦中的成熟淀粉狀蛋白斑負荷，如通過用剛果紅的組織學染色及測定腦皮層的橫截面中對剛果紅呈陽性的％面積量化的。數值是均值+/-SEM(*=p〈0.05)。
[0098]實施例1
[0099]利西拉來是一種通常胃腸外施用的肽藥物。為了引發針對神經變性性疾病(諸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、進行性核上性麻痹、多系統萎縮、路易體癡呆、帕金森氏病癡呆或中風)的活性，利西拉來必須穿過血腦屏障。若利西拉來提供下列一項或多項特征，則利西拉來(特別在胃腸外施用時)適合于治療或/和預防神經變性性疾病:
[0100](a)利西拉來可以穿過血腦屏障，
[0101](b)利西拉來活化腦中的GLP-1受體，并且通過受體活化誘導生理學效果，
`[0102](c)利西拉來在合適的模型中提供疾病緩解效果，
[0103](d)利西拉來在合適的模型中是神經保護的，以及
[0104](e)利西拉來相對于其它GLP-1受體激動劑諸如利拉魯肽或艾塞那肽提供優點。
[0105]腦的利西拉來攝取
[0106]在本實施例中，描述了 GLP-1受體激動劑利西拉來是否穿過血腦屏障(BBB)。測試3 種劑量(2.5nmol/kg bw, 25nmol/kg bw 和 250nmol/kg bw, ip.)，并且檢查注射后 30 分鐘和3小時的小鼠腦組織中找到的水平。利西拉來水平在用所有劑量投遞后30分鐘升高，并且用低(2.5nmol/kg bw)和中等水平(25nmol/kg bw)兩者而非高劑量250nmol/kg bw利西拉來也檢出。此差異提示了利西拉來進入腦的轉運受到調節，限制本文測試的高濃度的利西拉來的流入(圖1)。
[0107]腦中利西拉來攝取與利拉魯肽攝取的比較
[0108]將上文關于利西拉來的結果與那些關于GLP-1激動劑利拉魯肽(Novo Nordisk的Victoza)的結果比較。如上文討論及圖1和2中顯示的，利西拉來水平在最低劑量
2.5nmol/kg bw ip.時在腦中顯示顯著升高,而利拉魯肽在此劑量時沒有顯示升高(圖2),這提示了利西拉來比利拉魯肽在更低的濃度時被攝取入腦中。
[0109]從此發現得出結論，與利拉魯肽相比，利西拉來需要更低劑量的利西拉來以通過血腦屏障，從而與利拉魯肽相比，它可以在更低的劑量對如本文中描述的神經變性性疾病施加治療效果。
[0110]腦中的GLP-1受體活化/cAMP生成[0111]初步研究已經顯示了利西拉來活化胰GLP-1受體，這與CAMP水平升高相聯系(關于綜述，見例如Doyle等，2007)。
[0112]在本實施例中，已經第一次顯示了注射利西拉來1.p.增加腦中的cAMP量，指示利西拉來活化腦中的GLP-1受體(圖3b)。圖3c中顯示了利西拉來(25nmol/kg bw 1.p.)和利拉魯肽(25nmol/kg bw 1.p.,關于結果,見圖3a)對GLP-1受體的影響的直接比較。利西拉來在相同劑量時比利拉魯肽產生顯著更高的cAMP水平(*=ρ〈0.05)，這證明了利西拉來的
更聞效率。
[0113]利西拉來在腦中的神經生成效果/疾病緩解效果
[0114]調查利西拉來1.p.、毒蜥外泌肽_41.p.和利拉魯肽1.p.持續3周的長期注射對神經元祖干細胞增殖的影響。發現齒狀回中增強的干細胞增殖(BrdU染料，圖4和5)。令人驚訝地，在與毒蜥外泌肽-4或利拉魯肽相比時，利西拉來具有顯著增強的細胞增殖C=P<0.05)，這指示在以相同劑量注射時，利西拉來比毒蜥外泌肽-4和利拉魯肽在腦中更有效。
[0115]另外，在與利拉魯肽相比時，齒狀回中的幼神經元數目在利西拉來注射后增加(雙重皮質激素染料，數據未顯示)，這指示祖細胞分化成神經元。這證明了利西拉來誘導持久的改善。
[0116]利西拉來對干細胞的這些影響(增殖和分化)是腦修復的一個重要方面，因此這些效果可以在神經變性性疾病(諸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、和中風)中提供疾病緩解效果。
[0117]利西拉來在腦中的神經保護效果
[0118]在神經元細胞培養研究中，已經測試了利西拉來以調查它在細胞應激條件中是否具有神經保護效果。使用毒性藥物甲基乙二醛來降低細胞存活。利西拉來的添加以劑量依賴性方式顯示神經保護效果(圖6a)，在最低濃度的甲基乙二醛的情況中在所有劑量提供100%保護，且即使在測試的最高濃度的甲基乙二醛的情況中維持保護。IOnM劑量利西拉來在保護細胞免于1200 μ M甲基乙二醛應激中是足夠的。
[0119]另外，利西拉來與利拉魯肽相比顯示優越的保護。在圖6b中，顯示了利拉魯肽在IOnM的劑量時不能保護細胞。為了保護細胞免于1200 μ M甲基乙二醛應激需要200nM劑量利拉魯肽，更低劑量10或IOOnM顯示沒有效果。
[0120]材料和方法
[0121]腦中cAMP的測量
[0122]動物
[0123]使用雌性野生型(C57BL/6背景)小鼠，每組5只。對于cAMP測量，給小鼠1.p.注射25nmol/kg體重(bw)利拉魯肽、利西拉來或作為對照的鹽水(0.9%w.v.)，在兩個分開實驗中。注射后30分鐘，將小鼠腦立即取出，并快速冷凍。
[0124]cAMP的組織提取
[0125]使用0.1M HCI提取每個腦。對每g組織添加IOml0.1M HC10將樣品超聲處理，然后以10，OOOrpm于4°C離心15分鐘。將上清液倒出，并直接用于通過直接cAMP ELISA試劑盒(Enzo Life Sciences)測量。使用試劑盒中提供的0.1MHCl生成稀釋液。
[0126]免疫組織化學[0127]對動物施用BrdU(180mg/kg bw; 1.p.),之后18小時用戍巴比通(0.3ml; Euthanal, Bayer AG, Leverkusen,德國)麻醉，并用PBS,接著用4%低聚甲醒穿心灌注。將腦取出，并放入PBS中的30%蔗糖中過夜。對45μπι自由浮動切片實施BrdU或雙重皮質激素(DCX)方面的免疫組織化學。通過在3%過氧化氫中溫育切片淬滅內源過氧化物酶活性。DNA的變性牽涉在2Ν HCI，接著是0.1M硼砂中溫育10分鐘。將切片在針對BrdU的一抗(1:200，小鼠單克隆抗BrdU，Sigma)或者用于DCX的山羊多克隆抗雙重皮質激素(1:200，Santa Cruz, USA, sc_710)中于4°C溫育過夜。然后，應用二抗(1:200，馬抗小鼠，Vector精華ABC試劑盒,小鼠,Vector laboratories)。將切片在親合素生物素酶試劑中溫育，并在Vector SG底物發色團中溫育(關于詳情，見Gengler等.2010)。
[0128]顯微術
[0129]使用體視學技術,使用Olympus CX40顯微鏡分析切片。這牽涉隨機開始切片，并且收集每第5個貫穿齒狀回(DG)的顆粒細胞層(GCL)的切片。使用40倍物鏡實施分析，并且使用5.1MPix數字照相機拍攝代表性圖像。對于每個藥物組，分析4-6個小鼠腦。對每個腦采集8和12個之間的切片。分析的腦區范圍為-1.3至-2.5mm前囟。使用ImageJ軟件(NIH的免費軟件，http://rsbweb.nih.govl/i j/)計數DG中的所有陽性細胞。在GCL中，計數在BrdU或DCX方面呈陽性的細胞。
[0130]SH-SY5Y 細胞系
[0131]SH-SY5Y是一種三次克隆的人成神經細胞瘤細胞系，其在1970年從4歲女性中的轉移性成神經細胞瘤部位的骨髓活組織檢查建立。這些細胞是有多巴胺β羥化酶活性的，乙酰膽堿能的，谷氨酸能的且腺苷能的。SH-SY5Y細胞以漂浮的和粘附的細胞的混合物生長以及形成具有多個短的精致細胞過程的成神經細胞性細胞簇。視黃酸和膽固醇處理可以迫使細胞生長出樹突并分化。
[0132]用利西拉來或利拉魯肽預處理SH-SY5Y細胞，接著是甲基乙二醛應激
[0133]將SH-SY5Y細胞在Dulbecco氏極限必需培養基中培養，并在濕潤的，5%C02，37°C培養箱中溫育，所述Dulbecco氏極限必需培養基具有F12 (1:1)和Glutamax，且補充有10%熱滅活(于56°C加熱20分鐘)胎牛血清及青霉素和鏈霉素。將細胞在80%匯合時用胰蛋白酶處理，并在通過錐蟲藍排除法(Countess, Invitrogen)計數細胞后，將2xl04個細胞在經層粘連蛋白包被的96孔板(Nunc，Inc)中以95%細胞存活力分配。在細胞附著12小時后，將細胞用10nM、100nM和200nM不同劑量的利西拉來或利拉魯肽預處理，接著以濃度300μΜ、600μΜ和1200 μ M在無血清培養基中添加應激物甲基乙二醛(圖6Α和6Β)。通過PRISM5.0C (GraphPad Software, Inc.)分析數據，并且顯著性定義為小于0.05或更小的p值。
[0134]利西拉來或利拉魯肽預處理對經過過氧化氫應激的SH-SY5Y細胞的影響
[0135]將細胞用IOnM和IOOnM利拉魯肽或利西拉來預處理，接著以濃度200 μ Μ、400 μ M和800 μ M在無血清培養基中添加應激物過氧化氫。
[0136]LDH測定法
[0137]使用靈敏性乳酸-脫氫酶(LDH)測定法(Sigma)分析細胞培養液。LDH測定法經由總胞質LDH或者通過膜完整性(其作為釋放入培養基中的胞質LDH量的函數)提供死細胞數目的測量。釋放的LDH的測量基于通過LDH作用的NAD還原。在四唑染料的化學計量轉化中使用所得的還原性NAD (NADH)。通過比色法測量最終有色化合物。
[0138]匯總
[0139]本實施例的數據證明了利西拉來適合于治療或/和預防神經變性性疾病，諸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、進行性核上性麻痹、多系統萎縮、路易體癡呆、帕金森氏病癡呆或中風。此外，利西拉來與GLP-1類似物利拉魯肽和毒蜥外泌肽-4 (這兩者目前用作2型糖尿病的治療)相比具有優越的特性。
[0140]特別地，本實施例的數據證明了:
[0141](a)令人驚訝地，利西拉來可以穿過血腦屏障。本發明的數據指示轉運受到調節，因為高濃度的轉運速率限于最大水平。此外，與利拉魯肽相比，利西拉來在更低的胃腸外劑量時被攝取入腦中。
[0142](b)利西拉來活化腦中的GLP-1受體，并且誘導cAMP生成。令人驚訝地，利西拉來比利拉魯肽產生更高的cAMP水平，這證明了在相同劑量時在活化GLP-1受體方面的更高效率。
[0143](c)利西拉來可以誘導齒狀回中祖細胞的增殖。令人驚訝地，與毒蜥外泌肽-4或利拉魯肽相比，利西拉來在以相同劑量施用時提供增強的效果。在神經變性性疾病中，這些效果可以構成疾病緩解效果。
[0144](d)令人驚訝 地，在與利拉魯肽相比時，利西拉來在齒狀回中顯示優越的神經保護效果(針對細胞應激)。
[0145](e)令人驚訝地，用IOnM劑量利西拉來的預處理足以保護SH-SY5Y成神經細胞瘤細胞免于1200 μ M甲基乙二醛應激。200ηΜ劑量利拉魯肽在保護細胞免于1200 μ M甲基乙二醛應激中是必需的，這指示較低劑量的利西拉來足以誘導保護。
[0146]實施例2
[0147]甲基乙二醛(MG)和過氧化氫(H2O2)處理后用利西拉來或利拉魯肽的應激后處理
[0148]將SHSY-5Y細胞在96孔板中接種，并在血清饑餓12小時后，用600 μ M和ImM H2O2和ImM和2mM MG應激3小時。用O, I, 10，50和IOOnM利西拉來和O, 10，50，100和200nM利拉魯肽處理細胞。24小時后，添加50 μ L XTT試劑，并溫育8小時。測定體積是100 μ L。
[0149]圖7證明了用利西拉來的后處理以劑量依賴性方式顯著增加用MG或H2O2應激后的存活細胞數目(特別見圖7Α中用600 μ M H2O2，和2mM MG獲得的數據)。利拉魯肽沒有保護細胞免于MG或H2O2的應激(圖7B)。
[0150]用利西拉來或利拉魯肽的預處理，接著是甲基乙二醛(MG)應激
[0151]將SHSY-5Y細胞在96孔板中接種，并且在血清饑餓12小時后，用0，I, 10，50和IOOnM利西拉來和0，10，50，100和200nM利拉魯肽和毒蜥外泌肽_4處理4小時，之后用400 μ M和600 μ M MG應激14小時。添加50 μ L XTT試劑，并將板溫育8小時。
[0152]圖8證明了在MG或H2O2應激前用利西拉來預處理以劑量依賴性方式顯著增加存活細胞的數目，以最低劑量InM開始，50ηΜ時結果最佳(圖8Α)。利拉魯肽也保護細胞，但是僅于較高劑量IOOnM時(圖8Β)。毒蜥外泌肽_4沒有保護細胞免于MG或H2O2的應激(圖8C)。
[0153]材料和方法
[0154]使用甲基乙二醛作為應激物用SHSY-5Y細胞的預處理測定法[0155]1.將 SHSY-5Y 細胞在具有 10%FBS (產品目錄編號 10437，Invitrogen Inc.)和 1%青霉素鏈霉素(產品目錄編號15070063，Invitrogen Inc.)的DMEM+F12Glutamax培養基(產品目錄編號313310，Invitrogen Inc.)中維持。
[0156]2.將80-90%匯合的培養物使用0.25倍胰蛋白酶EDTA溶液進行胰蛋白酶處理，并且在96孔板(產品目錄編號55301，Orange Scientific)中接種，所述96孔板先前用用層粘連蛋白(L2020，Sigma)以I μ g/cm2的濃度于37°C在CO2培養箱中包被2小時，并且用無菌雙蒸水清洗2次。
[0157]3.在12-15小時后，對于接著的12小時，將培養基從含有10%FBS更換成無血清培養基(SFM)。
[0158]4.將細胞用腸降血糖素預處理4小時，在不同濃度的150 μ I體積形式中實施測定法,并將新鮮的SFM添加至對照，持續4小時。
[0159]5.用I倍HBSS和150 μ 1600 μ M甲基乙二醛(產品目錄編號Μ0252，Sigma)清洗孔，并分別對測試孔和對照添加SFM，持續12小時。
[0160]6.將上清液收集以實施LDH測定法，并于_20°C貯存。
[0161]7.將75μ1 XTT溶液(產品目錄編號11465015001，Roche Inc.)(含有偶聯劑)添加至剩余的細胞，并于37°C溫育4小時。該測定法基于代謝活性細胞將四唑鹽XTT還原成有色化合物的能力，這可以通過吸光度測量測定。升高的吸光度指示增加的代謝活性細胞數目。
[0162]8.通過于492nm和690nm測量每個孔并從A492扣除A69tl獲得吸光度。
[0163]9.對于LDH(產品目`錄編號G1780，Promega)測定法，將50 μ I上清液與50 μ I底物一起添加至96孔板，并在黑暗中于室溫溫育60分鐘。
[0164]10.添加50 μ I停止溶液，并于490nm測量吸光度。
[0165]11.使用Prism V分析XTT和LDH測定法的數據。
[0166]匯總
[0167]實施例2的數據證明了利西拉來適合于治療或/和預防神經變性性疾病，諸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、進行性核上性麻痹、多系統萎縮、路易體癡呆、帕金森氏病癡呆或中風。此外，與GLP-1類似物利拉魯肽和艾塞那肽相比，利西拉來具有優越的特性。
[0168]用IOnM劑量利西拉來的預處理足以保護SH-SY5Y成神經細胞瘤細胞免于600 μ M甲基乙二醛應激。100ηΜ-200ηΜ劑量利拉魯肽足以保護細胞免于600 μ M甲基乙二醛應激，這指示較低劑量的利西拉來足以誘導保護。如此，利西拉來適合于預防如上文指定的疾病。這些數據與實施例1中獲得的數據一致(圖6Α和B)，這證明了在與利拉魯肽相比時，利西拉來在SH-SY5Y成神經細胞瘤細胞中顯示優越的神經保護效果(針對細胞應激)。
[0169]此外，用利西拉來的后處理足以保護SH-SY5Y成神經細胞瘤細胞免于2mM甲基乙二醛應激或ImM H2O2應激。比較而言，利拉魯肽沒有保護細胞免于MG或H2O2的應激。
[0170]實施例3
[0171]用胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)激動劑利西拉來處理保護人神經元細胞免于
魚藤酮毒性。
[0172]在此實施例中，描述了細胞模型中的神經保護實驗，其支持在治療帕金森氏病、帕金森氏病癡呆、進行性核上性麻痹、多系統萎縮、和路易體癡呆中使用利西拉來。實施例證明了利西拉來可以通過保護此疾病中易受攻擊的神經元來減緩，阻滯或反轉帕金森氏病、帕金森氏病癡呆、進行性核上性麻痹、多系統萎縮、和路易體癡呆的進展。這些疾病與利用多巴胺作為神經遞質的神經元的損失有關。
[0173]實施例涉及使用人細胞系的體外培養測定法，所述人細胞系本質上是多巴胺能的，稱作Lund人中腦神經元(LUHMES細胞)。這些細胞記載于Lotharius等(2002)。將來自這些細胞的培養物在體外暴露于魚藤酮，已知魚藤酮殺死多巴胺能細胞并且與對人偶然或環境暴露后的帕金森氏病有關。魚藤酮與帕金森氏病的關聯記載于Sherer等，2003及Tanner等，2011。魚藤酮可以如下引起帕金森綜合征，這通過殺死多巴胺生成神經元來實現，由此在實驗中再現人帕金森氏病的主要特征。
[0174]在本實施例中，胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)激動劑利西拉來在LUHMES細胞中展現出針對由魚藤酮誘發的神經變性的顯著神經保護效果(圖9)。與其它GLP-1受體(GLP-1R)激動劑相比，利西拉來提供優點。利西拉來在LUHMES細胞中針對魚藤酮的神經保護效果在比利拉魯肽低3倍的濃度時顯著有活性(圖9和11)，該結果支持先前在實施例1的甲基乙二醛模型中看到的利西拉來的出乎意外的卓越活性效果。
[0175]艾塞那肽在0.3μΜ或I μΜ的濃度不誘導改善的存活力。比較而言，利西拉來在這些濃度提供顯著的存活力改善(圖9和10)。
[0176]材料和方法
[0177]為了評估針對魚藤酮的神經保護，將LUHMES細胞于37°C在濕潤的95%空氣，5%C02氣氛中在標準細胞培養培養基中培養。在塑料燒瓶中培養2天后，添加含有生長因子的分化培養基，并將細胞再溫育2天。將細胞解離，并接種入經包被的多孔板中，并添加新鮮的分化培養基，再持續4 天。分化的第6天，將細胞用多個濃度的利西拉來、艾塞那肽(毒蜥外泌肽-4)或利拉魯肽處理I小時，之后用魚藤酮(0.75μΜ)處理。用基于刃天青的測定法(一種經由細胞氧化-還原生成熒光產物的有代謝活性的細胞的指示劑)在72小時后測量神經保護。產生的熒光與培養物中的活細胞數目成比例，并且如此測量通過處理提供的對神經元LUHMES細胞的保護程度。在相對于沒有魚藤酮的對照標準化細胞存活力讀出后比較來自η=12次測量的數據。使用單因素方差分析，接著是Dunnett氏檢驗來進行實驗組間的統計學比較。認為數值Ρ〈0.05是顯著的，并且在圖中如下以星號表示:*=Ρ<0.05;**=ρ<0.01;***=ρ<0.001 ;NS=不顯著。神經保護表示為由魚藤酮誘導的存活力降低的百分比反轉。
[0178]匯總
[0179]實施例3的數據證明了利西拉來適合于治療或/和預防神經變性性疾病，諸如帕金森氏病、進行性核上性麻痹(PSP)、多系統萎縮(MSA)、路易體癡呆、帕金森氏病癡呆或中風。此外，與GLP-1類似物利拉魯肽和毒蜥外泌肽-4相比，利西拉來具有優越的特性。
[0180]在本實施例中，利西拉來在LUHMES細胞中展現出針對由魚藤酮誘導的神經變性的顯著神經保護效果(圖9)。與其它GLP-1受體(GLP-1R)激動劑相比，利西拉來提供優點。在經魚藤酮處理的LUHMES細胞中，利西拉來在比利拉魯肽低3倍的濃度顯著有活性。在濃度0.3 μ M或I μ M艾塞那肽，不能觀察到顯著效果。比較而言，利西拉來在這些濃度時提供劑量依賴性存活力改善。
[0181]實施例4:利西拉來在APPswe/PSl.轉基因小鼠中的效果。[0182]為了進一步證明利西拉來對于治療神經變性性疾病諸如阿耳茨海默氏病的利益，在本實施例中，描述了利西拉來處理在其腦中攜帶淀粉狀蛋白斑的轉基因小鼠中的效果。APP_/PSUE9轉基因小鼠是一種充分表征的阿耳茨海默氏病模型，其顯示淀粉狀蛋白腦病理學。在7月齡APP/PS1轉基因小鼠中在淀粉狀蛋白斑已經在腦中形成的齡期啟動利西拉來處理(10nmol/kg，1.p.,每日)，并且持續70天。
[0183]轉基因動物
[0184]具有C57B1/6 背景的 APPswe/PS]^E9 小鼠獲自 Jackson 實驗室(http://research.jax.0rg/reposi tory/Alzheimer s.html)。將雜合雄性與本地購買的野生型C57/B16雌性(Harlan，UK)育種。對后代進行耳沖孔，并用對APP序列特異性的引物(正向“GAATTCCGACATGACTCAGG, SEQ ID N0:4”，反向:“GTTCTGCTGCATCTTGGACA, SEQ ID NO: 5”)使用PCR測定基因型。使用不表達轉基因的小鼠作為野生型對照。在所有研究中使用雄性動物。將動物個別籠養，并且按12/12光照-黑暗周期(光照在08h00時開啟，在20h00時關閉)，在溫度受控房間(T:21.5°C ±1)中維持。食物和水任意可得到。將動物每日處理2周，之后開始研究。
[0185]用利西拉來的處理
[0186]小鼠在開始處理時為7月齡。在該時間時，小鼠已經顯示淀粉狀蛋白腦病理學。給小鼠每日一次腹膜內(1.P.)注射利西拉來(10nmol/kg體重)或鹽水(0.9%w/v)達70天。UK內政部依照1986年動物(科學規程)法案許可實驗。
[0187]利西拉來由Sanofi提供。將凍干的肽在Mill1-Q水中以濃度lmg/ml重建。將等分試樣在冷凍機中貯存，并在0.9%注射用鹽水中重建。
[0188]組織學制備
[0189]對動物穿心灌注PBS緩沖液，接著是PBS中冰冷的4%低聚甲醛。將腦取出，并在4%低聚甲醒中固定至少24小時,之后轉`移至30%鹿糖溶液過夜。然后,使用Envirofreez?將腦快速冷凍，并使用Leica低溫恒溫器在-2至_3前因深度切出40微米厚度的皮層切片。依照體視學規則選擇切片，隨機采集第一個切片，然后采集每第6個切片。
[0190]使用標準方法(關于詳情，見McClean等，2011),使用家兔多克隆抗淀粉狀蛋白β肽(1:200, Invitrogen, UK, 71-5800)染色β淀粉狀蛋白，并使用剛果紅染色密集核心斑。通過對每個切片拍攝2張皮層圖像(使用10倍物鏡)分析β淀粉狀蛋白和剛果紅(每個腦具有7-10個切片；η=6 (對于利西拉來10nmol/kg bw),n=12 (對于鹽水))。通過AxioScopel (Zeiss,德國)顯現所有染色，并使用具有Image J(NIH, USA)的多閾值插入進行分析。
[0191]結果
[0192]在啟動處理時已經攜帶淀粉狀蛋白腦病理學的APPswe/PSl ΔΕ9轉基因小鼠中，與用鹽水處理的小鼠相比，利西拉來處理70天導致β淀粉狀蛋白斑負荷降低62%，如通過β淀粉狀蛋白免疫反應性測量的(Ρ〈0.0039 ;重復測量t檢驗)(圖12)。
[0193]類似地，與相應的用鹽水處理的APP/PS1小鼠相比，利西拉來處理將密集核心淀粉狀蛋白斑負荷降低52%，如通過剛果紅組織學染色量化的(p=0.0419;重復測量t檢驗)(圖 13)。
[0194]在比先前對利拉魯肽描述的劑量(25nmolm/kg, McClean等，2011)低的劑量(IOnmoI/kg)觀察到活性。
[0195]匯總
[0196]使用兩種獨立技術得到的這些數據證明了利西拉來可以降低阿耳茨海默氏病動物模型中的腦淀粉狀蛋白病理學。數據證明了利西拉來適合于通過降低腦淀粉狀蛋白斑病理學來治療或/和預防神經變性性疾病，諸如阿耳茨海默氏病。因此，在其神經保護特性外，利西拉來可以降低病理學損傷諸如淀粉狀蛋白斑，并且因此代表一種針對阿耳茨海默氏病的有吸引力的治療或/和預防。此外，如從實施例1的數據預期的，在比先前對GLP-1類似物利拉魯肽描述的那些劑量低的劑量實現活性。
[0197]參考文獻
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【權利要求】
1.一種在預防或/和治療神經變性性疾病中使用的藥物組合物，所述組合物包含desPro36Exendin-4 (1-39)-Lys6-NH2或/和其藥學可接受鹽,和任選地藥學可接受載體、佐劑、或/和輔助物質。
2.依照權利要求1使用的藥物組合物，其中所述desPro36Exendin-4(1-39)-Lys6-NH2或/和其藥學可接受鹽制備用于胃腸外施用。
3.依照前述權利要求中任一項使用的藥物組合物，其中所述神經變性性疾病牽涉氧化應激、神經突完整性損失(loss of neurite integrity)、凋亡、神經元損失(neuronalloss)或/和炎癥應答。
4.依照前述權利要求中任一項使用的藥物組合物，其中所述神經變性性疾病與認知損傷有關。
5.依照前述權利要求中任一項使用的藥物組合物，其中所述神經變性性疾病選自下組:阿耳茨海默(Alzheimer)氏病、帕金森(Parkinson)氏病、進行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy, PSP)、多系統萎縮(multiple system atrophy, MSA) >路易體癡呆(Lewy body dementia)、帕金森氏病癡呆癲癇、中風、亨廷頓氏舞蹈癥(Huntington，s Chorea)、大腦缺氧(cerebral hypoxia)、多發性硬化(multiplesclerosis)、和周圍神經病(peripheral neuropathy)。
6.依照權利要求5使用的藥物組合物，其中周圍神經病與糖尿病有關。
7.依照權利要求5使用的藥物組合物，其中所述神經變性性疾病選自下組:阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、和中風。
8.依照權利要求5使用的藥物組合物，其中所述阿耳茨海默氏病是早期階段阿耳茨海默氏病。
9.依照權利要求5使用的藥物組合物，其中所述帕金森氏病是早期階段帕金森氏病。
10.依照前述權利要求中任一項的藥物組合物，其中所述desPro36Exendin-4 (1-39) -Lys6-NH2或/和其藥學可接受鹽制備用于以選自10 μ g至20 μ g范圍的日劑量(daily dose)施用。
11.一種用于預防或/和治療神經變性性疾病的方法，其包括對有此需要的患者施用權利要求1至10中任一項的組合物。
12.權利要求11的方法，其中所述神經變性性疾病選自下組:阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、和中風。
13.權利要求11或12的方法,其中所述組合物引發疾病緩解應答(disease-modifyingresponse)。
【文檔編號】A61P25/28GK103813801SQ201280038987
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年9月3日 優先權日:2011年9月1日
【發明者】S.赫斯, C.霍爾舍, A.貝姆, A.米納特, L.普拉蒂爾, V.陶平 申請人:賽諾菲-安萬特德國有限公司, 阿爾斯特大學