通過施用重組vwf治療凝血疾病的制作方法

通過施用重組vwf治療凝血疾病的制作方法
【專利摘要】本發明提供通過單獨地施用重組馮·威利布蘭德因子或將其與因子VIII結合施用而治療包括血友病和馮·威利布蘭德病的凝血疾病的方法。
【專利說明】通過施用重組VWF治療凝血疾病
發明背景
[0001]諸如馮.威利布蘭德病(VWD)和血友病的凝血疾病通常因凝血級聯中的缺陷所致。“馮.威利布蘭德病(von Willebrand Disease) ”是指一組由馮.威利布蘭德因子的缺陷所致的疾病。馮.威利布蘭德因子有助于血小板聚在一起并粘附到血管壁，這是正常凝血的必要條件。甲型血友病是指因子VIII活性的缺陷，而乙型血友病是指因子IX缺陷。這些凝血病的當前治療包括使用含有正常凝血因子的藥物制劑的替代療法。
[0002]VWD和甲型血友病患者中的替代療法涉及通過靜脈輸注反復施用含有正常凝血因子的制劑，這會對這些患者的生命構成沉重的負擔，尤其是當難以實現靜脈通路時。如果能夠降低輸注頻率將是有利的。一種潛在可行的療法是通過與諸如馮.威利布蘭德因子(VffF)的第二分子的締合而穩定因子VIII，結果是因子VIII的血漿半衰期得以延長。
[0003]VffF是一種糖蛋白，它以一系列大小從約500至20，OOOkD的多聚體形式在血漿中循環。已經克隆了 VWF的全長cDNA ;該多肽對應于全長前原VWF(Eikenboom等人(1995)Haemophilial, 7790)的第23至764位氨基酸殘基。多聚體形式的VWF由通過二硫鍵連接在一起的250kD的多肽亞單位組成。VWF介導最初的血小板與受損血管壁內皮下膜的粘附，其中較大的多聚體表現出增強的止血活性。多聚VWF通過VWF的Al結構域中的相互作用結合到血小板表面糖蛋白Gplba，從而有利于血小板粘附。VWF上的其他位點介導與血管壁的結合。因此，VWF在血小板與血管壁之間形成橋聯，這對高剪切條件下的血小板粘附和初期止血必不可少。通常，內皮細胞分泌較大的多聚形式的VWF，而具有較低分子量的那些形式的VWF則由蛋白水解裂解產生。極大分子質量的多聚體儲存在內皮細胞的韋伯潘力氏小體(Weibel-Pallade body)中，并在諸如凝血酶和組胺的激動劑刺激下釋放。
[0004]FVIII藥代動力學取決于VWF水平得到多項之前的觀察結果的支持。由于降低的VWF蛋白水平或降低的FVIII結合親和力而導致的馮.威利布蘭德病(VWD)中的FVIII結合活性降低導致內源性 FVIII的穩態水平降低(在Castaman等人，Disorders ofHemostasis88(l): 94-108 (2003)中有所概述)，并且改善VWF的存活已被提出作為改善FVIII 穩定性的可行策略(Denis 等人,Thromb Haemost.2008Feb; 99 (2): 271-8; Turecek等人，Blood, 2006，108(11):Abstractl002)。在重癥甲型血友病患者之中，輸注前VWF水平與輸注FVIII的半衰期之間的相關性已由Fijnvandraat及其同事證實(Fijnvandraat等人，Br J Haematol.19950ct;91 (2):474-6)。在該項研究中，與具有正常VWF水平的患者中12.5小時的平均值相比，據觀察，達平均VWF水平的200-300%的患者的FVIII半衰期為15-29小時。在另一項研究中，經證實，O型血患者具有與A型血患者(19.7小時)相比明顯更低的VWF水平和更短的FVIII半衰期(15.3小時)(Vlot等人，ThrombHaemost.2000Jan; 83 (I): 65-9)。已表明，化學修飾的 VffF 延長 rFVII I 的存活(Turecek等人，J- Thromb.Haemost.2007Jul9; 5 (2),摘要可見于:http/www.blackwellpublishing.com/i sth2007/abstract.asp?id=64898 )。因此，共同施用 rVWF 和 rFVI 11 是治療諸如馮.威利布蘭德病和甲型血友病的凝血疾病的可行策略。
[0005]發明概述[0006]因此，本發明提供通過向對其有需要的受試者單獨地施用重組馮.威利布蘭德因子(rVWF)或將其與重組因子VIII(rFVIII)結合施用而結果是因子VIII的體內半衰期得以延長以治療凝血疾病的方法和組合。
[0007]在一個方面，本發明提供用于治療對其有需要的受試者中的馮.威利布蘭德病或甲型血友病的方法，該方法包括:向受試者施用重組馮?威利布蘭德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期與施用血漿源馮.威利布蘭德因子的受試者相比得以延長，其中rVWF為高分子量VWF多聚體組合物，其包含至少20%的VWF十聚體或更高級的多聚體，并且其中rVWF具有比血漿源馮.威利布蘭德因子更高的比活性。
[0008]在另外的實施方案中并根據以上內容，本發明的方法包括向受試者共同施用重組馮.威利布蘭德因子(rVWF)和重組因子VIII(rFVIII)。
[0009]在另外的實施方案中并根據以上任一個，以單一組合物的形式一起施用rVWF和rFVIIL.[0010]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者每劑施用1.0IU/kg VWF:RCo至150IU/kg VWF:RCoο
[0011]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者每劑施用2IU/kg VffFiRCo至50IU/kg VWF:RCoο
[0012]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者每劑施用5IU/kg VffFiRCo至40IU/kg VWF:RCoο
[0013]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者每劑施用10IU/kg VffFiRCo至20IU/kg VWF:RCoο
[0014]在另外的實施方案中并根據以上任一個，用于本發明方法的rVWF通過用弗林蛋白酶(Furin)處理而體外成熟。
[0015]在另外的實施方案中并根據以上任一個，rVWF通過在中國倉鼠卵巢中表達(CH0細胞培養)而產生。
[0016]在另外的實施方案中并根據以上任一個，rFVIII和rVWF通過在相同的細胞培養中表達而產生。
[0017]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者每隔一天不超過一次施用rVWF。
[0018]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者一周不超過兩次施用rVWF。
[0019]在另外的方面并根據以上任一個，高分子量VWF多聚體組合物將至少20%的WF十聚體或更高級的多聚體在施用后維持至少3小時。
[0020]在另外的實施方案中并根據以上任一個，因子VIII半衰期延長約5小時。
[0021]在另外的實施方案中并根據以上任一個，因子VIII半衰期延長至少12小時。
[0022]在另外的實施方案中并根據以上任一個，因子VIII半衰期延長至少24小時。
[0023]在另外的實施方案中并根據以上任一個，因子VIII半衰期延長至少36小時。
[0024]在另外的實施方案中并根據以上任一個，因子VIII半衰期延長至少48小時。
[0025]在另外的實施方案中并根據以上任一個，其中因子VIII半衰期延長至少72小時。
[0026]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用給受試者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)與rVWF瑞斯托菌素輔因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在2:1與1:4之間。[0027]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用給受試者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)與rVWF瑞斯托菌素輔因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在3:2與1:3之間。
[0028]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用給受試者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)與rVWF瑞斯托菌素輔因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在1:1與1:2之間。
[0029]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用給受試者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)與rVWF瑞斯托菌素輔因子活性(IU rVWF:RCo)的23比率為約3:4。
[0030]在另外的實施方案中并根據以上任一個，rVWF具有約20-150mU/l.! g的比活性。
[0031]在另外的實施方案中并根據以上任一個，高分子量VWF多聚體組合物包含至少30%的VWF十聚體或更高級的多聚體。
[0032]在另外的實施方案中并根據以上任一個，高分子量VWF多聚體組合物包含至少40%的VWF十聚體或更高級的多聚體。
[0033]在另外的實施方案中并根據以上任一個，高分子量VWF多聚體組合物包含至少50%的VWF十聚體或更高級的多聚體。
[0034]在另外的實施方案中并根據以上任一個，高分子量VWF多聚體組合物包含至少60%的VWF十聚體或更高級的多聚體。
[0035]在另外的實施方案中并根據以上任一個，高分子量VWF多聚體組合物包含至少70%的VWF十聚體或更高級的多聚體。
[0036]在另外的方面并根據以上任一個，本發明提用于治療對其有需要的受試者中的甲型血友病或馮?威利布蘭德病的方法，該方法包括:向受試者施用重組馮?威利布蘭德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期與施用血漿源馮.威利布蘭德因子的受試者相比得以延長，其中:(a)rVWF具有比血漿源馮.威利布蘭德因子中更高的比活性，其中rVWF的比活性為約20-150mU/l.! g ;并且(b)FVIII半衰期是施用血漿源馮.威利布蘭德因子的受試者中的FVIII半衰期的至少約1.5倍。
[0037]在另外的方面并根據以上任一個，本發明提用于治療對其有需要的受試者中的甲型血友病或馮?威利布蘭德病的方法，該方法包括:向受試者施用重組馮?威利布蘭德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期與施用血漿源馮.威利布蘭德因子的受試者相比得以延長，其中:(a)rVWF是包含至少20%的VWF十聚體或更高級的多聚體的高分子量VWF多聚體組合物，(b)rVWF具有比血漿源馮.威利布蘭德因子中更高的比活性，其中rVWF的比活性為至少約20-150mU/y g ;并且(C)FVIII半衰期是施用血漿源馮.威利布蘭德因子的受試者中的FVIII半衰期的至少約1.5倍。
[0038]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用rVWF后24小時受試者血漿中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平為施用后I小時存在于血漿中的FVIII = C活性水平的至少90%。
[0039]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用后24小時受試者血漿中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平為施用后I小時存在于血漿中的FVIII = C活性水平的至少 100%ο
[0040]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用后36小時受試者血漿中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平為施用后I小時存在于血漿中的FVIII = C活性水平的至少 80%ο[0041]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用后48小時受試者血漿中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平為施用后I小時存在于血漿中的FVIII = C活性水平的至少 50%ο
[0042]在另外的實施方案中并根據以上任一個，更高級的rVWF多聚體在施用后穩定至少6小時。
[0043]在另外的實施方案中并根據以上任一個，更高級的rVWF多聚體在施用后穩定至少12小時。
[0044]在另外的實施方案中并根據以上任一個，更高級的rVWF多聚體在施用后穩定至少18小時。
[0045]在另外的實施方案中并根據以上任一個，更高級的rVWF多聚體在施用后穩定至少24小時。
[0046]在另外的實施方案中并根據以上任一個，更高級的rVWF多聚體在施用后穩定至少36小時。
[0047]在另外的實施方案中并根據以上任一個，更高級的rVWF多聚體在施用后穩定至少48小時。
[0048]在另外的實施方案中并根據以上任一個，更高級的rVWF多聚體在施用后穩定至少72小時。
[0049]在另外的方面并根據以上任一個，本發明提供用于治療對其有需要的受試者中的甲型血友病或馮?威利布蘭德 病的方法，該方法博包括:向受試者施用重組馮?威利布蘭德因子(rVWF)。
[0050]在另外的實施方案中并根據以上任一個，該方法包括向受試者共同施用重組因子VIII (rFVIII)和重組馮.威利布蘭德因子(rVWF)。
[0051]在另外的實施方案中并根據以上任一個，以單一組合物的形式一起施用rFVIII和 rVWF。
[0052]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用給受試者的rFVIII促凝血活性(IUrFVII1:C)與rVWF瑞斯托菌素輔因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在2:1與1:4之間。
[0053]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用給受試者的rFVIII促凝血活性(IUrFVII1:C)與rVWF瑞斯托菌素輔因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在3:2與1:3之間。
[0054]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用給受試者的rFVIII促凝血活性(IUrFVII1:C)與rVWF瑞斯托菌素輔因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在1:1與1:2之間。
[0055]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用給受試者的rFVIII促凝血活性(IUrFVII1:C)與rVWF瑞斯托菌素輔因子活性(IU rVWF:RCo)的比率為約3:4。
[0056]在另外的實施方案中并根據以上任一個，將rVWF通過用弗林蛋白酶處理而體外成熟。
[0057]在另外的實施方案中并根據以上任一個，將rVWF在哺乳動物細胞培養中表達。
[0058]在另外的實施方案中并根據以上任一個，將rFVIII在哺乳動物細胞培養中表達。
[0059]在另外的實施方案中并根據以上任一個，哺乳動物培養包括CHO細胞。
[0060]在另外的實施方案中并根據以上任一個，將rFVIII和rVWF在相同的培養中共表達。[0061]在另外的實施方案中并根據以上任一個，將rFVII I和rVWF共同純化。
[0062]在另外的實施方案中并根據以上任一個，將rFVIII和rVWF單獨純化。
[0063]在另外的實施方案中并根據以上任一個，將rFVIII/rVWF復合物在施用前復溶。
[0064]在另外的實施方案中并根據以上任一個，將rVWF在復溶rFVII I /rVWF復合物前用弗林蛋白酶處理。
[0065]在另外的實施方案中并根據以上任一個，將復溶的rFVIII/rVWF復合物用弗林蛋白酶處理。
[0066]在另外的實施方案中并根據以上任一個，弗林蛋白酶為重組弗林蛋白酶。
[0067]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者每天不超過一次施用rVWF。
[0068]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者每隔一天不超過一次施用rVWF。
[0069]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者每隔兩天不超過一次共同施用rVWF。
[0070]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者每隔三天不超過一次施用rVWF。
[0071]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者每劑施用1.5IU/kg FVIII = C至150IU/kg FVII1:C。
[0072]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者每劑施用10IU/kg FVIII = C至100IU/kg FVII1:C。
[0073]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者每劑施用25IU/kg FVIII = C至75IU/kg FVII1:C。
[0074]在另外的實施方案中并根據以上任一個，向受試者每劑施用40IU/kg FVIII = C至60IU/kg FVII1:C。
[0075]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用后24小時受試者血漿中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平為施用后I小時存在于血漿中的FVIII = C活性水平的至少 90%ο
[0076]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用后24小時受試者血漿中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平為施用后I小時存在于血漿中的FVIII = C活性水平的至少 100%ο
[0077]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用后36小時受試者血漿中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平為施用后I小時存在于血漿中的FVIII = C活性水平的至少 80%ο
[0078]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用后48小時受試者血漿中的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的水平為施用后I小時存在于血漿中的FVIII = C活性水平的至少 50%ο
[0079]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用給受試者的rVWF具有包含至少10%的VWF十聚體或更高級的多聚體的HMW VffF多聚體組成。
[0080]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用給受試者的rVWF具有包含至少20%的VWF十聚體或更高級的多聚體的HMW VffF多聚體組成。[0081]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用給受試者的rVWF具有包含至少30%的VWF十聚體或更高級的多聚體的HMW VffF多聚體組成。
[0082]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用給受試者的rVWF具有包含至少40%的VWF十聚體或更高級的多聚體的HMW VffF多聚體組成。
[0083]在另外的實施方案中并根據以上任一個，施用給受試者的rVWF具有包含至少50%的VWF十聚體或更高級的多聚體的HMW VffF多聚體組成。
[0084]在另外的實施方案中并根據以上任一個，更高級的rVWF多聚體在施用后在體外穩定至少3小時。
[0085]在另外的實施方案中并根據以上任一個，更高級的rVWF多聚體在施用后在體外穩定至少6小時。
[0086]在另外的實施方案中并根據以上任一個，其中更高級的rVWF多聚體在施用后在體外穩定至少12小時。
[0087]在另外的實施方案中并根據以上任一個，其中更高級的rVWF多聚體在施用后在體外穩定至少18小時。
[0088]在另外的實施方案中并根據以上任一個，更高級的rVWF多聚體在施用后在體外穩定至少24小時。
[0089]在另外的實施方案中并根據以上任一個，更高級的rVWF多聚體在施用后在體外穩定至少36小時。
[0090]在另外的實施方案中并根據以上任一個，其中更高級的rVWF多聚體在施用后在體外穩定至少48小時。
[0091]在另外的實施方案中并根據以上任一個，更高級的rVWF多聚體在施用后在體外穩定至少72小時。
[0092]在另外的實施方案中并根據以上任一個，內源性FVIII活性穩定至少12小時。
[0093]在另外的實施方案中并根據以上任一個，內源性FVIII活性穩定至少24小時。
[0094]在另外的實施方案中并根據以上任一個，內源性FVIII活性穩定至少36小時。
[0095]在另外的實施方案中并根據以上任一個，內源性FVIII活性穩定至少48小時。
[0096]在另外的實施方案中并根據以上任一個，內源性FVIII活性穩定至少72小時。
[0097]在另外的實施方案中并根據以上任一個，其中共同施用的rFVIII活性穩定至少12小時。
[0098]在另外的實施方案中并根據以上任一個，共同施用的rFVIII活性穩定至少24小時。
[0099]在另外的實施方案中并根據以上任一個，共同施用的rFVIII活性穩定至少36小時。
[0100]在另外的實施方案中并根據以上任一個，共同施用的rFVIII活性穩定至少48小時。
[0101]在另外的實施方案中并根據以上任一個，共同施用的rFVIII活性穩定至少72小時。
[0102]在另外的實施`方案中并根據以上任一個，共同施用的rFVIII活性通過延長rFVIII體內半衰期而穩定。[0103]在另外的實施方案中并根據以上任一個，FVIII半衰期與施用pdFVIII的患者相比延長至少約五小時。
[0104]在另外的實施方案中并根據以上任一個，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1%維持至少36小時。
[0105]在另外的實施方案中并根據以上任一個，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1%維持至少48小時。
[0106]在另外的實施方案中并根據以上任一個，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1%維持至少72小時。
[0107]在另外的實施方案中并根據以上任一個，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1%維持至少90小時。
[0108]在另外的實施方案中并根據以上任一個，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1%維持至少120小時。
[0109]在另外的實施方案中并根據以上任一個，在施用所述rFVIII的患者中，共同施用的rFVIII活性的至少1%維持至少168小時。
[0110]附圖簡述
[0111]圖1.評估單劑rVWF:rFVIII后的耐受性和安全性的研究設計示意圖。
[0112]圖2.藥代動力學數據。⑷提供rVWF/rFVIII和pdVWF/pdFVIII的PK數據。(B)提供關于暴露于ADAMTS13時高分子量rVWF的逐漸喪失的數據。
[0113]圖3.顯示 rVWF/rFVIII 和 p`dVWF/pdFVIII 的 FVIII PK 的藥代動力學數據。
[0114]圖4.匯總研究的患者人口統計資料的表格。
[0115]圖5.隊列4A的rVWF/rFVIII和pdVWF/pdFVIII治療的藥代動力學數據。
[0116]圖6.關于ADAMTS13對VWF多聚體的裂解的SDS-PAGE數據。
[0117]圖7.隊列4A的rVWF/rFVIII和pdVWF/pdFVIII治療的藥代動力學數據。
[0118]圖8.研究中的不良事件匯總。
[0119]圖9.研究中的rVWF PK參數數據。
[0120]圖10.得自患者I的rVWF PK數據。
[0121]圖11.得自患者2的rVWF PK數據。
[0122]圖12.得自患者3的rVWF PK數據。
[0123]圖13.患者1、2和3中rVWF PK的比較_ VWF參數和FVIII活性的比較。
[0124]圖14.研究所有隊列中的FVI11活性。
[0125]圖15.隊列2患者中的rVWF PK - VffF參數和FVIII活性的比較。
[0126]圖16.隊列2中患者的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的藥代動力學參數匯總。
[0127]圖17.隊列3所有患者中的rVWF PK - VffF和FVIII的血漿參數的比較。
[0128]圖18.隊列3中患者的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的藥代動力學參數匯總。
[0129]圖19.得自隊列4中的患者的數據。
[0130]圖20.隊列4A中患者的因子VIII促凝血活性(FVIII = C)的藥代動力學參數匯總。
[0131]圖21.比較共同施用的rVWF和rFVIII與Advate Pivotal的FVII1: C的藥代動力學數據。
[0132]圖22.接受共同施用的pdVWF/pdFVIII或rVWF/rFVIII的受試者的抗體匯總。【具體實施方式】
[0133]
[0134]本發明提供通過單獨地施用重組馮.威利布蘭德因子(rVWF)或將其與因子VIII(其可以為重組的或血漿源的)結合施用而治療受試者中的凝血疾病的組合物和方法。在一些方面，本發明的組合物和方法用于治療諸如馮.威利布蘭德病(VWD)或甲型血友病的凝血疾病。
[0135]在一個方面，施用給受試者的rVWF提供與因施用血漿源VWF產生的FVIII穩定性相比體內因子VIII (FVIII)活性的穩定性增強，從而允許比凝血疾病的傳統治療更低的治療劑量和/或頻率。FVIII活性的穩定性以及FVIII的水平升高可使用本領域已知的以及本文所述的方法測量，包括標準測定法，諸如一階段凝結測定法、顯色測定法和免疫測定法(參見例如 Lippi 等人,Blood Coagulation&FibrinoIysis, 2009, 20 (I): 1-3 和 Chandler 等Λ, Am J.Cl in.Pathol.，2003，120:34-39,它們每一者據此均以引用方式整體并入以用于所有目的，尤其是對于與FVIII水平和活性的測定法相關的所有教導而言)。如圖20中所示，平均FVIII半衰期通過rVWF相對于接受pdVWF的患者的半衰期延長5.2小時。圖2和7還顯示了與施用pdVWF的那些患者相比在施用rVWF的患者中FVIII活性的增加:圖2顯示了與施用PdVW的患者相比施用rVWF的患者的平均FVIII半衰期延長4.7小時，并且圖7中得自隊列4A的數據顯示了與施用pdVWF的患者相比施用rVWF的患者的FVIII半衰期延長5.3小時。此外，如圖21所示，與單獨接受FVIII (即Advate)的患者相比，在與rFVIII相結合接受rVWF的VWD患者中，血漿FVIII的半衰期延長12.27小時。
[0136]在又一個方面，rVWF的施用穩定內源性和/或共同施用的FVIII活性，結果是FVIII的體內半衰期和/或活性增加。在其中共同施用rVWF和FVI11的實施方案中，可以單一組合物的形式將rVWF和FVIII —起施用給受試者。在另外的實施方案中，rVWF和FVIII均不被水溶性聚合物修飾。在其他實施方中，rVWF或FVIII或兩者被水溶性聚合物修飾。如將會認識到，在其中與FVIII共同施用rVWF的實施方案中，FVIII可以為重組的或血漿源的。
[0137]在另外的方面并根據以上任一個，施用給受試者的rVWF為包含rVWF的十聚體或更高級的多聚體的高分子量多聚體組合物。如上所討論，使用本發明的rVWF組合物提供具有或不具有FVIII (重組的或血漿源的)的給藥(再次給藥)靈活性。在另外的實施方案中，施用給受試者的rVWF為包含至少20%的VWF十聚體或更高級的多聚體的高分子量VWF多聚體組合物。在具體的實施方案中，施用給受試者的rVWF不被水溶性聚合物修飾。
[0138]在另外其他方面，施用給受試者的rVWF具有比pdVWF更高的比活性。
[0139]在再一個方面，向受試者一周不超過兩次施用單獨的或與PdFVI 11或rFVI 11組合的 rVWF。
[0140]在還一個方面，將rVWF在施用給受試者前用弗林蛋白酶處理。在某些實施方案中，將rVWF用重組弗林蛋白酶處理。
[0141]在另外 的方面，用于本發明的rVWF根據本領域已知的并例如在2011年7月8日提交的US2012/0035110和2012年5月8日提交的美國專利8，173，597中所述的方法產生，這些專利的每一者據此以引用方式整體并入以用于所有目的，尤其是對于與rVWF組合物和產生這些組合物的方法相關的所有教導而言。
[0142]根據以上任一個，將單獨的或與FVIII組合的rVWF用于治療患有諸如VWD和甲型血友病的凝血疾病的患者。患有VWD的患者具有一定水平的FVIII，但該FVIII的穩定性通常低下，因為這些患者缺乏VWF15VWD患者的治療可在一些實施方案中涉及用rVWF和rFVIII兩者初始治療然后反復施用單獨的rVWF。在其他實施方中，初始治療可以通過單獨的rVWF進行，而后續反復施用通過rVWF和rFVIII兩者進行，或者初步和后續反復施用均可以包括rVWF和rFVIII兩者的共同施用。相似地，甲型血友病患者(缺乏FVIII)可接受rVWF和rFVI 11兩者的初始治療，而后續反復治療可包括施用單獨的rFVI 11或單獨的rVWF。在其他實施方中，初始治療可以為單獨的rFVIII，而后續反復治療涉及共同施用rVWF和rFVIII。
[0143]定義
[0144]如本文所用，“rVWF”是指重組VWF。
[0145]如本文所用，“rFVI 11 ”是指重組FVIII。
[0146]術語“重組”當關于例如細胞或核酸、蛋白或載體使用時表示該細胞、核酸、蛋白或載體已通過引入異源核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白而修飾，或表示該細胞衍生自如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達不存在于天然(非重組)形式的細胞內的基因，或表達原本異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。
[0147]如本文所用，〃重組VWF"包括通過重組DNA技術獲得的VWF。在某些實施方案中，本發明的VWF蛋白可包括例如如1986年10月23日公布的W01986/06096和1990年7月23日提交的美國專利申請序列號07/559，509 (以Ginsburg等人的名義)中制備的構建體，該專利關于產生重組VWF的 方法以引用方式并入本文。本發明中的VWF可包括所有潛在形式，包括單體和多聚形式。還應當理解，本發明涵蓋將以組合方式使用的不同形式的VWF。例如，本發明的VWF可包括不同的多聚體、不同的衍生物以及生物活性衍生物和非生物活性衍生物兩者。
[0148]在本發明的背景下，重組VWF涵蓋得自例如哺乳動物(諸如靈長類、人類、猴子、兔子、豬、哨齒類、小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠、犬科、貓科)的VWF家族的任何成員及其生物活性衍生物。還涵蓋具有活性的突變和變體VWF蛋白，VWF蛋白的功能片段和融合蛋白也一樣。此外，本發明的VWF可進一步包含有利于純化、檢測或兩者的標簽。本文所述的VWF可用治療性部分或適合體外或體內成像的部分進一步修飾。
[0149]如本文所用，〃血漿源VWF(pdVWF) 〃包括存在于血液中的所有形式的蛋白，包括具有在體內穩定(例如)至少一種FVIII分子的結合的特性的得自哺乳動物的成熟VWF。
[0150]術語“高度多聚VWF”或“高分子量VWF”是指包含至少10個亞單位或12、14或16個亞單位至約20、22、24或26個亞單位或更多個亞單位的VWF。術語“亞單位”是指VWF的單體。如本領域所已知，其通常為聚合形成更高級多聚體的VWF的二聚體。(參見Turecek等人，Semin.Thromb.Hemost.2010，36(5): 510-521，其據此以引用方式整體并入以用于所有目的，尤其是對于與VWF的多聚體分析相關的所有教導而言)。
[0151]如本文所用，術語〃因子VIir或"FVIII"是指具有凝血因子VIII的典型特征的任何形式的因子VIII分子，無論是患者內源性的、衍生自血漿的還是通過使用重組DNA技術而產生的，并包括因子VIII的所有修飾形式。因子VIII (FVIII)天然存在以及作為由單一基因產物而產生的多肽的異源分布而存在于治療性制劑中(參見例如Andersson等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 83:2979-2983 (1986))。包含因子 VIII 的治療性制劑的市售實例包括以商品名 HEMOFIL M、ADVATE 和 RECOMBINATE (可得自 Baxter HealthcareCorporation, Deerfield, 111., U.S.A.)銷售的那些。
[0152]如本文所用，“血漿FVIII活性”和“體內FVIII活性”可互換使用。使用標準測定法測量的體內FVIII活性可以是內源性FVIII活性、治療性施用的FVIII(重組的或血漿源)的活性或內源性與施用的FVIII活性兩者。相似地，“血漿FVIII”是指內源性FVIII或施用的重組或血漿源FVIII。
[0153]如本文所用，“馮.威利布蘭德病”是指一組由馮.威利布蘭德因子的缺陷所致的疾病。馮.威利布蘭德因子有助于血小板聚在一起并粘附到血管壁，這是正常凝血的必要條件。如在本文進一步詳細描述，存在多種類型的馮.威利布蘭德病。
[0154]如本文所用，術語“血友病”是指一組普遍以血液凝結或凝聚減弱為特征的病態。血友病可以指甲型、乙型或丙型血友病，或指所有三種疾病類型的復合形式。甲型血友病由因子VIII (FVIII)活性的降低或喪失所致，并為最主要的血友病亞型。乙型血友病由因子IX(FIX)凝結功能的喪失或減弱所致。丙型血友病是因子XI (FXI)凝結活性的喪失或降低的結果。甲型和乙型血友病是X染色體連鎖疾病，而丙型血友病為常染色體的。血友病的常見治療包括預防性和按需施用凝血因子，諸如fvii1、fix (包括Bebulin?-VH和fxi)以及FEIBA-VH、去氨加壓素，和血漿輸注。
[0155]術語“分離的”、“純化的”或“生物學上純的”是指實質上或基本上不含如在天然狀態中所見的通常與之相伴的組分的材料。純度和同質性通常使用諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜的分析化學技術測定。VWF是存在于實質上純化的制劑中的主要物質。術語“純化的”在一些實施方案中表示核酸或蛋白在電泳凝膠中產生基本上一條帶。在其他實施方中，意指核酸或蛋白的純度為至少50%，更優選地至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。在其他實施方中的“純化”意指從待純化的組合物中移除至少一種污染物。從這層意義上說，純化不需要純化后的化合物為均勻的，例如100%純的。
[0156]如本文所用，“施用”(和所有語法等同形式)包括向受試者靜脈內施用、肌內施用、皮下施用、經口施用、作為栓劑施用、局部接觸、腹膜內、病灶內或鼻內施用或植入緩釋裝置，例如微量滲透泵。施用通過任何途徑進行，包括腸胃外和經粘膜(例如經口、鼻腔、陰道、直腸或透皮)。腸胃外施用包括例如靜脈內、肌內、小動脈內、真皮內、皮下、腹膜內、心室內和顱內。其他遞送模式包括但不限于脂質體制劑、靜脈輸注、透皮貼片等。
[0157]術語“治療有效量或劑量”或“治療足夠量或劑量”或“有效或足夠量或劑量”是指產生為施用對象產生治療效果的劑量。例如，可用于治療血友病的藥物的治療有效量可以是能夠預防或緩解與血友病相關的一種或多種癥狀的量。精確劑量將取決于治療目的，并將能由本領域的技術人員使用已知的技術確定(參見例如Lieberman, PharmaceuticalDosage Forms (vols.1~3, 1992) ；Lloyd, The Art,Science and Technology ofPharmaceutical Compounding(1999) ；Pickar,Dosage Calculations(1999)和Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams&Wilkins)。
[0158]如本文所用，術語“患者”和“受試者”可互換使用并指患有疾病或可能感染疾病的哺乳動物(優選人)。
[0159]如本文所用，術語“約”表示指定值加或減10%的大致范圍。例如，用語“約20%”涵蓋18-22%的范圍。
[0160]如本文所用，術語“半衰期”是指物質的量衰減(或從樣品或從患者中清除)到一半所需的時間周期。
[0161]本發明的組合物
[0162]本發明利用包含重組馮.威利布蘭德因子(rVWF)的組合物治療凝血疾病，諸如VWD和甲型血友病。在一些實施方案中，本發明利用與因子VIII (FVIII)相結合的rVWF。共同施用的FVIII可以為重組(rFVIII)或血漿源(pdFVIII)。在優選的方面，本發明的組合物使體內因子VIII活性(在本文也稱為血漿因子VIII活性)穩定，使得因子VIII的體內半衰期與未施用rVWF或施用pdVWF的受試者中的體內半衰期相比得以延長。測量rVWF使FVIII活性穩定的程度(包括FVIII半衰期的延長)可使用本領域已知的方法進行。FVIII活性的水平可通過例如一階段凝結測定法、顯色測定法和免疫測定法測量(參見例如Lippi等人,Blood Coagulation&FibrinoIysis, 2009, 20 (I): 1-3, European Pharmacopoeia (Ph.Eur., 3rd Ed.1997:2.7.4)和 Chandler 等人，Am J.Clin.Pathol.，2003，120:34-39，它們每一者據此均以引用方式整體并入以用于所有目的，尤其是對于與FVIII水平和活性的測定法相關的所有教導而言)。[0163]在某些實施方案中，本發明的VWF蛋白可包括例如如1986年10月23日公布的W01986/06096和1990年7月23日提交的美國專利申請序列號07/559，509 (以Ginsburg等人的名義)中制備的構建體，該專利關于產生重組VWF的方法以引用方式并入本文。可用于本發明的VWF包括所有潛在形式，包括單體和多聚形式。一種尤其有用的VWF形式為至少兩種VWF的同源多聚體。VWF蛋白可以為生物活性衍生物，或在僅將用作FVIII的穩定劑時，VWF可以為非生物活性形式。還應當理解，本發明涵蓋將以組合方式使用的不同形式的VWF。例如，可用于本發明的組合物可包括不同的多聚體、不同的衍生物以及生物活性衍生物和非生物活性衍生物兩者。
[0164]在初期止血中，VWF起到作為血小板與細胞外基質特定組分(諸如膠原)之間的橋聯的作用。在此過程中VWF的生物活性可通過不同的體外測定法測量(Turecek等人，Semin.Thromb.Hemost.28:149-160, 2002)。瑞斯托菌素輔因子測定法基于在存在VWF的情況下由抗生素瑞斯托菌素誘導的新鮮或甲醛固定血小板的凝集。血小板凝集程度取決于VWF濃度,并可通過比池法測量,例如通過使用凝集計(Weiss等人，J.Clin.1nvest.52:2708-2716，1973;Macfarlane 等人，Thromb.Diath.Haemorrh.34:306-308，1975)。第二種方法是膠原結合測定法，這種方法基于ELISA技術(Brown et Bosak, Thromb.Res.43:303-311，1986;Favaloro, Thromb.Haemost.83:127-135，2000)。將微量滴定板包被上 I 型或 III型膠原。然后，使VWF結合到膠原表面，然后用酶標記的多克隆抗體檢測。最后一步是底物反應，其可通過ELISA酶標儀以光度學監測。如本文所提供，本發明的VWF(VWF:RCo)的瑞斯托菌素輔因子比活性通常以mU/ μ g VffF描述，如使用體外測定法測量。
[0165]本發明的rVWF組合物相對于pdVWF的優勢在于rVWF表現出比pdVWF高的比活性。在一些實施方案中，本發明的rVWF具有至少約20,22.5,25,27.5,30,32.5,35,37.5、40、42.5,45,47.5,50,52.5,55,57.5,60,62.5,65,67.5,70,72.5,75,77.5,80,82.5,85,87.5、90、92.5、95、97.5、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150mU/u g 或更高的比活
性。在一個實施方案中，用于本文所述的方法的rVWF具有20πιυ/μ g至150mU/u g的比活性。在另一個實施方案中，VWF具有30mU/ug至120mU/ug的比活性。在另一個實施方案中，rVWF具有40πιυ/μ g至90πιυ/μ g的比活性。在再一個實施方案中，rVWF具有選自存在于表1中的變型I至133的比活性。
[0166]表1.存在于組合物中的并用于本文提供的方法的rVWF的比活性的示例性實施方案。
[0167] (mil/ μ g)(mil/ μ g)(mil/ μ g)(mil/ μ g)
20Var.1 Τ?0Var.35~ 40-150~ Var.68~ 70-120~ Var.101
22.5Var.2 Π5Var.36~ 40-140~ Var.69~ 70-110~ Var.102
25Var.3 120Var.37~ 40-130~ Var.70~ 70-100~ Var.103
27.5Var.4 125Var.38~ 40-120~ Var.71 ~ 70-90 Var.104
30Var.5 130Var.39~ 40-110~ Var.72~ 70-80 Var.105
32.5Var.6 HEVar.40~ 40-100~ Var.73~ 80-150~ Var.106
35Var.7 HOVar.41 ~ 40-90 Var.74~ 80-140~ Var.107
37.5Var.8 145Var.42~ 40-80 Var.75~ 80-130~ Var.108
40Var.9 ΤδΟVar.43~ 40-70 Var.76~ 80-120~ Var.109
42.5Var.10~ 20-150~ Var.44~ 40-60 Var.77~ 80-110~ Var.110
45Var.11 ~ 20-140~ Var.45~ 40-50 Var.78~ 80-100~ Var.111
47.5Var.12~ 20-130~ Var.46~ 50-150~ Var.79~ 80-90 Var.112
[0168]
50IVar.13~120-120 IVar.47~150-140~IVar.80~190-150~IVar.113
52.5Var.14~ 20-110~ Var.48~ 50-130~ Var.81 ~ 90-140~ Var.114
55Var.15~ 20-100~ Var.49~ 50-120~ Var.82~ 90-130~ Var.115
57.5Var.16~ 20-90 Var.50~ 50-110~ Var.83~ 90-120~ Var.116
60Var.17~ 20-80 Var.51 ~ 50-100~ Var.84~ 90-110~ Var.117
【權利要求】
1.一種用于治療對其有需要的受試者中的馮?威利布蘭德病或甲型血友病的方法，所述方法包括: 向所述受試者施用重組馮.威利布蘭德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期與施用血漿源馮?威利布蘭德因子的受試者相比得以延長，其中所述rVWF為高分子量VWF多聚體組合物，其包含至少20%的VWF十聚體或更高級的多聚體，并且其中所述rVWF具有比血漿源馮.威利布蘭德因子更高的比活性。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法包括向所述受試者共同施用重組馮.威利布蘭德因子(rVWF)和重組因子VIII(rFVIII)。
3.根據權利要求2所述的方法，其中以單一組合物的形式一起施用所述rVWF和rFVIIL.
4.根據權利要求1至3任一項所述的方法，其中向所述受試者每劑施用1.0IU/kgVWF:RCo 至 150IU/kg VffFiRCo0
5.根據權利要求4所述的方法，其中向所述受試者每劑施用2IU/kgVWF = RCo至50IU/kg VffF:RCo ο
6.根據權利要求4所述的方法，其中向所述受試者每劑施用5IU/kgVWF = RCo至40IU/kg VffF:RCo ο
7.根據權利要求4所述的方法，其中向所述受試者每劑施用10IU/kgVWF = RCo至20IU/kg VffF:RCo ο
8.根據權利要求1至7任一項所述的方法，其中將所述rVWF通過用弗林蛋白酶處理而體外成熟。
9.根據權利要求1-8任一項所述的方法，其中所述rVWF通過在中國倉鼠卵巢中表達(CHO細胞培養)而產生。
10.根據權利要求1-9所述的方法，其中所述rFVIII和rVWF通過在相同的細胞培養中表達而產生。
11.根據權利要求1-10任一項所述的方法，其中向所述受試者每隔一天不超過一次施用 rVWF。
12.根據權利要求11所述的方法，其中向所述受試者一周不超過兩次施用rVWF。
13.根據權利要求1至12任一項所述的方法，其中所述高分子量VWF多聚體組合物將至少20%的VWF十聚體或更高級的多聚體在施用后維持至少3小時。
14.根據權利要求1至13任一項所述的方法，其中因子VIII半衰期延長至少5小時。
15.根據權利要求14所述的方法，其中因子VIII半衰期延長至少12小時。
16.根據權利要求14所述的方法，其中因子VIII半衰期延長至少24小時。
17.根據權利要求14所述的方法，其中因子VIII半衰期延長至少36小時。
18.根據權利要求14所述的方法，其中因子VIII半衰期延長至少48或72小時。
19.根據權利要求2-18所述的方法，其中施用給所述受試者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)與rVWF瑞斯托菌素輔因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在2:1與1:4之間。
20.根據權利要求19所述的方法，其中施用給所述受試者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)與rVWF瑞斯托菌素輔因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在3:2與1:3之間。
21.根據權利要求19所述的方法，其中施用給所述受試者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)與rVWF瑞斯托菌素輔因子活性(IU rVWF:RCo)的比率在1:1與1:2之間。
22.根據權利要求19所述的方法，其中施用給所述受試者的FVIII促凝血活性(IUFVIIIiC)與rVWF瑞斯托菌素輔因子活性(IU rVWF:RCo)的比率為約3:4。
23.根據權利要求1-22所述的方法，其中所述rVWF具有約20_150mU/yg的比活性。
24.根據權利要求1-23所述的方法，其中所述高分子量VWF多聚體組合物包含至少30%的VWF十聚體或更高級的多聚體。
25.根據權利要求1-24所述的方法，其中所述高分子量VWF多聚體組合物包含至少40%的VWF十聚體或更高級的多聚體。
26.根據權利要求1-25所述的方法，其中所述高分子量VWF多聚體組合物包含至少50%的VWF十聚體或更高級的多聚體。
27.根據權利要求1-26所述的方法，其中所述高分子量VWF多聚體組合物包含至少60%的VWF十聚體或更高級的多聚體。
28.根據權利要求1-27所述的方法，其中所述高分子量VWF多聚體組合物包含至少70%的VWF十聚體或更高級的多聚體。
29.一種用于治療對其有需要的受試者中的甲型血友病或馮.威利布蘭德病的方法，所述方法包括: 向所述受試者施用重組馮?威利布蘭德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期與施用血漿源馮.威利布蘭德因子的受試者相比得以延長，其中: (a)所述rVWF具有比血漿源馮?威利布蘭德因子更高的比活性，其中rVWF的比活性為約 20-150mU/y g ;并且 (b)FVI11半衰期為施用血漿源馮?威利布蘭德因子的受試者中的FVIII半衰期的至少1.5 倍。
30.一種用于治療對其有需要的受試者中的甲型血友病或馮.威利布蘭德病的方法，所述方法包括: 向所述受試者施用重組馮?威利布蘭德因子(rVWF)，使得因子VIII半衰期與施用血漿源馮.威利布蘭德因子的受試者相比得以延長，其中: (a)所述rVWF為包含至少20%的VWF十聚體或更高級的多聚體的高分子量VWF多聚體組合物， (b)所述rVWF具有比血漿源馮?威利布蘭德因子更高的比活性，其中rVWF的比活性為至少約20-150mU/y g ;并且(C)FVIII半衰期為施用血漿源馮?威利布蘭德因子的受試者中的FVIII半衰期的至少1.5 倍。
31.根據權利要求1-30的方法，其中所述方法為用于治療馮.威利布蘭德病3型的方法。
【文檔編號】A61P7/04GK103732244SQ201280038870
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年6月11日 優先權日:2011年6月10日
【發明者】F·沙伊芙林格, P·圖雷切克, B·埃文斯汀, Y·W·王, M·T·休特 申請人:巴克斯特國際公司, 巴克斯特保健股份有限公司