傷口噴劑的制作方法

傷口噴劑的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種組合物，其含有：血紅蛋白或肌紅蛋白和至少一種其他成分，其中在至少40%的所述血紅蛋白或肌紅蛋白中，氧結合位點帶有非-O2配體；本發明還涉及制備所述組合物的方法以及帶有非氧配體的血紅蛋白或肌紅蛋白用于傷口的外部治療的用途。
【專利說明】傷口噴劑
[0001]本發明涉及一種組合物，包含血紅蛋白或肌紅蛋白和至少一種其他成分，其中在至少40%的所述血紅蛋白或肌紅蛋白中，氧結合位點帶有非-O2配體；還涉及制備所述組合物的方法以及帶有非氧氣配體的血紅蛋白或肌紅蛋白在傷口外部治療中的用途。
[0002]根據傷口的狀況，使用不同的方法來治療傷口。首先，應優選地對仍然開放的傷口消毒，由此使其免受外部的不良影響。這可通過合適的消毒溶液或噴涂繃帶，或施用碘溶液來完成。然后必須從內部進行傷口的實際愈合。這意味著仍處于合適位置的血管必須為破壞的組織提供足夠量的基質，以使得組織修復機制能夠啟動。
[0003]傷口可由各種因素引起，例如損傷或術后或創傷事件。
[0004]另一方面，已知疾病也會引發傷口，尤其是慢性創面的形成，其中會發生大血管和/或小血管的退化和/或收縮。這可能是例如高齡患者長期臥床的結果(褥瘡)，或者是糖尿病的結果，糖尿病會導致大血管和小血管的退化和動脈硬化(動脈的大血管病變或小血管病變)(P.Carpenter, A.Franco, Atlas der Kapillaroskopie [Atlas of Capillaroscopy], 1983，Abbott, Max-Planck-1nst.2，D-Wiesbaden)。也表現為創傷區域內存在缺氧(低氧)現象。40mmHg 被認為是臨界值(C.D.Miiller et al., Hartmann Wund[Wound]Foruml (1999), 17-25)。
[0005]血液通過動脈流向包括皮膚的組織,并為細胞供應生命所需的基質。任何的血管退化都會導致細胞基質供應不足，從而導致其死亡。基質通過擴散從最小的血管(毛細管)到達細胞必須經過最后的看起來微不足道的約20 μ m的間隙；在這一點上，由于機體難以操縱該基質，因此氧氣起到 了特殊的作用。
[0006]存在以下三個主要問題:
[0007](I)確實，氧氣是生命必不可少的(人類在他/她的腦不接受氧氣僅約5分鐘后便會腦死亡)，但同時氧氣也是高毒性的(接受純氧呼吸治療的新生兒將在僅幾天后死亡)。
[0008](2)氧氣在水介質中的溶解性非常小。根據菲克第一定律，這會導致氧氣的擴散率較低。另外，擴散的基本定律，即斯莫魯霍夫斯基與愛因斯坦定律(SMOLUCHOWSKI’s andEINSTEIN’S law)，表明(氧氣的)擴散速度隨著擴散距離的增大而減小。由于氧氣的擴散常數很低，使得擴散距離僅為20 μ m時，擴散速度僅為初始值的5%。例如50 μ m的水層對于細胞而言代表著幾乎完全隔絕氧氣。氧氣在機體中隨血流并以與血紅蛋白結合的方式沿很長的路徑從肺運輸到趾尖，并且只有通過這種方式才能夠以適合機體的方式克服長距離運輸的缺陷。
[0009](3)與葡萄糖相反，例如體內并沒有用于氧氣的存儲區，因此細胞必須隨時且快速地獲得足夠量的這種基質；氧氣是所謂的生命必需的直接的基質。
[0010]完整的機體已利用數個機制解決了這些問題。氧氣在運輸期間與血紅蛋白結合的方式可以避免氧氣的毒性作用，并因此保持無害。同時，稀釋游離氧，并因此進一步喪失有害的氧化潛力。然而，由于與血紅蛋白的結合是可逆的，可以即刻獲得足量的氧氣。低擴散范圍的問題的解決是由于機體已經進化出非常精細的支血管網(毛細血管網)，其確保每個細胞與毛細血管的平均距離為至多25 μ m ;以這種方式，氧氣在機體內的擴散路徑會保持小于50μπι的臨界長度。此外，氧氣可以從數個方面以擴散的方式供應給細胞；這表現為安全機制。可通過血管流的血管調節，根據需求(過量的可用氧氣是不允許的，否則將有不良影響)實現機體內的即時獲取，這控制了灌流并由此優化氧氣的供應。
[0011]如果創面是開放性的，將會中斷細胞的氧氣供應。來自外部空氣的氧氣供應是貧乏的，因為(組織)細胞層上鋪有水液膜，如前所述，該層膜形成了氧氣擴散的屏障。如果來自下面的氧氣，換言之來自體內的氧氣的供應是充足的，那么正常組織的新傷口會在幾天后愈合。然而，動物實驗顯示，若增加周圍空氣中氧氣濃度，新傷口的愈合甚至會更好。已知較久的傷口特別是慢性傷口，由于缺少氧氣，它們的愈合是非常緩慢的。
[0012]為了更好地治愈慢性傷口，已經使用所謂的高壓氧療法(HBO)。在這種治療中，將患者放置于加壓室內，使他們經受一段時間的約3bar的純氧的超壓(C.D.MUller etal., Hartmann Wund Foruml (1999)，17-25)。實際上,通過該方法可以加快傷口的愈合。然而，效果會隨著治療次數而降低。
[0013]美國專利N0.2，527，210描述了一種血紅蛋白溶液，據稱其可以通過靜脈注射和外用如噴霧的方式用于治療傷口。在其說明書中，血紅蛋白是通過使新鮮的紅細胞在經過離心分離和脫去血清部分后對其進行冷凍休克(freezing shock)來獲得。這會導致細胞溶解，并釋放出血紅蛋白。破碎的細胞壁也會存在于產品中。該制劑是濃縮的細胞碎屑(細胞碎片)。以這種方法，應在已加入5%的硫化鈉后例如用碘溶液來實現抗菌的覆蓋效果。換言之，傷口幾乎是閉合的。這里并未提及氧氣的運輸。
[0014]W097/15313描述了血紅蛋白用于改善傷口愈合的治療用途。為此目的，將不含間質(stroma)和熱原質的血紅蛋白通過靜脈注射施用于患者，特別是在手術和創傷事件后施用，以升高血壓。 為此目的，特別使用了與聯阿司匹靈(diaspirin)交聯的血紅蛋白。
[0015]W02003/077941教導了用含分離的和可選的交聯的血紅蛋白的血紅蛋白溶液來治療開放性傷口。用來自豬血的血紅蛋白來配制新鮮的所述溶液，并將其施用于慢性傷口。
[0016]在制備和儲存基于血紅蛋白和肌紅蛋白的氧載體期間，它們可能會部分或完全地喪失其功能。為防止這種情況發生，需要穩定氧載體，以使它們保持可用性且能夠運輸氧氣。
[0017]通常，有不同的方法來制備人工氧載體；其中一種方法是制備合適的天然或化學修飾的血紅蛋白溶液(參見“Issues from Vth International Symposium onBlood Substitutes, San Diego,Calif.，USA, Marchl993”，Artificial Cells, BloodSubstitutes, and Immobilization Biotechnology22 (1994), vol.2-vol.4) ? 將這些藥物制劑作為人工氧載體使用時的一個問題是，它們通過自氧化(spontaneous oxidation)逐漸失活而形成高鐵血紅蛋白，其不再能運輸氧氣。這通常發生在生產者制備期間以及后續的儲存期間。
[0018]已描述了用于解決該問題的幾種方法。嘗試使血紅蛋白的氧化程度最小，或使氧化的血紅蛋白還原回去。
[0019]防止自氧化的一種可能是使血紅蛋白脫氧(即從制劑中完全去除氧)，因為相比氧合血紅蛋白，脫氧血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白會慢得多。
[0020]此外，通過在可能的最低溫度(對于水溶液在約4°C下)下儲存和/或制備有可能
使氧化量最小。[0021]另外，血紅蛋白的氧化率取決于氫離子濃度，即pH。例如，對于天然的人類血紅蛋白，處于PH7.5-9.5的區間時達到最低。
[0022]而且，加入某些醇可降低血紅蛋白的氧化。它們中的一些甚至在低濃度下起作用。這些醇類的毒性是一個問題。
[0023]某些金屬離子((:112+，？63+等)會催化血紅蛋白的自氧化。盡管EDTA本身會促進血紅蛋白的自氧化，但可通過將所述金屬離子與EDTA絡合而使其失效。
[0024]可進一步通過加入還原性物質來實現使人工氧載體免受氧化。在某些情況下，它們甚至會引發氧合血紅蛋白的再活化。
[0025]EP0857733描述了可通過將配體、特別是一氧化碳結合至氧結合位點來穩定血紅蛋白。據發現，這種羰基血紅蛋白可用于機體而不必脫去配體，且其作為血流內的氧載體是合適的。
[0026]本發明的目的是，提供一種用于傷口外部治療的產品，其加快傷口愈合，使用方便且可以儲存。
[0027]根據本發明，通過一種組合物，所述組合物包含:
[0028](a)氧載體，優選血紅蛋白或肌紅蛋白，其中在至少40%的所述氧載體中，氧結合位點帶有非-O2配體，以及
[0029](b)至少一種其他成分，其選自電解質防腐劑、穩定劑、抗絮凝劑、抗凝劑、pH緩沖劑、溶劑、抗氧化劑、 成膜劑和交聯劑，
[0030]和氧載體、優選在其氧結合位點上帶有非O2配體的血紅蛋白或肌紅蛋白在制備用于傷口外部治療的藥劑或組合物中的用途，而實現了該目的。
[0031]根據本發明，優選使用自然(天然)的氧載體，優選血紅蛋白或肌紅蛋白或其修飾衍生物或其混合物。人類或動物來源、特別是馬、牛或優選豬來源的血紅蛋白或肌紅蛋白，特別適用于本發明。如下所述，天然或修飾的人類或豬的血紅蛋白特別優選作為氧載體。氧載體可以從人類或動物的血液新鮮分離，或者可以人工制備。
[0032]也可以使用天然和修飾的氧載體的混合物，例如重量比為20:1-1:20。進一步，可以以前述的20:1-1:20的比例使用血紅蛋白和肌紅蛋白或它們的修飾衍生物。
[0033]在另一實施方案中，可以修飾所述氧載體。所述修飾可以是分子內交聯、聚合反應(分子間交聯)、聚乙二醇化(與聚環氧烷共價連接)、用化學反應性效應子如吡哆醛_5’ -磷酸酯或2-去甲-2-甲酰基-吡哆醛-5’ -磷酸酯進行的修飾，或用氧鍵合的化學非反應性效應子如2，3- 二磷酸甘油酸酯、肌醇六磷酸酯、肌醇六硫酸酯或苯六甲酸進行的修飾或它們的組合。這類修飾是公知的，并描述于例如DE-A10031744、DE-A10031742和DE-A10031740。氧載體的交聯也描述于 DE1970137、EP971000790、DE4418937、DE3841105、DE3714351、DE3576651。
[0034]修飾的氧載體的實例有分子量為65000至15000000的血紅蛋白，例如根據W097/15313的分子內交聯的分子，特別是聚合物產物，以及平均分子量為80000g/mol至10000000g/mol，特別是100000g/mol至5000000g/mol的分子間交聯的產物，或者類似產生的分子量為16000至5000000，特別是100000至3000000，優選1000000g/mol的肌紅蛋白。可以使用聚合的這些氧載體，例如通過使用對于分子間修飾公知的交聯劑來聚合，例如雙功能交聯劑，如雙環氧丁二烯(butadiene diepoxy)、二乙烯砜、二異氰酸酯、特別是六亞甲基二異氰酸酯、環己基二異氰酸酯和2，5- 二異氰酰苯基磺酸(2，5-bisisocyanatobenzolsulfonic acid)、二-N-羥基琥拍酰亞胺酯、二酰亞胺酯(diimidoester)或二醒,特別是起類似作用的乙二醛、乙二醇醛，或戊二醛。
[0035]此外，可以使用以這種方法聚合的且用聚乙二醇或其合適的衍生物聚乙二醇化的產物。這包括例如聚環氧乙烷、聚環氧丙烷或環氧乙烷與環氧丙烷的共聚物，或其酯、醚或酯酰胺。摩爾質量為200-5000g/mol的共價連接的聚環氧燒會是適合的。
[0036]對于聚環氧烷的共價連接，包含已與官能團共價結合的連接劑，從而允許與血紅蛋白的氨基、醇基、或巰基直接發生化學反應，形成聚環氧烷共價鍵的聚環氧烷的那些衍生物會是合適的，例如具有反應性N-羥基琥珀酰亞胺酯、環氧(縮水甘油醚)、醛、異氰酸酯、乙烯砜、碘乙酰胺、咪唑甲酸酯、三氟乙磺酸酯基(tresylate groups)和其他基團的聚環氧烷。許多這樣的單官能活化的聚乙二醇是市售的。
[0037]若使用修飾的氧載體，應優選修飾的交聯(分子內或分子間)或交聯的且聚乙二醇化的平均分子量為250000g/mol至750000g/mol的血紅蛋白產物，或平均分子量為50000g/mol至750000g/mol的肌紅蛋白產物。
[0038]根據特別優選的實施方案，使用新鮮分離的人或動物來源、特別是豬來源的血紅蛋白或肌紅蛋白來制備本發明的組合物。
[0039]根據本發明，氧載體的至少40%的氧結合位點帶有非O2配體。優選至少50%，優選至少60%，更優選至少70%，甚至更優選至少80%，特別優選至少90%或95%的血紅蛋白或肌紅蛋白以攜帶有配體的形式提供。在載體的分離過程中或其進一步純化后，可能已使用了這種攜帶，然而，特別優選的是，以受保護的形式進行氧載體的分離，這意味著在分離或純化過程中，配體被提供到/接觸氧載體。
[0040]非O2配體優選一氧化碳(CO)或一氧化氮(NO)或其混合物。這兩種配體對血紅蛋白/肌紅蛋白的O2結合位點都具有高親和力，并用作防止血紅素的中心Fe3+離子氧化的保護劑。
[0041]優選將帶有配體的氧載體溶解在水性或有機介質中，其中優選水溶液，以0.1-35重量％、優選0.1-20重量％、更優選0.1-15重量％以備應用。
[0042]本發明的組合物進一步包含至少一種其他添加劑，優選選自電解質、穩定劑、抗絮凝劑、防腐劑、PH緩沖劑、溶劑、抗氧化劑和成膜劑，更優選選自電解質、穩定劑、抗絮凝劑、防腐劑和PH緩沖劑。最優選的組合物是溶液的形式，并至少包含電解質和任選地包含穩定劑。
[0043]該溶液可包含適當或期望量的生理相容電解質如鹽。電解質可以以0.l_30wt%，優選0.l-10wt%的量存在，但優選各自以生理濃度存在。優選地，所述組合物包含前述量的鹽，如 NaCl、KCl、NH4C1、CaCO3、Na2CO3' K2CO3> MgSO4' Na2SO4' CaCl2' MgCl2、檸檬酸鈉、乳酸鈉或前述的混合物或類似物，但不限于此。最優選的鹽是NaCl，特別是濃度為0.9%(等滲溶液)的NaCl。
[0044]根據本發明，特別優選的是，所述組合物包含充當蛋白質、特別是血紅蛋白/肌紅蛋白的穩定劑和/或抗絮凝劑的化合物，如N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、N-乙酰甲硫氨酸、甲硫氨酸、非離液鹽(no n-chaotropic salts)、多元醇、類糖物質,優選二糖，以及氨基酸，優選各自的量為0.001wt%-20wt%o[0045]其中可使用的多元醇優選為低分子量多元醇，但是也可使用聚合的衍生物。這樣的多元醇包括乙二醇、丙三醇、赤蘚糖醇及甘露糖醇。可使用的環狀多元醇包括一個或多個脂環族環，并可具有至少一個側鏈。優選的多元醇包括二糖和糖醇，例如乳糖醇、山梨糖醇和肌醇。優選含2至10個羥基基團的化合物。多元醇的量優選可以在0.001-20%w/v的范圍內，更優選l_15%w/v,最優選2-10%w/v。
[0046]進一步地，蛋白質穩定劑的添加劑可以選自式I的三(羥甲基)甲基化合物；
[0047](HOCH2)3C-R (1)，
[0048]其中R 是:C「C4 烷基、取代的 C1-C4 烷基、NH2、NHC (CH2OH) 3、C1-C4 羥烷基;C「C4 烷基羧酸酯、NR1R2 (式中R1和R2可獨立地是=IC1-C4烷基、C1-C4烷基磺酸酯、C1-C4羥烷基磺酸酯)。式(I)化合物的優選實例包括:三(羥甲基)乙烷；1，1’，’-三(羥甲基)丙烷；三(羥甲基)氨基甲烷或其鹽，如氯化物、馬來酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽；1，3_雙[三(羥甲基)甲氨基]丙烷；雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷；N[三(羥甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸酯；N[三(羥甲基)甲基]-3-氨基丙烷磺酸酯；N[三(羥甲基)甲基]-3-氨基-2-羥基丙烷磺酸酯；N[三(羥甲基)甲基]甘氨酸。該化合物也可優選以0.001-20%w/ν的范圍加入,更優選l_15%w/v,最優選2-10%w/v。
[0049]進一步，蛋白質穩定劑的添加劑可以選自聚合電解質。聚合電解質可以是陽離子或陰離子聚合電解質。也可使用兩性聚合電解質。陽離子聚合電解質優選具有沿分子鏈分布的陽離子基團的聚合物。
[0050]陽離子基團，優選季銨衍生的官能團，可以排列在從鏈垂下的側基上，或者與其結合。陽離子聚合電解質的實例包括:乙烯基吡咯烷酮和季甲基丙烯酸甲酯(quaternary methylmethacrylate)的共聚物，例如由 ISP 獲得的 Gafquat 系列(755N,734，HS-100);取代的聚丙烯酰胺；聚乙烯亞胺，聚丙烯亞胺及取代的衍生物；多胺均聚物(Golchem CLl 18);多胺共聚物(例如表氯醇和單甲胺或二甲胺的縮合物)；聚二甲基二烯丙基氯化銨(polyDADMAC);取代的葡聚糖；修飾的瓜爾膠(用羥丙基三甲基氯化銨(hydroxypropytrimonium chloride)取代)；取代的蛋白質(例如在大豆蛋白和水解膠原質上取代的四價基團)；聚氨基酸(例如聚賴氨酸)；低分子量聚氨基化合物(例如精胺和亞精胺)。可以使用天然或人工聚合物。
[0051]可以使用MW為150到5000000、優選5000到500000、更優選5000到100000的陽
離子聚合電解質。優選0.01-10%w/v的量,更優選0.l_2%w/v,特別是0.05_5%w/v。
[0052]陰離子聚合電解質優選為具有沿分子鏈分布的陰離子基團的聚合物。包含羧酸鹽、磺酸鹽、硫酸鹽或其它帶負電荷的可電離類陰離子基團，可以排列在從鏈垂下的基團上，或者直接結合在聚合物主鏈上。可以使用天然或人工的聚合物。
[0053]陰離子聚合電解質的實例包括:Gantrez (Sseries, AN-series);褐藻酸及鹽；羧甲基纖維素及鹽；取代的聚丙烯酰胺(例如用羧酸基取代的聚丙烯酰胺)；聚丙烯酸及鹽；聚苯乙烯磺酸及鹽；葡聚糖硫酸鹽；取代的糖類,如鹿糖辛硫酸鹽(octosulphate);肝磷月旨。可以使用MW為150-5000000、優選5000-500000、更優選5000-100000的陰離子聚合電解質。優選0.01%-10%w/v的量，特別是0.05%-5%w/v,更特別是0.1%_2%w/v。
[0054]特別優選的穩定劑是N-乙酰半胱氨酸，以0-10%優選0.01-5%的量使用。
[0055]進一步地，組合物可包含任何防腐劑，如苯氧基乙醇、異噻唑啉、山梨酸或本領域技術人員已知的任何其它合適的防腐劑。
[0056]組合物可進一步優選地包含任何緩沖劑。可使用所有公知的緩沖劑，如Tris/HCl、K2HP04/KH2P04、Na2HP04/NaH2P04、MOPS (3- (N-嗎啉)丙磺酸)、HEPES (4-2-羥基乙基-1-哌嗪乙磺酸)，TAPS(3-{[三(羥甲基)甲基]氨基}丙磺酸)、N-二甘氨酸N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸)、三甲基甘氨酸N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)、TES(2-{[三(羥甲基)甲基]氨基}乙磺酸)、PIPES (哌嗪-N，N’ -雙(2-乙磺酸))、SSC (檸檬酸鈉鹽)、MES (2- (N-嗎啉)乙磺酸)，但不限于此。
[0057]本發明組合物中的合適溶劑優選為水或水溶液、有機溶劑如醇，優選乙醇或聚乙二醇(PEG)。也可使用所述溶劑的混合物。進一步地，天然油可用作一些成分的溶劑，組合物可作為乳液提供。特別優選的溶劑是水或水溶液。
[0058]用于本發明的組合物的抗氧化劑可以是例如維生素C、維生素E、類黃酮，類胡蘿卜素，或其鹽或其衍生物。
[0059]優選的成膜劑是常用于美容用途的這類試劑，例如丙烯酰胺/鈉(Acrylamide/Sodium)、丙烯酸共聚物(Acrylate Copolymer)、丙烯酸酯/丙烯酰胺共聚物、PVM/MA共聚物的丁酯、羧甲基幾丁質、殼聚糖、羥丙基纖維素、聚季銨鹽_36、PVP、PVP/VA共聚物、VA/巴豆酸酯共聚物或乙烯基己內酰胺/PCP/二甲基氨基辛基(dimethylaminoctyl)丙烯酸甲酯共聚物。
[0060]除非另有說明，上述所有添加劑可以以0-20%(w/v)的量存在，優選0.001、0.01、
0.05 或 0.1 到 10% (w/v)，更優選 0.5-5% (w/v)。
[0061]必要時，可存在其他添加劑，特別是以0_20wt%、優選0.l_20wt%、優選0.2_15wt%、特別是0.5-10wt%的量存在。優選的添加劑是細胞的營養物質。它們可選自例如0.l-5wt%的葡萄糖、至多25IU/ml的量的胰島素、0.l-5wt%的天然氨基酸特別是半胱氨酸，或生理量或高達它的10倍量的組織因 子，如白介素。
[0062]所述組合物優選為水溶液，其包含:
[0063](a)氧載體，優選血紅蛋白或肌紅蛋白，其中在至少40%的所述氧載體中，氧結合位點帶有非-O2配體，以及
[0064](b)至少一種其他成分，選自電解質、防腐劑、穩定劑、抗絮凝劑、抗凝劑、pH緩沖劑、抗氧化劑、有機溶劑、成膜劑和交聯劑。
[0065]在本發明的優選實施方案中，組合物包含從人或動物、優選豬的全血中分離的氧載體。
[0066]因此，本發明的另一方面是提供用于從全血純化可用于本發明的組合物的氧載體的方法。
[0067]為了制備優選實施方案的組合物，從人或動物的血液中分離氧載體，并進一步純化到基本上不含血漿和細胞膜成分。
[0068]“基本上不含”是指所指的化合物或組合物不含20%以上、優選不超過10%、甚至更優選不超過5%、特別優選不超過2%、或者小于1%的提及的不需要的化合物。
[0069]純化可包括任何適合的方式或方法步驟，例如像選擇性裂解或沉淀、離心、超離心、分級離心、層析方法如離子交換層析、尺寸排阻層析，親和或吸附層析、凝膠過濾或分子篩層析，或透析，但不限于這些實例，只要通過應用方法，使盡可能少的氧載體變性即可。在分離和純化過程中，氧載體優選基本上保持在溶液中。
[0070]當從全血中分離氧載體時，優選的是，從其它血液成分分離含有氧載體的細胞或者選擇性裂解所述細胞，以將(可溶性)氧載體遞送到溶液中，然后分離不溶性成分。這兩種方法的組合也是合適的。可通過任何合適的裂解方法對含氧載體的細胞進行裂解，例如化學裂解、滲透裂解、機械裂解、熱裂解或類似方法。
[0071]可通過任何合適的方式或方法來分離細胞碎片。包括例如離心、過濾、沉降和傾析、透析或任何類似的方法。
[0072]為了將非裂解細胞或細胞碎片與溶解的氧載體分離，常用的方法是粒化(pelletation)固體材料。例如，可進行離心步驟。2-5000Xg的離心通常足以粒化細胞和細胞碎片。
[0073]為了進一步粒化未溶解的成分，例如在純化過程中生成的任何沉淀物，可以在純化過程的任何時間進行另外的離心步驟，特別是使用較大的力的離心步驟，可直至高達IO6X g的超離心。
[0074]含氧載體的溶液的純化另外地或作為任何離心步驟的替換方案可包括至少一次過濾步驟、優選至少兩次、三次或更多次的過濾步驟。過濾既可以通過使用至少一個、優選至少兩個、更優選至少三個過濾器(如果本申請中使用多于一個過濾器時，我們使用術語“過濾器級聯”進行，也可通過一個、兩個、三個或更多個單獨的過濾步驟進行。
[0075]所述過濾器級聯或不同的過濾步驟可包括兩個、三個、四個、五個或更多的不同類型、不同材料和/或不同孔徑的過濾器。進一步地，可使用深床過濾器如玻璃棉或類似物，優選作為第一過濾材 料以保留粗細胞碎片。若使用超過一個的過濾器，優選使用孔徑逐級遞減的過濾器。例如，如果使用三個不同的過濾器，第一過濾器(深床過濾器之后)的平均孔徑可以是I至0.5 μ m，第二過濾器的孔徑可以是0.7至0.3 μ m，第三過濾器的孔徑為0.4至0.1 μ m，其中不依賴上述的重疊范圍，無論何種情況，后一個過濾器的孔徑小于它前面的過濾器的孔徑。通過所述過濾步驟，基本上除去了尺寸大于所使用的過濾器的孔徑的固體材料和沉淀材料。
[0076]進一步地，純化過程可包括超濾步驟，以用于純化氧載體。通過這樣的超濾步驟，可將不需要的未溶解的大分子分離。優選地，選擇尺寸排阻極限，以分離比需要的氧載體更大(更龐大、更高分子量)的大分子，因此通過過濾器保留所述大分子。由于血紅蛋白的分子量為約64000道爾頓，因此超濾過濾器的尺寸排阻極限應更高。為確保超濾步驟不會降低血紅蛋白的收率，優選將過濾器的尺寸排阻選擇為約100000道爾頓，優選約200000道爾頓，更優選約300000道爾頓，但并不限于此。
[0077]可另外地或作為替代地進行任何合適的層析步驟。特別優選的層析類型是離子交換層析或尺寸排阻層析。
[0078]通過透析步驟可以獲得同樣的結果，透析步驟是使用具有上述尺寸排阻極限的透析膜，使氧載體通過，但保留具有較高分子尺寸的大分子。
[0079]為降低小分子量化合物在溶液中的量，可使用尺寸排阻極限為約50000道爾頓的透析膜進行另外的透析步驟，使更小的分子通過，但保留氧載體。
[0080]為減少組合物中的病毒和/或微生物的污染，在純化過程中特別優選包括使病毒含量降級的步驟。通過這一步可減少病毒含量，優選減少至每毫升承載少于10個、優選少于5個、更優選少于2個病毒顆粒，并且甚至更優選為每毫升O個。在該步驟中，優選的是，使含有氧載體的所述溶液通過病毒含量降級過濾器(“病毒過濾器”)。這種過濾器是公知的，并可在市場中獲得。實例是Sartorius Virosart:? CPV> Planova? 15N, 20N、
Millipore Viresolve? NFP 或 PALL Pegasus? Grade LV6，但并不限于這些。可替代地
或額外地，在通過過濾器后，優選應用UV光處理，特別是245nm波長的紫外光，以消滅任何殘留的病毒。
[0081]任選地，在分離氧載體的過程中的任何階段，可進行至少一次加熱步驟。該步驟包括在分離過程中，將含氧載體的懸浮液或溶液加熱至40°C -85°C，優選60°C -80°C，更優選65°C -75°C的溫度范圍。該加熱步驟優選進行IOmin(分鐘)至6h(小時)，優選20min到4h,最優選30min至3h,并可包括上述范圍內的多個不同溫度。
[0082]根據本發明的方法，優選的是，在整個純化過程中將氧載體保持在溶液中。進一步優選的是，在本發明的組合物的整個純化過程和制備過程中，將氧載體保持在溶液中。這意味著，優選在本發明的方法中，氧載體不是沉淀的，因此它保持著處于其天然環境時其的天然三維結構。
[0083]在本發明的特別優選的方法中，從全血純化氧載體的方法至少包括以下步驟:
[0084](a)分離全血的血漿；
[0085](b)裂解紅細胞；
[0086](C)使氧載 體攜帶配體；
[0087](d)將樣品加熱至40°C _85°C的溫度；
[0088](e)將氧載體與任何不需要的血成分分開。
[0089]通過這些步驟，可獲得用于制備本發明的組合物的含氧載體的溶液。特別是，可以將通過這些步驟獲得的含氧載體的溶液濃縮至氧載體的所需量，并向該溶液中加入至少一種其他成分，以獲得本發明的組合物。
[0090]通過從全血中分離血漿的任何常用方法可進行本發明方法的步驟(a)，優選通過離心或過濾。通過在約2000-5000rpm,例如4000rpm下離心約30min,使紅細胞粒化,而可溶性化合物和白血細胞主要留在上清液中。通過對紅細胞反復再懸浮和粒化，例如2-5次，可以提高紅細胞與血液中不需要的化合物的分離程度。
[0091]優選通過向步驟(a)的稠化血中加入水、優選蒸餾水或適當的次級等滲緩沖液(sub-1sotonic buffer)、優選磷酸緩沖液,來進行步驟(b)。在用水或次級等滲緩沖液裂解紅細胞后，優選將鹽加入該溶液/懸浮液，以在溶液中獲得所述鹽的生理濃度。優選按溶液中0.9%的量加入NaCl。
[0092]步驟(c)可以在步驟(a)、步驟(b)、步驟(d)或步驟(e)之后進行，但優選至少在步驟(b)之后進行。需要特別指出的是，步驟(C)并不一定作為步驟(b)之后的下一步驟立即進行，也可以在步驟(d)、步驟(e)或任何以下處理步驟之后進行或重復進行。使溶液/懸浮液中的氧載體攜帶配體可通過在溶液/懸浮液中導入氣體來實現，優選CO或NO氣體或它們的混合。在優選的實施方案中，將CO氣體在足夠長的時間段內導入溶液/懸浮液，以獲得在溶液/或懸浮液中的飽和度大于90%，優選飽和度大于>95%。
[0093]步驟(d)可以在步驟(a)、步驟(b)、步驟(C)或步驟(e)之后進行，但優選在步驟(C)之后進行。進一步地，在分離過程期間可以反復加熱。該步驟包括在分離過程中，將含氧載體的懸浮液或溶液加熱到40°c -85°c、優選60°C -80°c、更優選65°C _75°C的溫度范圍。該加熱步驟優選進行IOmin至6h,優選20min到4h,最優選30min至3h,并可包括上述范圍內的多個不同溫度。
[0094]在步驟(e)中，從溶液中仍然含有的不需要的成分，如非裂解的細胞、細胞碎片、任何沉淀物或其它不溶解的成分中，進一步純化氧載體。進一步地，通過分離至少部分不需要的可溶化合物，例如像可溶大分子或具有低分子量的可溶化合物，可進一步純化氧載體。
[0095]因此所述步驟(e)可包括幾個單獨步驟，如過濾、超濾、離心、超離心、層析、使用不同類型的具有不同尺寸排阻極限的透析膜的透析、洗滌步驟、氧載體含量的濃縮等。上述任何方法可包括在該純化步驟內。
[0096]步驟(e)優選包括至少一次離心和/或至少一次過濾步驟。例如在離心機中旋轉裂解物，以分離剩余細胞和細胞碎片，或通過例如上述的過濾器級聯來過濾裂解物。也可以首先將裂解物離心，隨后進行過濾，或者可以在第一步中通過深床過濾器過濾，隨后通過至少一個過濾器或過濾器級聯進行過濾。通過離心或深床過濾器，由于留在過濾器上并阻塞它的材料較少，簡化了任何隨后的過濾步驟中的操作。如果沒有使用過濾器級聯，優選使用至少一個過濾器，使得保留懸浮液中所含的基本上所有的固體材料并使所有溶解的成分通過。在更優選的實施方案中，所用的至少一個過濾器能夠充當無菌濾器，將微生物保留。可進一步優選進行超濾步驟和/或用于減少溶液中的病毒和/或微生物的含量的步驟。因此，優選的是，在步驟(e)后，含氧載體的溶液基本不含任何未溶解顆粒、絮凝物、沉淀物。
[0097]在步驟(e)中，除了上述任意步驟/方法外，可以清洗和/或濃縮含有所需的氧載體的溶液。“清洗”意為分離小于所需氧載體的分子(具有較低分子量)，可優選通過向含 氧載體的溶液中加入相同量或多倍(例如5-10倍)量的等滲溶液，隨后用過濾器過濾所得(稀釋的)溶液，保留氧載體并使較小分子通過。優選使用0.9%NaCl溶液，以清洗溶液。清洗步驟可以重復2或3或4或5或至多達10次。在優選的示例性實施方案中，使用尺寸排阻極限為5000道爾頓、10000道爾頓或20000道爾頓的過濾器，以使較小分子通過。在該步驟中，(優選在清洗后)可以將含氧載體的溶液濃縮至氧載體的所需濃度，例如50g/l、100g/l或200g/l的濃度,但并不限于這些量。通過過濾進行濃縮或者通過加入0.9%NaCl溶液或類似的等滲溶液，可獲得任何需要的濃度。
[0098]然后，可使用如此獲得的含氧載體的溶液，通過向溶液中加入所需量的上述的至少一種其他成分來制備本發明的組合物。
[0099]在優選實施方案中，通過向含氧載體的溶液中至少加入防腐劑，優選藥學上可接受的防腐劑，例如苯氧乙醇、對羥基苯甲酸酯類、苯甲酸鈉、苯甲醇、六氯酚，以及抗氧化劑和/或穩定劑，例如N-乙酰半胱氨酸、辛酸鈉、N-乙酰-L-色氨酸酯、N-乙酰基-甲硫氨酸酯、維生素E、維生素C、甲基脫氫皮質醇或甘露糖醇，來制備本發明的組合物。此外，可另外加入上述的任意其他成分。
[0100]如需要，可以通過例如加熱、過濾、離心、加入防腐劑、蒸汽應用、氣體應用或UV應用或它們中的至少兩種的組合，優選通過進一步的無菌過濾步驟，對所得的組合物再次滅菌，并優選將其裝在用于儲存的無菌容器或無菌袋中。
[0101]根據優選的實施方案，將無菌袋放置于噴罐中供以后使用。一個實施例可以是閥上袋系統(Bag-on-Valve system)，其包括袋，例如層壓鋁袋，以及鋁板或錫板噴罐。由于產物與推進劑的分離，閥上袋可以在2-9巴的壓力下與壓縮空氣或氮氣一起使用。
[0102]根據本發明，該組合物優選用于治療開放性傷口，優選治療人和動物的慢性傷口，其中優選用于人的治療。優選用途是用所述的帶有配體的氧載體來外部治療傷口。
[0103]令人驚訝地發現，用所述帶有配體的氧載體可以有效地治療開放性傷口。如上所述，由于氧氣供應的減少，往往會減慢慢性傷口的愈合。因此在邏輯上，傷口的治療似乎需要攜帶氧的氧載體以用于治療。然而，本發明發現，通過應用攜帶CO或NO的氧載體，可以獲得傷口外部治療的積極效果。不受束縛地，我們的推測是，當應用于傷口時，由于空氣中的氧分壓，配體可以被氧替換，由此幫助傷口愈合。
[0104]本發明的組合物的明顯優勢在于，由于基于攜帶CO或NO配體的氧載體處于其非氧化狀態，氧載體的穩定性得到增強，從而獲得良好的制備穩定性和儲存穩定性。此外，組合物易于施用且容易操作，并且通過氧載體/試劑的調節而促進擴散，從而提供了安全有效的改善傷口愈合的途徑。
[0105]本發明的組合物是外用的。根據傷口的狀態，將其施用于、優選以細霧的方式噴灑于傷口區域。
[0106]已證明，根據本發明可有效治療開放性傷口，特別是具有非常不同病因的慢性傷口。還可以是術后、外傷、損傷后的傷口、愈合不良的傷口或低氧傷口，或由組織中的退行性病變引起的傷口。在這一點上，它們可以是由動脈血管的退行性病變引起的傷口以及慢性靜脈功能不全引發的傷口。這些具體包括褥瘡以及慢性傷口，具體為糖尿病引發的那些。可有效地治療由灼傷(高溫灼傷、化學灼傷或冰凍灼傷)或燙傷造成的其他傷口。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0107]圖1示出了依賴于O2環境分壓的血紅蛋白的O2飽和曲線。
實施例
[0108]實施例1:
[0109]通過以下方式從豬的全血中分離出血紅蛋白:從血清中分離紅細胞,裂解收集的紅細胞，粒化細胞碎片，通過導入CO氣體直到液體樣品達到飽和以獲得攜帶CO的血紅蛋白，將溶液加熱，進行幾個過濾步驟，包括病毒過濾步驟和通過兩次加入2倍體積的0.9%鹽水以清洗所得的血紅蛋白溶液，并過濾該溶液。
[0110]制備用于傷口治療的即用型組合物，其包含溶于0.9%NaCl的10%的純化且穩定的血紅蛋白、0.05%N-乙酰半胱氨酸和0.7%苯氧乙醇。向該組合物中再次充入CO氣體，將其分成10份，并分別裝入噴灌中。
[0111]實施例2:
[0112]在制備后立即使用實施例1的第一份組合物來治療在右腳處具有慢性傷口(7x2cm)的女性患者(診斷為:糖尿病、高血壓)。通過將組合物噴灑在傷口上來治療傷口，每日一次。三天后，可見第一個愈合跡象。接下來的幾周愈合過程顯著，并且在18周后，傷口獲得完全閉合。
[0113]實施例3:[0114]將實施例1中的第二份組合物在制備后在4°C下儲存2年，之后，使用它治療患有II型糖尿病的男性患者的慢性傷口。將組合物施用于患者左脛骨處的慢性淺表潰瘍(4x3cm)。對傷口進行治療，每日一次。兩周后出現愈合，4周后傷口愈合了超過基線的50%。接下來的幾周觀察到迅速的愈合，8周后傷口獲得完全閉合。
[0115]實施例4:
[0116]將實施例1的第三份組合物在10°C下儲存2年。之后，使用它治療患有II型糖尿病的男性患者的右腿處的慢性淺表潰瘍(4x2cm)。對傷口進行治療，每日一次。2.5周后可見愈合。接下來的幾周觀察到迅速的愈合，12周后傷口獲得完全閉合。
[0117]實施例5:
[0118]使用實施例1的一份組合物治療與熱開水和蒸汽接觸后的男性患者。診斷結果為他的臉為一級和二級燒傷。
[0119]用冷凝膠和新斯波林(Neosporin)初始治療一周，未顯示出任何改善，主治醫師建議，在鼻子和面部其他部位如眼瞼上，應用皮膚移植。
[0120]作為替代方案，用實施例1的組合物對患者治療7周。將組合物施用于皮膚，每日噴灑3-4次。觀察到皮膚的迅速改善和愈合，且患者在7周后出院。并不需要皮膚移植。
[0121]實施例6:帶有配體/不帶配體的血紅蛋白的比較
[0122]A)根據實施例 1制備帶有配體的血紅蛋白噴劑
[0123]制備用于傷口治療的即用型組合物，其包含溶于0.9%NaCl的10%純化且穩定的血紅蛋白、0.05%N-乙酰半胱氨酸和0.07%苯氧乙醇。向該組合物中再次充入CO氣體，將其分成20份，并分別裝入噴灌中。
[0124]可將組合物在4°C至室溫下儲存數月至數年。
[0125]B)除了不進行CO的充入，按照實施例1處理豬的全血的第二份。在加熱步驟期間，沉淀了相當數量的血紅蛋白。以下的過濾步驟難以進行。每升全血中純化的血紅蛋白的量減少至低于加熱前進行CO充入時的量的30%。這表明，在制備期間向樣品中充入⑶，通過在加熱步驟期間有相當少的血紅蛋白發生沉淀的方式，穩定了血紅蛋白。
[0126]制備用于傷口治療的即用型組合物，其包含溶于0.9%NaCl的10%純化的血紅蛋白、0.05%N-乙酰半胱氨酸和0.7%苯氧乙醇。將組合物分成份，并分別裝入噴罐中。
[0127]C)按照W02003/077941的實施例1中描述的方法從豬的全血中分離出血紅蛋白的其他部分，在制備期間沒有使血紅蛋白攜帶配體:在不加熱的情況下，通過離心和超濾使血紅蛋白從不含血漿和細胞膜組成部分中釋放出來，并進行純化。
[0128]制備用于傷口治療的即用型組合物，其包含溶于0.9%NaCl的10%純化的血紅蛋白、0.05%N-乙酰半胱氨酸和0.7%苯氧乙醇。將該組合物分成10份，并分別裝入噴灌中。
[0129]在治療期間按需要盡量頻繁地(每三天)新鮮制備如此制備的不帶配體的血紅蛋白噴劑，并在使用前將其在4°C下貯存最多一天。
[0130]患者的治療:
[0131]用A)的血紅蛋白噴劑(10°C下貯存至多6個月)或C)的新鮮制備的血紅蛋白噴劑(4°C下貯存至多3天，即新鮮的組合物都使用三天)對幾位小腿處患有糖尿病足部潰瘍的男性患者(65-75歲)治療三個月，直到所有患者的傷口獲得完全愈合。根據主治皮膚科醫生，相比用C)的血紅蛋白噴劑治療的傷口，特別是相比于常規治療的傷口，使用A)的組合物而獲得的傷口愈合在所有病例中都表現出分泌物較少，結痂較少和/或化膿較少。由于小問題，用A)的帶有配體的血紅蛋白組合物治療的傷口表現為每cm2的愈合比不帶配體的血紅蛋白噴劑C)快，且比常規治療的傷口愈合要快得多。另外，用組合物A)治療的患者報告的不適較少。
[0132]實施例7:
[0133]鑒于樣品的攜帶O2的情況以及不能結合O2的高鐵血紅蛋白的產生，測量實施例6A)、實施例6B)或實施例6C)制備的組合物樣品。此外，高鐵血紅蛋白會影響緊鄰的血紅蛋白分子，使這些血紅蛋白分子仍然可以結合O2，但不能再釋放02。
[0134]用0.9%NaCl溶液將表1中的所有樣品按1:1稀釋，以模擬傷口治療的條件。在稀釋后(稀釋前將樣品7.5-7.8貯存在室溫下)立即對樣品7.1-7.8進行測量。按以下方式進行氣體處理:將每6ml所述稀釋的溶液轉移至30ml的玻璃燒瓶中。通過向玻璃燒瓶中充滿相應的氣體，封閉燒瓶，并轉動樣品30秒來進行氣體處理。在30°C下將所有樣品貯存上述時間段。根據表1所述條件處理樣品，并且測量血紅蛋白總量(血紅蛋白+高鐵血紅蛋白)、氧含量、高鐵血紅蛋白含量以及任選地CO含量。
[0135]表1
【權利要求】
1.一種組合物，包括: (a)氧載體，優選血紅蛋白或肌紅蛋白，其中在至少40%的所述氧載體中，氧結合位點帶有非-O2配體，以及 (b)至少一種其他成分，選自電解質防腐劑、穩定劑、抗絮凝劑、抗凝劑、PH緩沖劑、溶劑、抗氧化劑、成膜劑或交聯劑。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物是水性或有機溶液。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，其特征在于，至少50%、優選至少60%、更優選至少70%、還更優選至少80%、特別優選至少90%的所述氧載體以帶有配體的形式提供。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的組合物，其特征在于，所述配體選自一氧化碳和一氧化氮。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的組合物，其特征在于，所述氧載體是血紅蛋白或肌紅蛋白，優選天然存在的人或動物來源的血紅蛋白或肌紅蛋白，或者是人工處理的、交聯或修飾的人或動物來源的血紅蛋白或肌紅蛋白。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的組合物，其以滅菌的形式提供。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的組合物，其提供于噴罐，優選壓力包裝噴罐中。
8.權利要求1-7中任一項所述的組合物，用于傷口的外部治療。
9.用于制備權利要求1-8中任一項所述的組合物的方法，其中(i)所述氧載體在從其天然環境分離的過程中或分離后攜帶有保護配體，(?)加入至少一種其他成分(b)，(iii)任選地，對所述組合物滅菌，以及(iv)包裝所述組合物，優選包裝于噴罐中。
10.根據權利要求9的所述方法，其中在步驟(iii)中通過加熱、過濾、離心、加入防腐劑、蒸汽應用、氣體應用或uv應用、或它們之中的至少兩種的組合對所述組合物滅菌。
11.在其氧結合位點上帶有非O2配體的血紅蛋白或肌紅蛋白在制備用于傷口的外部治療的藥物或組合物中的用途。
12.在其氧結合位點上帶有非O2配體的血紅蛋白或肌紅蛋白用于傷口的外部治療的方法。
13.根據權利要求8所述的組合物，或者權利要求11或12所述的應用，其特征在于，待治療的傷口是慢性傷口、手術傷口、損傷傷口、外傷后的傷口、開放性傷口、慢性傷口、愈合不良的傷口或低氧傷口、由動脈血管的退化或狹窄引起的傷口、由糖尿病引起的傷口、由慢性靜脈功能不全引起的傷口或褥瘡傷口或熱灼傷、化學灼傷或冰凍灼傷的灼傷傷口或燙傷。
14.用于從全血純化氧載體的方法，所述氧載體是血紅蛋白或肌紅蛋白，所述方法包括以下步驟: a.分離全血的血漿； b.裂解紅細胞； c.使所述氧載體攜帶配體； d.將樣品加熱至40°C_85°C的溫度； e.將所述氧載體與任何不需要的血成分分開， 其中步驟(e)包括至少一個過濾步驟。
15.根據權利要求14所述的方法，其特征在于，所述配體是一氧化碳或一氧化氮。
16.根 據權利要求14或15所述的方法，其中，步驟(e)中的所述過濾包括使用無菌過濾器和/或病毒過濾器。
【文檔編號】A61K38/42GK103781488SQ201280036457
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年7月23日 優先權日:2011年7月23日
【發明者】邁克爾·桑德爾, 哈拉爾德·波茨史克 申請人:薩斯托米德股份有限公司