具有氫氧化鋁納米顆粒的疫苗組合物的制作方法
【專利摘要】本發明包含至少一種抗原和一種佐劑的疫苗組合物，其特征在于該佐劑包含能夠無菌過濾的、包含假勃姆石和聚丙烯酸鹽的納米顆粒。
【專利說明】具有氫氧化鋁納米顆粒的疫苗組合物
[0001]本發明涉及疫苗領域，并且更具體地涉及包含至少一種佐劑的疫苗組合物。具體而言，本發明涉及疫苗組合物，其包含能夠無菌過濾的、包含假勃姆石(pseudo-boehmite)和聚丙烯酸鹽(polyacrylate) (PAA)的納米顆粒。
[0002]本領域中長期以來已知曉用鋁將疫苗佐劑化是有利的。許多市售疫苗包含鋁，或以氫氧化物形式或以磷酸鹽形式；然而，這些名稱無法準確反映對應產品的化學組成:氫氧化鋁更應是羥基氧化物，并且磷酸鋁則很少是純磷酸鹽，而更常見的是包含其他離子，尤其是硫酸鹽還有氫氧化物。盡管這些還已知為鋁凝膠的基于鋁的佐劑已經顯示出它們在提高由抗原誘導的免疫應答中的所有優點，但是，它們的確具有某些缺點。從工業的觀點來看，由于顆粒大小過大，因此氫氧化鋁或磷酸鋁的常規懸浮液無法在生產結束時通過過濾來進行滅菌，并因此需要依靠在無菌條件下進行生產過程。此外，在某些施用方式(尤其是皮內施用)的情況下，已經指責了鋁會導致施用部位處的紋身效應。因此，期望擁有有效的包含鋁的疫苗組合物，以從它的佐劑能力中受益而同時又避免其缺點。為此目的，本發明提出包含至少一種抗原和佐劑的疫苗組合物，其特征在于所述佐劑包含能夠無菌過濾的、包含假勃姆石和聚丙烯酸鹽的納米顆粒。
[0003]本發明的主題還是能夠無菌過濾的、包含假勃姆石和聚丙烯酸鹽的納米顆粒用于制備包含至少一種抗原的疫苗組合物的用途。
[0004]具體而言，本發明具有此類納米顆粒的用途，所述納米顆粒可以增加在施用所述疫苗組合物的過程中誘導的免疫應答。
[0005]本發明的主題還是包含至少一種抗原和佐劑的疫苗組合物的制備方法，根據所述方法:
O制備能夠無菌過濾的、包含假勃姆石和聚丙烯酸鹽的納米顆粒，
O利用滅菌濾器將所述納米顆粒過濾，
O將至少一種疫苗抗原加入所述納米顆粒中，
O并且，任選地，如需要，進行額外的過濾。
[0006]通過本發明的主題，可以擁有這樣的疫苗佐劑，其較常規使用的鋁懸浮液誘導較低的反應原性反應，尤其在皮內(ID)施用后更是如此，并且其可以在制造過程結束時經過濾進行滅菌。
[0007]本發明的其他 優點將在以下描述過程中顯示。
[0008]在本發明的術語中，納米顆粒是其大小允許它們經過滅菌濾器的顆粒，所述滅菌濾器的孔具有220 nm的直徑。因此，所述顆粒具有小于300 nm的大小，這是由于此類顆粒能夠通過變形而經過更小尺寸的孔。然而，優選地，所述顆粒具有小于220 nm的大小，并且甚至小于200 nm。此類顆粒形成透明的膠懸液。有利地，使用其中大部分顆粒直徑為30-200 nm的懸浮液，其允許用截 止閾值為220 nm的滅菌濾器將它們過濾，而不會過度損失材料。顆粒的直徑是流體力學直徑，其可以經不同技術來測量:例如，可以使用準彈性光散射(la diffusion quas1-elastique de la lumiere)0該技術可以測量膠懸液中半徑從I納米至幾微米的顆粒的大小。液體中懸浮的顆粒會進行布朗運動(熱攪動和液體分子和固體顆粒之間的碰撞)。光散射測量的原理在于用激光類型的連貫的和單色輻射轟擊膠懸液中的顆粒，并隨后利用雪崩光電二極管(photodiode ? avalanche)(用于對光子數記數的設備)記錄由這些顆粒散射的光強中的波動。
[0009]這些實驗通常在完全稀釋的對于眼為透明的介質中進行。在本發明的情況下，在去礦質水中稀釋(通常1/10)后測定納米顆粒的直徑。所用機器模型為Malvern ZetaSizerNano ZS0
[0010]根據本發明，納米顆粒為基本上由在它們的表面上具有聚丙烯酸鹽的假勃姆石組成，以防止通過透析洗滌納米顆粒后納米顆粒的聚集。根據本發明的具體方式，經靜電類型的相互作用使聚丙烯酸鹽與假勃姆石結合。根據本發明的一種方式，聚丙烯酸鹽的量表示少于納米顆粒質量的10%的質量，更具體而言，為少于9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的質量。根據本發明的一種方式，聚丙烯酸鹽的量表示至少等于納米顆粒質量的1%的質量，更具體而言，為大于2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%的質量。
[0011]在鑒定本發明的納米顆粒的基本成分中，作為假勃姆石可以通過X射線衍射分析進行，其產生假勃姆石的X射線衍射圖特征為在14、28.1,32.4,49.3,55.5和65° 2 Θ(λ=0.15406 nm)處觀察到的主線(020)、(021)、(130)、(150)、(151)和(132)。
[0012]使用聚丙烯酸鹽，這是由于所用的聚合物必須是生物相容的，即它們必須對于它們所施用的生物沒有毒性。此外，在合成納米顆粒過程中，所用的聚合物必須在所用的溫度是穩定的。所用的聚丙烯酸鹽可以是多種分子量的；尤其它可以是聚丙烯酸鈉或適合于藥學用途的任何其他鹽的聚丙烯酸鹽。用由Fl uka公司提供的聚丙烯酸鹽PAA 2100以及用來自Polysciences的PAA-60 000獲得了良好結果。
[0013]按照由S.Musi 等(^Materials Chemistry and Physics, 1999，59, 12-19題為 Chemical and mi cros true tural properties of A1-oxide phases obtained fromAlCl3 solutions in alkaline中描述的方法啟發而產生的方法制備顆粒。按照S.Musi等，通過加入堿(NaOH)使鋁鹽水溶液的pH在5分鐘的時期內升高到略高于11的值(使用PH計控制)。隨后，將混合物劇烈攪拌10分鐘，并隨后轉移至高壓滅菌器中并加熱至160°C保持24小時。將產物(均勻的發白溶液(whitish solution))通過Biichner過濾回收，洗滌并隨后在65°C在烘箱中干燥過夜。在本發明的合成的情況下，并且如Y.Mathieu等在 Langmuir 2007, 23, 9435-9442 中的 Control of the morphology and particlesize of boehmi te nanoparticles synthesized under hydro thermal conditions 中所描述，該合成在聚丙烯酸鈉存在的情況下進行，在開始時將所述聚丙烯酸鈉加入鋁鹽的水溶液中。聚合物的存在防止所形成顆粒的聚集。選擇聚丙烯酸鹽和鋁鹽的相對量，從而能夠將聚丙烯酸鹽溶解于鋁鹽溶液中，并獲得適合用作疫苗佐劑的可過濾的納米顆粒。因此，指出用PAA 2100時，使用聚丙烯酸鈉與鋁的摩爾比為0.43-0.57是有利的。
[0014]在加入堿之前，使聚丙烯酸鈉和鋁鹽的混合物進入成熟期，在該過程中將其攪拌。在室溫將該成熟期有利地進行約24小時。從工業的觀點來看，于室溫在短時期內(如需要，可以將其例如延長至數周)進行，這是非常有利的。
[0015]用于生產納米顆粒的鋁鹽可以是多種性質:它們尤其可以是氯化鋁AlCl3、硝酸鋁Al (NO3) 3或硫酸鋁Al2 (SO4) 3 ;優選選用氯化鋁A1C13。
[0016]可用于增加混合物的pH的堿是多種類型的，并且尤其可以選自NaOH、KOH或NH4OH。有利地，使用氫氧化鈉NaOH進行納米顆粒的合成。
[0017]根據本發明，在操作過程中在5-10分鐘內，使用氫氧化鈉來增加pH直至約10-11的值。在該PH增加期內，存在的多種的鋁種類經歷變化(諸如離解和重排)以導致形成不同程度的晶相。
[0018]根據本發明，隨后將該混合物進行水熱處理一段時期，其范圍可以為1-17小時；有利地，對于所獲的顆粒的大小以及它們的可過濾性，選用3小時的持續時間。在900C -200°C的溫度，更具體而言在160°C，以靜置方式或攪拌進行該處理。
[0019]根據本發明，所獲的納米顆粒能夠無菌過濾，其表示它們具有能使它們經過孔徑為220 nm的滅菌濾器的大小；在這樣的過濾過程中觀察到的損失與工業約束是一致的。具體而言，在0.22 Mm PTFE (聚四氟乙烯)濾器上進行的檢測顯示所發生的聚合物和鋁少于5%的損失，該5%的值可能對應于測定技術的誤差界限。
[0020]根據本發明，納米顆粒可以懸浮于鹽水溶液或生物緩沖液中。尤其是，在PBS(磷酸緩沖液鹽溶液)緩沖液中、TRIS (三(羥甲基)氨基甲烷)緩沖液中或在包含90 g/Ι的NaCl、
0.12 g/1的Na2HPO4和0.6 g/Ι的KH2PO4的鹽水溶液中進行檢測。
[0021]根據本發明的具體特征，包含假勃姆石和聚丙烯酸鹽的納米顆粒的懸浮液還包含表面活性劑，尤其是中性表面活性劑諸如Brij ? 58,Pluronic ? 123或Tween? 60、或者陰離子表面活性劑諸如SDS (十二烷基硫酸鈉)、或者聚合物諸如PEG (聚乙二醇)。因此，所形成的納米顆粒的穩定可以經位阻效應或經靜電排斥來增加。
[0022]根據本發明，疫苗組 合物包含至少一種抗原。
[0023]為了開發本發明的目的,使用純化的破傷風蛋白(tetanus protein)作為模型抗原。隨后用其他抗原，尤其是流感抗原(influenza antigens)、痕疾抗原LSA3 (malariaantigen LSA3)、或者ETEC (腸毒性大腸桿菌(AscAericAia coJ7))重組抗原進行檢測。然而，本發明的疫苗組合物可以包含可用于疫苗中的任何抗原，無論它是否是完整的微生物、亞基抗原，其不考慮它的性質可以是天然的、重組的、雜合等；所述抗原實際上可以是肽、蛋白、糖蛋白、多糖、糖脂、脂妝、VLP (病毒樣顆粒)等。
[0024]這些抗原是這樣的抗原，其已被使用或者可以被使用用于治療或預防易于影響動物界并且具體是人的多種疾病，尤其為:白喉(diphtheria)、破傷風(tetanus)、脊髓灰質炎(polio)、狂犬病(rabies)、百日咳(whooping cough)、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎(hepatitis A, B or C)、黃熱病(yellow fever)、傷寒(typhoid fever)、水痘(chickenpox)、麻疫(measles)、腿腺炎(mumps)、德國麻疫(German measles)、乙型腦炎(Japaneseencephalitis)、流感(influenza)、腦膜炎(meningitis)、霍亂(cholera)、由以下病毒介導的傳染:輪狀病毒(Rotavirus)、諾如病毒(Norovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)、單純皰疫病毒(/ferpes Simplex Virus)、乳頭狀瘤病毒(Papilloma Virus)、巨細胞病毒(Cytomegalovirus)、西尼羅河病毒(West NileVirus)、登革熱病毒(Dengue Virus)、基孔肯雅病毒(Chykungunya Virus)、HIV (AIDS),由以下引起的細菌性疾病:鏈球菌(streptococci)、沙眼衣原體和肺炎衣原體焊trachomatis and pneumoniae、、淋病奈瑟氏球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌{Neisseriagonorrheae and粘膜炎莫拉氏菌(iforax<977a caiarrAaJis)、金黃色葡萄球菌<3?<9?5.)或 B 型流感嗜血菌influenza type B),李斯特菌病(listeriosis)、志賀氏菌病(shigellosis)、沙門氏菌病(salmonellosis)、結核病(tuberculosis)、萊姆病(Lyme，s disease)、癌癥、寄生蟲疾病(parasitic complaints)諸如痕疾(malaria)、利什曼病(leishmaniasis)等。
[0025]本發明的藥物組合物可以是針對單一病原體或癌癥的免疫的組合物，即它包含一種或多種單一病原體或癌癥的抗原，或者可以是針對幾種病原體或癌癥的免疫的組合物(在這種情況下，將它稱為疫苗組合)。本發明的組合物還可以包含對單一疾病(但屬于該疾病原因的不同類別(根據原因的性質，可以是幾種菌株或血清型、或進化枝))特異的幾種抗原。它還可以是包含過敏原的疫苗組合物，尤其是旨在治療過敏反應的領域中用于脫敏時。
[0026]本發明的疫苗組合物可以經任何通常用于施用疫苗的途徑來施用；然而，皮內(intra-dermique)途徑是特別有利的。具體而言，盡管它對于誘導良好的免疫反應是非常有效的，但皮內途徑具有經常導致局部的反應原性反應的缺點，這會妨礙它的使用。由于本發明的納米顆粒，可以進行具有非常低的或沒有反應原性反應的皮內免疫，并且尤其是沒有紋身效應，而其已經是本領域的鋁懸浮液的情況。
[0027]根據本發明，通過將包含假勃姆石和聚丙烯酸鹽的納米顆粒的懸浮液和抗原懸浮液簡單混合來制備疫苗組合物。該操作可以通過向包含納米顆粒的膠懸液中加入抗原或者通過向已包含抗原的懸浮液中加入納米顆粒來進行。此外，在期望擁有包含幾種類型抗原的疫苗組合物的情況下，可以優選來優先進行某些抗原相對于其他的吸附。具體而言，在疫苗組合物包含抗原的混合物(其中的一些由于穩定性或免疫原性的原因，不應該被吸附)的情況下，可以優選來以以下方式進行:在引入不應該被吸附的抗原`之前，首先用需要吸附的抗原或用存在于緩沖物質中的離子或賦形劑使基于鋁的顆`粒飽和。
[0028]在制備本發明的納米顆粒過程中，可能會存在過量的聚合物。為了去除這些可能的過量聚合物，可以在制備納米顆粒階段之后直接進行額外步驟，或者在與抗原混合的階段之后進行額外步驟。可以通過針對去礦質水(Milli Q, Millipore)、鹽水溶液或生物緩沖液經合適孔隙度(根據納米顆粒的大小為30-100 kDa)的膜透析(dialyse)或滲濾(diafiltration)來進行該去除階段。
[0029]以下實施例說明本發明的實施方案。
[0030]實施例1:合成假勃姆石納米顆粒的膠懸液
使用由Fluka提供的分子量2100的聚丙烯酸鈉(NaPa)和由Avocado提供的氯化招六水合物(AlCl3.6H20)。
[0031]將9 g的NaPa溶于75 ml 0.1 M的AlClyK溶液。于室溫將所獲混合物劇烈攪拌24小時。隨后混合物的pH為5.5-5.9。隨后逐滴加入5 M氫氧化鈉NaOH直至獲得10.5的pH，并且隨后將混合物進一步攪拌10分鐘。當pH升高達到9.0-9.5時，溶液變得輕微混濁，這是由于假勃姆石納米顆粒的沉淀。為了獲得最終的納米顆粒，將在PH 10.5處獲得的懸浮液轉移入高壓滅菌器中，并于160° C輕柔攪拌(15 rpm)加熱3小時。隨后,通過使用裝有30 kDa聚醚聚砜膜的Sartorius Slice 200臺式機對5L的蒸懼水透析來洗漆膠懸液。所獲的膠懸液儲存于聚丙烯瓶中。所進行的大小測量顯示存在納米顆粒的單個群，其大小范圍為15-40 nm (數值分布)，具有0.19的多分散性指數(強度分析)。為了物理化學分析目的，通過在25 000 rpm離心I小時并于80° C干燥過夜來獲得固體材料的樣品。
[0032]利用Stoe-Stad1-P衍射儀使用銅的K α I線(λ =1.5406Α)通過X射線衍射來分析樣品。由于存在由鍺晶體組成的前單色儀，因此輻射完全是單色的。對于該分析，將預先磨碎的樣品置于Lindemann管中(直徑為0.3 mm)。使置于測角頭(goniometric head)上的毛細管旋轉，并在Debye-Scherrer模式中使用能夠覆蓋11° (2 Θ )的角方位的PSD型短線性檢測器(位置敏感檢測器)記錄衍射圖。
[0033]干燥樣品的X射線衍射分析產生了假勃姆石的特征結果。
[0034]所獲的納米顆粒能夠經0.2 Mm Millipore PVDF膜無菌過濾,具有通過原子吸收測定的最小材料損失(3.1%)。
[0035]實施例2:使用分子暈60 000的聚丙烯酸鈉溶液合成假勃姆石和聚丙烯酸鹽.的納米顆粒
使用由Polysciences提供的以35% (w/w)水溶液形式的分子量60 000的聚丙烯酸鈉(NaPa)和由Fluka提供的氯化鋁六水合物(AlCl3.6H20)。
[0036]為了獲得36 g的聚合物，取用包含66.86 g水的102.86 g的聚合物水溶液。
[0037]將7.2429 g的AlCl3置于燒杯中，并向其加入225.89 g的水。
[0038]向聚合物溶液中加入該鋁溶液，從而獲得300 ml的0.1 M AlCl3溶液。
[0039]所獲的混合物為白色的。
[0040]將該混合物劇烈攪拌24小時。
[0041]24小時后，混合物的pH為6.1。隨后逐滴加入5 M氫氧化鈉NaOH，直至pH為10.2。
[0042]將該混合物攪拌均化I小時，并隨后置于高壓滅菌器中攪拌(1400 rpm)并于160° C加熱3小時。
[0043]所獲的溶液為輕微乳白色的，并且X射線衍射分析顯示它由具有假勃姆石的峰特征的納米顆粒組成 ，并且所述納米顆粒具有約100 nm的平均大小,符合滅菌過濾。
[0044]該溶液能夠儲存超過I年，同時保持納米顆粒的完整性，其不會再聚集。
[0045]實施例3:制備包含氫氧化鋁的納米顆粒和純化的破傷風蛋白的疫苗組合物，及過濾檢測
通過向按照實施例1制備的4.5 ml假勃姆石納米顆粒懸浮液中加入10 μ?的測定濃度為1200絮凝單位/ml鹽水溶液的純化的破傷風蛋白制劑來制備疫苗組合物。
[0046]將該混合物溫和地攪拌并隨后經過固定于5 ml塑料注射器上的PVDF膜(由Millipore 提供)。
[0047]在向納米顆粒中加入破傷風蛋白之前和之后均進行納米顆粒大小的測量；無論是否存在蛋白，均獲得相同的大小概況，其證明破傷風蛋白沒有導致納米顆粒的聚集。
[0048]類似地，測定過濾導致鋁3%的損失，其從工業的觀點來看是完全可接受的。
[0049]因此，可以下結論本發明的疫苗組合物可以在0.22 Mffl滅菌濾器上過濾，而不會過度損失材料。
[0050]實施例4:對皮內施用包含納米顆粒和流感抗原的本發明組合物的小鼠的反應原性檢測
使用雌性BALB/c小鼠作為用于該檢測的動物模型，以評價本發明的組合物相比于標準鋁懸浮液的局部反應原性。
[0051]在該檢測中，抗原由已知為Flu ID原液的三價流感疫苗組成，其以每毒株150 μδ/πι1的HA的比例包含滅活的片段化的毒株A/Solomon/3/2006 (HlNl)、A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)和 B/Malaysia/2506/2004。
[0052]四組的10只小鼠以3周的時間間隔向耳的內表面內皮內接受亞最適劑量的30 μ?(即0.3 μg的HA/毒株)的(存在佐劑或不存在佐劑的)疫苗。
[0053]按以下方式制備所施用的組合物:
-A組:單獨Flu ID ;將54 μ?的Flu ID原液在756 μ?的PBS緩沖液中稀釋。
[0054]- B組:Flu ID + A100H ;連續加入以下組分:
O 54 μ? 的 Flu ID 原液
O 604 μ?的PBS緩沖液
O 152 μ? 的包含 8.01 mg/ml 招的 Α100Η 市售懸浮液(Alhydrogel?)
將該混合物溫和地攪拌2小時。
[0055]- C組:Flu ID + AlPO4 ;連續加入以下組分:
O 54 μι 的 Flu ID 原液
O 463 μ?的PBS緩沖液
O 293 μ? 的包含 4.15 mg/ml 招的 AlPO4 市售懸浮液(Alhydrogel?)
將該混合物溫和地攪拌2小時。
[0056]- D組:Flu ID +納米A100H ;連續加入以下組分:
O 54 μ? 的 Flu ID 原液
〇5 μ?的H2O
O 76 μ?的10倍濃縮的PBS緩沖液
O 675 μ?的以實施例1中描述的方式制備的且包含1.8 mg的Al/ml的假勃姆石納米顆粒懸浮液。
[0057]于室溫將混合物溫和地攪拌2小時。
[0058]每日監測小鼠，并將耳上出現的水腫、紅斑和病變按非正式標準進行分級，直至每一注射后2周。
[0059]不考慮所檢測的制劑，沒有觀察到明顯的紅斑。類似地，沒有報道水腫。
[0060]然而，在注射點上發現白色/微紅色的小結塊，這出現在小鼠接受包含標準鋁的組合物的情況下，而無論用氫氧化鋁或用磷酸鋁均是如此。然而，令人驚訝且非常有趣的是，在接受本發明的組合物的小鼠上沒有可見的小結塊。
[0061]關于施用包含現有技術的鋁的佐劑后出現小結塊的小鼠數目的結果顯示在下文表1中:
表1
【權利要求】
1.疫苗組合物，其包含至少一種抗原和佐劑，其特征在于所述佐劑包含能夠無菌過濾的、包含假勃姆石和聚丙烯酸鹽的納米顆粒。
2.權利要求1的疫苗組合物，其特征在于所述納米顆粒的核基本上由假勃姆石組成，并且所述聚丙烯酸鹽基本上位于所述納米顆粒的表面。
3.前述權利要求中任一項的疫苗組合物，其特征在于假勃姆石的質量是所述納米顆粒至少90質量％。
4.前述權利要求中任一項的疫苗組合物，其特征在于所述納米顆粒的大小小于300nm，并且有利地為小于220 nm。
5.前述權利要求中任一項的疫苗組合物，其特征在于它包含至少一種流感抗原。
6.前述權利要求中任一項的疫苗組合物，其特征在于它包含至少一種破傷風蛋白。
7.納米顆粒在制備包含至少一種抗原的疫苗組合物中的用途，所述納米顆粒能夠無菌過濾且包含假勃姆石和聚丙烯酸鹽。
8.前述權利要求的用途，其特征在于所述疫苗組合物用于皮內施用。
9.權利要求7或8的用途，其特征在于所述疫苗組合物包含至少一種流感抗原。
10.權利要求7-9中任一項的用途，其特征在于所述納米顆粒能增加在所述疫苗組合物的施用過程中誘導的免疫應答。
11.權利要求1-6中任一項的疫苗組合物的制備方法，根據所述方法: O制備能夠無菌過濾的、包含假勃姆石和聚丙烯酸鹽的納米顆粒，` O利用滅菌濾器將所述納米顆粒過濾， O將至少一種疫苗抗原加入所述納米顆粒中， O并且，任選地，如需要，進行額外的過濾。
【文檔編號】A61K39/39GK103826658SQ201280034602
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年7月12日 優先權日:2011年7月13日
【發明者】Y.馬蒂厄, B.勒博, V.瓦爾謝夫, J.帕塔蘭, M.加里諾, J.安斯勒, E.索佐 申請人:賽諾菲巴斯德有限公司