蛋白f-具有層粘連蛋白和玻連蛋白結合性能的新的流感嗜血桿菌粘附素的制作方法

蛋白f-具有層粘連蛋白和玻連蛋白結合性能的新的流感嗜血桿菌粘附素的制作方法【專利摘要】描述了疫苗組合物，其包含可在流感嗜血桿菌(Haemophilus?influenzae)中檢測到的具有SEQ?ID?NO：1中描述的氨基酸序列的蛋白質，或其片段。所述片段包含具有來自SEQ?ID?NO：1的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQ?ID?NO：1的多肽的免疫應答。【專利說明】蛋白F-具有層粘連蛋白和玻連蛋白結合性能的新的流感嗜血桿菌粘附素發明領域[0001]本發明涉及具有粘附性能的層粘連蛋白和玻連蛋白結合蛋白(蛋白F;pF),可在流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)中找到的毒力因子。本發明還涉及包含蛋白F的疫苗組合物。[0002]發明背景[0003]B型流感嗜血桿菌(Hib)和不可分型流感嗜血桿菌(NTHi)都在兒童和成人中引起多種疾病。Hib在年齡低于4歲的兒童中引起細菌性腦膜炎和其他侵入性感染，而NTHi已從中耳炎、竇炎、會厭炎、支氣管炎和肺炎的案例中被分離，并可導致新生兒敗血癥。目前沒有針對NTHi的可商購疫苗，但有多種在使用中的針對Hib的疫苗。這些疫苗由與多種蛋白質載體(腦膜炎球菌外膜復合物、破傷風類毒素、白喉毒素無毒突變體或白喉類毒素)綴合的Hib莢膜多糖、磷酸多核糖基核糖醇組成，綴合的目的是為了克服在低于18月齡的兒童中對莢膜多糖的弱免疫應答。流感嗜血桿菌外膜蛋白(OMP)也被認為是磷酸多核糖基核糖醇的載體，因為顯示它們是在Hib和NTHi感染后的宿主抗體的靶。在針對流感嗜血桿菌感染的體內保護和體外殺菌測定中，已經檢測了針對OMPPI,P2，P4，P5和P6以及98_kDa蛋白的抗體，針對Pl，P4和P6的抗體顯示了針對同源和異源流感嗜血桿菌菌株的生物學活性。針對其他OMP的抗體缺乏異源保護部分地由于這些蛋白質在不同流感嗜血桿菌菌株間的抗原多樣性。因此理想的抗原必須暴露在細菌表面并且抗原性良好保守。例如，在Hib和NTHi菌株二者間廣泛分布且抗原性保守的42-kDa膜蛋白(蛋白D)已經被分離、克隆、測序，并被顯示為致病因子和有效的候選疫苗(Janson等人，1991,Prymula等人,2006).[0004]NTHi發病機制中的初始步驟是對粘膜、基底膜和對細胞外基質(ECM)的粘附。兩種主要類別的大分子構成哺乳動物的ECM，具有結構和粘附功能的纖維性蛋白質(例如層粘連蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白)和以蛋白聚糖形式與蛋白質連接的糖胺聚糖[Heino等人，2009]。ECM穩定組織的物理結構，涉及調節真核細胞粘附、分化、遷移、增殖、形狀和結構。與ECM的細菌性相互作用在宿主組織的定居中起重要作用，并且在正常情況下ECM不暴露于病原體。然而，在由于機械或化學損傷或通過毒素和分解酶活性的細菌/病毒感染的組織損傷后，病原體可進入ECM。[0005]層粘連蛋白是由α，β，和Υ鏈組成的約400_900kDa的異源三聚體，大十字形的糖蛋白家族[Nguyen2006]。存在不同的α，β和y鏈,并且它們組合成不同的層粘連蛋白同種型。層粘連蛋白對上皮的主要作用是將細胞錨定在基底膜上。一些病原體結合層粘連蛋白，例如，結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)[Kinhikar等人,2006]和卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)[Tan等人2006]。[0006]玻連蛋白是ECM的另一個重要組分，其在肝臟中合成并分泌進血漿[綜述見Singh等人，2010b]。大多數血液中的循環玻連蛋白是單體(65和75kDa)，而血管外細胞結合的玻連蛋白是多聚體。在血漿中發現高濃度的玻連蛋白(200-700μg/ml)，其也存在于不同的人組織中。在肝臟、扁桃體、十二指腸、心臟、骨骼肌和肺組織中觀察到特別高的量。[0007]玻連蛋白在包括細胞遷移、粘附和血管生成的許多生物學過程中起關鍵作用[Preissner等人,1998]。玻連蛋白與尿激酶纖溶酶原激活物-尿激酶纖溶酶原激活物受體(uPA-uPAR)復合物和整合素受體的相互作用是涉及舊組織退化(細胞外周蛋白酶水解)、重組和傷口愈合的纖溶酶原激活系統的一部分。因此uPAR-玻連蛋白相互作用是內穩態過程中的關鍵決定因素[Smith等人,2010]。[0008]除了作為ECM的組分以外，玻連蛋白涉及補體激活的末端途徑的調控，以限制先天性免疫應答的自身反應性。膜攻擊復合物(MAC)的形成處于2種抑制劑膜蛋白CD59和玻連蛋白的控制下。玻連蛋白在C5b-7復合物的膜結合位點與其結合，從而抑制復合物插入細胞膜。因此，抑制裂解細胞的MAC的形成和避免細胞裂解[PreiSSner，1991]。在存在玻連蛋白時，C5b-7復合物仍然能夠結合C8和C9以形成C5b-8和C5b_9復合物，但后者是非裂解性的。此外，玻連蛋白通過結合C5b-9阻斷C9的成孔聚合[Preissner等人，1985]。除了利用玻連蛋白作為附著至上皮細胞的橋，包括NTHi的一些病原體使用玻連蛋白作為抑制MAC的有效的補體調控物，以增加在入血清中的存活[Singh等人，2010b]。最近已顯示，一些細菌外膜蛋白，特別是卡他莫拉菌的遍在表面蛋白(UspA2)[Singh等人，2010]和流感嗜血桿菌的蛋白E[HallstrSm等人2009]與玻連蛋白相互作用。[0009]在W02007/084053中描述了名為蛋白E的表面暴露蛋白，所述蛋白質可在流感嗜血桿菌中檢測到。蛋白E是粘附素且也結合玻連蛋白[Ronander2009，HallStrdm2009]。發明總結[0010]鑒于已發現流感嗜血桿菌是上呼吸道和下呼吸道感染的如此重要的原因這一事實，目前需要開發可用于對抗流感嗜血桿菌的疫苗。[0011]因此本發明的目的是進一步研究流感嗜血桿菌與體內細胞相互作用和與免疫系統相互作用的方式，能夠提供針對流感嗜血桿菌的新型有效疫苗。[0012]根據一個方面，本發明提供了可在流感嗜血桿菌中檢測到的具有根據序列IDN0.1的氨基酸序列的表面暴露蛋白，或其片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:1的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:1的多肽的免疫應答。[0013]根據另一個方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含根據權利要求1的表面暴露蛋白的免疫原性片段，所述片段可在流感嗜血桿菌中被檢測到。[0014]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含基于上述蛋白質的免疫原性蛋白質，其中SEQIDN0.1的第1-11或1_22位氨基酸中的一個或多個已被缺失或被一個或多個氨基酸替換。在一個實施方案中，SEQIDN0.1的第1-11或1_22位氨基酸中的一個或多個已被0-11或0-22個任選氨基酸序列替換。[0015]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含具有根據序列IDNO:2的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:2的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:2的多肽的免疫應答。[0016]還根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含具有根據序列IDNO:3的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:3的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:3的多肽的免疫應答。[0017]還根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含具有根據序列IDNO:4的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:4的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:4的多肽的免疫應答。[0018]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含具有根據序列IDNO:5的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:5的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:5的多肽的免疫應答。[0019]根據另一個方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含具有根據序列IDNO:6的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:6的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:6的多肽的免疫應答。[0020]仍然根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含具有根據序列IDNO:7的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:7的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:7的多肽的免疫應答。[0021]根據另一個方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含具有根據序列IDNO:8的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:8的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:8的多肽的免疫應答。[0022]還根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含具有根據序列IDNO:9的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:9的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:9的多肽的免疫應答。[0023]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含具有根據序列IDNO:10的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:10的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:10的多肽的免疫應答。[0024]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含具有根據序列IDNO:11的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:11的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:11的多肽的免疫應答。[0025]仍然根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含具有根據序列IDNO:12的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:12的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:12的多肽的免疫應答。[0026]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含具有根據序列IDNO:13的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:13的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:13的多肽的免疫應答。[0027]根據另一個方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含具有根據序列IDNO:14的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:14的氨基酸序列中的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:14的多肽的免疫應答。[0028]根據一個方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含根據上文的蛋白質或片段的至少一種二聚體、三聚體或多聚體。[0029]根據另外的方面，本發明提供了根據上文的疫苗組合物，其還包含一種或多種可藥用的佐劑、運載體、賦形劑、黏合劑、載體、防腐劑、緩沖劑、乳化劑、濕潤劑或促轉染化合物。[0030]在另一個方面，本發明提供了根據上文的疫苗組合物，其包含至少另一種疫苗。[0031]根據另外的方面，本發明提供了根據上文的疫苗組合物，其包含另一種分子的免疫原性部分。[0032]根據另外的方面，本發明提供了上述疫苗組合物，其中另一種分子的免疫原性部分選自流感嗜血桿菌的蛋白D，pilA或蛋白E，卡他莫拉菌的MID，卡他莫拉菌的UspAl或UspA2，和在人或動物中發現的任意呼吸道病原體的外膜蛋白。[0033]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含編碼上述蛋白質或片段的核酸序列，以及其同源物、多態性、簡并物和剪接變體。[0034]根據另一個方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含重組核酸序列，所述重組核酸序列包含與至少另一個基因融合的根據上文的核酸序列。[0035]還根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含質粒或噬菌體，所述質粒或噬菌體包含上述核酸序列。[0036]還根據另一個方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含非人宿主，所述宿主包含至少一種根據上文的質粒并能夠生產上述蛋白質或片段，所述宿主選自細菌、酵母和植物。[0037]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含上述宿主，所述宿主是大腸桿菌(E.coli)ο[0038]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含融合蛋白或多肽，其中通過利用上述重組核酸序列組合根據上文的蛋白質或片段與至少另一種蛋白質。[0039]根據另一個方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含根據上文的融合蛋白，所述蛋白是上述蛋白質或片段的二聚體、三聚體或多聚體。[0040]根據一個方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含融合產物，其中根據上文的蛋白質或片段或肽與蛋白質、碳水化合物或基質共價結合，或通過任意其他方式結合。[0041]根據另一個方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含分離的多肽，所述多肽包含與SEQIDN0:1的氨基酸序列在SEQIDNO:1的全長上具有至少85%同一性的氨基酸序列。[0042]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含如在權利要求31中要求保護的分離的多肽，其中氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少95%的同一性。[0043]還根據另外的方面，本發明提供了上述疫苗組合物，其包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。[0044]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含SEQIDNO:1的分離的多肽。[0045]根據另一個方面，本發明提供了上述疫苗組合物，其中所述多肽缺乏SEQIDNO:1的信號肽(氨基酸1-22)。[0046]在一個實施方案中本發明提供了疫苗組合物，其包含免疫原性片段，所述免疫原性片段包含具有來自SEQIDNO:1的氨基酸序列或來自上述多肽的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDN0:1的多肽(或上述多肽，分別地)的免疫應答，或能夠結合玻連蛋白和層粘連蛋白。[0047]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含上述多肽或免疫原性片段，其中所述多肽或所述免疫原性片段是較大的融合蛋白的一部分。[0048]根據另一個方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼上述多肽或免疫原性片段。[0049]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，或與所述分離的多核苷酸互補的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼在SEQIDNO:1的全長上與SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少85%同一性的多肽。[0050]根據另一個方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，或與所述分離的多核苷酸互補的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列在整個編碼區上與編碼SEQIDNO:1的多肽的核苷酸序列具有至少85%同一性。[0051]還根據另外的方面`，本發明提供了疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，或與所述分離的多核苷酸互補的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列在SEQIDNO:15的全長上與SEQIDNO:15的核苷酸序列具有至少85%同一性。[0052]根據另外的方面，本發明提供了上述疫苗組合物，其中分離的多核苷酸與SEQIDNO:15的同一性為至少95%。[0053]在一個實施方案中本發明提供了疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼SEQIDNO:1的多肽，或上述免疫原性片段的核苷酸序列。[0054]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含SEQIDNO:15的多核苷酸。[0055]還根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼SEQIDNO:1的多肽的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸可通過在嚴格雜交條件下用具有SEQIDNO:15的序列或其片段的經標記的探針篩選合適的文庫得到。[0056]在另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含表達載體或重組的活微生物，所述表達載體或重組的活微生物包含根據上文的分離的多核苷酸。[0057]還在另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含重組的活微生物，所述重組的活微生物包含根據上文的表達載體。[0058]根據另外的方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含宿主細胞，所述宿主細胞包含上述表達載體。[0059]根據另一個方面，本發明提供了疫苗組合物，其包含根據上文的宿主細胞的膜，所述宿主細胞表達分離的多肽，所述分離的多肽包含與SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。[0060]還根據另外的方面，本發明提供了生產根據上文的疫苗組合物的方法，所述方法包括在足以生產所述多肽或所述免疫原性片段的條件下培養上述宿主細胞，和從培養基中回收多肽。[0061]在一個實施方案中本發明提供了生產根據上文的疫苗組合物的方法，所述方法包括用包含至少一種所述多核苷酸的表達載體轉化宿主細胞，和在足以表達任一種所述多核苷酸的條件下培養所述宿主細胞。[0062]在另一個實施方案中本發明提供了疫苗組合物，其包含有效量的上述多肽或免疫原性片段和可藥用的賦形劑。[0063]還在另一個實施方案中本發明提供了疫苗組合物，其包含有效量的上述多核苷酸和可藥用的賦形劑。[0064]根據一個方面，本發明提供了根據上文的疫苗組合物，其中所述組合物包含至少另一種流感嗜血桿菌抗原。[0065]根據另外的方面，本發明提供了根據上文的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的肺炎球菌溶血素一起配制。[0066]根據另一個方面，本發明提供了上述疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自卡他莫拉菌的Omp106—起配制。[0067]根據另一個方面，本發明提供了根據上文的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自卡他莫拉菌的UspAl和/或UspA2—起配制。[0068]在一個實施方案中本發明提供了根據上文的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自卡他莫拉菌的Hly3—起配制。[0069]在另一個實施方案中本發明提供了上述疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自卡他莫拉菌的Omp⑶一起配制。[0070]根據另外的方面，本發明提供了根據上文的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自卡他莫拉菌的D15—起配制。[0071]根據另一個方面，本發明提供了根據上文的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自流感嗜血桿菌的0mp26—起配制。[0072]還根據另一個方面，本發明提供了上述疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自流感嗜血桿菌的P6—起配制。[0073]根據另外的方面，本發明提供了根據上文的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自流感嗜血桿菌的蛋白D或E—起配制。[0074]根據另外的方面，本發明提供了根據上文的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自流感嗜血桿菌的NlpC2—起配制。[0075]根據另外的方面，本發明提供了上述疫`苗組合物，所述疫苗組合物和來自流感嗜血桿菌的Slp或PilA—起配制。[0076]在一個實施方案中本發明提供了根據上文的疫苗在制造用于預防或治療感染的藥物中的用途。[0077]在另外的實施方案中本發明提供了根據上文的用途，其中所述感染由流感嗜血桿菌導致。[0078]根據另外的方面，本發明提供了根據上文的用途，其中流感嗜血桿菌是有莢膜的或不可分型的。[0079]還根據另外的方面，本發明提供了上述用途，用于預防或治療在患有例如慢性阻塞性肺病(COPD)的兒童和成人中的中耳炎、竇炎或下呼吸道感染。[0080]根據另一個方面，本發明提供了藥物，其包含根據上文的至少一種蛋白質、片段或肽和一種或多種可藥用的佐劑、運載體、賦形劑、黏合劑、載體、防腐劑、緩沖劑、乳化劑、濕潤劑或促轉染化合物。[0081]還根據另一個方面，本發明提供了分離根據上文的蛋白質、片段或肽的方法，所述方法包括以下步驟:[0082]a)培養包含編碼所述蛋白質、片段或肽的DNA的流感嗜血桿菌或大腸桿菌，收獲細菌并分離外膜、外膜囊泡或內含體；[0083]b)用強溶解劑(solvatisingagent)溶解內含體；[0084]c)加入復性劑；和[0085]d)用pH從8至10的緩沖液透析得到的懸浮液。[0086]根據另外的方面，本發明提供了根據上文的方法，其中溶解劑是鹽酸胍。[0087]還根據另外的方面，本發明提供了上述方法，其中復性劑是精氨酸。[0088]根據另一個方面，本發明提供了制備上述疫苗的方法，其中所述蛋白質、片段或肽和賦形劑一起配制。[0089]根據另外的方面，本發明提供了預防或治療在個體中的感染的方法，包括施用藥物有效量的根據上文的疫苗組合物。[0090]在一個實施方案中所述感染由有莢膜的或不可分型的流感嗜血桿菌導致，并且還在另一個實施方案中所述感染選自中耳炎、竇炎或下呼吸道感染。[0091]在一個方面本發明涉及編碼上述蛋白質、片段或肽的核酸序列，以及其同源物、多態性、簡并物和剪接變體。在一個實施方案中，所述核酸序列與至少另一個基因融合。[0092]在另一個方面本發明涉及包含上述核酸序列的質粒或噬菌體。[0093]還在另一個實施方案中本發明涉及非人宿主，其包含至少一種上述質粒并能夠生產上述蛋白質、片段或肽，以及其同源物、多態性、簡并物和剪接變體，所述宿主選自細菌、酵母和植物。在一個實施方案中，所述宿主是大腸桿菌。[0094]還在另一個方面，本發明提供了融合蛋白或多肽，其中上述蛋白質、片段或肽通過利用上述重組核酸序列與至少另一種蛋白質組合。在一個實施方案中，所述融合蛋白質是上述蛋白質、片段或肽的二聚體、三聚體或多聚體。[0095]在一個方面，本發明涉及融合產物，其中上述蛋白質或片段或肽與蛋白質、碳水化合物或基質共價結合，或通過任意其他方式結合。[0096]本發明涉及蛋白F，特別是蛋白F多肽和蛋白F多核苷酸，重組材料和其生產方法。在另一個方面，本發明涉及使用這些多肽和多核苷酸的方法，尤其包括微生物疾病的預防和治療。在另外的方面，本發明涉及用于檢測與微生物感染相關的疾病和與這些感染相關的病況的診斷測定，例如用于檢測蛋白F多核苷酸或多肽的表達或活性的測定。[0097]通過閱讀下面的描述和閱讀本公開內容的其他部分，在公開的發明的精神和范圍內的多種改變和修改對本領域技術人員而言將是顯而易見的。[0098]附圖描沭[0099]圖1.使用玻連蛋白作為誘餌，在I維和2維凝膠電泳(2D-SDS-PAGE)中都檢測到29kDa玻連蛋白結合流感嗜血桿菌蛋白。制備來自缺乏(_)或存在(+)C02的臨床分離物ΝΤΗ?3655的外膜囊泡(OMV)。運行SDS-PAGE并印跡至尼龍濾器上(左圖)。也對來自存在CO2時培養的培養物的OMV進行2D-SDS-PAGE(右圖)。對I維和2維凝膠，平行運行2塊對應的凝膠。一塊凝膠印跡至尼龍濾器(A)，一塊用考馬斯藍染色(B)。加入人血漿玻連蛋白，隨后用山羊抗玻連蛋白PAb探測濾器，然后使用HRP綴合的驢抗綿羊pAb檢測(A:1)。在圖A:1i中，顯示了僅與一抗和二抗pAb孵育(沒有玻連蛋白)的濾器以排除二抗的背景結合。從考馬斯染色的凝膠中切出對應推定的玻連蛋白結合蛋白的點(B)并通過MALD1-ToF測序。在圖A:1和B中用箭頭顯不pF。[0100]圖2.包括NTHi3655中蛋白F(SEQIDNo:1)的信號肽的DNA序列和翻譯的開放閱讀框。在㈧中顯示了DNA序列連同翻譯的蛋白質序列，在⑶中概述了指示不同預測區的PF的示意圖。[0101]圖3.蛋白F在不同的流感嗜血桿菌菌株的組中同源性很高。通過Clustal分析比較了在GeneBank中發現的對應H10362的不同的pF氨基酸序列。[0102]圖4.在大腸桿菌中生產重組pF12-293。使用流感嗜血桿菌DNA作為模板，通過PCR擴增對應缺乏預測的信號肽的N-端部分(氨基酸pFl-ΙΙ)的pF的開放閱讀框的序列并克隆進PET26中，然后轉化大腸桿菌，隨后誘導，表達并使用鎳樹脂通過親和層析純化。在㈧中顯示了考馬斯染色的凝膠，并在⑶中顯示了使用兔抗PF血清和HRP綴合的豬抗兔PAb檢測pF的蛋白質印跡。包括來自NTHi3655和卡他莫拉菌Bc5的外膜囊泡(OMV)分別作為陽性和陰性對照。卡他莫拉菌OMV證明了兔抗血清的特異性。[0103]圖5.可在不可分型`流感嗜血桿菌的外膜中找到蛋白F。(A)考馬斯染色的凝膠，指示了臨床NTHi分離物。(B)蛋白質印跡，顯示了pF的位置。對來自8種不同的臨床NTHi分離物的外膜蛋白(OMP)進行SDS-PAGE并使用特異性兔抗pF抗血清分析pF表達。[0104]圖6.pF缺陷的NTHi3655突變體在表面不表達pF。(A)NTHi3655野生型(WT)的流式細胞譜顯示在缺乏一級抗pF兔pAb的條件下山羊抗兔pAb-FITC的背景值。(B)通過特異性抗PFpAb判斷的NTHi3655上的蛋白F表達。(C)在缺乏抗pF兔pAb的條件下NTHi3655Apf突變體的熒光。(D)pF缺陷NTHi3655Λpf突變體在表面不表達pF。如在材料和方法中描述地制造含有cat基因的NTHi3655Apf突變體。在肉湯中過夜培養得到的突變體和野生型細菌并洗滌。之后，如指示地加入一級和檢測pAb，然后在冰上孵育，洗滌和最后在流式細胞儀中分析。抗PF抗血清在兔中產生。在用重組PF12-293和佐劑免疫3次后，針對PF12-293免疫純化得到的兔抗血清。顯示了具有類似結果的3次實驗中的一次典型實驗。[0105]圖7.重組pF(氨基酸12-293)結合玻連蛋白且表達pF的NTHi3655相比pF缺陷突變體NTHi3655APf顯著結合更多的玻連蛋白。(A)相比重組流感嗜血桿菌蛋白E，最近公開的粘附素[Ronander等人，2009]，玻連蛋白與pF12_293的結合稍好。(B)相比野生型細菌，缺乏PF的流感嗜血桿菌突變體具有顯著降低的與玻連蛋白的結合。在(A)中，在微滴定板中包被重組蛋白質并使用人玻連蛋白和兔抗玻連蛋白pAb分析所述重組蛋白質的玻連蛋白的結合。包括與玻連蛋白高度結合的卡他莫拉菌蛋白UspA230-539[Singh等人，2010a]作為陽性對照。MID962-1200指示陰性對照，其是源自卡他莫拉菌菌株“Bc5”的重組表達的蛋白質。牛血清白蛋白(BSA)是另一個陰性對照。在(B)中，NTHi3655和pF突變體NTHi3655APf與[125I]標記的玻連蛋白孵育。30分鐘后洗滌細菌并在Y-閃爍計數器中進行測量。數據代表在圖A和B每者中的3次獨立實驗。[0106]圖8.蛋白F12-293結合ECM蛋白層粘連蛋白。重組pF或pE附著于微滴定板中的塑料表面。加入小鼠肉瘤層粘連蛋白，然后使用兔抗層粘連蛋白PAb和HRP綴合的山羊抗兔PAb(作為第二層)進行檢測。包括BSA作為陰性對照。顯示了3次獨立實驗的平均值。[0107]圖9.重組PF12-293結合上皮細胞。在24孔板中將II型肺泡上皮細胞系A549培養至匯合，洗滌并用甲醛固定。之后，將濃度增加的重組PF12-293與細胞孵育，隨后進行充分洗滌步驟。用抗PF兔抗血清和HRP綴合的山羊抗兔pAb(作為第二層)檢測蛋白F。顯示了3次獨立實驗中的一次典型實驗。[0108]圖10.當與表達pF的野生型比較時，pF缺陷NTHi突變體具有顯著降低的與上皮細胞的結合能力。在24孔板中將A549上皮細胞培養至匯合。在存在[3H]-胸苷的條件下培養細菌3小時。將NTHi3655野生型(WT)或pF缺陷突變體(Apf)添加至細胞，然后孵育2小時。之后洗3次細胞，胰蛋白酶消化并在β-閃爍計數器中測量。使用不同的感染復數(MOI)。對成對的數據通過Studentt檢驗得到p值。顯示了3次獨立實驗的平均值+SD0[0109]圖11.用于繪制如在圖12中表明的pF的上皮細胞結合區的肽的列表。[0110]圖12.主要是pF氨基酸殘基23-48結合上皮細胞。顯示了(A)H292和(B)A549上皮細胞系的結果。在T25燒瓶中培養細胞至匯合，通過胰蛋白酶-EDTA分離，然后洗滌。之后進行直接結合測定(DBA)。以摩爾比例加入[125I]-標記的肽并與細胞在+4°C孵育30分鐘。在Y-閃爍計數器中測量放射性。[0111]圖13.當通過流式細胞術分析時，抗pF44-68pAb識別NTHi3655表面上的pF。比較表達PF的NTHi3655野生型(A和B)和pF缺陷的NTHi3655Δpf突變體(C和D)。(A)和(C)指示在缺乏特異性抗pF44-68pAb的條件下的背景值。使用附著于CnBr-Sepharose柱的肽PF44-68從抗pF12-293抗血清中免疫純化識別pF44_68的抗體。pF44_68是通過生物信息學分析揭示的預測的免疫原性區(未顯示)。如指示加入一級和檢測pAb，然后在冰上孵育，洗滌，最后在流式細胞儀中分析。[0112]發明詳沭[0113]在詳細地解釋本發明以前，理解本發明不受限于此申請中的實施方案和本文描述的步驟的細節是重要的。提到的實施例是為了說明本發明，但不以任何方式限制本發明。本發明能夠包括其他實施方案且能夠以多種方式實踐或實施。應當理解，本文使用的措辭和術語僅是為了描述的目的而不是限制。[0114]本申請描述了名為蛋白F(pF)的新的流感嗜血桿菌外膜蛋白的克隆和表達。使用人玻連蛋白作為誘餌發現了此蛋白質。[0115]為了最大化重組PF的產量，制造了由氨基酸殘基A12至K293組成的截短的pF片段。因此去除包括氨基酸pFl-11的預測的信號肽的N-端部分并替換為前導肽外加源自載體pET26(+)的9個殘基。將截短的pF命名為pF12-293。[0116]本發明包含嗜血桿菌屬外膜蛋白pF和pF衍生肽pF23_48(SEQIDNo:2),PF44-68(SEQIDNo:3)，pF64_88(SEQIDNo:4)，pF84_108(SEQIDNo:5)，pF104_128(SEQIDNo:6),pF124-148(SEQIDNo:7),pF144_168(SEQIDNo:8),pF164_188(SEQIDNo:9)，pF184-209(SEQIDNo:10)，pF204_230(SEQIDNo:11)，pF225_255(SEQIDNo:12)，pF250-275(SEQIDNo:13)，pF270_293(SEQIDNo:14)，及其二聚體、三聚體或寡聚體。特別地，給予PF或表面暴露的衍生肽的序列更高的優先性。[0117]因此，根據本發明的疫苗組合物包含可在所有流感嗜血桿菌中檢測到的具有根據SEQIDNo:1的氨基酸序列的表面暴露的蛋白質，和/或具有根據SEQIDNo:2_14的氨基酸序列的肽，或其片段，同源物、功能等同物、衍生物、簡并物或羥基化、磺化或糖基化產物或其其他二級加工產物作為免疫原性組分。疫苗組合物也可包含根據本發明的融合蛋白或多肽，或融合產物作為免疫原性組分。免疫原性組分能夠引發針對流感嗜血桿菌的抗體或其他免疫應答，其中引發的抗體抑制流感嗜血桿菌細菌對對象的細胞的致病機制。根據本發明的疫苗組合物的“免疫原性劑量”是這樣的劑量，其在施用后產生相比施用前的標準免疫應答的可檢測的體液和/或細胞免疫應答。[0118]在本發明的疫苗組合物中使用的產生抗原的核酸序列可通過多種程序插入任意多種表達載體。這樣的程序被認為是本領域技術人員公知的。[0119]使用公知的方法和技術容易實現疫苗組合物，并可以多種方式，優選胃腸外或鼻內施用疫苗組合物。適于胃腸外或鼻內施用的制劑包括水性和非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與考慮中的對象的體液等滲的溶質；和水性和非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑或增稠劑。活性免疫原性成分經常與可藥用的賦形劑，例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等混合。此外，疫苗組合物可還含有少量輔助物質，例如濕潤劑或乳化劑、PH緩沖劑、黏合劑、載體或防腐劑。[0120]疫苗組合物也可包括用于增強組合物的免疫原性的佐劑，例如弗氏佐劑和本領域公知的其他系統。[0121]疫苗組合物的免疫原性組分，即本發明的蛋白質、片段、肽、融合蛋白或多肽或融合產物可作為中性或鹽的形式配制`進疫苗。[0122]疫苗組合物的劑量將取決于疫苗的比活，并可通過常規實驗容易地測定。以治療有效的和免疫原性的量施用疫苗組合物，并且量取決于對象。[0123]本發明涉及在下文中更詳細描述的蛋白F多肽和多核苷酸。特別地，本發明涉及流感嗜血桿菌的蛋白F的多肽和多核苷酸。蛋白F多肽具有信號序列并暴露在細菌的表面。信號肽位于蛋白F多肽的第I位殘基至第22位殘基。[0124]本文中提及的“蛋白F”指本文中討論的本發明的任意肽、免疫原性片段、融合物、多肽或蛋白質(例如SEQIDNO:1，有或沒有信號序列，或其中信號肽的第1-11位(預測的信號肽的N-端部分)或第1-22位的氨基酸可被缺失或替換為一種或多種氨基酸)。[0125]“編碼蛋白F的多核苷酸”指編碼本文中討論的本發明的任意肽、免疫原性片段、融合物、多肽或蛋白質的任意多核苷酸序列。[0126]本文中的術語“包含”可可選地替換為術語“由...組成”。[0127]應當理解，在下文的序列表中引用的作為“DNA”的序列代表本發明的實施方案的示例，因為普通技術人員將認識到這些序列一般可有用地應用在包括多核糖核苷酸的多核苷酸中。[0128]蛋白F的序列在SEQIDNo:1中示出(來自NTHi菌株3655)。用于繪制pF的上皮細胞結合區的蛋白F編碼的肽序列在SEQIDNo:2-14中示出(來自NTHi菌株3655)。蛋白F多核苷酸的序列在SEQIDNO:15中示出。[0129]多肽[0130]在本發明的一個方面提供了在本文中將其稱為“蛋白F”和“蛋白F多肽”的流感嗜血桿菌(特別是不可分型流感嗜血桿菌)的多肽，及其在生物、診斷、預防、臨床或治療上有效的變體，和包含所述多肽或變體的組合物。[0131]本發明還提供了:[0132](a)分離的多肽，其包含與SEQIDNO:1_14中的任意序列具有至少85%同一性，優選地至少90%同一性，更優選地至少95%同一性，最優選地至少97-99%同一性或完全相同的氨基酸序列，[0133](b)由分尚的多核苷酸編碼的多肽,所述分尚的多核苷酸包含與SEQIDN0:15的任意序列在SEQIDNO:15的選擇的序列的全長上具有至少85%同一性，優選地至少90%同一性，更優選地至少95%同一性，甚至更優選地至少97-99%同一性或完全相同的多核苷酸序列；或[0134](C)由分離的多核苷酸編碼的多肽，所述分離的多核苷酸包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼與SEQIDNO:1-14的任意序列的氨基酸序列具有至少85%同一性，優選地至少90%同一性，更優選地至少95%同一性，甚至更優選地至少97-99%同一性或完全相同的多肽。[0135]在SEQIDNO:1_14中提供的蛋白F多肽是來自不可分型流感嗜血桿菌菌株的蛋白F多肽。已經從圖3列出的流感嗜血桿菌菌株中確認了其他蛋白F序列。[0136]本發明也提供了蛋白F多肽的免疫原性片段，即，蛋白F多肽的連續部分，其與包含選自SEQIDNO:1-14的相應氨基酸序列的多肽具有相同或基本相同的免疫原性活性。也就是說，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別蛋白F多肽的免疫應答。這樣的免疫原性片段可包括，例如缺乏N-端前導序列或其部分，和/或跨膜結構域和/或C-端錨定結構域的蛋白F多肽。在優選的方面，根據本發明的蛋白F的免疫原性片段包含與選自SEQIDNO:1-14的序列在所述序列的全長上具有至少85%同一性，優選地至少90%同一'I"生，更優選地至少95%同一'丨生,最優選地至少97-99%同一'丨生的多肽的基本全部的胞外結構域。[0137]片段是具有與本發明的任意多肽的任意氨基酸序列的部分地而不是全部完全相同的氨基酸序列的多肽。與蛋白F多肽一樣，片段可為“獨立的”，或包含在較大的多肽中，片段形成所述較大的多肽的部分或區域，最優選地作為單個較大多肽中的單個連續區域。因此片段可比全長天然序列短，或如果其包含在較大的多肽中的話，其可為全長天然序列或較長的融合蛋白。[0138]優選的片段包括，例如具有選自SEQIDNO:1_14的氨基酸序列或其變體的一部分的截短多肽，例如包括氨基和/或羧基末端氨基酸序列的連續的系列殘基。也優選通過宿主細胞或在宿主細胞中生產的本發明的多肽的降解形式。還優選通過結構或功能特性表征的片段，例如包含α-螺旋和α-螺旋形成區、折疊和折疊形成區、轉角和轉角形成區、卷曲和卷曲形成區、親水區、疏水區、a兩親性區、β兩親性區、彈性區、表面形成區、底物結合區和高抗原指數區的片段。[0139]其他優選的片段包括包含具有選自SEQIDNO:1_14的氨基酸序列的至少15，20，30，40，50或100個連續的氨基酸的氨基酸序列的分離的多肽，或包含具有從選自SEQIDNO:1-14的氨基酸序列截短或缺失了至少15，20，30，40，50或100個連續的氨基酸的氨基酸序列的分離的多肽。[0140]還優選的片段是包含B細胞表位的片段，例如在圖11中描述的那些片段/肽。[0141]本發明的全長蛋白F的片段可用于通過肽合成生產相應的全長多肽；因此，這些片段可用作生產全長蛋白F或基于本發明的蛋白F序列的其他多肽的中間體。[0142]特別優選的是下述變體，其中若干，5-10，1-5，1-3，1-2或I個氨基酸以任意組合被替換、缺失或添加。[0143]本發明的多肽，或免疫原性片段可為“成熟”蛋白質的形式或可為較大的蛋白質例如前體或融合蛋白的一部分。包括這樣的額外的氨基酸序列常常是有利的，所述額外的氨基酸序列含有分泌或前導序列、前序列、幫助純化的序列例如多組氨酸殘基，或用于重組生產期間的穩定性的額外序列。此外，也考慮添加外源多肽或脂類尾或多核苷酸序列以增加最終分子的免疫原性潛能。[0144]在一個方面，本發明涉及經遺傳改造的可溶性融合蛋白，其包含本發明的多肽，或其片段，和多種亞型(IgG，IgM,IgA,IgE)的免疫球蛋白重或輕鏈的恒定區的多個部分。[0145]作為免疫球蛋白，優選人IgG，特別是IgGl的重鏈的恒定部分，其中融合發生在鉸鏈區。在特定的實施方案中，可簡單地通過并入切割序列去除Fe部分，所述切割序列可被凝血因子Xa切割。[0146]此外，此發明涉及通過基因工程制備這些融合蛋白的方法，及其用于藥物篩選、診斷和療法的用途。本發明的另一個方面也涉及編碼這些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術的實例可見W094/29458和W094/22914。[0147]蛋白質可為化學綴合的，或表達為重組融合蛋白，所述重組融合蛋白允許較之非融合蛋白在表達系統中以增加的水平生產。融合伙伴可幫助提供T輔助表位(免疫融合伙伴)，優選地人識別的T輔助表位，或幫助以高于天然重組蛋白的產率表達蛋白質(表達增強子)。優選地融合伙伴將既是免疫融合伙伴又是表達增強伙伴。[0148]融合伙伴包括來自流感嗜血桿菌的蛋白D(EP594610)，來自流感嗜血桿菌的蛋白E(EP1973933)和/或來自流感病毒的非結構蛋白，NSl(血凝素)。另一種融合伙伴是名為0mp26的蛋白質(W097/01638)。另一種融合伙伴是名為LytA的蛋白質。優選地使用分子的C端部分。LytA源自肺炎鏈球菌，其合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，酰胺酶LytA，(由IytA基因編碼{Gene，43(1986)第265-272頁})，特異性降解肽聚糖骨架中的某些鍵的自溶素。LytA蛋白的C-端結構域負責對膽堿或對一些膽堿類似物例如DEAE的親和力。此性能已被用于開發用于表達融合蛋白的大腸桿菌C-LytA表達質粒。已經描述了在其氨基端含有C-LytA片段的雜種蛋白的純化{Biotechnology:10，(1992)第795-798頁}。可以使用在C末端中發現的從第178位殘基開始的LytA分子的重復部分，例如第188-305位殘基。[0149]本發明也包括上述蛋白F和肽的變體，即通過保守氨基酸替換與參考物不同的肽，其中殘基被具有相似特征的另一種殘基替換。一般這樣的替換在Ala，Val,Leu和Ile之間；Ser和Thr之間；酸性殘基Asp和Glu之間；Asn和Gln之間；和堿性殘基Lys和Arg之間；或芳香性殘基Phe和Tyr之間。[0150]本發明的多肽可以任意的合適方式制備。這樣的多肽包括分離的天然存在的多肽、重組生產的多肽、合成生產的多肽，或通過這些方法的組合生產的多肽。制備這樣的多肽的方式是本領域眾所周知的。[0151]最優選地，本發明的多肽源自不可分型流感嗜血桿菌，然而其可優選地從相同分類學屬的其他生物中得到。本發明的多肽也可從例如相同分類學科或目的生物中得到。[0152]多核苷酸[0153]本發明的目的是提供編碼蛋白F多肽的多核苷酸，特別是編碼本文命名為蛋白F的多肽的多核苷酸。[0154]在本發明的特別優選的實施方案中，多核苷酸包含編碼蛋白F多肽的區域，所述區域包含在SEQIDNO:15中示出的序列，所述序列包括全長基因或其變體。[0155]在SEQIDNO:15中提供的蛋白F多核苷酸是來自不可分型流感嗜血桿菌菌株3655的蛋白F多核苷酸。已經測定了在圖3列出的來自流感嗜血桿菌菌株的編碼蛋白F的基因的其他序列。[0156]作為本發明的另外的方面，提供了編碼和/或表達蛋白F多肽和多核苷酸，特別是不可分型流感嗜血桿菌蛋白F多肽和多核苷酸的分離的核酸分子，包括，例如未加工的RNA，核酶RNA，mRNA,cDNA，基因組DNA，B-和Z-DNA。本發明的其他實施方案包括生物學、診斷、臨床、預防或治療上有用的多核苷酸和多肽，及其變體，和包含所述多核苷酸、多肽或變體的組合物。[0157]本發明的另一個方面涉及分離的多核苷酸，其包括至少一個全長基因，所述基因編碼具有SEQIDNO:1-14的推斷的氨基酸序列的蛋白F多肽，和與其密切相關的多核苷酸及其變體。[0158]在本發明的另一個特別優選的實施方案中涉及來自不可分型流感嗜血桿菌的蛋白F多肽，其包含選自SEQIDNO:1-14或其變體的氨基酸序列或由上述序列組成。[0159]使用本文提供的信息，例如在SEQIDNO:15中示出的多核苷酸序列，可使用標準克隆和篩選方法得到編碼蛋白F多肽的本發明的多核苷酸，所述標準克隆和篩選方法例如用于從細菌中克隆和測序染色體DNA片段的方法，使用不可分型流感嗜血桿菌菌株3224A(或3655)細胞作為起始材料，然后得到全長克隆。[0160]此外，在SEQIDNO:15中示出的每個DNA序列含有開放閱讀框，所述開放閱讀框編碼具有大約在SEQIDNO:1中不出的氣基酸殘基數的蛋白質,所述蛋白質具有使用本領域技術人員熟知的氨基酸殘基分子量值可計算的推斷的分子量。[0161]在起始密碼子和終止密碼子之間的SEQIDNO:15的多核苷酸分別編碼SEQIDNO:1的多肽。[0162]在另外的方面，本發明提供了分離的多核苷酸，其包含下述序列或由下述序列組成:[0163](a)多核苷酸序列，其與來自SEQIDNO:15的任意多核苷酸序列在來自SEQIDNO:15的多核苷酸序列的全長上具有至少85%同一性，優選地至少90%同一性，更優選地至少95%同一性，甚至更優選地至少97-99%同一性或完全相同；或[0164](b)編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽與來自SEQIDNO:1_14(或其片段)的任意氨基酸序列在來自SEQIDNO:1-14(或其片段)的氨基酸序列的全長上具有至少85%同一性，優選地至少90%同一性，更優選地至少95%同一性，甚至更優選地至少97-99%同一性或100%完全相同。[0165]可通過包括下述步驟得到編碼本發明的多肽的多核苷酸，包括來自除了不可分型流感嗜血桿菌以外的物種的同源物和直向同源物，所述步驟包括在嚴格雜交條件下(例如，使用45-65°C范圍內的溫度和從0.1-1%的SDS濃度)使用經標記的或可檢測的探針篩選合適的文庫，所述探針由選自SEQIDNO:15或其片段的任意序列組成或包含所述任意序列；和分離含有所述多核苷酸序列的全長基因和/或基因組克隆。[0166]本發明提供了多核苷酸序列，其在其全長上與在SEQIDNO:15中示出的編碼序列(開發閱讀框)相同。[0167]本發明也提供了成熟多肽或其片段自身的編碼序列，以及與另一種編碼序列(例如編碼前導或分泌序列、前蛋白或原蛋白或前原蛋白序列的序列)符合讀框的成熟多肽或其片段的編碼序列。本發明的多核苷酸也可含有至少一種非編碼序列，包括例如，但不限于至少一種非編碼5’和3’序列，例如被轉錄但不被翻譯的序列，終止信號(例如依賴rho的和不依賴rho的終止信號)，核糖體結合位點,Kozak序列,穩定mRNA的序列，內含子和多聚腺苷酸化信號。多核苷酸序列也可包含編碼額外的氨基酸的額外的編碼序列。例如，可編碼幫助純化融合多肽的標記物序列。在本發明的某些實施方案中，標記物序列是如在PQE載體(Qiagen,Inc.)中提供的和在Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA86:821-824(1989)中描述的六組氨酸肽，或HA肽標簽(Wilson等人，Cell37:767(1984)，二者都可用于純化與其融合的多肽。本發明的多核苷酸也包括，但不限于，包含結構基因及其天然相關的控制基因表達的序列的多核苷酸。[0168]編碼SEQIDNO:1_14的蛋白F多肽的核苷酸序列可與編碼SEQIDNO:15的(或SEQIDN0:15包含的)序列的對應多核苷酸相同。可選地其可為任意序列，所述序列由于遺傳密碼的冗余性(簡并性)，也編碼SEQIDNO:1-14的多肽。[0169]本文中使用的術語“編碼多肽的多核苷酸”涵蓋包括這樣的序列的多核苷酸，所述序列編碼本發明的多肽，特別是細菌多肽和更特別地具有在SEQIDNO:1-14的任意序列中示出的氨基酸序列的不可分型流感嗜血桿菌的多肽蛋白F或其片段的序列。術語也涵蓋下述多核苷酸，其包括編碼多肽的單個連續區或不連續區(例如，被整合的噬菌體、整合的插入序列、整合的載體序列、整合的轉座子序列，或由于RNA編輯或基因組DNA重組中斷的多核苷酸)和也可含有編碼和/或非編碼序列的額外的區域。[0170]本發明也涉及本文描述的多核苷酸的變體，所述變體編碼具有SEQIDNO:1-14的任意序列的推斷的氨基酸序列的多肽的變體。本發明的多核苷酸片段可用于，例如合成本發明的全長多核苷酸。[0171]優選的片段是編碼B細胞表位(例如在圖11中描述的片段/肽)的多核苷酸，和包含所述多核苷酸片段的重組、嵌合基因。[0172]還特別優選的實施方案是編碼蛋白F變體的多核苷酸，所述變體具有來自SEQIDNO:1-14的任意序列的蛋白F多肽的氨基酸序列，其中若干，一些，5至10，I至5，I至3，2，I或沒有氨基酸殘基以任意組合被替換、修飾、缺失和/或添加。其中特別優選不改變蛋白F多肽的性能和活性(例如在本文實施例章節中描述的那些性能)的沉默替換、添加和缺失。[0173]本發明的其他優選實施方案是在其全長上與編碼蛋白E多肽的多核苷酸至少85%同一的多核苷酸,和與這些多核苷酸互補的多核苷酸,所述蛋白E多肽具有在SEQIDNO:1-14的任意序列中示出的氨基酸序列。可選地，最高度優選地是包含在其全長上與編碼蛋白F多肽的多核苷酸至少90%同一的區域的多核苷酸和與其互補的多核苷酸。在此方面，特別優選在其全長上與編碼蛋白F多肽的多核苷酸至少95%同一的多核苷酸。此外，在至少95%中高度優選至少97%，和其中特別高度優選至少98%和至少99%，更優選至少99%。[0174]優選的實施方案是編碼這樣的多肽的多核苷酸，所述多肽基本保持與選自SEQIDNO:15的DNA序列編碼的成熟多肽相同的生物學功能或活性。[0175]依照此發明的某些優選實施方案，提供了與蛋白F多核苷酸序列(例如SEQIDNO:15的那些多核苷酸)雜交，特別是在嚴格條件下雜交的多核苷酸。[0176]本發明還涉及與本文提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸。在此方面，本發明特別涉及在嚴格條件下與本文描述的多核苷酸雜交的多核苷酸。本文中使用的術語“嚴格條件”和“嚴格雜交條件”指只有在序列之間存在至少95%和優選地至少97%同一性時才發生的雜交。嚴格雜交條件的具體實例是在包含50%甲酰胺，5xSSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5xDenhardt溶液，10%硫酸葡聚糖和20微克/ml經變性、剪切的鮭魚精DNA的溶液中在42°C過夜孵育，然后在0.1xSSC中在約65°C洗滌雜交支持物。雜交和洗漆條件是公知的，并在Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版,ColdSpringHarbor7N.Y.,(1989),特別是其中的第11章中舉例說明。溶液雜交也可用于本發明提供的多核苷酸序列。`[0177]本發明也提供了由下述多核苷酸序列組成的或包含下述多核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸序列是通過使用具有在SEQIDNO:15的相應序列中示出的所述多核苷酸序列或其片段的序列的探針，在嚴格雜交條件下篩選含有在SEQIDNO:15的任意序列中示出的多核苷酸序列的完整基因的合適的文庫，并分離所述多核苷酸序列得到的。用于得到這樣的多核苷酸的片段包括，例如在本文其他地方充分描述的探針和引物。[0178]如在本文有關本發明的多核苷酸測定的其他部分討論地，例如，本發明的多核苷酸可用作用于RNA，cDNA和基因組DNA的雜交探針，以分離編碼蛋白F的全長cDNA和基因組克隆，和分離與蛋白F基因具有高同一性，特別是高序列同一性的其他基因的cDNA和基因組克隆。這樣的探針一般將包含至少15個核苷酸殘基或堿基對。優選地，這樣的探針將具有至少30個核苷酸殘基或堿基對和可具有至少50個核苷酸殘基或堿基對。特別優選的探針將具有至少20個核苷酸殘基或堿基對和將具有少于30個核苷酸殘基或堿基對。[0179]可使用在SEQIDNO:15中提供的DNA序列合成寡核苷酸探針通過篩選分離蛋白F基因的編碼區。然后使用具有與本發明的基因序列互補的序列的經標記的寡核苷酸篩選cDNA，基因組DNA或mRNA文庫，以測定哪些文庫成員與探針雜交。[0180]得到全長DNA或延伸短DNA的若干方法是現有的和本領域技術人員熟知的，例如基于cDNA末端快速擴增(RACE)的方法(見，例如Frohman，等人，PNASUSA85=8998-9002,1988)。例如，以Marathon?技術(ClontechLaboratoriesInc.)為例的最近的改進技術已顯著簡化了對較長的cDNA的尋找。在Marathon?技術中，已從選定組織提取的mRNA中制備了cDNA并在每個末端連接“銜接頭”序列。然后進行核酸擴增(PCR)以擴增DNA的“丟失的”5’末端，使用基因特異性和銜接頭特異性寡核苷酸引物的組合。然后使用“巢式”引物，即設計用于在擴增的產物內退火的引物(一般是在銜接頭序列的更遠的3’端退火的銜接頭特異性引物，和在選定的基因序列的更遠的5’端退火的基因特異性引物)重復PCR反應。然后通過DNA測序可分析此反應的產物，并通過將產物直接連接至現有的DNA以得到完整的序列，或使用用于5’引物設計的新的序列信息實施單獨的全長PCR構建全長DNA。[0181]本發明的多核苷酸和多肽可用作例如，用于發現疾病，特別是人疾病的治療和診斷的研究試劑和材料，如本文有關多核苷酸測定進一步討論的。[0182]是源自SEQIDNO:15的序列的寡核苷酸的本發明的多核苷酸可用于本文描述的方法中，但優選地用于PCR，以測定本文鑒定的多核苷酸是否在受感染的組織的細菌中整體或部分地轉錄。公認這樣的序列也用于診斷病原體達到的感染階段和感染類型。[0183]本發明也提供了編碼下述多肽的多核苷酸，所述多肽是成熟蛋白質加上額外的氨基或羧基端氨基酸，或在成熟多肽內部的氨基酸(例如，當成熟形式具有多于一條多肽鏈時)。這樣的序列可在加工蛋白質從前體至成熟形式中起作用，可允許蛋白質轉運，可延長或縮短蛋白質半壽期或特別地可幫助在測定或生產中操縱蛋白質。一般在體內的情況下，可通過細胞酶從成熟蛋白質上去除額外的氨基酸。[0184]對本發明的每一種多核苷酸提供了與其互補的多核苷酸。優選地，這些互補的多核苷酸與與其互補的每一種多核苷酸完全互補。[0185]具有與一個或多個前序列融合的多肽的成熟形式的前體蛋白可為多肽的失活形式。當前序列(prosequence)被去除時這些失活前體一般被激活。在激活前可去除一些或全部前序列。一般將這些前體稱為原蛋`白(proprotein)。[0186]除了核苷酸的標準A，G，C，T/U表示法，也可使用術語“N”描述本發明的某些多核苷酸。“N”指在DNA或RNA序列中的這樣的指定位置上可出現4種DNA或RNA核苷酸中的任一種，除了優選地N不是這樣的核酸之外，所述核酸當與相鄰核苷酸位置組合時，當以正確的讀框閱讀時，將在這樣的讀框中具有產生過早終止密碼子的效應。[0187]總之，本發明的多核苷酸可編碼成熟蛋白質，成熟蛋白質加前導序列(可將其稱為前蛋白)，具有一個或多個不是前蛋白的前導序列的前序列的成熟蛋白質的前體，或前原蛋白(preproprotein),其是具有前導序列和一個或多個前序列的原蛋白的前體,所述前導序列和一個或多個前序列一般在產生多肽的活性和成熟形式的加工步驟中被去除。[0188]依照本發明的方面，提供了本發明的多核苷酸用于治療或預防目的，特別是基因免疫的用途。[0189]本發明的多核苷酸在基因免疫中的用途將優選地應用合適的遞送方法，例如將質粒DNA直接注射進肌肉(Wolff等人，HumMolGenet(1992)1:363,Manthorpe等人，Hum.GeneTher.(1983)4:419),遞送與特異性蛋白質載體復合的DNA(Wu等人，JBiolChem.(1989)264:16985)，DNA與磷酸鈣共沉淀(Benvenisty&Reshef，PNASUSA,(1986)83:9551)，將DNA封裝在多種形式的脂質體中(Kaneda等人，Science(1989)243:375)，粒子轟擊(Tang等人，Nature(1992)356:152，Eisenbraun等人，DNACellBiol(1993)12:791)和使用克隆的逆轉錄病毒載體體內感染(Seeger等人，PNASUSA(1984)81:5849)。[0190]載體、宿主細胞、表達系統[0191]本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，用本發明的載體遺傳改造的宿主細胞和通過重組技術生產本發明的多肽。也可使用無細胞翻譯系統生產這樣的蛋白質，使用源自本發明的DNA構建體的RNA。[0192]可通過本領域技術人員熟知的方法從包含表達系統的經遺傳改造的宿主細胞中制備本發明的重組多肽。因此，在另外的方面，本發明涉及包含本發明的一種或多種多核苷酸的表達系統，用這些表達系統遺傳改造的宿主細胞，和通過重組技術生產本發明的多肽。[0193]為了重組生產本發明的多肽，可對宿主細胞進行遺傳改造以摻入本發明的表達系統或其部分或多核苷酸。可通過在許多標準實驗室手冊，例如Davis，等人，BASICMETHODSINMOLECULARBIOLOGY,(1986)和Sambrook，等人，MOLECULARCLONING:ALAB0RATORYMANUAL,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)中描述的方法，例如磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、轉應(transvection)、顯微注射、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、綴合、轉導、劃痕裝載(scrapeloading)、彈道引入(ballisticintroduction)和感染進行將多核苷酸引入宿主細胞。[0194]合適的宿主的代表性例子包括細菌細胞，例如鏈球菌(str印tococci)、葡萄球菌(staphylococci)、腸球菌(enterococci)、大腸桿菌、鏈霉菌(streptomyces)、藍細菌(cyanobacteria)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的細胞；真菌細胞，例如酵母、克魯維酵母(Kluveromyces)、酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母(Pichia)、擔子菌(basidiomycete)、白色念珠菌(Candidaalbicans)和曲霉屬(Aspergillus)的細胞；昆蟲細胞例如果蜆屬(Drosophila)S2和夜蛾屬(Spodoptera)Sf9的細胞；動物細胞例如CHO，COS,HeLa,C127,3T3，BHK,293,CV-1和Bowes黑素瘤細胞；和植物細胞，例如裸子植物或被子植物的細胞。[0195]可使用多種表達系統生產本發明的多肽。這些載體特別包括染色體、附加體和病毒來源的載體，例如源自細菌質粒、源自噬菌體、源自轉座子、源自酵母附加體、源自插入元件、源自酵母染色體元件、源自病毒例如桿狀病毒、乳多空病毒、例如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病病毒、小RNA病毒、逆轉錄病毒和α病毒的載體和源自其組合的載體,例如源自質粒和噬菌體遺傳元件的載體,例如粘粒和噬菌粒。表達系統構建體可含有調控和引起表達的控制區。在此方面，一般可使用適合在宿主中維持、繁殖或表達多核苷酸和/或表達多肽的任意系統或載體用于表達。可通過多種熟知和常規的技術中的任一種將合適的DNA序列插入表達系統，例如在Sambrook等人，MOLECULARCLONING,ALABORATORYMANUAL,(見上文)中示出的技術。[0196]在真核細胞重組表達系統中，為了將翻譯的蛋白質分泌到內質網腔、周質空間或細胞外環境中，可將合適的分泌信號摻入表達的多肽中。這些信號相對多肽可為內源的或其可為異源信號。[0197]可通過熟知的方法從重組細胞培養物中回收和純化本發明的多肽，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優選地，使用離子金屬親和層析(IMAC)用于純化。當多肽在細胞內合成、分離和或純化期間變性時，可使用熟知的用于重折疊蛋白質的技術再生活性構象。[0198]表達系統也可為重組的活微生物，例如病毒或細菌。可將目的基因插入活的重組病毒或細菌的基因組中。用此活載體接種和體內感染將導致抗原的體內表達和誘導免疫應答。用于此目的的病毒和細菌為例如:痘病毒(例如牛痘、禽痘、金絲雀痘)，α病毒(辛德畢斯病毒，塞姆利基森林病毒，委內瑞拉馬腦炎病毒)，腺病毒，腺相關病毒，小RNA病毒(脊髓灰質炎病毒，鼻病毒)，皰疹病毒(水痘帶狀皰疹病毒，等等)，李斯特菌屬(Listeria)，沙門氏菌屬(Salmonella)，志賀氏菌屬(Shigella)，BCG，鏈球菌。這些病毒和細菌可為有毒的，或為了得到活疫苗以多種方式減毒的。這樣的或疫苗也構成本發明的部分。[0199]診斷、預后、血清分型和突變測定[0200]此發明也涉及本發明的蛋白F多核苷酸和多肽用作診斷試劑的用途。在真核生物，特別是哺乳動物和尤其是人中檢測蛋白F多核苷酸和/或多肽將提供用于疾病診斷、疾病分期或感染性生物對藥物的應答的診斷方法。通過多種熟知技術以及本文提供的方法，可在核酸或氨基酸水平上檢測真核生物，特別是哺乳動物，和尤其是人，特別是感染了或疑似感染了包含蛋白F基因或蛋白質的生物的那些。[0201]可從推定感染和/或感染的個體的身體材料中得到用于預后、診斷或其他分析的多肽和多核苷酸。來自任一這些來源的多核苷酸，特別是DNA或RNA可直接用于檢測或可在分析前通過使用PCR或任意其他擴增技術酶促擴增。也可以相同的方式使用RNA，特別是mRNA，cDNA和基因組DNA。使用擴增，可通過分析生物的選定的多核苷酸的基因型對個體中存在的感染性或駐留生物的種和株進行表征。通過與選自相關生物，優選相同屬的不同物種或相同種的不同菌株的參考序列的基因型相比的擴增的產物大小的改變可檢測缺失和插入。通過使擴增的DNA與經標記的蛋白F多核苷酸序列雜交可鑒定點突變。通過DNA酶或RNA酶消化(分別用于DNA或RNA)，或通過檢測熔解溫度或復性動力學的差異，可分辨完全或顯著匹配的序列和不完全或更顯著錯配的雙鏈體。也可通過較之參考序列，多核苷酸片段在凝膠中的電泳遷移率的改變檢測多核苷酸序列差異。這可用或不用變性劑進行。也可通過直接的DNA或RNA測序檢測多核苷酸差異。見,例如，Myers等人，Science,230=1242(1985)。也可通過核酸酶保護測定，例如RNA酶，Vl和SI保護測定或化學切割法揭示在特異性位置上的序列變化。見，例如，Cotton等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA,85:4397-4401(1985)。[0202]在另一個實施方案中，可構建包含蛋白F核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針陣列以進行例如基因突變、血清型、系統分類或鑒定的有效篩選。陣列技術方法是熟知的并具有普適性，并可用于解決在分子遺傳學中的多種問題，包括基因表達、遺傳連鎖和遺傳變異性(見，例如，Chee等人，Science,274:610(1996))。[0203]因此在另一個方面，本發明涉及診斷試劑盒，其包含:[0204](a)本發明的多核苷酸，優選地SEQIDNO:15的任意核苷酸序列，或其片段；[0205](b)與(a)的多核苷酸序列互補的核苷酸序列；[0206](c)本發明的多肽，優選地SEQIDNO:1_14的任意多肽，或其片段；或[0207](d)針對本發明的多肽，優選地針對SEQIDNO:1_14的任意多肽的抗體，[0208]應當理解，在任意這樣的試劑盒中，(a)，(b)，(c)或(d)可包含實質組分(substantialcomponent)。這樣的試劑盒將特別地用于診斷疾病或對疾病的易感性。[0209]此發明也涉及本發明的多核苷酸作為診斷試劑的用途。檢測與疾病或致病性相關的本發明的多核苷酸的突變形式，優選SEQIDNO:15的任意序列的突變形式將提供可增加或定義疾病的診斷，病程的預后，疾病階段的測定，或對疾病的易感性的診斷工具，這是多核苷酸的低表達、過表達或改變的表達的結果。可通過多種技術，例如在本文其他部分描述的技術在多核苷酸水平上檢測在這些多核苷酸中攜帶突變的生物，特別是傳染性生物。[0210]也可通過多種技術在多核苷酸或多肽水平上檢測在本發明的多核苷酸和/或多肽中攜帶突變或多態性(等位基因變異)的生物的細胞，以允許例如血清分型。例如，可使用RT-PCR檢測RNA中的突變。特別優選使用RT-PCR與自動化檢測系統(例如GeneScan)的組合。RNA，cDNA或基因組DNA也可用于相同的目的，PCR。例如，與編碼蛋白F多肽的多核苷酸互補的PCR引物可用于鑒定和分析突變。[0211]本發明還提供了從5’和/或3’末端去除了1，2，3或4個核苷酸的引物。這些引物可特別地用于擴增從源自個體的樣品(例如身體材料)分離的蛋白FDNA和/或RNA。引物可用于擴增從受感染的個體分離的多核苷酸，使得然后可對多核苷酸進行多種技術以闡明多核苷酸序列。這樣，可檢測多核苷酸序列中的突變并使用突變以對感染或其階段或過程進行診斷和/或預后，或對感染原進行血清分型和/或分類。[0212]本發明還提供了用于診斷疾病，優選細菌感染，更優選由不可分型流感嗜血桿菌導致的感染的方法，所述方法包括從源自個體的樣品，例如身體材料中測定多核苷酸的提高的表達水平，所述多核苷酸具有SEQIDNO:15的序列中的任意序列。可使用本領域熟知的用于定量多核苷酸的任一方法測量蛋白F多核苷酸的提高或降低的表達，例如，擴增、PCR、RT-PCR、RNA酶保護、Northern印跡、光譜測定法和其他雜交方法。[0213]此外，可使用依照本發明的診斷測定檢測例如感染的存在，所述診斷測定用于檢測相比正常對照組織樣品的蛋白F多肽的過表達。[0214]可用于測定在源自宿主的樣品，例如身體材料中的蛋白F多肽水平的測定技術是本領域技術人員熟知的。這樣的測定方法包括放射免疫測定、競爭結合測定、蛋白質印跡分析、抗體夾心測定、抗體檢測和ELISA測定。[0215]本發明的多核苷酸可用作多核苷酸陣列的組分，優選高密度陣列或網格的組分。這些高密度陣列特別有助于診斷和預后目的。例如，可使用每者包含不同基因并且還包含本發明的多核苷酸的點的組用于探測，例如使用雜交或核酸擴增，使用從身體樣品得到的或源自身體樣品的探針，以檢測個體中特別多核苷酸序列或相關序列的存在。這樣的存在可指示病原體，特別是不可分型流感嗜血桿菌的存在，并可用于疾病或病程的診斷和/或預后。優選包含SEQIDNO:15的任意多核苷酸序列的多種變體的網格。也優選編碼SEQIDNO:1-14的任意多肽序列的多核苷酸序列的多種變體。[0216]抗體[0217]本發明的多肽和多核苷酸或其變體，或表達所述多肽和多核苷酸或其變體的細胞可用作免疫原以生產分別對于這些多肽或多核苷酸免疫特異性的抗體。可選地，也可使用多肽序列中的表位的模擬表位，特別是肽模擬表位用作免疫原以生產對于本發明的多肽免疫特異性的抗體。術語“免疫特異性”指相比其對現有技術中的其他相關多肽的親和力，抗體對本發明的多肽具有實質更高的親和力。[0218]在本發明的某些優選的實施方案中提供了針對蛋白F多肽或多核苷酸的抗體。[0219]可通過對動物，優選非人動物使用常規方案施用本發明的多肽和/或多核苷酸，或二者之一或二者的具有表位的片段，二者之一或二者的類似物，或表達二者之一或二者的細胞，得到針對本發明的多肽或多核苷酸產生的抗體。為了制備單克隆抗體，可使用本領域已知的提供通過連續的細胞系培養物生產的抗體的任意技術。例子包括多種技術，例如在Kohler,G.和Milstein,C.，Nature256:495-497(1975);Kozbor等人,ImmunologyToday4:72(1983)；Cole等人，第77-96頁在MONOCLONALANTIBODIESANDCANCERTHERAPY,AlanR.Liss,Inc.(1985)中描述的技術。[0220]可調整用于生產單鏈抗體的技術(美國專利號4，946，778)以生產本發明的多肽或多核苷酸的單鏈抗體。也可使用轉基因小鼠，或其他生物或動物，例如其他哺乳動物，以表達對于本發明的多肽或多核苷酸免疫特異性的人源化抗體。[0221]可選地，可利用噬菌體展示技術從篩選的具有抗蛋白F的人淋巴細胞的PCR擴增的V-基因庫或從天然文庫中選擇對本發明的多肽具有結合活性的抗體(McCafferty,等人，(1990)，Nature348，552-554;Marks，等人，(1992)BiotechnologylO,779-783)?也可通過例如鏈改組提高這些抗體的親和力(Clackson等人，(1991)Nature352:628)。[0222]上述抗體可用于分離或鑒定表達本發明的多肽或多核苷酸的克隆以例如通過親和層析純化多肽或多核苷酸。[0223]因此，針對蛋白F多肽或蛋白F多核苷酸的抗體可特別用于治療感染，特別是細菌感染。[0224]包括抗原、表位或免疫學等同變體的多肽變體構成此發明的特別的方面。[0225]優選地，修飾抗體或其變體使其在個體中免疫原性較低。例如，如果個體是人，抗體最優選地為“人源化的”，其中雜交瘤來源的抗體的一個或多個互補決定區已被移植到人單克隆抗體中，例如如在Jones等人(1986)，Nature321,522-525或Tempest等人，(1991)Biotechnology9,266-273中描述的。[0226]拮抗劑和激動劑一測定和分子[0227]本發明的多肽或多核苷酸也可用于評估在例如細胞、無細胞制劑、化學文庫和天然產物混合物中的小分子底物和配體的結合。這些底物和配體可為天然底物和配體或可為結構或功能模擬物。見例如Coligan等人，CurrentProtocolsinImmunologyl(2);第5早(1991)。[0228]通過與候選化合物直接或間接連接的標記物，篩選方法可僅測量候選化合物與多肽或多核苷酸，或與具有多肽或多核苷酸的細胞或膜，或多肽的融合蛋白的結合。可選地，篩選方法可涉及與經標記的競爭物的競爭。此外，這些篩選方法可檢測候選化合物是否導致由多肽或多核苷酸的激活或抑制產生的信號，使用適合于包含多肽或多核苷酸的細胞的檢測系統。一般在存在已知的激動劑時測定抑制或激活，并且觀察在候選化合物存在時激動劑對激活的影響。可在反向激動劑或抑制劑的篩選方法中，在沒有激動劑或抑制劑時，使用組成型活性多肽和/或組成型表達的多肽和多核苷酸，通過檢測候選化合物是否導致多肽或多核苷酸的抑制或激活，視情況而定。此外，篩選方法可僅包括以下步驟:混合候選化合物和含有本發明的多肽或多核苷酸的溶液以形成混合物，測量混合物中的蛋白F多肽和/或多核苷酸活性，和比較混合物的蛋白F多肽和/或多核苷酸活性和標準物。也可使用融合蛋白，例如在上文描述的由Fe部分和蛋白F多肽組成的那些融合蛋白，用于高通量篩選測定，以鑒定本發明的多肽的拮抗劑，以及系統發生以及和/或功能相關的多肽的拮抗劑(見D.Bennett等人,JMolRecognition,8:52-58(1995);和K.Johanson等人，JBiolChem,270(16):9459-9471(1995))。[0229]也可使用與本發明的多肽結合和/或相互作用的多核苷酸，多肽和抗體構成篩選方法用于檢測添加的化合物對細胞中的mRNA和/或多肽的生產的影響。例如，通過本領域公知的標準方法，使用單克隆和多克隆抗體，可構建ELISA測定用于測量多肽的分泌或細胞相關的水平。這可用于從適當操作的細胞或組織中發現可抑制或增強多肽的生產的活性劑(分別被稱為拮抗劑或激動劑)。[0230]本發明也提供了鑒定增強(激動劑)或阻斷蛋白F多肽或多核苷酸的作用的化合物，特別是抑菌和/或殺菌的化合物的篩選化合物的方法。篩選方法可涉及高通量技術。例如，為了篩選激動劑或拮抗劑，在缺乏或存在可能為蛋白F激動劑或拮抗劑的候選分子的條件下，孵育包含蛋白F多肽和這些多肽的經標記的底物或配體的合成的反應混合物，細胞區室，例如膜、細胞囊膜或細胞壁，或其任意制劑。候選分子激動或拮抗蛋白F多肽的能力反映為標記配體的降低的結合或來自這些底物的產物的降低的生產。義務地(gratuitously)結合的分子，即不誘導蛋白F多肽的作用的分子最可能是好的拮抗劑。良好結合，和視情況而定，增加來自底物的產物生產率、增加信號轉導或增加化學通道活性的分子是激動劑。可通過使用報告子系統增強視情況而定，對來自底物的產物生產、信號轉導或化學通道活性的速率或水平的檢測。在此方面可用的報告子系統包括但不限于轉化為產物的色度標記底物，響應蛋白F多核苷酸或多肽活性改變的報告子基因，和本領域公知的結合測定。[0231]用于蛋白F激動劑的測定的另一個例子是競爭性測定，其在適于競爭性抑制測定的條件下組合蛋白F和潛在的激動劑和蛋白F結合分子，重組蛋白F結合分子，天然底物或配體或底物或配體模擬物。例如可通過放射性或色度化合物標記蛋白F，使得可準確測定與結合分子結合的或轉化為產物的蛋白F分子的數量，以評估潛在的拮抗劑的有效性。[0232]潛在的拮抗劑特別包括結合本發明的多核苷酸和/或多肽和因此抑制或消除其活性或表達的有機小分子、肽、多肽和抗體。潛在的拮抗劑也可為這樣的有機小分子、肽、多肽，例如緊密相關的蛋白質或抗體，其結合在結合分子(例如結合分子)上的相同位點，而不誘導蛋白F誘導的活性，從而通過阻止蛋白F多肽和/或多核苷酸結合阻止蛋白F多肽和/或多核苷酸的作用或表達。[0233]潛在的拮抗劑包括這樣的小分子，其結合并占據多肽的結合位點，從而阻止與細胞結合分子的結合，使得阻止正常生物學活性。小分子的例子包括但不限于有機小分子、肽或肽樣分子。其他潛在的拮抗劑包括反義分子(有關這些分子的描述見Okano，J.Neurochem.56:560(1991)；0LIG0DE0XYNUCLE0TIDESASANTISENSEINHIBITORSOFGENEEXPRESSION,CRCPress,BocaRaton,FL(1988))?優選的潛在拮抗劑包括與蛋白F相關的化合物和蛋白F變體。[0234]在另外的方面，本發明涉及經遺傳改造的可溶性融合蛋白，其包含本發明的多肽，或其片段，和多個亞類(IgG，IgM,IgA,IgE)的免疫球蛋白的重或輕鏈的恒定區的多個部分。優選人IgG，特別是IgGl的重鏈的恒定部分作為免疫球蛋白，其中融合發生在鉸鏈區。在特別的實施方案中，可僅通過摻入可被凝血因子Xa切割的切割序列去除Fe部分。此外，此發明涉及通過遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，及其用于藥物篩選、診斷和療法的用途。本發明的另外的方面也涉及編碼這些融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術的例子可見國際專利申請號W094/29458和W094/22914。[0235]本文提供的每一個多核苷酸序列可用于探索和開發抗菌化合物。被編碼的蛋白質在表達后可用作用于篩選抗菌藥物的靶。另外，編碼被編碼的蛋白質的氨基端區域的多核苷酸或各個mRNA的Shine-Delgarno或其他翻譯促進序列可用于構建控制目的編碼序列的表達的反義序列。[0236]本發明也提供了本發明的多肽、多核苷酸、激動劑或拮抗劑用于干擾一種或多種病原體和真核，優選哺乳動物宿主之間最初的物理相互作用中的用途，所述相互作用導致感染的結果。特別地，本發明的分子可用于:預防細菌，特別是革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性菌對留置裝置(in-dwellingdevice)上的真核,優選地哺乳動物的細胞外基質蛋白，或對傷口中的細胞外基質蛋白的粘附；阻斷在真核，優選哺乳動物的細胞外基質蛋白和介導組織損傷的細菌蛋白F蛋白之間的細菌粘附和/或；阻礙除了由植入留置裝置或由其他外科技術以外的原因起始的感染的致病機制的正常進展。[0237]依照本發明的另一個方面，提供了蛋白F激動劑和拮抗劑，優選抑菌或殺菌激動劑和拮抗劑。[0238]本發明的拮抗劑和激動劑可用于例如預防、抑制和/或治療疾病。[0239]在另外的方面，本發明涉及本發明的多肽的模擬表位。模擬表位是與天然肽(在序列上或結構上)足夠類似的肽序列，其能夠被識別天然肽的抗體識別；或當與合適的載體偶聯時能夠引發識別天然肽的抗體。[0240]可通過添加、缺失或`替換所選擇的氨基酸設計肽模擬表位用于特別的目的。因此，為了易于和蛋白質載體綴合的目的可修飾肽。例如，對于一些化學綴合方法包括末端半胱氨酸可能是理想的。此外，對于與蛋白質載體綴合的肽，包括遠離肽的綴合末端的疏水末端可能是理想的，使得肽的自由的未綴合端保持與載體蛋白質的表面連接。從而以最接近在整個天然分子的情況下發現的肽的構象展示肽。例如，可改變肽使其具有N-端半胱氨酸和C-端疏水酰胺化尾。可選地，可進行一個或多個氨基酸的D-立體異構體形式的添加或替換(inverso序列)以產生有益的衍生物，例如以增強肽的穩定性。模擬表位也可為天然肽序列的retro序列，因為序列方向是反向的。模擬表位特性也可為retro-1nverso。在W095/24916和W094/05311中描述了retro、inverso和retro-1nverso妝。[0241]可選地，可使用能夠自身結合本發明的多肽的抗體使用例如噬菌體展示技術(EPO552267B1)的技術鑒定肽模擬表位。此技術產生大量肽序列，所述肽序列模擬天然肽結構并因此能夠結合抗天然肽抗體，但自身可不一定與天然多肽共有顯著的序列同源性。[0242]疫苗[0243]本發明的另一個方面涉及在個體，特別是哺乳動物，優選人中誘導免疫應答的方法，其包括用足以生產抗體和/或T細胞免疫應答以保護所述個體免受感染，特別是細菌感染和最特別地是不可分型流感嗜血桿菌感染的蛋白F多核苷酸和/或多肽，或其片段或變體接種個體。也提供了這樣的方法，藉此這樣的免疫應答減慢細菌復制。本發明的另一個方面涉及在個體中誘導免疫應答的方法，其包括對所述個體遞送核酸載體、序列或核酶以指導蛋白F多核苷酸和/或多肽，或其片段或變體的表達，用于體內表達蛋白F多核苷酸和/或多肽，或其片段或變體以誘導免疫應答，例如以生產抗體和/或T細胞免疫應答，包括例如產細胞因子T細胞或細胞毒性T細胞，以保護所述個體,優選人免患疾病,不論所述個體是否已患有疾病。施用基因的一個例子是通過作為顆粒上的涂層或其他形式使其加速進入期望的細胞。這樣的核酸載體可包括DNA，RNA,核酶，經修飾的核酸，DNA/RNA雜交物，DNA-蛋白質復合物或RNA-蛋白質復合物。[0244]本發明的另外的方面涉及免疫組合物，當所述組合物引入能夠在體內誘導免疫應答的個體，優選人中時，誘導在所述個體中的針對蛋白F多核苷酸和/或由其編碼的多肽的免疫應答，其中組合物包含重組蛋白F多核苷酸和/或由其編碼的多肽和/或包含DNA和/或RNA，所述DNA和/或RNA編碼和表達所述蛋白F多核苷酸、由其編碼的多肽或其他本發明的多肽的抗原。免疫應答可用于治療或預防，并且可采取抗體免疫和/或細胞免疫的形式，例如由CTL或⑶4+T細胞引發的細胞免疫。[0245]蛋白F多肽或其片段可與輔蛋白(co-protein)或化學部分融合，所述輔蛋白或化學部分自身可或不可生產抗體，但能夠穩定第一種蛋白質和生產將具有抗原和/或免疫原性能，和優選地保護性能的融合的或修飾的蛋白質。如此融合的重組蛋白，優選地還包含抗原性輔蛋白，例如來自流感嗜血桿菌的脂蛋白或蛋白D(EP594610)，來自流感嗜血桿菌的蛋白E(EP1973933)，谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)或β-半乳糖苷酶，或使蛋白質溶解并幫助其生產或純化的任意其他相對大的輔蛋白。此外，在提供接受蛋白質的生物的免疫系統的一般化的刺激的意義上，輔蛋白可作為佐劑。輔蛋白可附著于第一種蛋白質的氨基或羧基端。[0246]在根據本發明的疫苗組合物中，蛋白F多肽和/或多核苷酸，或其片段，或模擬表位，或其變體可存在于載體中，例如上述活重組載體，例如活細菌載體。[0247]非活載體也適用于蛋白F多肽，例如細菌外膜囊泡或“皰(bleb)”。OM皰源自革蘭氏陰性菌的雙層膜的外膜，并已在包括砂眼衣原體(C.trachomatis)和鸚鵡熱衣原體(C.Psittaci)的多種革蘭氏陰性菌中有記錄(Zhou,L等人1998.FEMSMicrobiol.Lett.163:223-228)0據報導生產皰的細菌病原體的非詳盡列表也包括:百日咳桿菌(Bordetellapertussis),伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi),馬爾他布魯氏菌(Brucellamelitensis),綿羊布魯氏菌(Brucellaovis),大腸桿菌，流感嗜血桿菌，嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila),卡他莫拉菌，淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae),腦膜炎奈瑟菌，綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和小腸結腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)。[0248]皰具有提供處于其天然構象的外膜蛋白的優勢，因此特別利于疫苗。也可通過改造細菌從而修飾一種或多種分子在外膜上的表達為了疫苗用途改進皰。因此例如可引入或上調(例如通過改變啟動子)期望的免疫原性蛋白，例如蛋白F多肽在外膜上的表達。替代地或額外地，可下調不相關的(例如未保護的抗原或免疫顯性但多變的蛋白質)或有害的(例如毒性分子例如LPS，或自身免疫應答的潛在誘導物)外膜分子的表達。下面更詳細地討論這些方法。[0249]蛋白F基因的非編碼側翼區含有在基因表達中重要的調控元件。此調控在轉錄和翻譯水平上都存在。可通過DNA測序得到在基因的開放閱讀框的上游或下游的這些區域的序列。此序列信息允許測定潛在的調控基序，例如不同的啟動子元件、終止序列、誘導型序列元件、阻遏子、負責相轉變的元件、shine-dalgarno序列、具有潛在的參與調控的二級結構的區域，以及其他類型的調控基序或序列。此序列是本發明的另外的方面。[0250]此序列信息允許調節蛋白F基因的天然表達。可通過改變啟動子、shine-dalgarno序列、潛在的阻遏子或操縱子元件，或任意其他相關元件實現基因表達的上調。同樣地，可通過類似類型的修飾實現表達的下調。可選地，通過改變相轉變序列，可使基因表達處于相轉變的控制之下，或使其與此調控解偶聯。在另一種方法中，可使基因表達處于一種或多種允許受調控的表達的誘導型元件的控制之下。這樣的調控的例子包括但不限于，通過溫度變化、加入誘導底物例如選定的碳水化合物或其衍生物、微量元素、維生素、輔因子、金屬離子等進行誘導。[0251]可通過若干不同的方式引入上述這些修飾。可通過隨機誘變然后選擇期望的表型，在體內進行參與基因表達的序列修飾。另一種方法在于分離目的區域并通過隨機誘變，或定點替換、插入或缺失誘變修飾目的區域。然后可將經修飾的區域通過同源重組再引入細菌基因組并可評估對基因表達的影響。在另一種方法中，可使用目的區域的序列信息來替換或缺失天然調控序列的全部或部分。在這種情況下，分離和修飾靶向的調控區以含有來自另一個基因的調控元件，來自不同基因的調控元件的組合，合成的調控區，或任意其他調控區，或以缺失野生型調控序列的選定部分。然后可通過同源重組將這些修飾的序列再引入細菌基因組中。可用于上調基因表達的優選啟動子的非詳盡列表包括下述啟動子:來自腦膜炎奈瑟菌或淋病奈瑟菌(N.gonorroheae)的porA,porB,IbpB,tbpB,pllO,1st,hpuAB;ompO),copB,IbpB,ompE,UspAl；UspA2;來自卡他莫拉菌的TbpB;來自流感嗜血桿菌的pi,p2,p4,p5,p6,IpD,pE,tbpB,D15,Hia,Hmwl,Hmw2。[0252]在一個例子中，可通過與較強的啟動子交換基因的啟動子調芐基因的表達(通過分離基因的上游序列，體外修飾此序列，和通過同源重組再引入基因組)。可在細菌中以及從細菌脫落(或產生)的外膜囊泡中都得到上調的表達。[0253]在其他例子中，所述方法可用于產生在疫苗應用中具有改進特性的重組細菌菌株。其可為，但不限于，減毒株，具有選定抗原的提聞的表達的菌株，具有干擾免疫應答的基因敲除(或降低的表達)的菌株，具有免疫顯性蛋白質的調節的表達的菌株，具有外膜囊泡的調節的脫落的菌株。[0254]因此，本發明也提供了蛋白F基因的經修飾的上游區，所述經修飾的上游區含有異源調控元件，所述調控元件改變位于外膜上的蛋白F蛋白的表達水平。根據本發明的此方面的上游區包括蛋白F基因的上游序列。上游區從緊接蛋白F基因的上游開始，并通常持續到從ATG起始密碼子開始不超過基因上游的約1000bp的位置。在位于多順反序列(操縱子)中的基因的情況下，上游區可從緊接目的基因的前面，或操縱子中的第一基因的前面開始。優選地，根據本發明的此方面的經修飾的上游區在ATG上游500和700bp之間的位置上含有異源啟動子。[0255]公開的上游區上調蛋白F基因的表達的用途，通過同源重組實現此目的的方法(例如如在W001/09350中描述的，將其引入本文作為參考)，包含適用于此目的的上游序列的載體，和這樣改變的宿主細胞都是此發明的另外的方面。[0256]因此，本發明提供了在經修飾的細菌皰中的蛋白F多肽。本發明還提供了能夠生產基于非活膜的皰載體的經修飾的宿主細胞。本發明還提供了包含具有經修飾的上游區的蛋白F基因的核酸載體，所述上游區含有異源調控元件。[0257]本發明還提供了制備根據本發明的宿主細胞和細菌皰的方法。[0258]此發明還提供了組合物，特別是疫苗組合物，和包含本發明的多肽和/或多核苷酸和免疫刺激性DNA序列(例如在Sato,Y.等人Science273:352(1996)中描述的那些)的方法。[0259]此發明還提供了在流感嗜血桿菌感染的動物模型中的這樣的基因免疫實驗中使用的多核苷酸構建體中，使用描述的多核苷酸或其特別的片段的方法，已顯示所述多核苷酸或其特別的片段編碼細菌細胞表面蛋白的非可變區。這樣的實驗將特別可用于鑒定能夠引起預防或治療性免疫應答的蛋白質表位。認為此方法將允許隨后制備源自成功抵抗或清除了感染的動物的必需器官的、特別有價值的單克隆抗體，允許開發在哺乳動物，特別是人中的細菌感染，特別是流感嗜血桿菌感染的預防劑或治療法。[0260]本發明也包括疫苗制劑，其包含本發明的免疫原性重組多肽和/或多核苷酸連同合適的載體，例如可藥用的載體。因為多肽和多核苷酸可在胃中被分解，優選地胃腸外施用每者，包括例如皮下、肌肉內、靜脈內或皮內施用。適于胃腸外施用的制劑包括水性和非水性無菌注射液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌化合物和使制劑與個體的體液，優選血液等滲的溶質；和水性和非水性無菌懸浮液，其可含有懸浮劑或增稠劑。制劑可存在于單位劑量或多劑量的容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并可在凍干條件下儲存，在使用前僅需要立即加入無菌液體載體。[0261]本發明的疫苗制劑也可包括佐劑系統用于增強制劑的免疫原性。優選地，佐劑系統優先引發THl型應答。[0262]免疫應答可廣泛地分為2個極端類型，體液或細胞介導的免疫應答(傳統上分別以抗體和細胞效應保護機制為特征)。這些應答類型被稱為THl型應答(細胞介導的應答)和TH2型免疫應答(體液應答)。[0263]極端的THl型免疫應答可通過抗原特異性、單倍型限制的細胞毒性T淋巴細胞的產生和自然殺傷細胞的應答表征。在小鼠中THl型應答經常通過IgG2a亞型的抗體的產生表征，而在人中其對應IgGl型抗體。TH2型免疫應答通過廣泛的免疫球蛋白同種型(在小鼠中包括IgGl，IgAjPIgM)的產生表征。[0264]可以認為，產生這兩類免疫應答的背后的驅動力是細胞因子。高水平的THl型細胞因子傾向有利于誘導對給定抗原的細胞介導的免疫應答，而高水平的TH2型細胞因子傾向有利于誘導對抗原的體液應答。[0265]THl和TH2型免疫應答的區別不是絕對的。實際上個體將支持被描述為THl主要的或TH2主要的免疫應答。然而，經常方便地根據Mosmann和Coffman(Mosmann,T.R.和Coffman,R.L.(1989)THlandTH2cells:differentpatternsoflymphokinesecretionlead至differentfunctionalproperties.AnnualReviewofImmunology,7,pl45-173)在鼠⑶4+veT細胞克隆中描述的理解細胞因子家族。傳統上，THl型應答與T淋巴細胞產生的INF-Y和IL-2細胞因子相關。通常與誘導THl型免疫應答直接相關的其他細胞因子不是由T細胞產生的，例如IL-12。相反地，TH2型應答與IL-4，IL_5，IL-6和IL-13的分泌相關。[0266]已知某些疫苗佐劑特別適合刺激THl或TH2型細胞因子應答。傳統上，在接種疫苗或感染后免疫應答的THl:TH2平衡的最佳指示物包括在用抗原再刺激后在體外直接測量T淋巴細胞產生的THl或TH2細胞因子，和/或測量抗原特異性抗體應答的IgGl:IgG2a比例。[0267]因此，THl型佐劑是這樣的佐劑，當用抗原在體外再刺激時，其優先刺激分離的T細胞群產生高水平THl型細胞因子，并促進CD8+細胞毒性T淋巴細胞和與THl型同種型相關的抗原特異性免疫球蛋白應答的產生的佐劑。[0268]在國際專利申請號W094/00153和W095/17209中描述了能夠優先刺激THl細胞應答的佐劑。[0269]3De-0_酰化單磷酰脂A(3D_MPL)是一種這樣的佐劑。其從GB2220211(Ribi)知曉。在化學上其是具有4，5或6個酰化鏈的3De-0-酰化單磷酰脂A的混合物，由RibiImmunochem,Montana制造。3De_0_酰化單磷酰脂A的優選形式在歐洲專利0689454B1(SmithKlineBeechamBiologicalsSA)中公開。[0270]優選地，3D-MPL的顆粒足夠小以致可通過0.22微米的膜無菌過濾(歐洲專利號0689454)。[0271]3D-MPL將以10μg_100μg，優選地25-50μg/劑的范圍存在，其中抗原一般將以2-50μg/劑的范圍存在。[0272]另一種優選的佐劑包含QS21,源自石堿木(QuillajasaponariaMolina)樹皮的HPLC純化的無毒級分。任選地其可與3De-0-酰化單磷酰脂A(3D-MPL)混合，任選地與載體一起混合。[0273]在美國專利號5，057,540中公開了生產QS21的方法。[0274]以前已描述了含有QS21的無反應原性(Non-reactogenic)佐劑制劑(W096/33739)。當與抗原一起配制時，顯示這樣的包含QS21和膽固醇的制劑是成功的THl刺激佐劑。[0275]是THl細胞應答的優先刺激物的其他佐劑包括免疫調節寡核苷酸，例如如在W096/02555中公開的未甲基化的CpG序列。[0276]也考慮不同的THl刺激佐劑(例如上文提及的佐劑)的組合以提供是THl細胞應答的優先刺激物的佐劑。例如，QS21可與3D-MPL—起配制。QS21:3D_MPL的比例一般在1:10至10:1的數量級；優選1:5至5:1和基本上經常為1:1。最佳協同作用的優選范圍是2.5:I至1:1的3D-MPL:QS21。[0277]優選地在根據本發明的疫苗組合物中也存在載體。載體可為水包油乳劑，或鋁鹽，例如磷酸鋁或氫氧化鋁。[0278]優選的水包油乳劑包含可代謝的油，例如鯊烯、α生育酚和吐溫80。在特別優選的方面，在根據本發明的疫苗組合物中的抗原在這樣的乳劑中與QS21和3D-MPL組合。另外地，水包油乳劑可含有span85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。[0279]一般用于入施用，QS21和3D-MPL將以lyg_200yg，例如10-100μg，優選地IOyg-SOyg/劑的范圍存在于疫苗中。一般地水包油將包含2至10%鯊烯，2至10%α生育酚和0.3至3%吐溫80。優選地鯊烯:α生育酚的比例等于或小于1，因為這提供了更穩定的乳劑。Span85也可以1%的水平存在。在有些情況下，本發明的疫苗將還有利地包含穩定劑。[0280]無毒水包油乳劑優選地在水性載體中含有無毒油，例如角鯊烷或鯊烯，乳化劑，例如吐溫80。水性載體可為，例如磷酸緩沖鹽溶液。[0281]在W095/17210中描述了在水包油乳劑中包含QS21，3D-MPL和生育酚的特別有力的佐劑制劑。[0282]盡管已參考某些蛋白F多肽和多核苷酸描述了本發明，應當理解這包括天然存在的多肽和多核苷酸的片段，和具有基本上不影響重組多肽或多核苷酸的免疫原性性能的添加、缺失或替換的類似多肽和多核苷酸。優選的片段/肽顯示在圖11中。[0283]本發明也提供了多價疫苗組合物，其包含本發明的疫苗制劑和其他抗原，特別是用于治療中耳炎的抗原的組合。這樣的多價疫苗組合物可包括本文上面描述的TH-1誘導佐劑。[0284]在優選的實施方案中，本發明的多肽、片段和免疫原與一種或多種以下組的抗原一起配制:a)—種或多種肺炎球菌莢膜多糖(簡單的(plain)或與載體蛋白綴合)；b)—種或多種可保護宿主抵抗卡他莫拉菌感染的抗原；c)一種或多種可保護宿主抵抗肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)感染的蛋白抗原；d)—種或多種其他不可分型流感嗜血桿菌蛋白抗原；e)—種或多種可保護宿主抵抗RSV的抗原；和f)一種或多種可保護宿主抵抗流感病毒的抗原。優選組a)和b)；b)和c)；b)，d),和a)和/或c)；b),d),e),f),和a)和/或c)的組合。這樣的疫苗可有利地用作全面的中耳炎疫苗。[0285]肺炎球菌莢膜多糖抗原優選地選自血清型1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A,11A，12F,14，15B,17F,18C,19A,19F，20，22F，23F和33F(最優選地選自血清型1，3，4，5，6B，7F，9V,14，18C,19F和23F)。[0286]優選的肺炎球菌蛋白抗原是暴露在肺炎球菌外表面的那些肺炎球菌蛋白(在肺炎球菌的至少部分生命周期期間能夠被宿主的免疫系統識別)，或由肺炎球菌分泌或釋放的蛋白質。最優選地，所述蛋白質是肺炎鏈球菌的毒素、粘附素、2組分信號轉導物或脂蛋白，或其片段。特別優選的蛋白質包括但不限于:肺炎球菌溶血素(優選地通過化學處理或突變解毒的)[Mitchell等人NucleicAcidsRes.1990Julll;18(13):4010"ComparisonofpneumolysingenesandproteinsfromStreptococcuspneumoniaetypesland2.",Mitchell等人BiochimBiophysActal989Jan23；1007(I):67-72"ExpressionofthepneumolysingeneinEscherichiacoli:rapidpurificationandbiologicalproperties."，W096/05859(A.Cyanamid)，W090/06951(Paton等人)，W099/03884(NAVA)]；PspA及其跨膜缺失變體(W092/14488；W099/53940；US5804193-Briles等人)；PspC及其跨膜缺失變體(W099/53940；W097/09994-Briles等人);PsaA及其跨膜缺失變體(Berry&Paton,InfectImmunl996Dec；64(12):5255-62"SequenceheterogeneityofPsaA,a37_kilodaltonputativeadhesinessentialforvirulenceofStreptococcuspneumoniae");肺炎球菌膽堿結合蛋白及其跨膜缺失變體；CbpA及其跨膜缺失變體(W097/41151；W099/51266);甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Infect.1mmun.199664:3544)；HSP70(W096/40928);PcpA(Sanchez-Beato等人FEMSMicrobiolLettl998，164:207-14)；M樣蛋白，SB專利申請號EP0837130;和粘附素18627(SB專利申請號EP0834568)。其他優選的肺炎球菌蛋白抗原是在W098/18931中描述的，特別是選自W098/18930和PCT/US99/30390的那些肺炎球菌蛋白抗原。[0287]可包括在組合疫苗(特別是用于預防中耳炎)中的優選的卡他莫拉菌蛋白抗原是:0MP106[W097/41731(Antex)&W096/34960(PMC)];0MP21;LbpA&/或LbpB[W098/55606(PMC)]；TbpA&/或TbpB[W097/13785&W097/32980(PMC)]；CopB[HelminenME,等人(1993)Infect.1mmun.61:2003-2010]；UspAl和/或UspA2[W02007/018463(ArneForsgrenAB),W093/03761(UniversityofTexas)]；0mpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；0MP85(PCT/EP00/01468);Iipo06(GB99I7977.2)；IipolO(GB9918208.1);lipolI(GB9918302.2);Iipo18(GB9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；0mplAl(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)；和OmpE。[0288]可包括在組合疫苗(特別是用于預防中耳炎)中的優選的其他不可分型流感嗜血桿菌蛋白抗原包括:絲束蛋白[(US5766608_0hioStateResearchFoundation)]和包含來自其的肽的融合物[例如LBl(f)肽融合物；US5843464(OSU)或W099/64067]；0MP26[W097/01638(Cortecs)]；P6[EP281673(StateUniversityofNewYork)]；蛋白D(EP594610);蛋白E(EP1973933);TbpA和/或TbpB;Hia;Hsf;Hin47;Hif;Hmwl；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(W094/12641)；P2；P5(W094/26304)；NlpC2(BASB205)[W002/30971]；Slp(BASB203)[W002/30960];和?0ΜΡ1681(BASB210)[W002/34772]。[0289]優選的流感病毒抗原包括整個、活的或失活的病毒，在卵或MDCK細胞或Vero細胞中培養的裂解的流感病毒，或整個流感病毒體(virosome)(如R.Gluck,Vaccine,1992，10，915-920描述)或其純化的或重組蛋白，例如HA，NP,NA，或M蛋白，或其組合。[0290]優選的RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白或其衍生物。[0291]組合物、試劑盒和施用[0292]在本發明的另外的方面提供了用于對細胞或對多細胞生物施用的包含蛋白F多核苷酸和/或蛋白F多肽的組合物。[0293]本發明還涉及包含本文討論的多核苷酸和/或多肽或其激動劑或拮抗劑的組合物。本發明的多肽和多核苷酸可與`用于細胞、組織或生物的一種或多種非滅菌的或無菌的載體組合使用，例如適于對個體施用的藥物載體。這樣的組合物包含例如，介質添加劑或治療有效量的本發明的多肽和/或多核苷酸和可藥用的載體或賦形劑。這樣的載體可包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。制劑應適合施用模式。本發明還涉及診斷和藥物包和試劑盒，其包含一個或多個容器，所述容器填充了一種或多種本發明的上述組合物的成分。[0294]本發明的多肽、多核苷酸和其他化合物可單獨使用或與其他化合物，例如治療化合物組合使用。[0295]藥物組合物可以任意有效、方便的方式施用，特別地包括例如通過局部、口、肛門、陰道、靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、鼻內或皮內途徑施用。[0296]在療法中或作為預防藥，活性劑可作為可注射的組合物，例如作為無菌水性分散液，優選等滲的無菌水分散液的形式對個體施用。[0297]在另外的方面，本發明提供了藥物組合物，其包含治療有效量的本發明的多肽和/或多核苷酸，例如多肽和/或多核苷酸的可溶形式，激動或拮抗肽或小分子化合物，和可藥用的載體或賦形劑的組合。這樣的載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。本發明還涉及藥物包和試劑盒，其包含一個或多個容器，所述容器填充了一種或多種本發明的上述組合物的成分。本發明的多肽、多核苷酸和其他化合物可單獨使用或與其他化合物，例如治療化合物組合使用。[0298]組合物將適合于施用途徑，例如全身或口服途徑。全身施用的優選形式包括注射，一般通過靜脈內注射。可使用其他注射途徑，例如皮下、肌肉內或腹膜內注射途徑。全身施用的可選方式包括使用滲透劑例如膽汁鹽或夫西地酸(fusidicacid)或其他去垢劑經粘膜和經皮施用。另外，如果可將本發明的多肽或其他化合物配制為腸溶制劑或囊封制劑，也可口服施用。也可以藥膏、糊劑、凝膠、溶液、粉末等形式局部和/或定位施用這些化合物。[0299]為了對哺乳動物，特別是人施用，預期活性劑的每日劑量水平將為從0.01mg/kg至10mg/kg，通常約lmg/kg。無論如何醫師將決定最合適個體的實際劑量，這將根據特定個體的年齡、體重和反應而變化。上述劑量是平均情況的示例。當然會有應當較高或較低劑量范圍的個例，這些包括在此發明的范圍內。[0300]所需的劑量范圍取決于選擇的肽，施用途徑，制劑的性質，對象的病況，和主治醫生的判斷。然而，合適的劑量在0.1-100μg/kg對象的范圍內。[0301]疫苗組合物方便地為可注射的形式。可使用常規佐劑以增強免疫應答。接種疫苗的合適的單位劑量是0.5-5微克/kg抗原，這樣的劑量優選地施用1-3次，間隔為1-3周。使用指示的劑量范圍，將不會觀察到會妨礙本發明的化合物對合適的個體施用的有害的毒理學作用。[0302]然而，考慮到多種可用的化合物和多種施用途徑的不同的效率，預期需要的劑量在大范圍內變化。例如，預期口服施用將比通過靜脈內注射的施用需要較高的劑量。可使用本領域眾所周知的用于優化的標準實驗途徑調整這些劑量水平的變化。[0303]序列數據庫、在有形介質中的序列和算法[0304]多核苷酸和多肽序列形成了有價值的信息資源，可用于測定其二維和三維結構以及鑒定具有相似同源性的其他序列。通過將序列存儲在計算機可讀介質中，然后在已知的大分子結構程序中使用存儲的數據或使用熟知的搜索工具，例如GCG程序包可最容易地實現這些方法。[0305]本發明也提供了分析特征序列或串，特別是基因序列或編碼的蛋白質序列的方法。優選的序列分析方法包括，例如序列同源性分析方法，例如同一性和相似性分析，DNA、RNA和蛋白質結構分析，序列組裝，進化枝分析，序列基序分析，開放閱讀框測定，核酸堿基調用，密碼子使用分析，核酸堿基整理和測序色譜峰分析。[0306]提供了進行同源性鑒定的基于計算機的方法。此方法包括以下步驟:在計算機可讀介質中提供包含本發明的多核苷酸序列的第一多核苷酸序列；和比較所述第一多核苷酸序列和至少一種第二多核苷酸或多肽序列以鑒定同源性。[0307]也提供了進行同源性鑒定的基于計算機的方法，所述方法包含以下步驟:在計算機可讀介質中提供包含本發明的多肽序列的第一多肽序列；和比較所述第一多肽序列和至少一種第二多核苷酸或多肽序列以鑒定同源性。[0308]將在此說明書中引用的所有出版物和參考，包括但不限于專利和專利申請以其整體引入本文作為參考，就如同每一單個出版物或參考被明確特別和單獨地說明被引入本文作為參考被充分闡述一樣。也將此申請要求優先權的任意專利申請以其整體以上述用于出版物和參考的方式一樣引入本文作為參考。[0309]定義[0310]如本領域公知的，“同一性”是通過如比較序列測定的兩種或多種多肽序列或兩種或多種多核苷酸序列之間的關系，視情況而定。在本領域中，“同一性”也表示多肽或多核苷酸序列(視情況而定)之間的序列相關程度，如通過這些序列字符串之間的匹配測定的。可通過已知方法容易地計算“同一性”，包括但不限于在(ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.Μ.,編，OxfordUniversityPress,NewYork,1988；Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.ff.，編，AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,PartI,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,編，HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeine,G.,AcademicPress,1987;和SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.,編，MStocktonPress,NewYork,1991;和Carillo,H.,和Lipman,D.,SIAMJ.AppliedMath.,48:1073(1988)中描述的方法。測定同一性的方法被設計為產生檢測的序列之間的最大匹配。此外，測定同一性的方法在公開的計算機程序中編纂。測定2種序列之間的同一性的計算機程序方法包括但不限于，在GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.，等人，NucleicAcidsResearchl2(l):387(1984)),BLASTP，BLASTN(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.215:403-410(1990)，和FASTA(Pearson和LipmanProc.Natl.Acad.Sc1.USA85；2444-2448(1988)。BLAST家族程序在NCBI和其他來源中公開地獲得(BLASTManual,Altschul,S.，等人，NCBINLMNIHBethesda,MD20894；Altschul,S.,等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。也可使用熟知的SmithWaterman算法測定同一性。[0311]用于多肽序列比較的參數包括以下:[0312]算法:Needleman和Wunsch,J.MolBiol.48:443-453(1970)[0313]比較矩陣:來自HenikoffandHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.89:10915-10919(1992)的BL0S`SUM62[0314]空位罰分:8空位長度罰分:2[0315]使用這些參數的程序以來自GeneticsComputerGroup,MadisonWI的“gap”程序公開獲得。上述參數是用于肽比較的默認參數(以及對末端空位沒有罰分)。[0316]用于多核苷酸比較的參數包括以下參數:[0317]算法:Needleman和Wunsch,J.MolBiol.48:443-453(1970)[0318]比較矩陣:匹配=+10，錯配=O[0319]空位罰分:50[0320]空位長度罰分:3[0321]以來自GeneticsComputerGroup,MadisonWI的“gap，，程序獲得。[0322]這些是用于核酸比較的默認參數。[0323]用于多核苷酸和多肽(視情況而定)的“同一性”的優選含義可在下文的(I)和(2)中提供。(I)多核苷酸實施方案還包括分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含與SEQIDNO:15的參考序列具有至少50，60，70，80，85，90，95，97或100%同一性的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可與SEQIDNO:15的參考序列相同或可包括相比參考序列至多某整數個的核苷酸改變，其中所述改變選自至少一個核苷酸缺失、替換(包括轉換或顛換)或插入，并且其中所述改變可發生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置上或在這些末端位置之間的任意位置上，單獨地分散在參考序列的核苷酸之中或以一個或多個連續的組分散在參考序列中，并且其中如下測定所述核苷酸改變數，即將SEQIDNO:15中的核苷酸總數乘以已經除以100的定義百分比同一性的整數，然后將乘積從SEQIDNO:15中的所述核苷酸總數中扣除，或:[0324]nn(xn-(xn.y),[0325]其中nn是核苷酸改變數，xn是SEQIDNO:15中的核苷酸總數，對于50%y是0.5，對于60%是0.6，對于70%是0.7，對于80%是0.8，對于85%是0.85，對于90%是0.9，對于95%是0.95，對于97%是0.97或對于100%是1.0，.是乘號的符號，并且其中在從Xn扣除前，將X1^Py的任意非整數乘積向下取整為最近的整數。編碼SEQIDNO:1-14的多肽的多核苷酸序列的改變可產生在此編碼序列中的無意、錯義或移框突變，因此改變在這些改變后多核苷酸編碼的多肽。[0326]作為示例，本發明的多核苷酸序列可與SEQIDNO:15的參考序列相同，即其可為100%同一，或其可包括相比參考序列至多某整數個的核酸改變，使得百分比同一性小于100%同一1丨生。這樣的改變選自至少一個核苷酸缺失、替換(包括轉換或顛換)，或插入,并且其中所述改變可發生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置上或在這些末端位置之間的任意位置上，單獨地分散在參考序列的核苷酸之中或以一個或多個連續的組分散在參考序列中。如下測定對于給定的百分比同一性的核酸改變數^fSEQIDNO:15中的核苷酸總數乘以已經除以100的定義百分比同一性的整數，然后將乘積從SEQIDN0:15中的所述核苷酸總數中扣除，或:[0327]nn(xn-(xn.y),[0328]其中nn是核苷酸改變數，Xn是SEQIDNO:15中的核苷酸總數，例如，對于70%y是0.7，對于80%是0.8，對于85%是0.85，等，.是乘號的符號，并且其中在從Xn扣除前，將Xn和I的任意非整數乘積向下取整為最近的整數。[0329](2)多肽實施方案還包括分離的多肽，所述分離的多肽包含與SEQIDNO:1_14的多肽參考序列具有至少50，60，70，80，85，90，95，97或100%同一性的多肽，其中所述多肽序列可與SEQIDNO:1-14的參考序列相同或可包括相比參考序列至多某整數個的氨基酸改變，其中所述改變選自至少一個氨基酸缺失、替換(包括保守和非保守替換)或插入，并且其中所述改變可發生在參考多肽序列的氨基或羧基末端位置上或在這些末端位置之間的任意位置上，單獨地分散在參考序列的氨基酸之中或以一個或多個連續的組分散在參考序列中，并且其中如下測定所述氨基酸改變數，將SEQIDNO:1-14中的氨基酸總數乘以已經除以100的定義百分比同一性的整數，然后將乘積分別從SEQIDNO:1-14中的所述氨基酸總數中扣除，或:[0330]na(xa-(xa.y),[0331]其中na是氨基酸改變數，xa是SEQIDNO:1-14中的氨基酸總數，對于50%y是0.5，對于60%是0.6，對于70%是0.7，對于80%是0.8，對于85%是0.85，對于90%是0.9，對于95%是0.95，對于97%是0.97或對于100%是1.00，而.是乘號的符號，并且其中在從Xa扣除前，將Xa和I的任意非整數乘積向下取整為最近的整數。[0332]作為示例，本發明的多肽序列可與SEQIDNO:1_14的參考序列相同，即其可為100%同一，或其可包括相比參考序列至多某整數個的氨基酸改變，使得百分比同一性小于100%同一性。這樣的改變選自至少一個氨基酸缺失、替換(包括保守和非保守替換)或插入，其中所述改變可發生在參考多肽序列的氨基或羧基末端位置上或在這些末端位置之間的任意位置上，單獨地分散在參考序列的氨基酸之中或以一個或多個連續的組分散在參考序列中。如下測定給定％同一性的氨基酸改變數，將SEQIDNO:1-14中的氨基酸總數乘以已經除以100的定義百分比同一性的整數，然后將乘積從SEQIDNO:1-14中的所述氨基酸總數中扣除，或:[0333]na(xa-(xa.y),[0334]其中na是氨基酸改變數，xa是SEQIDNO:1_14中的氨基酸總數，例如，對于70%y是0.7，對于80%是0.8，對于85%是0.85，等，.是乘號的符號，其中在從xa扣除前，將Xa和I的任意非整數乘積向下取整為最近的整數。[0335]當在本文中用于生物時，“個體”指多細胞真核生物，包括但不限于后生動物、哺乳動物、ovid、牛科動物、類人猿、靈長類和人。[0336]“分離的”表示“通過人工”從其天然狀態改變的，即如果其天然存在，其已從其原始環境被改變或去除，或二者。例如，依照本文使用的術語，在活生物中天然存在的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但從其天然狀態的共存材料中分離的相同的多核苷酸或多肽是“分離的”。此外，通過轉化、基因操縱或通過任意其他重組方法引入生物的多核苷酸或多肽是“分離的”，即使其仍然存在于所述生物中，所述生物可為活的或非活的。[0337]“多核苷酸”一般指任意多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可為包括單和雙鏈區的未經修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。[0338]“變體”指與參考多核苷酸或多肽不同、但保留了基本性能的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型變體與參考多核苷酸彼此核苷酸序列不同。在變體核苷酸序列中的改變可或可不改變由參考多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下文討論的，核苷酸改變可導致由參考序列編碼的多肽中的氨基酸替換、添加、缺失、融合和截短。多肽的典型變體與參考多肽彼此氨基酸序列不同。一般差異是有限的，使得參考多肽和變體的序列總體上很相似，并且在許多區域是相同的。變體和參考多肽的氨基酸序列差異可為一種或多種替換、添加、缺失的任意組合。替換或插入的氨基酸殘基可或可不由遺傳密碼編碼。多核苷酸或多肽的變體可為天然存在的，例如等位基因變體，或其可為不已知天然存在的變體。多核苷酸和多肽的非天然存在的變體可通過誘變技術或通過直接合成產生。[0339]“疾病”指由細菌引起的或與細菌感染相關的疾病，包括例如在嬰兒和兒童中的中耳炎，在老年人中的肺炎，竇炎，院內感染和侵襲性疾病，具有聽力喪失、在中耳中的積液、聽覺神經損傷、語言學習延遲，上呼吸道感染和中耳炎癥的慢性中耳炎。[0340]實驗部分[0341]除了另外詳細描述的部分，使用本領域技術人員熟知和常規的標準技術進行下面的實施例。實施例是說明性的，而不是限制本發明。本研究描述了使用玻連蛋白作為誘餌發現的流感嗜血桿菌的名為蛋白F(pF)的新的玻連蛋白結合外膜蛋白的分離、純化、表征、克隆和表達，和新的截短的重組蛋白F(pF)。[0342]材料與方法[0343]細菌、試劑和上皮細胞系[0344]不可分型流感嗜血桿菌菌株NTHi3655是臨床分離物，由R.Munson(OhioStateUniversity,Colombus,Ohio)饋贈。通過具有上呼吸道感染的患者(SkaneCounty,Sweden)的鼻咽拭子得到臨床NTHi分離物。在補充NAD和氯高鐵血紅素(Sigma,St.Louis,MO)的腦心浸液(BHI)肉湯中(DifcoLaboratories,Detroit,MI)或在已描述的巧克力血瓊脂板上(Ronander等人,2009)過夜培養流感嗜血桿菌。[0345]A549(CCL-185)，和H292上皮細胞系來自ATCC。在含10%FCS的RPMI1640中在37°C和5%CO2下維持兩種細胞系。[0346]二維SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-SDS-PAGE)[0347]如描述地純化外膜囊泡(OMV)和外膜蛋白(Ronander等人,2008,Schaar等人，2010)。使用IPGphorIEF系統(AmershamPharmaciaBiotech)對OMV進行等電聚焦(IEF)(Ronander等人，2008)。為了凝膠校準，使用標準物(貨號161-0320；Bio-Rad)。將2-D聚丙烯酰胺凝膠以120mA過夜電印跡至Immobilon-PVDF濾器(0.45mm；Millipore,Bedford,MA)。從凝膠上切出用考馬斯藍染色的2D-SDS-PAGE中的點并如描述送去通過MALD1-ToF法測序(Schaar等人，2010)。[0348]SDS-PAGE和膜上蛋白質的檢測(蛋白質印跡；免疫印跡)[0349]使用10%Bis-Tris凝膠以150恒壓運行SDS-PAGE，試劑和印跡儀器來自Novex(SanDiego,CA)(Vidakovics等人，2010)。用考馬斯亮藍R-250(Bio-Rad,Sundbyberg,Sweden)染色凝膠。在電泳轉移后，在含5%奶粉的具有0.05%吐溫20的PBS(PBS-吐溫)中封閉Immobilon-P膜。洗滌后，用在含2%奶粉的PBS-吐溫中的人玻連蛋白(Sigma)(0.5μg/ml)在室溫孵育膜。在一些實驗中，在洗滌后加入1/1，000稀釋的HRP綴合的小鼠抗人玻連蛋白。孵育后在Fluor-SMax中或用ECL蛋白質印跡檢測試劑(AmershamPharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)進行顯色。[0350]DNA克隆和在大腸桿菌中的重組PF12-293的蛋白質表達[0351]使用來自NTHi3655的染色體DNA作為模板分離pF編碼序列。通過PCR將限制酶位點BamHI和HindIII引入編碼pF12_293的DNA的側翼區。為了融合由表達載體編碼的6個組氨酸殘基，突變PF12-293終止密碼子。將得到的PCR產物連接進pET26(+)(Novagen,Darmstadt,Germany)中。將編碼pF的質粒轉化進表達宿主BL21(DE3)中。為了生產重組PF12-293，用異丙基-β-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導細菌3.5h。離心后，在冰上用lmg/ml溶菌酶孵育細菌沉淀，聲波處理和離心。如制造商建議地在含有鎳樹脂的柱上(Novagen)在天然條件下純化可溶性蛋白質。[0352]抗體和酶聯免疫吸附測定^LISA)[0353]為了生產特異性抗pF抗血清，根據標準程序使用完全和不完全弗氏佐劑用重組PF12-293肌肉內免疫兔3次(間隔2周)(Ronander等人2008)。使用與CnBr-S^harose綴合的pF12-293通過親和層析分離得到的多克隆抗體(pAb)。此外,使用與CnBr-Sepharose綴合的特異性PF44-68肽通過親和層析分離抗pF44-68。辣根過氧化物酶(HRP)綴合的豬抗兔多克隆免疫球蛋白來自Dakopatts(Gentofte,Denmark)。使用重組的截短的卡他莫拉菌(非IgD結合)IgD結合蛋白(mid)962-1200作為陰性對照(Nordstr5m等人，2002)。[0354]如描述地也用重組pF12-293免疫小鼠(Balb/c)(Ronander等人，2009)。通過ELISA分析特異性小鼠抗pFpAb。簡單地說，在微滴定板中在4°C過夜包被50μg重組PF12-293。洗滌后，加入小鼠血清并在室溫孵育。在30分鐘和另外的洗滌后，加入HRP綴合的兔抗小鼠多克隆抗體并讀取OD54tl處的吸光度。[0355]DF-缺陷的流感嗜血桿菌(NTHi3655ADf)的制各[0356]使用從NTHi3655分離的基因組DNA作為模板。擴增pf的5’和3’端并通過使用PCR通過重疊延伸與包含氯霉素乙酰轉移酶(cat)基因的盒融合(Riesbeck等人，1999)。在其中一條側翼引物中包括特異性攝取序列(AAGTGCGGT)。如描述地將得到的PCR產物轉化進NTHi3655中(Poje等人，2003)，然后在含有氯霉素的板上篩選。[0357]流式細胞術分析[0358]在肉湯中培養過夜培養物細菌直至0D_0.8。之后用含I%BSA的PBS洗2次NTHi菌株，然后根據標準方案[Samuelsson等人，2007]與純化的兔抗pF抗血清孵育。洗滌后，用FITC綴合的山羊抗兔二抗pAb(Dakopatts)孵育細菌，然后通過流式細胞術分析(EPICS?.XL-MCL,Coulter,Hialeah,FL)。[0359]上皮細胞、粘附測定和肽結合實驗[0360]在24孔板(Nunc)中培養上皮細胞系至匯合。在36°C在具有上述補充物的BHI中培養細菌并用[3H]-胸苷脈沖。4小時后用補充10%FCS，0.2%葡萄糖，0.02%明膠的RPMI(反應介質)洗I次細菌。去除上皮細胞的培養基，以不同的感染復數(MOI)加入一式三份的細菌(20μ1)。之后，補充反應介質，然后以800rpm離心5分鐘。在36°C，5%C0290分鐘后，用PBS洗3次孔，然后加入胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Sigma)。合并一式三份的孔，用PBS洗滌，轉移至閃爍管并在計數器中測量(Wallac)。[0361]使用氯胺T法(Greenwood等人，1963)用[125碘]-標記(0.05摩爾碘/摩爾蛋白質)標記覆蓋整個PF序列的合成肽的系列。大多數肽含有酪氨酸殘基，但在有些情況下在C-端添加了額外的酪氨酸殘基。上皮細胞與經放射性標記的蛋白質在PBS，2%BSA中在37°C孵育45分鐘。之后，在相同的緩沖液中洗細胞，然后在Y-閃爍計數器中測量。[0362]MS[0363]蛋白F(pF)是流感嗜血桿菌中新的玻連蛋白結合蛋白[0364]為了確定不可分型流感嗜血桿菌(NTHi)中的玻連蛋白結合蛋白，從NTHi3655中分離了外膜囊泡(OMV)。對從在存在或缺乏CO2的條件下孵育的培養物中收獲的OMV進行SDS-PAGE。平行運行了2塊凝膠，一塊印跡至尼龍濾器(圖lA(i)，左圖)，而另一塊用考馬斯藍染色(圖1B，左圖)。孵育濾器與玻連蛋白，然后使用抗玻連蛋白pAb和HRP綴合的PAb二抗檢測。在用CO2孵育的細菌的OMV中得到最強的信號(圖lA(i)，左圖)，提示我們用相同的OMV制劑運行2D-SDS-PAGE。如可從圖1A⑴中看到的(右圖)，在存在CO2下培養的細菌的OMV的2D-SDS-PAGE上得到玻連蛋白的清晰信號。為了確保檢測抗體沒有給出假陽性背景，在缺乏玻連蛋白時也用抗體檢測了濾器(圖lA(ii))。當在2D-SDS-PAGE中已經確定了玻連蛋白結合的點時(圖1A(i)，右圖)，在考馬斯染色的2D-SDS-PAGE上確定了對應的點(圖1B，右圖)。將幾個點送去測序，如箭頭所示，較明顯的點中的其中一個顯示了對應H10362的29kDa蛋白質(圖1A⑴和B)。此新的玻連蛋白結合蛋白被命名為蛋白F(pF),并被選中用于進一步的分析。[0365]蛋白F的DNA序列和開放閱讀框[0366]將在NTHi3655中編碼蛋白F的DNA測序并詳細分析。完整的pF序列由293個氨基酸組成(圖2A)并具有長22個氨基酸的信號肽(圖2B)(Nielsen等人，1997)。信號肽后面是預測的黏性結構域和在C-末端的金屬結合區。[0367]為了比較與GeneBank中現有的其他pF序列的同源性，進行了聚類分析(圖3)。在發現的15個不同的pF序列中，11個菌株具有100%保守的序列，其中也包括NTHi3655的公共序列。4個菌株與NTHi3655中的pF具有99%的同一性。因此，通過與其他公開的序列的比較判斷pF極其保守。[0368]蛋白F的克隆和在大腸桿菌中的表達;[0369]為了表達pF，使用NTHi3655基因組序列作為模板。擴增了編碼缺乏信號肽(pFl-22)的遠N-端疏水部分(11個氨基酸)的開放閱讀框(ORF)的DNA并克隆進表達載體PET26中，然后轉化。將得到的重組蛋白質命名為PF12-293。在誘導后，通過親和層析純化PF12-293。洗脫純蛋白質并進行SDS-PAGE。在圖4A中證明了得到的具有由6個組氨酸組成的C-端標簽的重組pF(左邊第2道)。最終產物遷移的大小對應約33kDa。[0370]通過兔抗血清檢測重組生產的蛋白F(pF12_293)且pF存在于所有分析的臨床分析物中[0371]為了研究pF是否是免疫原性的以及是否在兔中誘導多克隆抗體應答，用重組PF12-293免疫動物。在總共6周的時間內免疫3次后，收集特異性抗pF抗血清。研究了在NTHi3655外膜中的pF的存在。外膜囊泡(OMV)從培養物上清中分離并對其進行SDS-PAGE。在凝膠上包括重組PF12-293和來自卡他莫拉菌的0MV(圖4A)。如可從圖4B中所看見的，兔抗血清既識別重組PF12-293又識別來自NTHi3655的OMV制劑中的天然pF，而在用作陰性對照的莫拉菌屬(Moraxella)OMV中沒有發現交叉反應性。此外，用pF免疫小鼠并且這些動物也產生了抗體應答，即在ELISA中檢測到針對重組pF的特異性多克隆抗體(數據未顯示)O[0372]從疫苗的角度來說，所有臨床NTHi分離物都在蛋白質水平上表達pF是很重要的。為了研究這一點，從鼻咽NTHi分離物的系列中分離外膜蛋白并進行SDS-PAGE，然后印跡(圖5)。使用特異性抗pF抗血清進行蛋白質印跡。用抗血清容易地檢測到蛋白F且在實驗室使用的標準培養條件期間PF在所有臨床分離物中組成型表達。蛋白質印跡證明，在所有分析的菌株中PF作為具有相同大小的(約29kDa)單條帶遷移(圖5B)。總之，pF是免疫原性的且在所有的臨床NTHi分離物中可見。[0373]嗜血桿菌蛋白F是表面暴露的外膜蛋白[0374]為了揭示pF是否位于NTHi3655的表面，通過引入導致氯霉素抗性的編碼氯霉素乙酰轉移酶(CAT)的基因盒制備了pf缺陷的突變體。通過PCR和重疊延伸將cat基因盒與pF的5’和3’-側翼區融合。使用抗pF抗血清通過蛋白質印跡驗證沒有pF表達,所述抗PF抗血清是通過層析針對重組pF12-293純化的(未顯示)。通過流式細胞術進一步分析蛋白F表達(圖6)。如可從圖6B中所看見的，當用抗pFpAb分析時,相比僅由FITC綴合的檢測二抗組成的背景對照，PF在NTHi3655上顯著表達(圖6A)。有趣的是，當pf基因被突變時，相比NTHi3655野生型(圖6B)，表面暴露的pF明顯消失(圖6D)。在圖6C中顯示了PF缺陷的NTHi3655Apf突變體的背景對照。這些實驗因此證明pF位于流感嗜血桿菌的細菌細胞表面。[0375]蛋白F是既結合玻連蛋白又結合層粘連蛋白的外膜蛋白[0376]玻連蛋白是細胞外基質(ECM)的重要組分，并且其通過抑制主要由于補體蛋白(C)9的結合的膜攻擊復合物(MAC)的形成和因此中和MAC在維持補體級聯的內穩態中也起重要作用(Singh等人，2010b)。為了檢測pF是否能夠結合玻連蛋白，在微滴定板上涂敷重組pF12-293并在ELISA中檢測其結合全長玻連蛋白。包括良好表征的UspA2(Singh等人，2010a)和pE(HallstrSm等人，2009)作為陽性對照和卡他莫拉菌MID962-1200作為非玻連蛋白結合的陰性對照(Nordstriim等人，2002)。有趣地是，相比pE，pF略好地吸引玻連蛋白，而UspA2是強結合物(圖7A)。相反地，MID962-1200在ELISA中不吸引玻連蛋白。[0377]為了進一步研究pF依賴的玻連蛋白結合的作用，在直接結合測定中用[125I]-玻連蛋白孵育缺乏PF的NTHi3655APf突變體。有趣地是，相比野生型，pF缺陷突變體NTHi3655Apf顯示了降低了40%的與玻連蛋白的結合(圖7B)。[0378]許多細菌種類使用ECM蛋白層粘連蛋白作為上皮細胞上的靶分子。為了測試重組蛋白F是否也結合層粘連蛋白，在微滴定板中涂敷重組pF12-293，然后加入層粘連蛋白并用抗層粘連蛋白PAb特異性檢測。觀察到劑量響應，且相比蛋白E，pF略好地結合層粘連蛋白(圖8)。總之，嗜血桿菌pF既結合玻連蛋白又結合層粘連蛋白，因此是在NTHi致病機制中的重要毒力因子。[0379]蛋白F附著于上皮細胞且活性結合結構域位于蛋白F的N-端部分內(氨基酸PF23-48)[0380]若干玻連蛋白結合蛋白也在附著于上皮細胞中起作用(Singh等人，2010b)，即這些通常多功能的外膜蛋白作為粘附素。為了測試PF是否可促進細菌與上皮細胞的結合，將重組PF12-293加入附著于塑料表面的上皮細胞中。當對細胞加入至多0.12μM的漸增濃度的PF12-293，然后使用抗pF兔抗血清和HRP綴合的檢測二抗檢測時，觀察到劑量響應(圖9)。[0381]為了進一步證明PF作為粘附素的重要性，比較了pF缺陷突變體NTHi3655Apf和表達PF的天然NTHi3655野生型`。有趣地是，當使用50和100的感染復數(MOI)的上皮細胞分析時，PF突變體丟失了超過50%的其結合能力(圖10)，進一步證明pF是重要的NTHi粘附素。因此，PF在NTHi附著于上皮細胞中起作用，可被視作細菌粘附素。[0382]制備了一系列合成肽以分析負責附著于上皮細胞表面的pF的準確結合區(圖11)。肽用碘標記并與2種不同的上皮細胞系孵育。如可在圖12中所看見的，N-端肽(PE23-48)顯著結合H292(圖12A)和A549上皮細胞二者(圖12B)。總之，主要的上皮結合位點位于分子的N-端部分內。[0383]N-端PF44-68是表面暴露的并可通過特異性抗體檢測[0384]因為上皮細胞結合位點最可能位于pF的N-端部分內，分子的此部分將是表面暴露的。生物信息學分析顯示PF23-48不是免疫原性的(未顯示)。相反地,分析認為pF44-68將是免疫原性的。因此，將肽PF44-68與CnBr-S^harose連接，然后使用pF12_293抗血清作為來源吸附特異性抗pF44-68pAb。NTHi3655野生型和pF缺陷的突變體都與得到的抗PF44-68兔pAb孵育。之后，加入FITC綴合的山羊抗兔檢測抗體，然后進行流式細胞術分析。如可從圖13B中所看見的，用抗pF44-68pAb容易地檢測到表達pF的NTHi3655。相反地，用抗pF44-68pAb沒有檢測到pF缺陷的突變體NTHi3655Δpf突變體(圖13D)。也顯示了在缺乏抗pF44-68pAb的條件下孵育的細菌，并證明pAb二抗不結合(圖13A和C)。總之，通過由針對序列PF44-68的抗體識別，在表面可發現pF的N-端部分。[0385]參考文獻[0386]GreenwoodFC,HunterWM和GloverJS.ThePreparationof1-131-LabelledHumanGrowthHormoneofHighSpecificRadioactivity.BiochemJ1963；89:114-23.[0387]HallstromT，BlomAM，ZipfelPF,RiesbeckK.NontypeableHaemophilusinfluenzaeproteinEbindsvitronectinandisimportantforserumresistance.JImmunol.2009Augl5；183(4):2593-601.Epub2009Jul27.PubMedPMID:19635912.[0388]HeinoJiKapylaJ.Cellularreceptorsofextracellularmatrixmolecules.CurrPharmDes2009；15:1309-17.[0389]Nielsen，H.，J.Engelbrecht,S.Brunak^flG.vonHeijne.1997.1dentificationofprokaryoticandeukaryoticsignalpeptidesandpredictionoftheircleavagesites.ProteinEngineeringlO:1.[0390]NordstromT，ForsgrenA和RiesbeckK.TheimmunoglobulinD-bindingpartoftheoutermembraneproteinMIDfromMoraxellacatarrhaliscomprises238aminoacidsandatetramericstructure.JBiolChem2002；277:34692-9.[0391]Janson，H.，L_0.Heden,A.Grubb,M.Ruan,和A.Forsgren.1991.ProteinD，animmunoglobulinD-bindingproteinofHaemophiliusinfluenzae:cloning,nucleotidesequence，andexpressioninEscherichiacol1.1nfect.1mmun.59:119.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IDNO:14的氨基酸序列的肽，或片段，其中所述片段包含具有來自SEQIDNO:14的氨基酸序列的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:14的多肽的免疫應答。18.疫苗組合物，其包含根據權利要求1-17中任一項的蛋白質或片段的至少一種二聚體、三聚體或多聚體。19.根據權利要求1-18的疫苗組合物，還包含一種或多種可藥用的佐劑、運載體、賦形劑、黏合劑、載體、防腐劑、緩沖劑、乳化劑、濕潤劑或促轉染化合物。20.根據權利要求1-19中任一項的疫苗組合物，其包含至少一種另外的疫苗。21.根據權利要求1-20中任一項的疫苗組合物，其包含另一種分子的免疫原性部分。22.根據權利要求21的疫苗組合物，其中另一種分子的免疫原性部分選自包含流感嗜血桿菌的蛋白D或E,卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)的MID,卡他莫拉菌的UspAl或UspA2，和任意呼吸道病原體的外膜蛋白的組。23.疫苗組合物，其包含編碼根據權利要求1-17中任一項的蛋白質或片段的核酸序列，以及其同源物、多態性、簡并物和剪接變體。24.疫苗組合物，其包含重組核酸序列，所述重組核酸序列包含與至少另一個基因融合的根據權利要求23的核酸序列。25.疫苗組合物，其包含質粒或噬菌體，所述質粒或噬菌體包含根據權利要求23或24的核酸序列。26.疫苗組合物，其包含非人宿主，所述非人宿主包含根據權利要求25的至少一種質粒并能夠生產根據權利要求1至17的蛋白質或片段，所述宿主選自細菌、酵母和植物。27.疫苗組合物，其包含根據權利要求26的宿主，所述宿主是大腸桿菌(E.coli)。28.疫苗組合物，其包含融合蛋白或多肽，其中通過使用根據權利要求24的重組核酸序列，將根據權利要求1至17的蛋白質或片段與至少另一種蛋白質組合。29.疫苗組合物，其包含根據權利要求28的融合蛋白，所述融合蛋白是根據權利要求1至17的蛋白質或片段的二聚體、三聚體或多聚體。30.疫苗組合物，其包含融合產物，其中根據權利要求1至17中任一項的蛋白質或片段或肽與蛋白質、碳水化合物或基質共價結合，或通過任意其他方式結合。31.疫苗組合物，其包含分離的多肽，所述分離的多肽包含與SEQIDNO:1的氨基酸序列在SEQIDNO:1的全長上具有至少85%同一性的氨基酸序列。32.疫苗組合物，其包含如在權利要求31中要求保護的分離的多肽，其中氨基酸序列與SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少95%同一性。33.如在權利要求31中要求保護的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。34.疫苗組合物，其包含SEQIDNO:1的分離的多肽。35.權利要求33或34的疫苗組合物，其中多肽缺乏SEQIDNO:1的信號肽(氨基酸1-22)或信號肽的部分。36.疫苗組合物，其包含免疫原性片段，所述免疫原性片段包含具有來自SEQIDN0:1的氨基酸序列或來自權利要求18-21的多肽的至少15個連續的氨基酸的氨基酸序列，所述片段(如需要當與載體偶聯時)能夠引起識別SEQIDNO:1的多肽(或權利要求33-35的多肽，分別地)的免疫應答，或能夠結合玻連蛋白和層粘連蛋白。37.疫苗組合物，其包含如權利要求31至36中任一項要求保護的多肽或免疫原性片段，其中所述多肽或所述免疫原性片段是較大的融合蛋白的部分。38.疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸編碼如權利要求31至37中任一項要求保護的多肽或免疫原性片段。39.疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，或與所述分離的多核苷酸互補的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼與SEQIDN0:1的氨基酸序列在SEQIDN0:1的全長上具有至少85%同一性的多肽。40.疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，或與所述分離的多核苷酸互補的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列與編碼SEQIDΝΟ:1的多肽的核苷酸序列在整個編碼區上具有至少85%同一性。41.疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，或與所述分離的多核苷酸互補的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸包含`下述核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNO:15的核苷酸序列在SEQIDNO:15的全長上具有至少85%同一性。42.如權利要求38-41中任一項要求保護的疫苗組合物，其中分離的多核苷酸與SEQIDNO:15的同一性為至少95%。43.疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼SEQIDNO:1的多肽，或權利要求36或37的免疫原性片段的核苷酸序列。44.疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含SEQIDNO:15的多核苷酸。45.疫苗組合物，其包含分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼SEQIDΝΟ:1的多肽的核苷酸序列，所述分離的多核苷酸可通過在嚴格雜交條件下使用具有SEQIDNO:15的序列或其片段的經標記的探針篩選合適的文庫得到。46.疫苗組合物,其包含表達載體或重組的活微生物,所述表達載體或重組的活微生物包含根據權利要求38-45中任一項的分離的多核苷酸。47.疫苗組合物，其包含重組的活微生物，所述重組的活微生物包含根據權利要求46的表達載體。48.疫苗組合物，其包含宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求47的表達載體。49.疫苗組合物，其包含根據權利要求48的宿主細胞的膜，所述宿主細胞表達分離的多肽，所述分離的多肽包含與SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。50.生產權利要求31-37的疫苗組合物的方法，所述方法包括在足以生產所述多肽或所述免疫原性片段的條件下培養權利要求48的宿主細胞，和從培養基中回收多肽。51.生產權利要求38-45中任一項的疫苗組合物的方法，所述方法包括用包含至少一種所述多核苷酸的表達載體轉化宿主細胞，和在足以表達任一種所述多核苷酸的條件下培養所述宿主細胞。52.疫苗組合物，其包含有效量的權利要求31至37中任一項的多肽或免疫原性片段和可藥用的賦形劑。53.疫苗組合物，其包含有效量的權利要求38至45中任一項的多核苷酸和可藥用的賦形劑。54.根據權利要求52或53中任一項的疫苗組合物，其中所述組合物包含至少一種其他的流感嗜血桿菌抗原。55.權利要求1-45中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的肺炎球菌溶血素一起配制。56.權利要求1-45中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自卡他莫拉菌的Omp106一起配制。57.權利要求1-45中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自卡他莫拉菌的UspAl和/或UspA2—起配制。58.權利要求1-45中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自卡他莫拉菌的Hly3一起配制。59.權利要求1-45中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自卡他莫拉菌的OmpO)—起配制。60.權利要求1-45中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自卡他莫拉菌的D15一起配制。61.權利要求1-45中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自流感嗜血桿菌的Omp26一起配制。62.權利要求1-45中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自流感嗜血桿菌的P6一起配制。63.權利要求1-45中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自流感嗜血桿菌的蛋白D—起配制。64.權利要求1-45中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自流感嗜血桿菌的NlpC2一起配制。65.權利要求1-45中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物和來自流感嗜血桿菌的Slp或PilA—起配制。66.根據權利要求1-17中任一項的疫苗在制造用于預防或治療感染的藥物中的用途。67.根據權利要求66的用途，其中所述感染由流感嗜血桿菌導致。68.根據權利要求67的用途，其中所述流感嗜血桿菌是有莢膜的或不可分型的。69.根據權利要求66-68中任一項的用途，用于預防或治療在患有例如慢性阻塞性肺病(COPD)的兒童和成人中的中耳炎、竇炎或下呼吸道感染。70.藥物，其包含根據權利要求1-17中任一項的至少一種蛋白質、片段或肽和一種或多種可藥用的佐劑、運載體、賦形劑、黏合劑、載體、防腐劑、緩沖劑、乳化劑、濕潤劑或促轉染化合物。71.分離根據權利要求1-17中任一項的蛋白質、片段或肽的方法，所述方法包括以下步驟:a)培養包含編碼所述蛋白質、片段或肽的DNA的流感嗜血桿菌或大腸桿菌，收獲細菌并分離外膜或內含體；b)用強溶解劑溶解內含體；c)加入復性劑；和d)用pH從8至10的緩沖液透析得到的懸浮液。72.根據權利要求71的方法，其中所述溶解劑是鹽酸胍。73.根據權利要求71或72的方法，其中所述復性劑是精氨酸。74.制備疫苗的方法，所述方法包括權利要求71-73的步驟，其中蛋白質、片段或肽和賦形劑一起配制。75.預防或治療在個體中的感染的方法，所述方法包括施用藥學有效量的根據權利要求1-45和52-65中任一項的疫苗組合物。76.根據權利要求75的方法，其中所述感染由流感嗜血桿菌導致。77.根據權利要求76的方法，其中所述流感嗜血桿菌是有莢膜的或不可分型的。78.根據權利要求75-77中任一項的方法，用于預防或治療在患有例如慢性阻塞性肺病(COPD)的兒童和成人中的中耳炎、竇炎或下呼吸道感染。【文檔編號】A61P31/04GK103687613SQ201280034173【公開日】2014年3月26日申請日期:2012年5月11日優先權日:2011年5月11日【發明者】K·里斯貝克,Y-C·蘇申請人:里斯貝克保健瑞典股份公司