用于降低抗體異質性的方法和產生其抗體的方法
【專利摘要】本公開內容涉及一種在培養期間降低抗體的異質性的方法，其中該異質性是由于抗體的電荷變體的比例。該公開內容還包括一種在致使抗體具有降低的異質性的細胞培養系統中生長細胞的方法。在一個實施方式中，通過將二價過渡金屬離子如鋅（Zn2+）添加至細胞培養基以降低抗體異質性。在另一個實施方式中，通過降低細胞培養基的同滲容摩以降低抗體異質性。
【專利說明】用于降低抗體異質性的方法和產生其抗體的方法
【技術領域】
[0001]本公開內容涉及提高蛋白質產量的方法，例如，大規模商業化蛋白質生產如抗體生產，使用包含細胞生長階段和多肽產生階段的改良的細胞培養方法。該改良的細胞培養方法控制過程特征和操作參數以獲得具有改變的電荷變體/堿性變體的多肽產品。本公開內容涉及降低抗體的異質性。更具體地，該公開內容包括在細胞培養系統中生長細胞的方法，該細胞培養系統通過降低堿性變體的比例來降低電荷變體的異質性。
【背景技術】
[0002]無論處于商用或開發中，大部分的生物技術產品都是蛋白質治療劑。因此，對于在細胞培養物中例如在動物細胞培養物中的蛋白質生產以及對于與該生產相關的改進方法存在較大和增長的需求。因此，大量的研究集中在可以優化多肽產量的動物細胞培養條件和方法上，即，支持高細胞密度與高效價的蛋白質的條件和方法上。
[0003]在生物制藥學的單克隆抗體中通常觀察到C-端賴氨酸變體。單克隆抗體異質性可以歸因于各種因素，如氨基端改變(例如，對于焦谷氨酸)、C-端的不完全處理、天冬酰胺脫酰胺、磷酸化、糖基化、氧化、突變等。這些種類的變異發生在許多類型的蛋白質中并且在生物治療藥物方面可以影響它們的活性和穩定性。抗體的同質性是重要的特征并且認為其對于證明由FDA和其它管理機構所要求的藥物安全性和功效是必不可少的。
[0004]重組單克隆抗體已經顯示在C-端具有精氨酸(Arg)或賴氨酸(Iys)的C-端異質性。當使用羧肽酶B (—種外肽酶)處理MAb的這些C-端變體時，Arg和Lys從兩個抗體亞基的C-端斷裂，從而消除 C-端異質性。
[0005]羧肽酶(CP)是催化肽和蛋白質中的C-端肽鍵水解的酶。從多肽或蛋白質的C-端除去一個或幾個氨基酸對該分子的生物學活性可以具有深遠的影響。由于在從來自合成時的分子到來自從受試者中完全清除時的分子的時間范圍內引入了各種修飾，因此MAb的異質性是常見的。研究治療劑的修飾是重要的，由于該治療劑可能影響制劑的活性/安全性從而導致功效損失和不良副作用的風險。
[0006]US專利號5，126，250公開了一種降低由抗體生產細胞分泌的抗體的異質性的方法。
【發明內容】
[0007]因此，本公開內容涉及一種降低通過細胞培養獲得的抗體的異質性的方法，所述方法包括將二價過渡金屬離子添加至抗體生產培養基或改變培養基的同滲容摩(滲透壓摩爾濃度，osmolality)或它們的組合以獲得具有降低的異質性的所述抗體；以及一種用于產生具有降低的異質性的抗體的方法，所述方法包含以下步驟:(a)在培養基中培養細胞以產生抗體，并將二價過渡金屬離子添加至培養基或改變培養基的同滲容摩或它們的組合，以及(b)從培養基中回收具有降低的異質性的抗體。【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]為了可以容易地理解該公開內容并且投入實際應用，現在將參考示例性實施方式，如參照附圖示出的。附圖連同下文的詳細描述并入說明書中并且形成說明書的一部分，用來進一步示出實施方式并說明各種原理和優點，根據本公開內容，其中:
[0009]圖1示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第264h即第11天堿性變體的％差異(抗體I )。
[0010]圖2a示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體I )。
[0011]圖2b示出了在存在和不存在鎂離子的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體I )。
[0012]圖3示出了在含有鋅離子的低同滲容摩(240-260m0sm/Kg)培養基和310-320m0sm/Kg的同滲容摩的生產培養基中，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體I)。
[0013]圖4示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體2 )。
[0014]圖5示出了在含有鋅離子的低同滲容摩(240-260m0sm/Kg)培養基和同滲容摩范圍(310-320m0sm/Kg)的生產培養基中堿性變體的％差異(抗體3)。
[0015]圖6示出了使用不同初始同滲容摩的培養基的總堿性變體的％差異(抗體I)。
[0016]圖7示出了在存在和不存在鋅離子(ImM)的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體I)。
[0017]圖8示出了在存在和不存在鋅離子(0.5mM)的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體I)。
[0018]圖9示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體3 )。
[0019]圖10示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體4)。
[0020]圖11示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第168h即第7天堿性變體的％差異(抗體I )。
[0021]圖12示出了在存在和不存在鋅離子的情況下，在第192h即第8天堿性變體的％差異(抗體3)。
[0022]注釋:在對照中，沒有添加鋅離子。
【具體實施方式】
[0023]本公開內容涉及一種降低通過細胞培養獲得的抗體的異質性的方法，所述方法包括將金屬離子添加至抗體生產培養基或改變培養基的同滲容摩或它們的組合以獲得具有降低的異質性的所述抗體。
[0024]在本公開內容的實施方式中，該異質性是由于抗體的電荷變體的比例；并且其中通過降低抗體的C-端上的賴氨酸殘基的比例來降低異質性。
[0025]在本公開內容的另一個實施方式中，針對比例在約75%至約100%的范圍內的抗體通過進行所述方法降低異質性。
[0026]在本公開內容的又一個實施方式中，該抗體是天然產生的抗體或者選自包括單克隆抗體、修飾的抗體、抗體衍生物和抗體片段、或它們的任何組合的組中的重組抗體。
[0027]在本公開內容的又一個實施方式中，通過降低約3%至約30%的抗體的堿性變體比例和提高約5%至約25%的主峰/0賴氨酸以降低異質性。
[0028]在本公開內容的又 一個實施方式中，該二價過渡金屬離子是在約0.05mM至約
1.5mM濃度范圍內的Zn+2。
[0029]在本公開內容的又一個實施方式中，改變培養基的同滲容摩以提供約240m0sm/Kg至約260m0sm/Kg范圍內的同滲容摩。
[0030]在本公開內容的又一個實施方式中，該培養是補料式分批培養(fed batchculturing);并且包括哺乳動物細胞培養，優選中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系培養。
[0031]在本公開內容的又一個實施方式中，首先在細胞培養的細胞生長階段然后在細胞培養的多肽生產階段進行金屬離子的添加；或其中在細胞的所述培養之前的初始階段進行金屬離子的添加。
[0032]本公開內容進一步涉及一種用于產生具有降低的異質性的抗體的方法，所述方法包括以下步驟:(a)在培養基中培養細胞以產生抗體，并將二價過渡金屬離子添加至培養基或改變培養基的同滲容摩或者它們的組合，以及(b)從培養基中回收具有降低的異質性的抗體。
[0033]在本公開內容的實施方式中，在約0.5xl06細胞/ml至約0.6xl06細胞/ml的濃度范圍內培養該細胞。
[0034]在本公開內容的另一個實施方式中，在約36°C至約38°C的溫度范圍內進行培養。
[0035]在本公開內容的又一個實施方式中，該抗體是天然產生的抗體或者選自包括單克隆抗體、修飾的抗體、抗體衍生物和抗體片段、或它們的任何組合的組中的重組抗體。
[0036]在本公開內容的又一個實施方式中，該異質性是由于抗體的電荷變體的比例；并且其中通過降低抗體的C-端上的賴氨酸殘基的比例進行降低異質性。
[0037]在本公開內容的又一個實施方式中，針對比例在約75%至約100%的范圍內的抗體通過進行所述方法降低異質性。
[0038]在本公開內容的又一個實施方式中，通過降低約3%至約30%的抗體的堿性變體比例和提高約5%至約25%的主峰/0賴氨酸降低異質性。
[0039]在本公開內容的又一個實施方式中，該培養是補料式分批培養；并且包括哺乳動物細胞培養，優選中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系培養。
[0040]在本公開內容的又一個實施方式中，金屬離子是在約0.05mM至約1.5mM濃度范圍內的Zn+2。
[0041]在本公開內容的又一個實施方式中，改變培養基的同滲容摩以提供約240m0sm/Kg至約260m0sm/Kg范圍內的同滲容摩。
[0042]在本公開內容的又一個實施方式中，在約30°C至約32°C的溫度范圍內，首先在培養的細胞生長階段然后在培養的多肽生產階段進行金屬離子的添加，或其中在細胞的所述培養之前的初始階段進行金屬離子的添加。
[0043]在本公開內容的又一個實施方式中，細胞生長階段具有約12xl06細胞/ml至約13xl06細胞/ml的范圍內的細胞濃度，并且其中多肽生產階段具有約13xl06細胞/ml至約15xl06細胞/mL的范圍內的細胞濃度。
[0044]在本公開內容的實施方式中，優選以七水合硫酸鋅的形式使用該二價鋅離子。其它鋅化合物可以包括，而不限于，ZnH2、Zn (OH) 2、Zn (NO3)2.6H20、和ZnCl2。
[0045]在本公開內容的實施方式中，在沒有使用酶除去賴氨酸殘基的情況下，通過降低抗體的C-端上賴氨酸殘基的比例進行降低異質性。
[0046]本公開內容克服了現有技術的局限性以提供用于降低抗體的異質性的方法。本公開內容的目的是提供用于提高蛋白質生產的方法，例如大規模的商業化蛋白質生產如抗體生產，使用包含細胞生長階段和多肽生產階段的改良的細胞培養方法。
[0047]在本公開內容的另一個目的中，通過添加金屬離子如Zn+2來降低抗體的堿性變體。
[0048]在公開內容的又一個目的中，鋅離子的濃度是在0.05-1.5mM的范圍內。
[0049]在本公開內容的又一個目的中，通過降低生產培養基的同滲容摩降低抗體的堿性變體。
[0050]本公開內容的又一個目的包括在細胞培養系統中生長細胞的方法，該細胞培養系統通過提高主峰/0賴氨酸的形成降低電荷變體的異質性，其中在抗體的任何鏈的C-端上基本上存在O個賴氨酸。
[0051]本公開內容的又一個目的是細胞培養基中的堿性變體降低3-30%。
[0052]因此，本公開內容提供了提高蛋白質生產的方法，例如大規模的商業化蛋白質生產如抗體生產，使用包括細胞生長階段和多肽生產階段的改良的細胞培養方法。
[0053]本公開內容進一步描述了降低抗體的微異質性(microheterogeneity)。更具體地，該公開內容包括在細胞培養系統中生長細胞的方法，該細胞培養系統通過降低堿性變體的形成降低電荷變體的異質性。
[0054]本公開內容涉及一種用于通過培養哺乳動物細胞并從培養基或/和細胞中分離MAb來生產具有改變的堿性變體比例的單克隆抗體的方法。
[0055]在本公開內容的實施方式中，通過添加0.05-1.5mM范圍內的金屬離子如Zn+2和通過使用240-260m0sm/Kg的同滲容摩范圍內的生產培養基降低抗體的堿性變體。
[0056]本公開內容的又一個實施方式降低通常與標準生產程序相關的抗體的堿性變體的％。有利地，該公開內容通過較大量的含有期望質量的產品尤其是生物仿制(biosimilar)抗體的回收提供了經濟和商業效益。
[0057]術語定義
[0058]術語“抗體”包括抗體或抗體衍生物或它們的片段并且該抗體的規格還應用于本公開內容的抗體制備。在抗體片段中抗體的功能等價物或同源體包括含有免疫球蛋白結合域或模擬該結合域的肽以及Fe區或與Fe區同源的區或它的至少部分的任何多肽。包括含有免疫球蛋白結合域的嵌合分子或融合至另一個多肽的等價物。
[0059]示例性抗體分子是完整的免疫球蛋白分子和包含抗體結合部位(paratope)的免疫球蛋白分子的那些部分，包括稱為Fab、Fab’、F(ab’)2、Fe、和F (v)、以及N-聚糖結構的那些部分。
[0060] 抗體描述了血清的功能成分并且通常是指多個分子(多個抗體或多個免疫球蛋白、多個片段等)或一個分子(抗體分子或免疫球蛋白分子)。抗體分子能夠結合至特異的抗原決定簇(抗原或抗原表位)或與抗原決定簇(抗原或抗原表位)反應，該抗體分子進而可以致使誘導免疫學效應機理。單個抗體分子通常被認為是單特異性的，并且抗體分子的組合可以是單克隆的(即，由相同的抗體分子組成)或多克隆的(即，由與相同的抗原或明顯不同的抗原上的相同或不同的表位反應的不同抗體分子組成)。該明顯不同的抗體分子組成的多克隆抗體可以被稱作“成員(member)”。每個抗體分子具有能夠特異性結合至其相應抗原的唯一結構，并且所有天然抗體分子都具有相同的整體基本結構(兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈)。
[0061]異質性被定義為其中分泌抗體具有各種離散的生物化學形式的現象，例如，但不限于，抗體重鏈中的一個或兩個的羧基端上另外的一個或多個氨基酸或者由于氨基酸修飾而引起該抗體的整體電荷分布的差異。
[0062]如在本文中使用的，短語“多肽”或“多肽產物”分別與術語“蛋白質”和“蛋白產物”是同義的，并且，在本領域中通常理解為是指經由連續的肽鍵連接的至少一個氨基酸鏈。在某些實施方式中，“感興趣的蛋白質”或“感興趣的多肽”等是由已經轉化至宿主細胞的外源核酸分子所編碼的蛋白質。在某些實施方式中，其中已經轉化的宿主細胞的外源DNA編碼“感興趣的蛋白質”，外源DNA的核酸序列決定氨基酸序列。在某些實施方式中，“感興趣的蛋白質”是由宿主細胞的內源核酸分子編碼的蛋白質。在某些實施方式中，使用外源核酸分子(該外源核酸分子可以，例如，包含一個或多個調節序列和/或編碼增強感興趣的蛋白質的表達的蛋白質)通過轉染宿主細胞改變這種感興趣的內源蛋白質的表達。
[0063]如在本文中使用的，“抗體變體”是指具有不同于親本抗體的氨基酸序列的氨基酸序列的抗體。優選地 變體必然具有低于100%的序列一致性或者相似于親本抗體。在優選的實施方式中，該抗體變體將具有約75%至低于100%、更優選約80%至低于100%、更優選約85%至低于100%、更優選約90%至低于100%、以及最優選約95%至低于100%的氨基酸序列同一于或相似于親本抗體的任一重鏈或輕鏈可變區的氨基酸序列的氨基酸序列。相對于該序列的同一性或相似性在本文中定義為候選序列中的氨基酸殘基與親本抗體殘基同一(即，相同的殘基)的百分比，在對齊序列并且引入間隔后，如果需要，以達到最大百分比序列同一'I"生。
[0064]如在本文中使用的術語“培養介質”、“細胞培養基”和“培養基”是指包含滋養生長動物細胞如哺乳動物細胞的營養物的溶液，并且也可以指與細胞結合的培養基。(通常可以使用的商用培養基如培養基 Hyclone CDM4NS0、Hyclone CDM4Mab、Invitrogen CDOptiCHO和 Lonza Power CHO)。
[0065]優選的哺乳動物宿主是CHO細胞并且優選的發酵模式是補料式分批。其它細胞系的實例是NSO (非分泌型)和BHK (幼倉鼠腎臟)。
[0066]用于基因改造的(genetically engineering)細胞和/或細胞系以表達感興趣的蛋白質的方法和載體是本領域技術人員所熟知的。基因工程技術包括，但不限于，表達載體、靶同源重組和基因激活。可選地，在異源控制元件(如，例如，不天然引導該多肽產生的啟動子)的控制下表達該蛋白質。例如，該啟動子可以是引導哺乳動物多肽表達的強病毒性啟動子(例如，CMV，SV40)。該宿主細胞可以或不可以正常地產生該蛋白質。例如，該宿主細胞可以是已經基因改造的CHO細胞以產生蛋白質，是指編碼蛋白質的核酸已經被引入CHO細胞中。
[0067]本領域技術人員將確認應當培養特定細胞系的溫度和/或濃度。例如，大部分哺乳動物細胞，例如，CHO細胞，在約35°C至39°C的范圍內，優選地在37°C生長良好，然而通常在27°C培養昆蟲細胞。
[0068]在公開內容的一個實施方式中，使用本公開內容的方法產生的蛋白質是抗體或其抗原結合片段。如在本文中使用的，術語“抗體”包括含有至少一個并且通常兩個VH區或其部分、和/或至少一個并且通常兩個VL區或其部分的蛋白質。在某些實施方式中，抗體是兩個重免疫球蛋白鏈和兩個輕免疫球蛋白鏈的四聚體，其中重免疫球蛋白鏈和輕免疫球蛋白鏈是通過例如二硫鍵互相連接的。抗體或其部分可以獲自任何來源，包括，但不限于，嚙齒動物、靈長類(例如，人類和非人類靈長類)、鯊魚等，或者它們可以是重組產生的，例如，嵌合、人化等，和/或體外產生，例如通過本領域技術人員所熟知的方法。
[0069]在優選的實施方式中，本公開內容的細胞培養是在搖瓶(30ml工作容積)和/或生物反應器(1L/50L)中進行的，并且使用補料式分批模式。在補料式分批培養中，最初提供具有300-3lOmOsm/Kg的同滲容摩的哺乳動物宿主細胞和培養基并且定期供給營養物(氨基酸、葡萄糖和維生素)。在37±1°C使用0.5-0.6xl06細胞/ml的初始細胞計數開始進行產物發酵，第一個3-4天用于生長細胞。下一步包括降低溫度至31 ± I°C并且兩次間歇地添加鋅離子，使得添加的總量達到0.05-1.5mM (一次在生長階段的第3天/第4天注射并且另一次在生產階段的第6/7/8天注射)。根據本公開內容的實施方式的抗體制備，優選至少90%、優選至少95%、更優選至少99%、最優選100%的修飾抗體、其衍生物或片段缺少C-端賴氨酸殘基，尤其是取決于重鏈(其通常可以包含賴氨酸)的總數。由于抗體可以具有多個潛在地包含C-端賴氨酸的鏈,應理解缺少賴氨酸的數量百分比涉及潛在地具有C-端賴氨酸的所有鏈。顯示了單克隆 抗體在C-端賴氨酸的存在下是異質的。在另一個實施方式中，本公開內容的細胞培養是在搖瓶(30ml工作容積)和/或生物反應器(1L/50L)中進行的，并且使用補料式分批模式。在優選的補料式分批培養中，最初提供具有240-260m0sm/Kg的降低的同滲容摩的哺乳動物宿主細胞和培養基，并且定期供給營養物(氨基酸、葡萄糖和維生素)。通過使用MilliQ/WFI稀釋培養基降低培養基的同滲容摩。在37±1°C使用0.5-0.6xl06細胞/ml的初始細胞計數開始進行產物發酵，第一個3-4天用于生長細胞。下一步包括降低溫度至31 ± I °C并且兩次間歇地添加0.1mM的濃度的鋅離子(一次在生長階段的第3/4天注射并且另一次在生產階段的第5/6/7/8天注射)。根據本公開內容的實施方式的抗體制備，優選至少90%、優選至少95%、更優選至少99%、最優選100%的修飾的抗體、或衍生物其片段缺少C-端賴氨酸殘基，尤其是取決于重鏈(其通常可以包含賴氨酸)的總數。由于抗體可以具有多個潛在地包含C-端賴氨酸的鏈,應理解缺少賴氨酸的數量百分比涉及潛在地具有C-端賴氨酸的所有鏈。顯示了單克隆抗體在C-端賴氨酸的存在下是異質的。
[0070]為了說明和描述的目的，提出了本公開內容的【具體實施方式】的上述描述。不意圖將該公開內容窮盡或限制為公開的精確形式。鑒于上文的教導各種變型和改變都是可以的。此外，可以進行許多變型以使具體情形、材料、物質的組合、過程、一個或多個處理步驟適應本公開內容的目的、精神和范圍。所有這些變型都在所附權利要求的范圍內。
[0071]借助于以下實施例進一步詳細說明了本申請的技術。然而，該實施例不應解釋為限制本公開內容的范圍。
[0072]實施例:
[0073]本公開內容公開了具有降低的異質性的抗體的生產。抗體-1是抑制血管內皮細胞生長因子A (VEGF-A)的人化單克隆抗體。抗體-2是干擾HER2/neu受體(抗her2抗體)的單克隆抗體。抗體-3是抑制TNF的人化單克隆抗體，抗體-4是抗CD6。
[0074]實施例1:
[0075]使用鋅離子以降低抗體-1的堿性變體或提高抗體-1的主峰/0賴氨酸
[0076]提供具有300-310m0sm/Kg的同滲容摩的培養基并且使用0.5-0.6xl06/ml濃度的細胞接種并且使其生長。在細胞計數在第4天達到12-13xl06/ml之后，將溫度從37°C轉變至31°C。以0.1mM的濃度提供鋅的第一次注射。在第8天時，當細胞計數是13-15xl06/ml時，以0.1mM的濃度提供鋅的另一次注射。使得進行直到第11天。觀察到的異質性列在以下表中。
[0077]表-1
【權利要求】
1.一種降低通過細胞培養所獲得的抗體的異質性的方法，所述方法包括將二價過渡金屬離子添加至產生所述抗體的培養基中或改變所述培養基的同滲容摩或者它們的組合以獲得具有降低的異質性的所述抗體。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述異質性是由于所述抗體的電荷變體的比例；并且其中，所述異質性的降低是通過降低所述抗體的C-端上的賴氨酸殘基的比例進行的。
3.根據權利要求2所述的方法，其中，針對約75%至約100%范圍內的抗體比例，通過進行所述方法降低所述異質性。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述抗體是天然產生的抗體或者選自包括單克隆抗體、修飾的抗體、抗體衍生物和抗體片段、或它們的任何組合的組中的重組抗體。
5.根據權利要求2所述的方法，其中，通過降低約3%至約30%的所述抗體的堿性變體比例和提高約5%至約25%的主峰/0賴氨酸以降低所述異質性。
6.根據權利要求1所述的方法，其中，所述金屬離子是在約0.05mM至約1.5mM濃度范圍內的Zn+2。
7.根據權利要求1所述的方法，其中，改變所述培養基的同滲容摩以提供約240m0sm/Kg至約260m0sm/Kg范圍內的同滲容摩。
8.根據權利 要求1所述的方法，其中，所述培養是補料式分批培養；并且包括哺乳動物細胞培養，優選中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系培養。
9.根據權利要求1所述的方法，其中，首先在所述細胞培養的細胞生長階段以及其次在所述細胞培養的多肽生產階段進行所述二價過渡金屬離子的添加；或者其中，在所述細胞的所述培養之前的初始階段進行所述金屬離子的添加。
10.一種用于生產具有降低的異質性的抗體的方法，所述方法包括以下步驟: Ca)在培養基中培養用于產生所述抗體的細胞，并且將二價過渡金屬離子添加至所述培養基或改變所述培養基的同滲容摩或者它們的組合；以及 (b)從所述培養基中回收具有降低的異質性的所述抗體。
11.根據權利要求11(a)所述的方法，其中，在約0.5xl06細胞/ml至約0.6xl06細胞/ml的濃度范圍內培養所述細胞。
12.根據權利要求11(a)所述的方法，其中，在約36°C至約38°C的溫度范圍內進行所述培養。
13.根據權利要求11所述的方法，其中，所述抗體是天然產生的抗體或者選自包括單克隆抗體、修飾的抗體、抗體衍生物和抗體片段、或它們的任何組合的組中的重組抗體。
14.根據權利要求11所述的方法，其中，所述異質性是由于所述抗體的電荷變體的比例；并且其中，所述異質性的降低是通過降低所述抗體的C-端上的賴氨酸殘基的比例進行的。
15.根據權利要求15所述的方法，其中，針對約75%至約100%范圍內的抗體比例，通過進行所述方法降低所述異質性。
16.根據權利要求15所述的方法，其中，通過降低約3%至約30%的所述抗體的堿性變體比例和提高約5%至約25%的主峰/0賴氨酸以降低所述異質性。
17.根據權利要求11所述的方法，其中，所述培養是補料式分批培養；并且包括哺乳動物細胞培養，優選中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系培養。
18.根據權利要求11所述的方法，其中，所述金屬離子是在約0.05mM至約1.5mM濃度范圍內的Zn+2。
19.根據權利要求11所述的方法，其中，改變所述培養基的同滲容摩以提供約.240m0sm/Kg至約260m0sm/Kg范圍內的同滲容摩。
20.根據權利要求11(b)所述的方法，其中，在約30°C至約32°C范圍內的溫度下，首先在所述培養的細胞生長階段以及其次在所述培養的多肽生產階段進行所述二價過渡金屬離子的添加；或者其中，在所述細胞的所述培養之前的初始階段進行所述金屬二價過渡離子的添加。
21.根據權利要求20所述的方法，其中，所述細胞生長階段具有約12xl06細胞/ml至約13xl06細胞/ml范圍內的細胞濃度；并且其中，所述多肽生產階段具有約13xl06細胞/ml至約15xl06細胞/mL的范圍內的細胞濃度。
【文檔編號】A61K39/395GK104024423SQ201280031457
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年4月27日 優先權日:2011年4月29日
【發明者】魯吉卡·斯里瓦斯塔瓦, 斯奈哈·拉克什曼達斯·赫姆德維, 安庫爾·巴特納格爾, 薩拉瓦南·德桑, 安努杰·格爾, 哈里什·耶爾 申請人:拜康研究有限公司